专利名称：膜透过型nfat抑制肽的制作方法
技术领域：
本发明涉及到含有生物膜通过信号序列的新型肽化合物。另外本发明还涉及到由数个精氨酸残基和VIVIT构成的NFAT活性的抑制剂、免疫抑制剂以及心肥大抑制剂。
背景技术：
以往，对于移植手术后的排斥反应或特应性皮炎等免疫疾病使用各种各样的化合物作为免疫抑制剂。例如环孢菌素A(CysA)以及FK506是众所周知的免疫抑制剂，人们也都知道当将这些抑制剂用于动物时，会产生肾功能低下、高血压、胰岛素分泌量低下或神经毒性等副作用。另外，就CysA以及FK506以外的免疫抑制剂产生的副作用也进行了研究，人们一直期盼副作用更少的免疫抑制剂。
现在，除了利用上述合成化合物进行治疗外，将含有外源基因的载体用于人的基因治疗引人注目，现正在就各种各样的疾病进行临床阶段的研究。然而，对于基因治疗中使用的载体，例如，在将载体用于人时的向细胞内的导入效率、从给药到蛋白质表达必需的时间以及副作用等要解决的问题还有很多。虽然各种各样的肽制剂等都正在研究中，但目前可用于临床的还没有。
心肥大是由于遗传背景或压负荷等造成心脏比通常大的状态，可能与心功能不全有关。然而，对于心肥大，防止其发展或促进其退缩的心肥大抑制剂现在还没有销售的。这是因为现在所知道的心肥大抑制剂具有很强的副作用，实际上还不能应用于人的缘故。因此，人们渴望抑制或改善心肥大、而且没有副作用等问题的药剂。
发明内容
本发明的课题就是要解决上述那样的以往的问题，提供从给药到实际发挥效果的期间短、没有副作用和抗原性的肽化合物。尤其是提供针对免疫疾病和心肥大的治疗剂。另外，本发明也提供NFAT活性的抑制剂。
在专利申请2000-358442中公布了由9个～13个精氨酸残基，特别是由11个精氨酸残基构成的肽作为生物膜通过信号序列是非常有效的。进一步研究，初步发现将9个～13个精氨酸残基与核内T细胞活化因子(Nuclear Factor Activated T cell)NFAT的活性抑制肽融合后的肽化合物用在体内时，可以获得很好的免疫抑制效果。此外还发现，将该肽投与心肥大大鼠时，也很好地改善了心肥大症状，从而完成了本发明。
即本发明是涉及到由含有9个～13个精氨酸残基和序列号1氨基酸序列的肽化合物构成的NFAT活性的抑制剂。
另外本发明涉及到由含有9个～13个精氨酸残基和序列号1氨基酸序列的肽化合物作为有效成分的免疫抑制剂。
另外本发明涉及到由含有9个～13个精氨酸残基和序列号1氨基酸序列的肽化合物作为有效成分的心肥大抑制剂。
附图的简单说明
图1是表示在添加各种浓度11R-VIVIT、FK506以及11R-VEET后进行培养的细胞中IL-2基因的转录量的图。纵轴表示IL-2基因相对于GAPDH的相对RNA量。
图2是表示只在含有10％胎牛血清的RPMI培养基中培养60小时的Jurkat细胞、添加了11R-VIVIT后培养13小时、18小时、24小时、36小时以及60小时的Jurkat细胞以及添加FK506后培养60小时的Jurkat细胞中IL-2基因的转录量的图。纵轴表示IL-2基因相对于GAPDH的相对RNA量。
图3是表示在淋巴细胞混合试验中，整合到细胞中的[3H]TdR的放射活性的图。
图4是表示在使用由给予11R-VIVIT、FK506以及11R-VEET的小鼠获得的细胞的淋巴细胞混合试验中，整合到细胞中的[3H]TdR的放射活性的图。
图5是表示用卡普兰-迈耶存活曲线(法)(Kaplan-Meier)对移植的β细胞的存活率进行评价的图。
图6是表示对移植的β细胞进行免疫染色的结果的显微镜照片。1表示BALB/c鼠的β细胞。2表示糖尿病模型鼠的肾脏。
