Hiv抑制蛋白的制作方法

专利名称：Hiv抑制蛋白的制作方法
技术领域：
本发明涉及HIV融合抑制剂和白蛋白融合蛋白的领域。
背景技术：
背景2001年末，在美国和加拿大估计有940,000名成人和儿童患有HIV/AIDS。该区的成人患病率是0.6％，其中妇女占HIV-阳性成人的20％。在2001年间，在该区有45,000名成人和儿童新近感染了HIV(UNAIDS AIDS Epidemic Update，2001年11月)。
近几年，在发展抗逆转录病毒治疗人免疫缺陷病毒(HIV)中取得了显著的进展，主要是通过干扰病毒的逆转录过程和成熟来靶向病毒复制。然而需要新的药物种类克服药物耐受性和毒性作用，潜在的病毒储备(reservoirs)，以及抗药性的问题。需要更安全的治疗和改进的定量给药方案以促进更好的抗逆转录病毒治疗依从性。这些治疗必须有可接受的风险/收益比例，并应该能够和其他抗逆转录病毒治疗同时使用。发展药物的一种有希望的方法就是干扰HIV的进入。
HIV-1的包膜糖蛋白产生为gp160前体，该蛋白包埋于病毒颗粒核心周围的膜双层结构中。所述糖蛋白的160kDa重量的近50％由N连接的碳水化合物组成。Env在合成非共价结合的外部(exterior)gp120亚单位和跨膜gp41亚单位的过程中发生蛋白水解而裂解。所述gp120亚单位在与细胞受体的附着中起作用，并且与其受体结合时其构象会改变。gp120中的构象改变导致gp41的融合肽的暴露，它是氨基酸的疏水部分，直接介导膜融合。激发后，gp41经过巨大的构象改变，其中两条α螺旋形成卷曲的螺旋结构(coiled coils)，该结构可帮助插入融合肽并形成融合孔(fusion pore)。通过使用模拟这些螺旋的肽或用结合关键螺旋结构的小分子干扰这些构象改变被证明是有效抑制病毒进入其靶细胞的方法。(综述见Chan DC和Kim PS(1998)Cell 93681-684；Doranz BJ(2000)Emerging Therapeutic Targets 4423-437；LaBranche CC(2001)AntiviralResearch 5095-115)。Env以gpl20/gp41亚单位的三聚体形式到达细胞表面，并通过形成病毒膜和细胞膜之间的孔促进融合。
T-20也称DP-178，是保守的36个氨基酸的肽，来自gp41的C肽。它和前发夹结构中间体结合，并抑制gp41中进一步的构象改变，从而阻断病毒进入其靶细胞中(Wild CT等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.919770-9774)。已显示T-20对HIV-1的多种分化株(clades)具有活性，然而，它不抑制HIV-2或SIV。在低纳摩尔范围内(0.2-2nM)的T-20在细胞-细胞融合试验中显示抗病毒活性。T-20对应于HIV-1 gp41蛋白的氨基酸(aa)638到673(36 aa)。
T-1249是与T-20的设计相似的另一种融合抑制剂，但它对HIV-1，HIV-2，和SIV有活性，并包含增强子序列(US 6,258,782)。该增强子序列源自gp41，并据称可改善其附着的任何多肽的药代动力学特性。T-1249的长度为39个氨基酸，与T-20部分同源，但具有氨基酸交换和额外的gp41氨基酸序列，并具有治疗T-20抗性病毒的能力。此外，T-1249在灵长类动物中的半衰期比T-20长(AUC延长两倍)，从而可每日一次定量给药(once-daily dosing)。
5-螺旋(5-Helix)来自HIV-1的gp41中的氨基酸位置558到678，所含6个螺旋中的5个(三个N-和两个C-螺旋)形成gp41发夹三聚体结构的核心，所述结构由短肽接头连接。第三个C多肽的缺口形成与gp41的羧基末端区结合的位点。如果在形成发夹三聚体之前能够接近(至少是瞬间地)该区，预期5-螺旋的结合能够防止与融合事件相关的构象改变，从而防止细胞受到感染(Root MJ(2001)Science 291884-888)。
5-螺旋是通过细菌表达产生的，并且在体外的生理条件下是稳定的，病毒感染性和细胞-细胞融合试验发现，该结构显示可有力地抑制纳摩尔范围的HIV-1膜融合。由此可推论，C-肽的结合是5-螺旋的抗病毒活性的关键决定因素。5-螺旋可抑制HIV-1的A，B和D型分化株的分离物(isolates)的感染，证实了gp41发夹三聚体内N和C末端区之间的保守界面。
Cyanovirin-N是一种自Nostoc ellipsosporum分离的小蛋白，它与gpl20上的糖结构结合(Boyd等(1997)Antimicrob.Agents Chemother.411521-1530；Gustafson等(1997)Biochem.Biophys.Res.Comm.238223-228)。
已对T-20和T-1249进行了临床试验。对于T-20，采用的常用剂量为50mg，每天两次。测定的血浆半衰期约为1.8小时。灵长类动物中T-1249的半衰期比T-20长(AUC增加了两倍)。
长期和短期使用HAART的预期持续时间和由于抗药性造成治疗失败的增加表明，的确需要包括进入(entry)抑制剂在内的多种创新性抗逆转录治疗。HIV融合抑制剂，例如T-20和T-1249，提供了除传统的蛋白酶和逆转录酶抑制剂以外的新的治疗原则。白蛋白融合技术如果能够显著延长血浆半衰期和生物利用度，可每周给药一次并显著增加肠外HIV药物作为一线治疗的可接受性。例如T-20和T-1249白蛋白融合物的产品，由于其改善了副作用的情况可以改善某些病人对治疗方案的耐受性。诸如T-20和T-1249的肽是疏水性的，它们与白蛋白融合改善了其可溶性，从而也提高了生物利用度并可配成更高浓度的配制剂。

发明内容
本发明涉及一种蛋白质，它包含HIV融合抑制肽(包括，但不限于，与HIV env蛋白结合的肽或者来自HIV env蛋白的肽)，所述肽与白蛋白或其片段或变体融合。在本发明中这些融合蛋白统称“本发明的蛋白融合蛋白”。本发明的这些融合蛋白显示延长的体内半衰期和/或延长的活性或治疗活性。
本发明包括治疗性白蛋白融合蛋白，组合物，药物组合物，配制剂和试剂盒。本发明还包括编码本发明的白蛋白融合蛋白的核酸分子，以及包含这些核酸分子的载体，用这些核酸分子和载体转化的宿主细胞，以及利用这些核酸，载体和/或宿主细胞制备本发明的白蛋白融合蛋白的方法。
本发明还涉及抑制HIV诱导的细胞融合的组合物和方法。本发明还涉及抑制HIV传染到未被感染的细胞和用于预防和/或治疗HIV相关疾病的组合物和方法。
附图简述

图1.N-末端T-1249-(GGS)4GG-白蛋白融合物(fusion)开放阅读框架的DNA序列。(该DNA序列编码初级(primary)翻译产物并因此，最开始的72个核苷酸编码24个氨基酸的前导序列，在本发明的实施例中，该序列在酵母菌的分泌过程中被去除)。
图2.N-末端T-1249-(GGS)4GG-白蛋白融合蛋白的氨基酸序列。(该氨基酸序列代表图1显示的DNA序列的初级翻译产物，并因此包含在酵母菌分泌过程中被去除的24个氨基酸的前导序列。因此，该蛋白序列不代表用于本发明的病毒抑制实施例中的蛋白序列)。
图3.C-末端白蛋白-(GGS)4GG-T-1249融合物开放阅读框架的DNA序列。(该DNA编码初级翻译产物，并因此最开始的72个核苷酸编码一个24个氨基酸的前导序列，在本发明的实施例中，该序列在自酵母菌的分泌中被去除)。
图4.C-末端白蛋白-(GGS)4GG-T-1249融合蛋白的氨基酸序列。(该氨基酸序列代表图3显示的DNA序列的初级翻译产物，并因此包含在酵母分泌中被去除的24个氨基酸的前导序列。因此，该蛋白序列不代表用于本发明的病毒抑制实施例中的蛋白序列)。
图5.N-末端T-20-(GGS)4GG-白蛋白融合物开放阅读框架的DNA序列。(该DNA编码初级翻译产物，并因此最开始的72个核苷酸编码一个24个氨基酸的前导序列，在本发明的实施例中，该序列在自酵母菌的分泌中被去除)。
图6.N-末端T-20-(GGS)4GG-白蛋白融合蛋白的氨基酸序列。(该氨基酸序列代表图5显示的DNA序列的初级翻译产物，并因此包含在酵母菌分泌过程中被去除的24个氨基酸的前导序列。因此，该蛋白序列不代表用于本发明的病毒抑制实施例中的蛋白序列)。
图7.C-末端白蛋白-(GGS)4GG-T-20融合物开放阅读框架的DNA序列。(该DNA编码初级翻译产物，并因此最开始的72核苷酸编码一个24个氨基酸的前导序列，在本发明的实施例中，该序列在自酵母菌的分泌中被去除)。
图8.C-末端白蛋白-(GGS)4GG-T-20融合蛋白的氨基酸序列。(该氨基酸序列代表图7显示的DNA序列的初级翻译产物，并因此包含在酵母菌分泌过程中被去除的24个氨基酸的前导序列。因此，该蛋白序列不代表用于本发明的病毒抑制实施例中的蛋白序列)。
图9.使用4-12％的梯度SDS非还原胶对T-20白蛋白融合物进行电泳(A)胶体蓝(Colloidal Blue)胶体；(B)抗-HSA Western蛋白印迹。
图10.细胞-细胞融合试验中T-20白蛋白融合物的抗病毒活性，所述活性有赖于在pmt1基因缺陷的酵母菌菌株中的表达。PMT1，野生型；pmt1，缺陷型。
图11.使用4-12％的梯度SDS非还原胶对C末端T-1249白蛋白融合物进行电泳(A)胶体蓝胶体；(B)抗-HSA Western蛋白印迹图12.C-末端T-1249白蛋白融合蛋白的抗病毒活性。
图13.C-末端T-20白蛋白融合蛋白的药代动力学研究结果。
图14(A-D)成熟形式的人白蛋白(SEQ ID NO18)的氨基酸序列和编码它的多核苷酸(SEQ ID NO17)。
发明详述本发明涉及一种融合蛋白，它包含与HIV融合抑制肽偶联的白蛋白。这类肽包括，但不限于，与HIV env蛋白结合的肽或来源于HIV env蛋白的肽，包括与HIV gp41结合的肽或来源于HIV gp41的肽。这些肽包括T-20，T-1249，5-螺旋或cyanovirin-N，或其片段或其变体，所述肽都具有HIV融合抑制特性。
本文术语“蛋白”和“肽”是非限制性的并且包括蛋白和多肽以及肽。
本发明还涉及双功能(或多功能)融合蛋白，其中的白蛋白与两种(或多种)HIV融合抑制肽偶联，所述的HIV融合抑制肽可选地为不同的HIV融合抑制肽。与只包含一种类型的HIV融合抑制肽的白蛋白融合蛋白相比，预期这类具有不同的HIV融合抑制肽的双功能(或多功能)融合蛋白具有改善的抗药性情况，这是由于抗药性突变HIV菌株的产生可能被显著推迟。与只包含一种类型的HIV融合抑制肽的白蛋白融合蛋白相比，这种双功能(或多功能)融合蛋白也可以显示协同的抗-HIV效果(尽管注意到5-螺旋和C-肽显示互相拮抗)。
本发明还涉及一种融合蛋白，其中一种(或多种)HIV融合抑制肽或其片段或其变体与两种白蛋白分子或其片段或其变体偶联，所述HIV融合抑制肽可选为不同的HIV融合抑制肽，所述白蛋白分子可以是相同的或不同的。
此外，化学成分(Chemical entity)可以通过共价的方式附着于本发明的融合蛋白上，或联合使用所述化学成分与本发明的融合蛋白，以增强生物活性或调节生物活性。
预期本发明的白蛋白融合蛋白可延长HIV融合抑制肽的体内半衰期。延长所述白蛋白融合肽的体外或体内半衰期到超过未连接白蛋白的肽的半衰期的2倍，5倍或更多倍。此外，至少部分由于所述肽半衰期的延长，预期本发明的白蛋白融合蛋白会降低定量给药该治疗性肽的频率。所述定量给药频率比未连接白蛋白的治疗性肽的定量给药频率减少了至少四分之一，或减少了至少二分之一或更多。
本发明的白蛋白融合蛋白在体内和/或体外延长肽的半衰期，和/或稳定该肽和/或其在溶液中(或在药物组合物中)的活性。这些白蛋白融合蛋白可以作为治疗剂，预期可减小使用大量过量载体蛋白(例如白蛋白，非融合的)来配置蛋白溶液的需要，从而防止由于例如非特异性结合等的因素而丢失蛋白。
本发明还包括编码该白蛋白融合蛋白的核酸分子，以及含有这些核酸的载体，由这些核酸载体转化的宿主细胞，以及使用这些核酸，载体和/或宿主细胞制备本发明的白蛋白融合蛋白的方法。本发明进一步包括转基因有机体，这些有机体经修饰从而包含本发明的核酸分子，可选地经修饰可表达由所述核酸分子编码的白蛋白融合蛋白。
本发明还包含一种药物配制剂，该配制剂包含本发明的白蛋白融合蛋白和可药用的稀释剂或载体。这种配制剂可以在试剂盒或容器中。这样的试剂盒或容器可以和如何延长蛋白的半衰期的说明书包装在一起。这种配制剂可用于预防，治疗，改善或诊断例如哺乳动物或人的患者体内的HIV感染或HIV相关疾病，疾病的症状或相关的疾病，该方法包括将药物配制剂给药患者的步骤。
本发明进一步包含有效最小化与用适度较高浓度的HIV融合抑制肽治疗哺乳动物相关的副作用(例如注射位点反应，头痛，恶心，发热，能量水平增加，皮疹，衰弱，腹泻，眩晕，过敏性反应，中性粒细胞水平异常降低)的方法，所述方法包括将本发明的白蛋白融合HIV融合抑制肽给药所述哺乳动物。
本发明包含预防，治疗或改善HIV感染和/或由于HIV感染造成的疾病或病症的方法，包括将包含HIV融合抑制肽(或其片段或其变体)的本发明的白蛋白融合蛋白以能有效治疗，预防或缓解所述疾病或病症的量给药哺乳动物，在该动物中这种预防，治疗，或者改善是其所需要的。在本发明中，诸如T-20和/或T1249等的HIV融合抑制肽也被称作“治疗性蛋白”。
本发明包括的白蛋白融合蛋白含有T-20和/或T-1249肽或T-20和/或T-1249的单体(包括其片段或其变体)的多重拷贝，它们与白蛋白或白蛋白(包括其片段或其变体)的多重拷贝融合。
本发明还包括延长哺乳动物体内HIV T-20和/或T-1249肽的半衰期的方法。所述方法将HIV T-20和/或T-1249肽与白蛋白连接，形成白蛋白融合的HIV T-20和/或T-1249肽，并将该白蛋白融合的HIV T-20和/或T-1249肽给药哺乳动物。具体地，所述白蛋白融合的HIV T-20和/或T-1249肽的半衰期可被延长到超过缺乏该连接的白蛋白的HIV T-20和/或T-1249肽的半衰期的至少2倍，5倍，10倍，20倍，30倍，40倍或至少50倍。
本文举例说明的是显示抗病毒活性的融合蛋白，它包含与T-20和/或T-1249融合的白蛋白。这样的抗病毒活性包括，但不限于，抑制HIV传染到未被感染的CD-4+细胞。此外，本发明还涉及使用这种包含与T-20和/或T-1249融合的白蛋白的融合蛋白抑制人或非人逆转录病毒，尤其是HIV传染到未被感染的细胞的抑制剂。
本发明还包括与现有技术相比的改良的生产治疗性成分(therapeuticmoiety)的方法。例如，本发明提供了与现有技术中复杂的化学合成方法相比增强的生产具有活性成分T-20或T-1249的蛋白的方法。(见，例如SCRIPMagazine，September2002，7-10页和WO 99/48513″Methods and Compositionsfor Peptide Synthesis″)。
下文详细讨论了本发明的各方面。
T-20T-20(也称为DP-178)是一种肽，其氨基酸序列为YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF(SEQ ID NO1)，相应于HIV-1LAI分离株(isolate)的跨膜蛋白gp41的氨基酸残基638到673。用于本发明的T-20肽包括其片段或其变体，例如可以是天然存在的HIV T-20肽的任何类似物，同源物，片段或衍生物的分子，例如美国专利6,133,418和WO 94/28920所述的以及表1列出的对比文件中的那些分子，上述对比文件的具体内容包含在此作为参考。用于本发明的HIV T-20肽只需具有SEQ ID NO1的HIVT-20肽的单一生物活性。
用于本发明的T-20肽显示抗病毒活性，并可以进一步具有其它有利特征，例如增加的生物利用度，和/或稳定性，或降低的宿主免疫识别。
当T-20(或其片段或其变体)在能够进行O-糖基化的酵母菌中表达时，任何丝氨酸或苏氨酸都可被修饰，或降低其数量以最小化O-糖基化的效应或降低T-20(或其片段或其变体)的生物活性。可选地，或此外，可使用糖基化不足(underglycosylates)(即O-糖基化缺陷)的酵母菌。
T-1249T-1249的氨基酸序列是WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF(SEQ ID NO2)。见例如美国专利6,258,782和WO 99/59615。使用本领域已知的技术可以鉴定用于本发明的白蛋白融合蛋白的T-1249活性片段及其变体，包括在专利文件和表1中列出的对比文件中描述的那些技术，所述对比文件包含在文中作为参考。
5-螺旋5-螺旋是一种设计的蛋白，其中用短的Gly/Ser肽序列交替连接(N-C-N-C-N)三个N-肽片段(N40)和两个C-肽片段(C38)。以单字母氨基酸密码表示的各部分的序列是N40，QLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILA(SEQ ID NO3)；C38，HTTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQ-NQQEKNEQELLE(SEQ ID NO4)；N至C接头，GGSGG(SEQ ID NO5)；和C至N接头，GSSGG(SEQ IDNO6)(Root等)。用专利文件和表1中列出的对比文件中描述的技术可鉴定用于本发明白蛋白融合蛋白的5-螺旋的活性片段及其变体，所述对比文件包含在文中作为参考。
Cvanovirin-NCyanovirin-N的氨基酸序列是LGKFSQTCYNSAIQGSVLTSTCERTNGGYNTSSIDLNSVIENVDGSLKWQPSNFIE TCRNTQLAGSSELAAECKTRAQQFVSTKINLDDHIANIDGTLKYE(SEQ ID NO7)(Gustafson等)。用专利文件和表1中列出的对比文件中描述的技术可鉴定用于本发明白蛋白融合蛋白的Cyanovirin-N的活性片段及其变体，所述对比文件包含在文中作为参考。
白蛋白术语人血清白蛋白(HAS)和人白蛋白(HA)在本文中可互换使用。术语“白蛋白”和“血清白蛋白”更广泛，并包含人血清白蛋白(及其片段和变体)以及来自其它物种的白蛋白(及其片段和变体)。
本文中的“白蛋白”指为白蛋白的蛋白(albumin protein)或氨基酸序列，或具有一种或多种白蛋白功能活性(例如生物活性)的白蛋白片段或变体的统称。具体地，“白蛋白”指人白蛋白或其片段(见EP201 239，EP 322 094 WO97/24445，WO95/23857)，具体为图14和本文的SEQ ID NO18中，图15和美国临时申请60/355,547中的SEQ ID NO18和WO01/79480中显示的成熟形式的人白蛋白，或者来自其它脊椎动物的白蛋白或其片段，或者这些分子的类似物或其变体或其片段。