图7是以相对于对照的相对值表示由进行各种处理的细胞产生的胰岛素分泌量的图。图7(a)以相对于对照的相对值表示由进行各种浓度的11R-VIVIT处理的细胞产生的胰岛素分泌量的图。图7(b)以相对于对照的相对值表示由进行各种浓度的FK506处理的细胞产生的胰岛素分泌量的图。图7(c)以相对于对照的相对值表示由进行各种浓度的11R-VEET处理的细胞产生的胰岛素分泌量的图。
图8是以相对于对照的相对值表示由进行各种处理的细胞的增殖的图。图8(a)是以相对于对照的相对值表示由用11R-VIVIT处理的细胞的增殖的图。图8(b)是以相对于对照的相对值表示由用FK506处理的细胞的增殖的图。图8(c)是以相对于对照的相对值表示由用11R-VEET处理的细胞的增殖的图。
图9利用超声波回声对大鼠的心室中隔以及左室全壁的厚度进行解析得到的结果图。图9(a)是表示对照、AoB、给予CysA的AoB以及给予11R-VIVIT的AoB的心室中隔厚度的图。图9(b)是表示对照、AoB、给予CysA的AoB以及给予11R-VIVIT的AoB的左室全壁厚。
图10是大鼠心脏的组织标本的显微镜照片。图10(a)是表示正常大鼠的心脏切片的显微镜照片。图10(b)是表示AoB的心脏切片的显微镜照片。图10(c)是表示给予CysA的AoB的心脏切片的显微镜照片。图10(d)是表示给予11R-VIVIT的AoB的心脏切片的显微镜照片。3表示左心室，4表示右心室。
图11是表示大鼠的血液检查结果的图。图11(a)是表示对照、AoB、给予CysA的AoB以及给予11R-VIVIT的AoB的ANP的图，图11(b)是表示对照、AoB、给予CysA的AoB以及给予11R-VIVIT的AoB的BNP的图。
具体实施例方式
以下就本发明的肽化合物以及其用途进行详细说明。
本申请发明的肽化合物含有数个精氨酸连续的氨基酸序列和序列号1的氨基酸序列。
作为连续的精氨酸残基数，优选9～13个残基，最优选11个残基。当连续的精氨酸残基数在8个以下或14个以上时，本申请发明的肽化合物对细胞的导入效率有变坏的倾向。
本申请发明的肽化合物还含有NFAT的活性抑制肽VIVIT。所谓NFAT是通过钙调素(カルシニュ一リン)脱磷酸化活化的转录调节因子，形成包括NFAT1、NFAT2、NFAT3以及NFAT4等在内的家族。VIVIT是由MAGPHPVIVITGPHEE(序列号1)表示的氨基酸序列构成的肽。VIVIT不影响钙调素的磷酸酶活性，而是有选择地抑制属于NFAT家族的蛋白质和钙调素的相互作用(Aramburu，J.等人、Science、第285卷、2129～2133页、1999年)。在序列号1所示的氨基酸序列中，各氨基酸残基只要是抑制NFAT的，也可以取代为生物学同等的氨基酸序列，只要是具有与VIVIT同等生物学活性的，也可以付加、缺失数个氨基酸残基。
另外，本发明的肽化合物只要是具有同等生物学活性的，除了上述的数个精氨酸连续的氨基酸序列和序列号1的氨基酸序列以外，也可以付加、缺失或取代数个氨基酸残基。
另外，本发明的肽化合物也可以含有用于确认被导入细胞内事实的标记物。标记物没有特别限定，例如可以使用异硫氰酸酯荧光素(以下略称为FITC)、GFP以及罗丹明等。
本发明的肽化合物可以通过通常的人工合成法、或通过一般销售的人工合成仪制造。或者，使用基因工程手法也可以制造本发明的肽化合物。例如，制作插入了编码含有由数个精氨酸连续的序列和VIVIT构成的序列的肽序列的DNA的重组载体，将重组载体导入适当的宿主细胞后，对该宿主细胞进行培养。然后通过回收培养物，可以得到本发明的肽化合物。制造本发明的肽化合物后，得到的肽化合物也可以用众所周知的方法进行纯化。这些肽化合物的制造法以及纯化法是本领域中的一般手法，同行人很容易实施。
本发明的肽化合物可以用作NFAT活性的抑制剂。NFAT活性的抑制剂可以用作起因于NFAT的活性的疾病的治疗剂。作为起因于NFAT的活性的疾病如有过敏性疾病和心肥大等。
本发明的肽化合物具有诱导免疫抑制的作用，可以用作移植时的免疫抑制剂。另外，本发明的免疫抑制剂也可以用作免疫疾病等的治疗剂。作为具体的免疫疾病，如有移植手术后的排斥反应、特应性皮炎等。
本发明的免疫抑制剂可以通过静脉内、皮下、肌肉内、经皮、直肠内等非口服途径给药。特别是，由于通过将肽化合物直接导入血流，可以防止肽化合物的分解，所以优选静脉内给药或皮下给药。
本发明的免疫抑制剂的剂型可以根据给药的方法适当设定。具体来说，如水溶液和乳液等液剂和软膏。
本发明的免疫抑制剂的有效量可以在考虑了给药方法、适用的患者的年龄、体重、病情等后进行适当设定，换算为有效成分，通常是1～10mg/kg。然而，作为有效成分的本发明的肽化合物的量可变更，并不限定于这些范围。
本发明的免疫抑制剂只要是作为有效成分含有本发明的肽化合物，没有特别限定，也可以添加适当的药学上的赋形剂、适当的载体、溶剂、凝胶形成剂、抗氧化剂、稀释剂、等渗剂、载体、pH稳定剂等在本技术领域中通常使用之外的成分。这些添加剂通常可以由同行人适当选择。
本发明的肽化合物作为心肥大抑制剂是有效的。本发明的心肥大抑制剂可以通过静脉内、皮下、经皮、直肠内等非口服途径给药。特别由于将肽化合物直接导入血流，在防止肽化合物的分解上很重要，所以优选静脉内给药。
本发明的心肥大抑制剂的剂型可以根据给药的方法适当设定。具体来说，如水溶液和乳液等液剂和软膏。
本发明的心肥大抑制剂的给药量可以根据给药方法、适用的患者的年龄、体重、病情等进行适当设定，换算为有效成分，通常是0.1～2mg/kg。然而，作为有效成分的本发明的肽化合物的量可变更，并不限定于这些范围。
本发明的心肥大抑制剂只要是作为有效成分含有本发明的肽化合物，并没有特别限定，也可以添加适当的药学上的赋形剂、适当的载体、溶剂、凝胶形成剂、抗氧化剂、稀释剂、等渗剂、载体、pH稳定剂等在本技术领域中通常使用之外的成分。这些添加剂通常可以由同行人适当选择。
以下通过实施例，对本发明的肽化合物进行更详细说明，只要是不脱离本发明的宗旨，本发明并不限定于这些实施例。
实施例1人工合成含有连续11个精氨酸残基、VIVIT和FITC的肽化合物(Sigma Genosin Japan，Inc.制造)，通过分级反相HPLC纯化该肽。以下将由连续11个精氨酸残基和付加了3个甘氨酸的VIVIT构成的肽略称为11R-VIVIT。序列号2表示11R-VIVIT的肽序列。而FITC被付加在11R-VIVIT的氨基末端。
实施例2对于6周龄的C3H/HeN小鼠H-2k(CLEA Japan，Inc.生产)，将溶解了实施例1制造的由11R-VIVIT和FITC构成的肽化合物10mg/kg量的0.5ml的林格氏溶液作为注射剂实施腹腔内注射。注射后6小时，从各个小鼠摘出脾脏、淋巴节、肝脏、肾脏和心脏，将他们在3ml的ヒストプレツプ(Fisher Scientific生产)中于-80℃下冷冻。然后，在恒冷切片机上制作10～50μm的切片，用Zeiss显微镜(Zeiss公司生产)进行分析。而作为对照，使用未处理的C3H/HEN小鼠的切片。
分析结果，在来自给予复合肽的小鼠的脾脏、淋巴节、肝脏、肾脏和心脏的切片上都可以观察到FITC的荧光。这表明通过腹腔内给药，11R-VIVIT至少被导入到了脾脏、淋巴节、肝脏、肾脏和心脏的细胞中。
实施例3IL-2基因的转录对11R-VIVIT的浓度依赖的效果的研究。