用于本发明的白蛋白融合蛋白的人血清白蛋白含有以下一组或两组点突变SEQ ID NO18Leu-407到Ala，Leu-408到Val，Val-409到Ala，和Arg-410到Ala的点突变；或Arg-410到Ala，Lys-413到Gln，和Lys-414到Gln的点突变(见例如，国际公开WO95/23857，包含于文中作为参考)。在其他实施方案中，包含一组或所有两组上述点突变的本发明的白蛋白具有改进的对酵母菌Yap3p的蛋白裂解的稳定性/抵抗力，使得酵母菌宿主细胞表达的重组白蛋白融合蛋白的产生增加。
文中足以延长治疗性蛋白的体内半衰期，治疗活性，或保质期(shelf-life)的白蛋白的一部分指如下的一部分它的长度或结构足以使得与非融合状态的治疗性蛋白的体内半衰期，治疗活性或保质期相比，所述白蛋白融合蛋白的治疗蛋白部分的体内半衰期，治疗活性或保质期得以稳定，延时(prolong)或延长(extend)。白蛋白融合蛋白的白蛋白部分可以包含上述HA序列的全长，或者可以包括HA序列的一个或多个片段，所述片段能够稳定或延长该蛋白的治疗活性。这种片段的长度可以是10个或更多个氨基酸，或者可以包括来自HA序列的约15，20，25，30，50或更多个连续的氨基酸，或者可以包括HA的部分或所有特定结构域。
本发明的白蛋白融合蛋白的白蛋白部分可以是正常HA的变体。本发明白蛋白融合蛋白的治疗性蛋白部分也可以是本文所述治疗性蛋白的变体。术语“变体”包括保守或非保守的插入，缺失和取代，其中这些变化基本上不改变白蛋白的一种或多种抗肿瘤(oncotic)特性，有用的配体结合特性和非免疫源特性，或者基本上不改变赋予所述治疗性蛋白的治疗活性的活性位点或活性结构域。
具体地，本发明的白蛋白融合蛋白可以包括人白蛋白天然存在的多态性变体，和人白蛋白的片段，例如EP 322 094公开的那些片段(即HA(Pn)，其中n是369到419)。所述白蛋白可以来自任何脊椎动物，特别是任何哺乳动物，例如人，母牛，绵羊或猪。非哺乳动物白蛋白包括，但不限于，母鸡和鲑鱼。白蛋白融合蛋白的白蛋白部分与治疗性蛋白部分可能来自不同的动物。
通常，HA片段或变体的长度至少为100个氨基酸，可选至少长150个氨基酸。所述HA变体可能由至少一个完整的HA结构域组成或可选地包含至少一个完整的HA结构域，所述结构域例如结构域1(SEQ ID NO18的氨基酸1-194)，2(SEQ ID NO18的氨基酸195-387)，3(SEQ ID NO18的氨基酸388-585)，1+2(SEQ ID NO18的1-387)，2+3(SEQ IDN018的195-585)或1+3(SEQ ID NO18的氨基酸1-194+SEQ ID NO18的氨基酸388-585)。每个结构域本身由两个同源的亚结构域组成，即1-105，120-194，195-291，316-387，388-491和512-585，所述亚结构域之间具有可弯曲的亚结构域间接头区，所述接头区包括残基Lys106到Glu119，Glu292到Val315和Glu492到Ala511。
本发明的白蛋白融合蛋白的白蛋白部分可以包括至少一个HA的亚结构域或结构域或其保守性修饰物。如果融合是基于亚结构域的，一些或所有相邻的接头都可选地用来连接所述治疗性蛋白部分。
白蛋白融合蛋白本发明总体上涉及白蛋白融合蛋白以及治疗，预防，或改善疾病或病症的方法。本文的“白蛋白融合蛋白”指通过至少一个白蛋白分子(或其片段或其变体)与至少一个治疗性蛋白分子(或其片段或其变体)的融合形成的蛋白。本发明的白蛋白融合蛋白包括至少一种治疗性蛋白的片段或变体以及至少一种人血清白蛋白的片段或变体，例如通过彼此的基因融合使它们相互连接(即通过核酸的翻译产生白蛋白融合蛋白，其中所述核酸中，编码所有或一部分治疗性蛋白的多核苷酸与编码所有或一部分白蛋白的多核苷酸在阅读框内相连接)。所述治疗性蛋白和白蛋白蛋白，一旦成为白蛋白融合蛋白的一部分，就可称为该白蛋白融合蛋白的“一部分(portion)”，“一个区(region)”或“一个成分(moiety)”。
在一个实施方案中，本发明提供的一种白蛋白融合蛋白包括一种治疗性蛋白和一种血清白蛋白，或可选地由上述两种蛋白组成。在另一个实施方案中，本发明提供的白蛋白融合蛋白包括一种具有生物活性的和/或治疗活性的治疗性蛋白的片段和一种血清白蛋白，或可选地由上述两种蛋白组成。在其他实施方案中，本发明提供的白蛋白融合蛋白包括一种具有生物活性和/或治疗活性的治疗性蛋白的变体，和一种血清白蛋白，或可选地由上述两种蛋白组成。在其他实施方案中，白蛋白融合蛋白的血清白蛋白组分是血清白蛋白的成熟部分。
在其他实施方案中，本发明提供的白蛋白包括一种治疗性蛋白和一种有生物活性和/或治疗活性的血清白蛋白片段，或可选地由上述两种蛋白组成。在进一步的实施方案中，本发明提供的白蛋白包括一种治疗性蛋白和一种有生物活性和/或治疗活性的血清白蛋白变体，或可选地由上述两种蛋白组成。在一些实施方案中，白蛋白融合蛋白的治疗性蛋白部分是治疗性蛋白的成熟部分。
在其他实施方案中，本发明提供的白蛋白包括一种有生物活性和/或治疗活性的治疗性蛋白的片段或变体和一种有生物活性和/或治疗活性的血清白蛋白片段或变体，或可选地由上述两种蛋白组成。在一些实施方案中，本发明提供的白蛋白包括一种治疗性蛋白的成熟部分和一种血清白蛋白的成熟部分，或可选地由上述两种蛋白组成。
在一个实施方案中，所述白蛋白融合蛋白包含N末端部分的HA，C末端部分的治疗性蛋白。可选地，也可使用包含C末端部分的HA，N末端部分的治疗性蛋白的白蛋白融合蛋白。
在另一实施方案中，所述白蛋白融合蛋白中的治疗性蛋白融合于白蛋白的N末端和C末端。在一个实施方案中，该在N和C末段融合的治疗性蛋白是同一种治疗性蛋白。在另一实施方案中，在N和C末段融合的治疗性蛋白是不同的治疗性蛋白。在另一实施方案中，在N和C末段融合的治疗性蛋白是不同的治疗性蛋白，所述治疗性蛋白可用来治疗或预防同一种疾病，病症或病情。在另一实施方案中，在N和C末段融合的治疗性蛋白是不同的治疗性蛋白，所述治疗性蛋白可用来治疗或预防已知通常同时出现在病人中的疾病或病症。
除了其中的白蛋白部分与治疗性蛋白部分的N末段和/或C末段融合的融合蛋白，本发明的白蛋白融合蛋白还可通过将治疗性蛋白或目的肽插入HA的内部区产生。例如，在HA分子的蛋白序列内的α-螺旋的终点和起点之间，存在许多环(loops)和转弯(turn)结构，这些结构是通过二硫键稳定的。HA分子的晶体结构分析(PDB鉴定子(identifiers)1A06，1BJ5，1BKE，1BMO，1E7E至1E7I和1UOR)发现所述环的绝大部分都伸展到HA分子体以外。这些环可用于有治疗活性的肽或治疗性蛋白的插入，或内部融合以实质上产生出具有特定生物活性的白蛋白分子，所述治疗活性肽尤其指那些需要二级结构有功能的肽。
所述肽或多肽可插入人白蛋白中的环，从而产生出本发明的白蛋白融合蛋白，所述环包括Val54-Asn61，Thr76-Asp89，Ala92-Glu100，Gln170-Ala176，His247-Glu252，Glu266-Glu277，Glu280-His288，Ala362-Glu368，Lys439-Pro447，Val462-Lys475，Thr478-Pro486，和Lys560-Thr566。在其他实施方案中，肽或多肽被插入成熟人白蛋白(SEQ IDNO18)中的Val54-Asn61，Gln170-Ala176，和/或Lys560-Thr566环。
被插入的肽可以是源自噬菌体展示或合成肽文库中筛选出来的具有特定生物活性的肽或者来自具有所需功能的分子的活性部分。此外，可以在特定的环内或通过将随机肽插入HA分子的特定环内产生随机肽文库，在该文库中展示了所有可能的氨基酸组合。
通过以下方法中的一种可以在HA或HA结构域片段的基础上产生这样的文库。
(a)对HA或HA结构域片段的一种或多种肽环内的氨基酸进行随机突变。可以用这种方式使环内的一个，多个或所有残基突变。
(b)用长度为Xn的随机肽取代或插入HA或HA结构域片段的一种或多种环(即，内部融合)，其中X是氨基酸而n是残基的数目；(c)除(a)和/或(b)的N-，C-或N-和C-末端肽/蛋白融合。
通过将针对不同靶点的不同环的不同筛选所得的肽移植到相同的HA或HA结构域片段中，也可以制备所述HA或HA结构域片段。
插入人血清白蛋白的环中的肽是治疗性蛋白肽或其肽片段或其肽变体。例如，插入人血清白蛋白的环内的肽可以包括T-20和/或T-1249肽或其肽片段或其肽变体。更具体地，本发明包括的白蛋白融合蛋白包括长度为至少7，至少8，至少9，至少10，至少11，至少12，至少13，至少14，至少15，至少20，至少25，至少30，至少35，或至少40个氨基酸的肽片段或肽变体，所述肽片段或肽变体插入到人血清白蛋白的环内。本发明包括的白蛋白融合蛋白还包括长度为至少7，至少8，至少9，至少10，至少11，至少12，至少13，至少14，至少15，至少20，至少25，至少30，至少35，或至少40个氨基酸的肽片段或肽变体，所述肽片段或肽变体融合于人血清白蛋白的N末端。本发明包括的白蛋白融合蛋白包括长度为至少7，至少8，至少9，至少10，至少11，至少12，至少13，至少14，至少15，至少20，至少25，至少30，至少35，或至少40个氨基酸的肽片段或肽变体，所述肽片段或肽变体融合于人血清白蛋白的C末端。