使用含有1nM、10nM、100nM或1μM的11R-VIVIT的1ml的含有10％胎牛血清RPMI(Invitorogen公司生产)，将1×105个细胞的Jurkat细胞在设定于37℃、5％二氧化碳浓度的二氧化碳培养箱(山洋电器株式会社生产)中培养1小时。然后，添加含有2μM的佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-醋酸酯(PMA)(Sigma公司生产)和40μM的离子霉素(Sigma公司生产)的100μl的RPMI，再培养12小时。然后回收细胞，使用得到的细胞，通过下面的实时定量RT-PCR(real-time quantitative RT-PCR)测定IL-2基因的转录量。在实时定量RT-PCR中，将已知的管家基因GAPDH作为内部标准物质使用。另外，将在不含有11R-VIVIT的培养基中培养的Jurkat细胞用作对照细胞，实施同样的实时定量RT-PCR。
按照程序使用RNeasy Mini试剂盒(QIAGEN生产)，从细胞中提取总RNA。使用得到的总RNA，于22℃下进行10分钟，然后于42℃下温育20分钟实施逆转录反应。
接下来使用LightCycler-FastStart DNA Master SYBR Green I试剂盒(Rhoche Molecular Biochemicals生产)，制备20μl的反应混合液(转录产物的十分之一量，4mM MgCl2、4种引物各0.5μM、2μl的10×LightCycler-FastStart DNA Master SYBR Green I)用于扩增反应。作为对于人IL-2的引物，使用竞争定量RT-PCR试剂盒(Competitive Quantitative RT-PCR Kit)(フナコシ株式会社生产)内含有的引物。作为对GAPDH的引物使用5’-CTGACCAGGGTCCTATTCCA-3’(序列号5)和5’-TGGTTATCCCAAGCAAGAGG-3’(序列号6)(都是Geneset公司生产)。扩增反应在于95℃下温育10分钟后，实施每一循环为在94℃下温育15秒钟、57℃下温育5秒钟和72℃下温育10秒钟的60次循环。然后，以0.2℃/秒间隔使温度上升至95℃。在解离曲线解析中使用LightCycler软件(Rhoche Molecular Biochemicals生产)。图1给出了作为解析结果的对得到的GAPDH的相对RNA量(n＝3)。
11R-VIVIT将IL-2基因的转录抑制到未处理时的12％。IL-2基因是在由于过敏或排斥反应使得T细胞活化时促进转录的基因。因此，该结果表明11R-VIVIT可以抑制T细胞活化。
比较例1与实施例1一样，人工合成、纯化由连续11个精氨酸残基、附加3个甘氨酸残基的VIVIT构成的肽化合物(以下略称为11R-VEET)。VEET是由MAGPPHIVEETGPHVI(序列号3)表示的氨基酸序列构成的肽。序列号4给出了11R-VEET的肽序列。以下将11R-VEET作为11R-VIVIT的阴性对照使用。
除了代替11R-VIVIT使用含有100nM的FK506(藤泽药品工业株式会社生产)或1μM的11R-VEET的培养基之外，与实施例3同样操作，培养Jurkat细胞，使用得到的细胞实施RT-PCR。结果如图1所示。
11R-VIVIT对IL-2基因的转录水平没有影响。
实施例4根据对IL-2转录的抑制活性对T细胞中11R-VIVIT的半衰期进行研究。
使用含有1μM的11R-VIVIT的1ml的含有10％胎牛血清RPMI，将1×105个细胞的Jurkat细胞在设定于37℃、5％二氧化碳浓度的二氧化碳培养箱中培养1小时。然后，在添加含有2μM PMA和40μM的离子霉素的100μl的RPMI中再继续培养12小时、17小时、23小时、35小时或59小时。另外作为对照细胞使用在不含有11R-VIVIT的10％胎牛血清RPMI中与上述一样培养1小时，在添加了含有2μM PMA和40μM的离子霉素的100μl的RPMI后再继续培养12小时、17小时、23小时、35小时或59小时的Jurkat细胞。
接下来，除了用得到的各个细胞作为样品外，其他与实施例3同样操作，通过实施RT-PCR以及实时定量RT-PCR，进行解析，测定对GAPDH的相对RNA量。结果如图2所示(n＝3)。图2所示的时间指的是培养总体时间。
11R-VIVIT的半衰期大约是30小时。添加11R-VIVIT 60小时之后看不到他的IL-2转录抑制活性。
比较例2使用含有1μM的FK506的1ml含有10％胎牛血清RPMI，将1×105个细胞的Jurkat细胞在设定于37℃、5％二氧化碳浓度的二氧化碳培养箱中培养1小时。然后，在添加含有2μM PMA和40μM的离子霉素的100μl的RPMI后再继续培养12小时、17小时、23小时、35小时或59小时。除了使用得到的培养细胞外，用与实施例3同样的方法，实施RT-PCR以及实时定量RT-PCR。从添加FK506的60小时后的相对IL-2 mRNA水平如图2所示。
FK506即使在60小时后也没有代谢，强烈抑制IL-2的转录。
实施例5通过淋巴细胞混合试验研究11R-VIVIT对T细胞的活化以及增殖的效果。
从6～8周龄的C3H/HeN小鼠和6～8周龄的BALB/c小鼠H-2d(清水实验材料株式会社生产)取出脾脏细胞。BALB/c脾脏细胞用丝裂霉素C(协和发酵工业株式会社生产)处理，用作刺激细胞。
将含有1pM、1nM或1μM的11R-VIVIT的RPMI添加到平底96孔板(イワキ株式会社生产)中。然后将上述刺激细胞和来自C3H/HeN小鼠的脾脏细胞以1∶5混合后的混合细胞添加到各个孔中(每孔5×105个)，在设定于37℃、5％二氧化碳浓度的二氧化碳培养箱中培养90小时。另外，作为对照，向只有培养基的孔中添加混合细胞，进行同样培养。
然后添加0.5Ci/孔的3H甲基胸腺嘧啶(以下略称为[3H]TdR。Amersham Pharmacia Biotech株式会社生产)，培养6小时。然后，将细胞置于直径1cm的滤纸上，通过β计数器(ベツクマン公司制)测定整合到细胞的[3H]TdR放射活性。结果如图3所示。
1μM的11R-VIVIT与对照相比，对淋巴细胞的增殖的抑制达43％。图3中，*意味着与对照相比P＜0.05，**意味着无论哪一个都是P＜0.001。
比较例3除了代替11R-VIVIT使用含有1pM、1nM或1μM的FK506或含有1μM的11R-VEET的RPMI之外，通过与实施例5同样的方法，对混合细胞进行培养，通过β计数器测定整合到细胞的[3H]TdR放射活性。结果如图3所示。
11R-VEET在1μM时对淋巴细胞的增殖没有影响。
比较例4使用不含有11R-VIVIT的RPMI作为培养基，除了代替混合细胞只使用来自C3H/HeN小鼠的脾脏细胞之外，通过与实施例5同样的方法，对细胞进行培养，添加[3H]TdR，通过β计数器测定整合到细胞的[3H]TdR放射活性。结果如图3所示。
实施例6将溶解了10mg/kg量的11R-VIVIT的0.5ml的林格氏溶液用作注射剂，研究11R-VIVIT在体内对T细胞的活性和增殖的效果进行研究。
向6周龄的C3H/Hen小鼠腹腔内注射上述注射剂，1日1次，注射2日。
从第2次注射6小时后，通过外科手术摘出脾脏。对得到的脾脏细胞(1×104个)与用丝裂霉素C处理的BALB/c小鼠的脾脏细胞(1×105个)一起添加到平底96孔板上，在设定于37℃、5％二氧化碳浓度的二氧化碳培养箱中培养90小时。培养基使用RPMI。另外，作为对照，向只有培养基的孔中添加混合细胞，进行同样培养。
然后添加0.5μCi/孔的[3H]TdR，培养6小时。接下来，将细胞置于直径1cm的滤纸上，通过β计数器测定整合到细胞的[3H]TdR放射活性。结果如图4所示。**意味着无论哪一个与对照比较都是P＜0.001。
在体内，10mg/kg的11R-VIVIT相对于对照表现出30％的抑制效果。