通常，本发明的白蛋白融合蛋白可以具有一个源自HA的区和一个源自治疗性蛋白的区。然而，可利用每种蛋白的多个区制备本发明的白蛋白融合蛋白。类似地，一种或一种以上的治疗性蛋白可以用来制备本发明的白蛋白融合蛋白。例如，治疗性蛋白可以融合于HA的N末端和C末端。在这样一种结构中，治疗性蛋白部分可以是相同的或不同的治疗性蛋白分子。双功能白蛋白融合蛋白的结构可以表示为X-HA-Y或Y-HA-X或X-Y-HA或HA-X-Y或HA-Y-X-HA或HA-X-X-HA或HA Y-Y-HA或HA-X-HA-Y或X-HA-Y-HA或多重组合和/或将X和/或Y插入HA序列内的任何位置。
根据其功能，半衰期等，可以按各种比例制备双或多功能白蛋白融合蛋白。
也可以制备双或多功能白蛋白融合蛋白，使得融合物的治疗蛋白部分通过HA中另一末端的蛋白或肽靶向靶器官或细胞类型。
除了融合已知的治疗性分子，还可以通过筛选文库获得所述肽，该文库被构建为通常为6，8，12，20或25或Xn(其中X是氨基酸(aa)且n等于残基数)的随机选择的氨基酸与HA或HA的结构域片段的N-，C-，或N-和C-末端的融合物的文库，并且该文库中包括所有可能的氨基酸组合。这种方法特别的优势在于可以在HA分子上原位筛选所述肽，而且由此该肽的特性是被选出来的，而不像通过任何其他方法然后被附着于HA产生的肽那样，可能是经过修饰产生该特性。
此外，本发明的白蛋白融合蛋白还可包括接头肽，所述接头肽为与融合的部分之间，以更好地在物理上分开各部分，并因此使得例如在与治疗性白蛋白部分的相关受体结合时，该治疗性蛋白的可接近性最大化。所述接头肽可能由这样的氨基酸组成，它们使得该接头肽更加柔韧(flexible)或更加僵硬(rigid)。
因此，如上述，本发明的白蛋白融合蛋白可以具有以下的结构式R2-R1；R1-R2；R2-R1-R2；R2-L-R1-L-R2；R1-L-R2；R2-L-RI；或R1-L-R2-L-R1，其中，R1是至少一种治疗性蛋白，肽或多肽序列(包括其片段或其变体)，且不必要是相同的治疗性蛋白，L是接头，R2是血清白蛋白序列(包括其片段或其变体)。示例性的接头包括(GGGGS)n(SEQ ID NO8)或(GGGSn(SEQ ID NO9)或(GGS)n，其中N是大于或等于1的整数且其中G代表甘氨酸而S代表丝氨酸。当R1是两种或多种治疗性蛋白，肽或多肽序列时，这些序列可选地通过接头连接。
在另外的实施方案中，本发明的白蛋白融合蛋白包含的治疗性蛋白与不与白蛋白融合的相同治疗性蛋白的保质期或体内半衰期或治疗活性相比，前者具有延长的保质期或体内半衰期或治疗活性。保质期通常指这样一段时期，在该时期内溶液中或其他储存配制剂中的治疗性蛋白的治疗活性是稳定的，并没有不适当地丧失治疗活性。许多治疗性蛋白在非融合状态下都是高度不稳定的。如下所述，掺入本发明的白蛋白融合蛋白后，通常这些治疗性蛋白的保质期都显著延长。
具有“延时的(prolonged)”或“延长的(extended)”保质期的本发明的白蛋白融合蛋白显示比处于同样的储存和处理条件下的标准品更大的治疗活性。所述标准品可以是未融合的全长治疗性蛋白。当该白蛋白融合蛋白的治疗性蛋白部分是类似物，变体或发生其它变异或者不包括该蛋白的完整序列，治疗活性的延长也可以和该类似物，变体，变异的肽或不完整的序列的非融合对等物(equivalent)进行对比。例如，当本发明的白蛋白融合蛋白处于和标准品相同的储藏和处理条件下并在一个给定的时间点进行比较时，它保持标准品的约100％以上的治疗活性，或大于标准品的约105％，110％，120％，130％，150％或200％的治疗活性。然而，注意到治疗活性有赖于治疗性蛋白的稳定性，因此治疗活性可以低于100％。
也可用储存后保持的治疗活性评估保质期，以储存开始时的治疗活性为标准。显示延时的或延长的治疗活性因而具有延时的或延长的保质期的本发明的白蛋白融合蛋白，可保持的治疗活性超过相同条件下等量未融合治疗性蛋白的治疗活性的约50％以上，约60％，70％，80％，或90％或更多。
治疗性蛋白如上述，本发明的白蛋白融合蛋白包含至少一种治疗性蛋白的片段或变体和至少一种人血清白蛋白的片段或变体，它们通常通过基因融合互相连接。
本文的“治疗性蛋白”指具有一种或几种治疗和/或生物活性的HIV融合抑制肽(例如T-20，T-1249，5-螺旋或cyanovirin-N)，或其片段或其变体。因此，本发明的白蛋白融合蛋白可以包含至少一种治疗性蛋白的片段或变体。此外，术语“治疗性蛋白”可以指内源性治疗蛋白或其天然存在的相关物质。变体包括突变体，类似物，和模拟物(mimetics)，以及同源物，包括内源性治疗蛋白或其天然存在的相关物质。
显示“治疗活性”的多肽或“治疗上有活性的”蛋白，是指具有一种或多种与治疗性蛋白相关的已知的生物和/或治疗活性的多肽，所述治疗性蛋白例如本文所述的或本领域已知的一种或多种治疗性蛋白。一个非限制性的示例中，“治疗性蛋白”是可用于治疗，预防或缓解疾病，病情或病症的蛋白。
本文的“治疗活性”或”活性“指这样一种活性，其效果与病人所需的治疗结果一致，或者与非人哺乳动物或其它物种或有机体中的所需效果一致。治疗活性可以在体内或体外测定。例如，可以在细胞培养中测定所需的效果。这种体外的或细胞培养试验通常用于本领域所描述的许多治疗性蛋白。
有用的试验的实例包括，但不限于，表1的对比文件和出版物中的那些试验(例如美国专利6,133,418，第12栏，第20-58行)，具体包含在文中作为参考，以及实施例8和11所述的那些试验。本发明的融合蛋白显示的抗病毒活性可以通过例如简易的体外试验测定，例如以下所述的试验，这些试验可以检测融合蛋白抑制合胞体(syncytia)形成的能力，或者抑制游离于细胞外的病毒(cell-free virus)感染的能力。使用这些试验方法可测定例如该融合蛋白显示对给定的病毒毒株的相对抗病毒活性和/或该融合蛋白的毒株特异性抑制活性。细胞-细胞融合试验可用来检测融合蛋白抑制HIV诱导的体外合胞体形成的能力。这种试验可以包括在慢性HIV感染的细胞和待检测的肽存在的条件下培养未被感染的CD4+细胞(例如Molt或CEM细胞)。对于每种肽，可测定肽浓度的范围。所述范围包括没有加入该肽的对照培养。培养采用本领域普通技术人员熟悉的标准条件。温育适当的时间后(例如37℃下24到72小时)，用显微镜检查培养物中是否存在多核巨细胞，该细胞表明细胞融合体和合胞体形成。
作为另一个实施例，可利用逆转录酶(RT)试验来检验该融合蛋白抑制游离于细胞外的HIV感染CD4+细胞的能力。这种试验包括在待测定的融合蛋白存在的条件下培养适当浓度的病毒(即TCID50)和CD4+细胞。使用本领域技术人员熟悉的培养条件。如上述，使用包括不加入肽的对照培养在内的一定浓度范围内的融合蛋白。温育适当的培养时间(例如7天)后，使用标准步骤制备不含细胞的上清液，并测定上清液中RT活性的存在以确定感染的成功。使用例如Goff等(Goff，S.等，1981，J.Virol 38239-248)和/或Willey等(Willey，R.等，1988，J.Virol.62139-147)所述的标准技术测定RT活性。这些对比文件的全文包含在本文中作为参考。
可以通过附加1个或多个寡糖基团来修饰对应于本发明白蛋白融合蛋白的治疗性蛋白部分的治疗性蛋白。所述糖基化修饰可在很大程度上影响蛋白的物理特性并且在蛋白的稳定性，分泌和定位中也很重要。这种修饰在美国临时申请60/355,547和WO 01/79480中描述，所述对比文件包含在本文中作为参考。
可以修饰对应于本发明的白蛋白融合蛋白的治疗性蛋白部分的治疗性蛋白，以及其类似物和变体，使得一个或几个位点上的糖基化发生改变，所述改变是表达它们的宿主细胞或者其他表达条件对其核酸序列操纵的结果。例如，通过消除或引入糖基化位点可以制备糖基化异构体，如通过氨基酸残基的取代或缺失，例如用天冬酰胺取代谷氨酰胺，或者通过在宿主细胞中表达所述蛋白制备非糖基化的重组蛋白，所述宿主细胞不糖基化所述蛋白，例如大肠杆菌或糖基化缺陷的酵母菌。这些方法的实施例在美国临时申请60/355,547和WO01/79480中有详细描述，所述对比文件包含在本文中作为参考，并且是本领域已知的。
表1非穷尽性地列出了对应于本发明白蛋白融合蛋白的治疗性蛋白部分的治疗性蛋白。该“治疗性蛋白X”一栏公开了治疗性蛋白分子和括号内的科学及商品名称，所述分子包括治疗性蛋白分子或其片段或其变体或可选地由这些成分组成。本文的“治疗性蛋白X”指单个的治疗性蛋白分子(如由CAS和Genbank登录号可得的氨基酸序列所定义的)，或者指与该栏中公开的给定治疗性蛋白分子相关的整组治疗性蛋白。与这些蛋白相关的信息均包含在本文中作为参考，尤其涉及本发明所述的氨基酸序列。“PCT/专利对比文件”一栏提供了描述治疗性蛋白分子的美国专利号，或专利和/或公开的专利申请的PCT国际公开号。“PCT/专利对比文件”一栏引用的每件专利和/或公开的专利申请的全部内容均包含在本文中作为参考。具体地，每篇引用的“PCT/专利对比文件”中的序列表中说明的具体多肽的氨基酸序列，例如每篇引用的“PCT/专利对比文件”中详细描述的这些氨基酸序列(突变，片段等)的变体，例如每篇引用的“PCT/专利对比文件”中详细描述的治疗指征，以及详细描述说明的具体多肽的活性测定，且更具体地每篇引用的“PCT/专利对比文件”中的实施例包含在文中作为参考。“生物活性”一栏描述了与该治疗性蛋白分子相关的生物活性。“相关信息”一栏中引用的每篇对比文件的全文内容都包含在本文中作为参考，具体涉及对比文件中描述的测定相应生物活性的各活性测定法(见例如方法部分)。“优选指症Y”一栏描述了通过治疗性蛋白X或包含治疗性蛋白X部分的本发明的白蛋白融合蛋白来治疗，预防，诊断或改善的疾病，病症和/或病情。