比较例5除了代替11R-VIVIT使用1mg/kg的FK506或10mg/kg的11R-VEET的RPMI之外，通过与实施例6同样的方法，对C3H/Hen小鼠实施腹腔内注射，取出脾脏细胞进行培养，添加[3H]TdR，通过β计数器测定整合到细胞的[3H]TdR放射活性。结果如图4所示。
11R-VEET在1μM时对淋巴细胞的增殖没有影响。
比较例6使用不含有11R-VIVIT的RPMI作为培养基，除了代替混合细胞只使用来自C3H/HeN小鼠的脾脏细胞之外，通过与实施例6同样的方法，对细胞进行培养，添加[3H]TdR，通过β计数器测定整合到细胞的[3H]TdR放射活性。结果如图4所示。
实施例7将溶解了10mg/kg量的11R-VIVIT的0.5ml的林格氏溶液用作注射剂，对11R-VIVIT在β细胞的移植中的效果进行研究。移植时，作为施主使用6周龄的BALB/c小鼠，作为接受者用6周龄的C3H/HeN小鼠。
对于C3H/HeN小鼠，通过腹腔内注射一次220mg/kg的链脲霉素(シグマ-アルドリツチ日本株式会社)，制作糖尿病模型小鼠。注射链脲霉素6日后，将葡萄糖值超过350mg/dl的小鼠判断为是高血糖症。
另外，取出BALB/c小鼠的胰脏，实施不连续ficoll密度梯度离心后，通过通常的胶原酶消化分离β细胞。
将分离的约500个β细胞移植到上述糖尿病模型小鼠的左肾的被膜下。移植后，每日一次，向小鼠腹腔内注射10mg/kg的11R-VIVIT(n＝6)。作为对照向移植了β细胞的小鼠注射不含有11R-VIVIT的生理盐水(n＝4)。测定血糖，当该值2天内连续超过200mg/dl时作为移植组织排斥。图5是表示用卡普兰-迈耶存活曲线(法)进行评价的结果。
通过给予11R-VIVIT，与对照相比，存活率显著地上升(P＜0.005)。
比较例7除了代替11R-VIVIT使用10mg/kg的11R-VEET之外，通过与实施例7同样的方法，研究11R-VEET对β细胞移植的效果。结果如图5所示。
11R-VEET与对照一样对移植组织的存活没有任何影响。
实施例8使用实施例1中给予11R-VIVIT的小鼠，对移植的β细胞的功能进行研究。
通过外科手术摘出β细胞移植50天后的肾脏。然后使用冷冻ミトクロ-ム(カ-ルツアイス公司生产)，制作30μm的肾脏切片。然后对得到的切片，用针对胰岛素的多克隆抗体(サンタクル-ズ公司生产)和抗生物素蛋白、生物素过氧化物酶法(ベクタ-公司生产)实施免疫染色。
图6给出了免疫染色的结果。在图6中，1是被移植的β细胞个数，2是接受者的肾脏。移植的β细胞由于被胰岛素抗体染色，所以确认移植细胞产生胰岛素。
实施例911R-VIVIT对βTC6细胞的胰岛素分泌的效果的研究。βTC6细胞是通过葡萄糖应答性分泌胰岛素的胰岛的细胞系。
将βTC6细胞(American Type Culture collection，CRL-11506)接种到96孔板(5×104个细胞/孔)，使用含有10、100、1000或10000nM的11R-VIVIT的1ml的含有10％胎牛血清RPMI，在设定于37℃、5％二氧化碳浓度的二氧化碳培养箱中培养96小时。培养基每隔24小时与含有11R-VIVIT的新鲜培养基交换。96小时后，换成新鲜培养基后再培养1小时，回收培养上清。作为对照除了使用不含有11R-VIVIT的培养基之外，同样对βTC6细胞进行培养。
然后用回收的培养上清，按照使用程序使用小鼠胰岛素ELISA(TMB)试剂盒(シバヤギ生产)，对分泌的胰岛素进行分析。图7(a)以相对于对照的相对值给出了用11R-VIVIT处理的细胞产生的胰岛素分泌量。
βTC6细胞的胰岛素分泌量在11R-VIVIT处于0～1μM的范围内几乎与对照相同，在10μM时为对照的71％(P＝0.042)。
比较例8除了代替11R-VIVIT，使用含有1、10、100或1000nM的FK506，或者含有10、100、1000或10000nM的11R-VEET的完全培养基之外，通过与实施例9同样的方法，对βTC6细胞进行培养，对βTC6细胞产生的胰岛素分泌的效果进行研究。图7(b)和图7(c)给出了研究的结果。
βTC6细胞的分泌胰岛素由于FK506的作用而显著减少，但11R-VEET没有影响。
实施例1011R-VIVIT对βTC6细胞的增殖的效果的研究。
将βTC6细胞接种到96孔板(5×104个细胞/孔)，使用含有10、100、1000或10000nM的11R-VIVIT的完全培养基，在设定于37℃、5％二氧化碳浓度的二氧化碳培养箱中培养88小时。培养基每隔24小时与含有11R-VIVIT的新鲜培养基交换。然后添加1μCi/孔的[3H]TdR，再培养8小时。作为对照除了使用不含有11R-VIVIT的培养基之外，同样对βTC6细胞进行培养。然后，将细胞置于直径1cm的滤纸上，通过β计数器测定整合到细胞中的[3H]TdR放射活性。图8(a)以相对于对照的相对值给出了用11R-VIVIT处理的细胞的增殖的状况。
关于βTC6细胞的增殖，当11R-VIVIT处于0～1μM范围内几乎与对照相同，在10μM时为对照的73％(P＝0.075)。
比较例9除了取代11R-VIVIT使用含有1、10、100、或1000nM的FK506，或者含有10、100、1000或10000nM的11R-VEET的完全培养基之外，通过与实施例10同样的方法，对βTC6细胞进行培养，对βTC6细胞增殖的效果进行研究。图8(b)和图8(c)给出了研究的结果。
FK506和11R-VEET对βTC6细胞的的增殖没有表现出抑制效果。
实施例1111R-VIVIT对心肥大的效果的研究。
对于心肥大模型大鼠，将溶解了1.5mg/kg量的11R-VIVIT的0.5ml的林格氏溶液隔日进行皮下注射(n＝6)。而心肥大模型大鼠是通过对体重200～250g的7周龄的雄性Wister大鼠(清水实验材料株式会社生产)的大动脉结扎的心脏加负荷制作的。在本说明书中，将心肥大模型大鼠略称为AoB。
然后，用以下的方法于0、1、2、3、4以及5周后对大鼠的心脏进行评价。而作为对照使用没有给予11R-VIVIT的正常大鼠。
对于对照和给予11R-VIVIT的AoB，象以下那样实施超声波回声检查(ULC)、组织标本制作和血液检查。
ULC通过对大鼠的心室中隔和左室全壁的厚度进行超声波回声(日立株式会社生产)，用小孩用探针进行解析。结果如图9(a)和图9(b)所示。结果确认通过给予11R-VIVIT，AoB中的心室中隔和左室全壁的厚度都有改善。
组织标本通过用外科手术摘出大鼠的心脏，用冷冻ミクロト一ム制作5μm的切片，用苏木精曙红对得到的切片进行染色制作。得到的组织标本用显微镜观察(图10(d))。在图10中3表示左心室，4表示右心室。该结果确认给予11R-VIVIT症状可以改善到接近正常的状态。
心房性钠利尿肽(ANP)和B型钠利尿肽(BNP)的测定借助于日本エスア-ルエル株式会社。结果如图11(a)和图11(b)所示。该结果确认给予11R-VIVIT，AoB中的ANP和BNP的值都被改善了。
比较例10除了使用没有给予11R-VIVIT的AoB之外，与实施例11同样，实施ULC的测定、组织标本的制作和血液检查。结果如图9(a)、图9(b)、图10(b)、图11(a)和图11(b)所示。
比较例11除了代替11R-VIVIT使用5mg/kg的CysA之外，与实施例11同样，研究CysA对心肥大的效果。结果如图9(a)、图9(b)、图10(c)、图11(a)和图11(b)所示。