表1

在多种实施方案中，本发明的白蛋白融合蛋白具有治疗活性和/或对应于该治疗活性的生物活性和/或对应于表1相应行中列出的白蛋白融合蛋白的治疗性蛋白部分的治疗性蛋白的生物活性(见例如，表1中的“生物活性”和“治疗性蛋白X”栏)。在其他实施方案中，本发明的白蛋白融合蛋白的治疗活性蛋白部分是对比序列的片段或变体，并且具有对应表1的“生物活性”一栏中公开的相应治疗性蛋白的治疗活性和/或生物活性。
多肽和多核苷酸片段及变体片段本发明还涉及表1中所述的治疗性蛋白，白蛋白，和/或本发明的白蛋白融合蛋白的片段。
即使从蛋白的N末端消除一个或多个氨基酸导致所述治疗性蛋白，白蛋白，和/或白蛋白融合蛋白的一种或多种生物功能发生修饰或丢失，仍然可保持其他治疗活性和/或功能活性(例如生物活性，多聚体化能力，结合配体的能力)。例如，当完整多肽的较少部分残基从N末端去除时，具有N末端缺失的多肽通常保持诱导和/或结合抗体的能力，所述抗体识别该多肽的完整或成熟形式。通过本文所述的常规方法和其他本领域已知的方法可轻易测定缺乏完整多肽的N-末端残基的具体多肽是否保持这种免疫活性。具有大量缺失的N末端氨基酸残基的突变蛋白(mutein)完全可能保持一些生物或免疫活性。事实上，由少至6个氨基酸残基组成的肽通常会激发免疫应答。
相应地，对应于本发明白蛋白融合蛋白的治疗性蛋白部分的治疗性蛋白片段包括全长蛋白以及从对比多肽(例如表1公开的治疗性蛋白)的氨基酸序列的氨基端缺失一个或多个氨基酸的多肽。编码这些多肽的多核苷酸也包含在本发明中。
此外，对应本发明的白蛋白融合蛋白的白蛋白部分的血清白蛋白多肽的片段，包括全长蛋白以及从对比多肽(即血清白蛋白)的氨基酸序列的氨基端缺失一个或多个氨基酸的多肽。编码这些多肽的多核苷酸也包含在本发明中。
此外，本发明的白蛋白融合蛋白片段，包括全长白蛋白融合蛋白以及从该蛋白的融合蛋白的氨基端消除一个或多个氨基酸的多肽。编码这些多肽的多核苷酸也包含在本发明中。
本发明还提供了一种从治疗性蛋白的氨基酸序列的羧基端消除了一个或多个残基的多肽，所述治疗性蛋白对应于本发明的白蛋白融合蛋白的治疗性蛋白部分(例如，表1中涉及的治疗性蛋白)。编码这些多肽的多核苷酸序列也包含在本发明中。
此外，本发明提供了一种从白蛋白的氨基酸序列的羧基端消除一个或多个残基的多肽，所述白蛋白对应于本发明的白蛋白融合蛋白的白蛋白部分(例如，血清白蛋白)。编码这些多肽的多核苷酸序列也包含在本发明中。
此外，本发明提供了一种从本发明的白蛋白融合蛋白的羧基端消除一个或多个残基的多肽。编码这些多肽的多核苷酸序列也包含在本发明中。
此外，可结合上述任何N或C末端的消除产生N和C末端缺失的对比多肽(例如表1中涉及的治疗性蛋白，或血清白蛋白(例如SEQ ID NO18)，或本发明的白蛋白融合蛋白)。本发明还提供了从所述氨基末端和羧基末端消除一个或多个氨基酸的多肽。编码这些多肽的多核苷酸序列也包含在本发明中。
本发明还涉及含有与本文所述的对比多肽序列(例如本发明的治疗性蛋白，血清白蛋白或白蛋白融合蛋白)至少60％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同的多肽的蛋白，或其片段。在一些实施方案中，该应用涉及包含与对比多肽具有至少60％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％同一性的多肽的蛋白，所述对比多肽的氨基酸序列具有上述的N和C末端缺失。编码这些多肽的多核苷酸也包含在本发明中。
本发明的其他多肽片段包含显示所述治疗性蛋白或血清白蛋白的多肽序列的治疗活性和/或功能活性(例如生物活性)的氨基酸序列，或者由该氨基酸序列组成，所述氨基酸序列是片段。
其他多肽片段是有生物活性的片段。有生物活性的片段是那些显示与本发明的多肽的活性类似而无需相同的活性的片段。所述片段的生物活性可以包括增加的所需活性，或减小的不需要的活性。
变体“变体”指与对比核酸或多肽不同但仍保持其必要特性的多核苷酸或核酸。通常，变体总体上十分相似，且在许多区内，与对比核酸或多肽完全一致。
本文的“变体”是指本发明的白蛋白融合蛋白的治疗性蛋白部分，本发明的白蛋白融合蛋白的白蛋白部分，或者这样一种白蛋白融合蛋白，它与本发明的治疗性蛋白(见表1中“治疗性”一栏)，白蛋白和/或本发明的白蛋白融合蛋白的序列各有不同，但保持所述蛋白的至少一种功能特性和/或治疗特性(例如表1中“生物活性”一栏公开的治疗活性和/或生物活性)，如本文其它部分所述或本领域已知的特性。通常，变体总体上都非常相似，而且在很多区内，都与对应于本发明白蛋白融合蛋白的治疗性部分的治疗性蛋白，对应于本发明的白蛋白融合蛋白的白蛋白部分的白蛋白，和/或本发明的白蛋白融合蛋白的氨基酸序列相同。编码这些变体的核酸包含在本发明内。
本发明还涉及一种蛋白，它包含与例如对应于本发明的白蛋白融合蛋白的治疗性蛋白部分的治疗性蛋白(例如表1公开的氨基酸序列，或其片段或其变体)，对应于本发明白蛋白融合蛋白的白蛋白部分的白蛋白(例如SEQID NO18或其片段或其变体)，和/或本发明的白蛋白融合蛋白的氨基酸序列具有至少60％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％的同一性的氨基酸序列，或者由这样的序列组成。还提供了这些多肽的片段(例如本文所述的那些片段)。本发明还包括一种多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸与编码本发明的氨基酸序列的核酸分子的互补物(complement)在严格的条件下杂交(例如45摄氏度6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中，与缚束在滤纸上的DNA杂交，然后在约50-65摄氏度0.2X SSC，0.1％SDS中进行一到多次洗涤)，在高度严格的条件下杂交(例如45摄氏度6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中，与缚束在滤纸上的DNA杂交，然后在约68摄氏度0.1X SSC，0.2％SDS中进行一到多次洗涤)，或者在本领域技术人员已知的其它严格杂交条件下杂交(见例如Ausubel，F.M.等，eds.，1989 Current protocol的MolecularBiology，Green publishing associates，Inc.，和John Wiley&Sons Inc.，NewYork，6.3.1-6.3.6和2.10.3页)。编码这些多肽的多核苷酸也包含在本发明中。
具有与本发明的目标(query)氨基酸序列至少例如95％的“同一性”的氨基酸序列的多肽的意思是，除了目的(subject)多肽序列可以包括目标多肽的每100个氨基酸中的5个氨基酸变异外，目的多肽的氨基酸序列与目标氨基酸序列相同。换言之，为获得具有与目标多肽的氨基酸序列具有至少95％的同一性的多肽，目的序列中有5％的氨基酸残基可以被插入，缺失，或被其它氨基酸取代。对比序列的这些变异可以出现在对比氨基酸序列的氨基或者羧基末端位置，或者在那些末端位置之间的任何位置，可以单独散布在对比序列中的残基中，或者以一个或多个连续的组的形式位于对比序列中。
实际上，使用已知的计算机程序可以方便地测定具体的任何多肽是否与例如本发明的白蛋白融合蛋白或其片段(例如该白蛋白融合蛋白的治疗性蛋白部分或者该白蛋白融合蛋白的白蛋白部分)的氨基酸序列具有至少60％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％的同一性。这样的程序和使用所述程序的方法在例如美国临时申请60/355，547和WO01/79480(41-43页)中描述，所述对比文件包含在本文中作为参考，并且是本领域技术人员熟悉的。
本发明的多核苷酸变体可包含在编码区，非编码区或这两个区内的变异。多核苷酸变体包括含有产生沉默取代，添加或缺失的变异的那些变体，但所述变异不改变所编码的多肽的特性或活性。由于基因密码子的简并性，这样的多核苷酸变体可以通过沉默取代产生。多肽变体包括那些其中少于50，少于40，少于30，少于20，少于10，或5-50，5-25，5-10，1-5，或1-2个氨基酸以任何组合方式被取代，缺失或添加的那些变体。制备多核苷酸变体的理由有很多，例如为了对特定宿主而言密码子表达最优化(将人mRNA中的密码子改变成例如酵母菌或大肠杆菌的微生物宿主优选的密码子)。
在另一实施方案中，编码本发明的白蛋白融合蛋白的白蛋白部分的多核苷酸被最优化用来在酵母菌或哺乳细胞中表达。在另一实施方案中，编码本发明的白蛋白融合蛋白的治疗性蛋白部分的多核苷酸被最优化用来在酵母菌或哺乳细胞中表达。在另一实施方案中，编码本发明的白蛋白融合蛋白的多核苷酸被最优化用来在酵母菌或哺乳细胞中表达。
在另一可选的实施方案中，编码本发明的白蛋白融合蛋白的治疗性蛋白部分的密码子最优化的多核苷酸不与编码该治疗性蛋白的野生型多核苷酸在本文所述的严格条件下杂交。在另一实施方案中，编码本发明的白蛋白融合蛋白的白蛋白部分的密码子最优化的多核苷酸不与编码该白蛋白的野生型多核苷酸在本文所述的严格条件下杂交。在另一实施方案中，编码本发明的白蛋白融合蛋白的密码子最优化的多核苷酸不与编码治疗性蛋白部分或白蛋白部分的野生型多核苷酸在本文所述的严格条件下杂交。