试验例1使用给予11R-VIVIT的AoB研究11R-VIVIT对肝功能和肾功能的毒性。
将溶解了1.5mg/kg量的11R-VIVIT的0.5ml的林格氏溶液隔日对AoB进行皮下注射4周(n＝6)。得到的AoB借助于日本エスア-ルエル株式会社进行以下测定。
作为肝功能检查测定谷草转氨酶(GOT)和谷丙转氨酶(GPT)，作为肾功能检查测定肌酸酐(Cr)和尿素氮(BUN)。而作为对照使用没有给予11R-VIVIT的正常大鼠和AoB。结果如表1所示。
表1
测定结果表明本发明的肽化合物不会影响肝脏和肾脏的功能。
产业上利用的可能性本发明的肽化合物可以用作副作用极少的起因于NFTA的活性的疾病的治疗剂。具体来说，例如，由于可作为免疫抑制剂和心肥大抑制剂使用，所以非常有用。
序列表自由文字说明序列号2融合肽序列序列号4融合肽序列序列表<110>日本科学技术公司<110>松井秀树<110>松下正之<120>膜透过型NFAT抑制肽<130>FP-8321PCT<160>6<210>1<211>16<212>PRT<213>人<400>1Met Ala Gly Pro His Pro Val Ile Val Ile Thr Gly Pro His Glu Glu1 5 10 15<210>2<211>30<212>PRT<213>人工序列<223>人工序列描述融合肽序列<400>2Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly Gly Gly Met Ala1 5 10 15Gly Pro His Pro Val Ile Val Ile Thr Gly Pro His Glu Glu20 25 30<210>3
<21l>16<212>PRT<213>人<400>3Met Ala Gly Pro Pro His Ile Val Glu Glu Thr Gly Pro His Val Ile1 5 10 15<210>4<211>30<212>PRT<213>人工序列<223>人工序列描述融合肽序列<400>4Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly Gly Gly Met Ala1 5 10 15Gly Pro Pro His Ile Val Glu Glu Thr Gly Pro His Val Ile20 25 30<210>5<211>20<212>DNA<213>人<400>5ctgaccaggg tcctattcca 20<210>6<211>20<212>DNA<213>人
<400>6tggttatccc aagcaagagg 20
权利要求
1.含有9个～13个精氨酸残基和序列号1的氨基酸序列的肽化合物。
2.权利要求1所述肽化合物，其中精氨酸是11个残基。
3.由权利要求1或2所述的肽化合物构成的NFAT活性化的抑制剂。
4.以权利要求1或2所述的肽化合物作为有效成分的免疫抑制剂。
5.以由权利要求1或2所述的肽化合物作为有效成分的心肥大抑制剂。
全文摘要
本发明涉及一种膜透过型NFAT抑制肽，目的在于通过对免疫疾病、心肥大或起因于NFAT的活化的疾病的患者，提供从给药到实际发挥效果的期间短、没有副作用和抗原性的肽化合物，解决了以往的问题。本发明提供含有数个连续的精氨酸和NFAT的活化抑制肽序列的膜透过型NFAT抑制肽、由该肽构成的NFAT活性的抑制剂，以及以该肽化合物作为有效成分的免疫抑制剂和心肥大抑制剂。
文档编号A61P43/00GK1639190SQ0380473
公开日2005年7月13日 申请日期2003年2月26日 优先权日2002年2月28日
发明者松井秀树, 松下正之 申请人:独立行政法人科学技术振兴机构, 松井秀树, 松下正之