在另一的实施方案中，编码本发明的白蛋白融合蛋白的治疗性蛋白的多核苷酸不包括该治疗性蛋白天然存在的序列，或者可选地不由该治疗性蛋白天然存在的序列组成。在另一的实施方案中，编码本发明的白蛋白融合蛋白的白蛋白部分的多核苷酸不包括该白蛋白天然存在的序列，或者可选地不由该白蛋白天然存在的序列组成。在另一实施方案中，编码本发明的白蛋白融合蛋白的多核苷酸不包括该治疗性蛋白部分或该白蛋白部分天然存在的序列，或者可选地不由该治疗性蛋白部分或该白蛋白部分天然存在的序列组成。
在另一实施方案中，所述治疗性蛋白可以通过淘选(biopanning)从随机肽文库选择，这样将不会存在天然产生的野生型多核苷酸。
天然存在的变体称为“等位基因变体”，并且涉及占据有机体的染色体给定座位基因之多种替换形式中的一种。(GenesII，Lewin，B.，ed.，JohnWiley&Sons，New York(1985))。这些等位基因变体可以在多核苷酸和/或多肽水平上不同，并且包含于本发明中。可选地，可以通过诱变技术或直接合成制备非天然存在的变体。
使用已知的蛋白质工程和重组DNA技术，可以产生变体来改善或改变本发明的多肽的性质。本发明的多肽可从N末端或C末端消除一个或几个氨基酸，而基本上不丧失生物功能。见例如Ron等，J.Biol.Chem2682984-2988(1993)(KGF变体)和Dobeli等，J.Biotechnology7199-216(1998)(干扰素γ的变体)。
另外，大量证据表明变体通常保持与天然存在的蛋白相似的生物活性(例如Gayle andcoworkers(J.Biol.Chem.26822105-22111(1993)(IL-1a变体))。此外，即使从多肽的末端消除一个或多个氨基酸造成一种或多种生物功能的修饰或丧失，其他生物活性仍可被保持。例如，当分泌形式的部分残基从N末端或C末端去除时，缺失变体诱导和/或结合识别该分泌形式的抗体的能力很可能被保持。所述蛋白的缺失N末端或C末端残基的特定多肽是否保持这种免疫活性，可通过本文所述的常规方法和本领域已知的其他方法轻易测定。
因此，本发明还包括具有功能活性(例如生物活性和/或治疗活性)的多肽变体。在其他实施方案中，本发明提供的白蛋白融合蛋白的变体具有功能活性(例如生物活性和/或治疗活性，例如表1“生物活性”一栏中公开的活性)，所述功能活性对应于所述白蛋白融合蛋白的治疗性蛋白部分相应的治疗性蛋白的一种或多种生物活性和/或治疗活性。这样的变体包括根据本领域已知的通常规则筛选的缺失，插入，翻转，重复和取代，所述变异几乎不影响变体的活性。
在其他实施方案中，本发明的变体具有保守的取代。“保守的取代”是指组间交换，例如取代脂肪族或疏水氨基酸Ala，Val，Leu和Ile之间的取代；酸性残基Asp和Glu之间的取代；酰胺残基Asn和Gln之间的取代，碱性残基Lys，Arg，和His之间的取代；芳香族残基Phe，Tyr，和Trp之间的取代，和体积小的氨基酸Ala，Ser，Thr，Met，和Gly之间的取代。
涉及如何制备表型沉默的氨基酸取代的指导在例如Bowie等，″Deciphering the Message in Protein SequencesTolerance to Amino AcidSubstitutions，″Science 2471306-1310(1990)，中给出，其中作者指出有两种主要的策略来研究氨基酸序列对改变的耐受性。
如作者所述，蛋白质具有令人惊讶的耐受氨基酸取代的能力。作者进一步指出哪些氨基酸改变很可能在蛋白质中特定的氨基酸位置上是允许的。例如，大多数被包埋的(包埋在蛋白质的三级结构中)的氨基酸残基要求非极性侧链，而通常表面侧链的极少的特征是保守的。此外，被耐受的保守氨基酸取代涉及脂肪族或疏水氨基酸Ala，Val，Leu和Ile的取代；羟基残基Ser和Thr的取代；酸性残基Asp和Glu的取代；胺残基Asn和Gln的取代，碱性残基Lys，Arg，和His的取代；芳香族残基Phe，Tyr，和Trp的取代，以及体积小的氨基酸Ala，Ser，Thr，Met，和Gly的取代。
除了保守的氨基酸取代，本发明的变体包括(i)包含一种或多种非保守的氨基酸残基取代的多肽，其中取代的氨基酸残基可以是也可以不是基因密码子编码的，或(ii)包含一种或多种具有取代基的氨基酸残基取代的多肽，或(iii)与另一种化合物融合或通过化学方法偶联的多肽，例如增加该多肽的稳定性和/或溶解性的化合物(例如聚乙二醇)，(iv)含有附加的氨基酸的多肽，例如IgG Fc融合区多肽。通过本文的教导本领域熟练技术人员完全可以掌握这样的多肽变体。
例如，含有用另一种带电荷的或中性氨基酸取代带电氨基酸的氨基酸取代的多肽变体可以制备出具有改善的特性例如更少发生聚合的蛋白。由于聚合物的免疫原活性，药物制剂的聚集可以降低其活性和增加其清除率。见Pinckard等，Clin.Exp.Immunol.2331-340(1967)；Robbins等，Diabetes 36838-845(1987)；Cleland等，Crit.Rev.Therapeutic Drug Carrier Systems 10307-377(1993)。
在具体的实施方案中，本发明的多肽包括本文所述的治疗性蛋白和/或人血清白蛋白，和/或本发明的白蛋白融合蛋白的氨基酸序列的片段或变体，或由它们组成，其中与对比氨基酸序列相比，所述片段或变体具有1-5，5-10，5-25，5-50，10-50或50-150个氨基酸残基的添加，取代和/或缺失。在具体的实施方案中，所述氨基酸取代是保守的。编码这些多肽的核酸也包含在本发明中。
本发明的多肽可以由通过肽键或修饰的肽键，即肽等电子体(isostere)，连接各氨基酸形成并且可以包含除了基因编码的20个氨基酸以外的氨基酸。也可以通过例如翻译后加工的天然方法，或者通过本领域已知的化学修饰技术修饰所述多肽。这样的修饰在基本的教科书里有所描述，并在专题文章以及大量研究文献中有更详细的描述。通常修饰可以出现在多肽中的任何位置，包括多肽主链，氨基酸侧链和氨基或羧基端。可以理解同样类型的修饰可以相同或不同程度地出现在给定多肽的多个位置。另外，给定的多肽可以包括多种类型的修饰。例如由于遍在蛋白化作用(ubiquitination)，多肽可以是分枝的，且也可以是环化的而具有或没有分枝。环化的，分枝的，和分枝环化的多肽可以产生自翻译后天然加工或可通过合成方法被制备。修饰包括乙酰化，酰化，ADP-核糖基化，酰胺化，黄素共价附着，亚铁血红素部分共价附着，核苷酸或核苷酸衍生物的共价附着，脂类或脂类衍生物的共价附着，磷脂酰肌醇的共价附着，交联，环化，二硫键形成，去甲基化，共价交联形成，胱氨酸形成，焦谷氨酸(pyroglutamate)形成，甲酰化，γ羧化作用，糖基化，GPI锚定物形成，羟基化，碘化，甲基化，豆蔻酰化，氧化，PEG化(pegylation)，蛋白水解加工，磷酸化，异戊二烯化，外消旋作用，selenoylation，硫酸盐化，转运RNA介导的氨基酸添加到蛋白，例如精氨酰化(arginylation)和遍在蛋白化作用。
此外，化学成分也可以共价附着于所述白蛋白融合蛋白以增强或调节具体的功能或生物活性，例如通过Current Opinions in Biotechnology，10324(1999)中所述的方法。
本发明包括的附加翻译后修饰包括，例如N连接的或O连接的碳水化合物链，N末端或C末端的加工，化学部分附着于氨基酸主链，N-连接的或O连接的碳水化合物链的化学修饰，以及由原核宿主细胞表达造成的N末端蛋氨酸残基的添加或缺失。所述白蛋白融合蛋白的其他修饰方法包括，但不限于，化疗剂，如药物，和/或可检测的标记，如酶，荧光素，同位素和/或亲和标记以便检测和分离蛋白。这种修饰的实例在美国临时申请60/355,547和WO01/79480(105-106页)中给出，上述对比文件包含在文中作为参考，并且是本领域熟悉的。
功能活性“具有功能活性的多肽”指能够显示一种或多种已知的功能活性的多肽，所述功能活性与治疗性蛋白的全长，前蛋白，和/或成熟形式相关。这样的功能活性包括，但不限于，生物活性，抗原性(与抗多肽抗体结合的能力(或与结合抗多肽抗体的多肽竞争的能力))，免疫原性(产生与本发明特定多肽结合的抗体的能力)，与本发明的多肽形成多聚体的能力，以及与多肽的受体或配体结合的能力。
“具有生物活性的多肽”指在具体的生物试验中，显示与本发明的治疗性蛋白，包括其成熟形式的活性相似但不必要相同的活性的多肽，所述多肽的活性可以是剂量依赖或非剂量依赖性的。如果存在剂量依赖性，所述活性无需与本发明的多肽的剂量依赖性相同，而是基本上与本发明的多肽在给定的活性中的剂量依赖性相似。
在另一实施方案中，本发明的白蛋白融合蛋白具有至少一种与没有和白蛋白融合的该治疗性蛋白(或其片段或其变体)相关的生物和/或治疗活性。
适用本领域已知的常规修饰法，以及本文所述的实验方法可以测定本发明的白蛋白融合蛋白的功能活性(例如生物活性)。具体地，可以使用表1的″相关出版物″一栏中的方法测定白蛋白融合蛋白的功能活性(例如生物活性或治疗活性)。此外，本领域熟练技术人员可以使用表1的相应行中的方法常规地测定本发明的白蛋白融合蛋白的治疗性蛋白部分对应的治疗性蛋白的片段的活性。此外，本领域熟练技术人员可以适用本领域已知的方法和/或如美国临时申请60/355,547和WO01/79480中所述方法常规地测定本发明的白蛋白融合蛋白的白蛋白部分对应的白蛋白片段的活性。
此外，本文所述的方法(见实施例和表1)以及本领域已知的其他方法可以常规地用于测定本发明的白蛋白融合蛋白及其片段，变体或衍生物激发与本发明的白蛋白融合蛋白的治疗性蛋白部分和/或白蛋白部分相关的生物活性和/或治疗活性的能力。其他方法是本领域熟练技术人员已知的并包含在本发明的范围内。
融合蛋白的表达本发明的白蛋白融合蛋白可以通过酵母菌，如细菌等的微生物，或者人或动物细胞系的分泌被制备成重组分子。可选地，所述多肽自宿主细胞中分泌。
为表达本发明举例说明的白蛋白融合蛋白，成功地使用了如WO95/33833举例说明的HSP150基因中断(disrupted)的酵母菌株或WO00/44772[rHA法](用于降低/消除所述白蛋白融合物的O-连接的糖基化)举例说明的PTM1基因中断的酵母菌株，或WO 95/23857举例说明的YAP3基因中断的酵母菌株，以及与它们相组合的酵母菌PRB1启动子，WO 90/01063举例说明的HAS/MFα-1融合前导序列，酵母菌ADH1终止子，LEU2选择标记物和美国专利5,637,504中举例说明的中断(disintegration)载体pSAC35。
其他可用于本发明的酵母菌株，启动子，前导序列，终止子，标记物和载体在美国临时申请60/355,547和WO01/74980(94-99页)中描述，该文献包含在本文中作为参考，并且是本领域已知的。
本发明还包括细胞，可选为酵母细胞，所述细胞被转化以表达本发明的白蛋白融合蛋白。除了转化的宿主细胞本身，本发明还涉及培养基中的那些细胞的培养物，可选地为单克隆(均一克隆)培养物，或者来自单克隆培养的培养物。如果所述多肽是被分泌的，所述培养基将含有该多肽和细胞，或如果细胞被过滤或离心去除的情况下不含有细胞。许多已知并可用的表达系统包括细菌(例如大肠杆菌和枯草杆菌)，酵母菌(例如酿酒酵母，乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces.lactis)和巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)，丝状真菌(例如曲菌)，植物细胞，动物细胞和昆虫细胞。
通过传统方法制备所需的蛋白，例如通过插入宿主染色体中或游离的质粒上的编码序列。可用所需蛋白的编码序列以例如电穿孔的任何常见的方法转化酵母菌。通过电穿孔转化酵母菌在Becker&Guarente(1990)MethodsEnzymol.194，182中公开。
成功转化的细胞，即含有本发明的DNA构建体的细胞，可以通过已知的技术被鉴定。例如，通过引入表达载体产生的细胞可以生长以表达所需的多肽。收获并裂解细胞，并使用例如Southern(1975)J Mol.Biol.98，503或Berent等(1985)Biotech.3,208所述的方法检查细胞的DNA含量以确定DNA的存在。可选地，上清液中所述蛋白的存在可以通过使用抗体检测。
有用的酵母菌质粒载体包括pRS403-406和pRS413-416，通常自Stratagene Cloning Systems，La Jolla，CA 92037，USA可得。质粒pRS403，pRS404，pRS405和pRS406是酵母菌整合质粒(Integrating plasmids)(YIps)并包括酵母可选标记物HIS3，TRPI，LEU2和URA3。质粒pRS413-416是酵母着丝点质粒(Centromere plasmids)(YCps)。
制备在酵母菌中表达的白蛋白融合蛋白的载体包括pPPC0005，pScCHSA，pScNHSA，和pC4HAS，所述载体于2001年4月11日保存在美国典型培养物保藏中心(the American Type Culture Collection)，10801University Boulevard，Manassas，Virginia 20110-2209，并在美国临时申请60/355,547和WO01/79480中描述，这些文献包含在本文中作为参考。
另一种预期可用于在酵母中表达白蛋白融合蛋白的载体是pSAC35载体，所述载体在Sleep等，BioTechnology 842(1990)中描述，其全文包含在本文中作为参考。美国专利5,637 504描述了中断(disintegration)类型的载体的质粒pSAC35。
已发展出多种方法通过互补粘末端将DNA可操作地连接于载体。例如，可将互补的均聚物束(complementary homopolymer tracts)加入DNA片段中从而将其插入载体DNA。随后通过互补均聚物尾之间的氢键连接所述载体和DNA片段形成重组的DNA分子。
含有一个或多个限制性位点的合成接头提供了将DNA片段连接到载体的另一种方法。通过内切酶的限制性消化产生所述DNA片段，并用噬菌体T4 DNA聚合酶或大肠杆菌DNA聚合酶I处理，这些酶能够用其3’5’-核酸内切酶活性去除突出的，γ-单链末端，并用其聚合活性填补凹陷的3’末端。这些活性的结合由此产生了平末端的DNA片段。随后在能够催化平末端DNA分子连接的酶(例如噬菌体T4 DNA接合酶)存在的条件下，将过量的接头分子与所述平末端DNA片段共同温育。因此，该反应的产物是其末端具有聚合的接头序列的DNA片段。然后用适当的限制性酶切割这些DNA片段，并与表达载体接连，所述表达载体已经被产生与所述DNA片段相匹配的末端的酶裂解过。
含有多种限制性内切酶位点的合成接头可从多处购得。
根据本发明修饰DNA例如制备HA变体的一种适当的方法，是利用Saiki等(1988)Science 239，487-491所述的聚合酶链反应。在该方法中，被酶扩增的DNA侧接两种特异的寡核苷酸引物，所述引物自身也被掺入扩增的DNA中。该特异的引物可以包含限制性内切酶识别位点，用本领域已知的方法将其克隆到表达载体中。
本发明可用作表达所述白蛋白融合蛋白的宿主的示例性酵母菌种是毕赤酵母属(Pachia)(以前被分类为汉逊酵母(Hansenula))，酵母属(Saccharomyces)，克鲁维酵母属(Kluyveromyces)，曲菌属(Aspergillus)，假丝酵母属(Candida)，球拟酵母属(Torulopsis)，有孢圆酵母属(Torulaspofa)，裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)，固囊酵母属(Citeronzyces)，管囊酵母属(Pachysolen)，接合酵母属(Zygosaccharomyces)，德巴利酵母属(Debaromyces)，木霉属(Trichoderma)，头孢菌属(Cephalosporium)，腐质霉菌(Humicola)，毛霉属(Mucor)，脉孢霉(Neurospora)，西洋蓍霉(yarrowia)，梅奇酵母属(Metschunikowia)，红冬孢酵母属(Rhodosporidium)，白冬孢酵母菌属(Leucosporidium)，Botryoascus，锁掷酵母菌属(Sporidiobolus)，拟内孢菌属(Endomycopsis)等。包括选自酵母属，裂殖酵母菌属，毕赤酵母菌属，或球拟酵母属的菌属。酵母属的实例是酿酒酵母，意大利酵母和鲁酵母。美国临时申请60/355,547和WO01/79480(97-98页)中描述了其他种类的实例和转化它们的方法，这些文献包含在文中作为参考。
EP 251 744，EP 258 067和WO 90/01063中教导了转化酿酒酵母的方法，其所有内容包含在文中作为参考。
适合酿酒酵母的启动子包括与以下基因相连的启动子PGKI基因，GAL1或GAL10基因，CYCI，PHO5，TRPI，ADHI，ADH2，和甘油醛-3-磷酸脱氢酶，己糖激酶，丙酮酸脱羧酶，磷酸果糖激酶，丙糖磷酸异构酶，磷酸葡萄糖异构酶，葡萄糖激酶，α-配对因子信息素[alpha-mating factorpheromone](一种配对因子信息素)，PRBI启动子，GUT2启动子，GPDI启动子和涉及5’调控区的部分与其它启动子的5’调控区或者上游激活位点(例如EP-A-258 067的启动子)杂交体的杂交启动子。
用于粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的便利可调控启动子是如Maundrell(1990)J.Biol.Chem.265，10857-10864所述的来自nmt基因的硫胺可抑制(repressible)的启动子和如Hoffman&Winston(1990)Genetics 124，807-816所述的葡萄糖可抑制的jbpl基因启动子。
转化毕赤酵母属以表达外来基因的方法的教导见例如Cregg等(1993)和各种Phillips专利(例如美国专利4 857467，包含在文中作为参考)，并且毕赤酵母表达试剂盒可自Invitrogen BV，Leek，Netherlands，和InvitrogenCorp.，San Diego，California购得。适宜的启动子包括AOXI和AOX2。Gleeson等(1986)J.Gen.Microbiol.132，3459-346包括了汉逊酵母载体和转化的信息，适宜的载体是MOX1和FMD1；且EP 361 991，Fleer等(1991)和Rhone-Poulenc Rorer的其他出版物教导了如何在克鲁维酵母属中表达外来蛋白。
转录终止信号可以是真核生物基因的3’侧接序列，所述序列包含用于转录终止和多腺苷酸化的适当信号。适宜的3’侧接序列可以是例如天然地与使用的表达控制序列相连的基因的序列，即可以与启动子对应。可选地，在任选地使用酿酒酵母ADH I的终止序列时，所述序列也可以不同。
最初，可以使用分泌性前导序列表达适合需要的白蛋白融合蛋白，所述前导序列可以是选定的酵母菌中的任何有效的前导序列。用于酿酒酵母的前导序列包括来自配对因子α多肽(MF α-1)的序列和EP-A-387319的杂交前导序列。在成熟的白蛋白被释放到周围的培养集中以前，这样的前导序列(或信号)可以被酵母菌裂解。此外，这样的前导序列包括JP 62-096086(授权号911036516)中公开的酿酒酵母转化酵素(invertase)(SUC2)，酸性磷酸酶(PH05)，MFα-1的前序列，0葡聚糖酶(BGL2)和致死毒素(killer toxin)；糖化酵母葡糖淀粉酶I1(S.diastaticus glucoamylase I1)；卡尔酵母α半乳糖苷酶(S.carlsbergensis α-galactosidase)(MEL1)；乳酸克鲁维酵母致死毒素(K lactiskiller toxin)和假丝酵母葡糖淀粉酶(Candida glucoamylase)的前导序列。
重组和合成法生产白蛋白融合蛋白的其他方法本发明包括编码白蛋白融合蛋白的多核苷酸，以及载体，宿主细胞和含有这些多核苷酸的有机体。本发明还包括通过合成和重组技术生产本发明的白蛋白融合蛋白的方法。所述多核苷酸，载体，宿主细胞，和有机体可以利用本领域已知的方法分离和纯化。
用于本发明的载体可以是例如，噬菌体，质粒，粘粒，微小染色体，病毒和逆转录病毒载体。
可用于克隆和/或表达本发明的多核苷酸的载体是那些能够在宿主细胞中复制和/或表达多核苷酸的那些载体，其中该多核苷酸需要在所述宿主细胞中复制和/或表达。通常，该多核苷酸和/或载体可用于原核或真核的任何细胞，包括哺乳动物细胞例如人(例如HeLa)，猴(例如Cos)，兔(例如兔网织红细胞)，大鼠，仓鼠(例如CHO，NSO和幼年仓鼠肾细胞)或小鼠细胞(例如L细胞)，植物细胞，酵母细胞，昆虫细胞或细菌细胞(例如大肠杆菌)。见F.Ausubel等，Current Protocols in MolecularBiology.Greene PublishingAssociates and Wiley-Interscience(1992)和Sambrook等(1989)中用于各种类型的宿主细胞的适宜载体的实例。然而，须注意，当使用复制缺陷的逆转录病毒载体时，病毒繁殖将只出现在互补的宿主细胞中。
含有这些多核苷酸的宿主细胞可用来表达大量用于例如药品，诊断试剂，疫苗和治疗方法中的蛋白。所述蛋白可以通过本领域已知的或者本文所述的方法分离和纯化。
编码本发明的白蛋白融合蛋白的多核苷酸可以和含有选择性标记物的载体相连，用于在宿主中繁殖。通常，质粒载体可以被引入例如磷酸钙沉淀物的沉淀物，或者具有带电的脂类的复合物中。如果载体是病毒，可使用适当的包装细胞系将其在体外进行包装，然后转导至宿主细胞中。
多核苷酸插入序列可以和与宿主细胞相容的适当启动子可操作地连接，其中所述多核苷酸将被表达。所述启动子可以是强启动子和/或可诱导的启动子。启动子的实例包括噬菌体λPL启动子，大肠杆菌lac，trp，phoA和tac启动子，SV40早期和晚期启动子，以及逆转录病毒LTRs的启动子等等。本领域熟练技术人员已知其它适宜的启动子。表达构建体进一步包含转录起始位点，终止位点，和位于被转录区内用于翻译的核糖体结合位点。构建体表达的转录物可包括分别位于被翻译的多肽起点的翻译起始密码子和位于该多肽末端的适当位置上的终止密码子(UAA，UGA，或UAG)。
本文所述的表达载体可包括至少一种可选择的标记。这类标记包括用于真核细胞培养的二氢叶酸还原酶，G418，谷氨酰胺合酶，或者新霉素抗性，用于培养大肠杆菌和其他细菌的四环素，卡那霉素或氨苄青霉素抗性基因。适当的宿主的代表性实例包括，但不限于，细菌细胞，如大肠杆菌，链霉菌属和鼠伤寒沙门氏菌细胞；真菌细胞，例如酵母菌细胞(例如酿酒酵母或巴氏毕赤酵母(ATCC保藏号201178)；昆虫细胞，例如果蝇S2和秋粘虫(Spodoptera)Sf9细胞；动物细胞例如CHO，COS，NSO，293，和Bowes黑素瘤细胞；以及植物细胞。本领域已知培养上述宿主细胞的适当培养基和条件。
在一个实施方案中，编码本发明的白蛋白融合蛋白的多核苷酸可以和信号序列融合，所述信号序列将本发明的蛋白的位置导向原核或真核细胞的特定隔室和/或指导本发明的蛋白自原核或真核细胞的分泌。例如，在大肠杆菌中，可将所述蛋白的分泌导向壁膜间隙。可以和本发明的白蛋白融合蛋白融合从而将多肽的表达导向细菌的壁膜间隙的信号序列或蛋白的实例包括，但不限于，pelB信号序列，麦芽糖结合蛋白(MBP)信号序列，MBP，ompA信号序列，位于壁膜间隙的大肠杆菌热不稳定肠毒素B亚基的信号序列，以及碱性磷酸酶的信号序列。多种可购得的载体可用于构建可导向蛋白定位的融合蛋白，例如可自New England Biolabs购得的Pmal系列载体(具体为pMAL-p系列)。在具体的实施方式中，本发明的多核苷酸白蛋白融合蛋白可以和pelB果胶酸裂合酶信号序列融合来增加这类多肽在革兰氏阴性细菌中的表达和纯化效率。见美国专利5,576,195和5,846,818，其全文内容包含在本文中作为参考。
可以和本发明的白蛋白融合蛋白融合以导向其在哺乳动物细胞中的分泌的信号肽的实例包括，但不限于MPIF-1信号序列(例如GenBank登录号为AAB51134的氨基酸1-21)，stanniocalcin信号序列(MLQNSAVLLLLVISASA，SEQ ID NO10)和共有信号序列(MPTWAWWLFLVLLLALWAPARG，SEQ ID NO11)。适宜和杆状病毒表达系统联合使用的信号序列是gp67信号序列(例如GenBank登录号AAA72759的氨基酸1-19)。
使用谷氨酰胺合酶(GS)或DHFR作为选择性标记的载体可以分别在药物methionine sulphoximine或甲氨蝶呤(methotrexate)的存在下被扩增。以谷氨酰胺合酶为基础的载体的优势在于可利用谷氨酰胺合酶阴性的细胞系(例如小鼠骨髓瘤细胞系，NSO)。通过提供额外的抑制子来防止内源性基因的功能，谷氨酰胺合酶表达系统也可在表达谷氨酰胺合酶的细胞(例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)中起作用。谷氨酰胺表达系统及其组分在以下PCT出版物中详细描述WO87/04462；WO86/05807；WO89/01036；WO89/10404；和WO91/06657，其全文包含在本文中作为参考。此外，谷氨酰胺表达载体可以自Lonza Biologics，Inc.(Portsmouth，NH)获得。Bebbington等，Bio/tecAnology 10169(1992)和Biblia和RobinsonBiotechnol.Prog.111(1995)中描述了使用GS表达系统在小鼠骨髓瘤细胞中表达和制备单克隆抗体，这些文献包含在本文中作为参考。
本发明还涉及含有载体构建体的宿主细胞，例如本文描述的那些，还包括含有本发明的核苷酸序列的宿主细胞，所述核苷酸序列通过使用本领域已知的技术与一个或多个异源性调控序列区(例如启动子和/或增强子)可操作地连接。宿主细胞可以是更高等的真核细胞，例如哺乳动物细胞(例如人来源的细胞)或较低等的真核细胞，例如酵母菌细胞，或者宿主细胞可以是原核细胞，例如细菌细胞。可选择调节插入的基因序列的表达或者以特定所需方式修饰并加工该基因产物的宿主菌株。在特定诱导物的存在下，特定启动子启动的表达可以被提高；从而可控制基因改造的多肽的表达。此外，不同的宿主细胞具有不同的蛋白质翻译和翻译后加工和修饰(例如磷酸化，裂解)特性和具体机制。可选择适宜的细胞系以保证对表达的外来蛋白进行所需的修饰和加工。
磷酸钙转染，DEAE-右旋糖苷介导的转染，阳离子脂质介导的转染，电穿孔，转导，感染或其他方法均可影响将本发明的核酸和核酸构建体引入所述宿主细胞。这类方法在多个标准实验室手册中描述，例如Davis等，Basic Methods In Molecular Biology(1986)。事实上具体涉及本发明的多肽可以被缺乏重组载体的宿主细胞表达。
除了包含含有本发明所述的载体构建体的宿主细胞以外，本发明还包含原代，传代和无限繁殖的脊椎动物来源的宿主细胞，具体为哺乳动物来源，所述宿主细胞经过改造消除或取代了内源性基因物质(例如对应于治疗性蛋白的编码序列可以被对应于治疗性蛋白的白蛋白融合蛋白取代)，和/或包括了基因物质(可包括例如异源性多核苷酸序列，例如对应于所述治疗性蛋白的本发明的白蛋白融合蛋白)。与内源性多核苷酸可操作地连接的基因物质可以活化，改变，和/或扩增内源性多核苷酸。
此外，可利用本领域已知的技术将异源性多核苷酸(例如编码白蛋白，或其片段或变体的多核苷酸)和/或异源性控制区(例如启动子和/或增强子)和编码治疗性蛋白的内源性多核苷酸序列通过同源重组可操作地连接(见例如，美国专利5,641,670，1997年6月24日公开；国际公开WO 96/29411；国际公开WO 94/12650；Koller等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 868932-8935(1989)；和Zijlstra等，Nature 342435-438(1989)，其全文的公开内容均包含在本文中作为参考)。
有利地，本发明的白蛋白融合蛋白可以通过已知的方法从重组细胞培养物中回收并纯化，所述方法包括硫酸铵或乙醇沉淀，酸提取，阴离子或阳离子交换色谱，磷酸纤维素层析，疏水性相互作用层析，亲和层析，羟磷灰石层析，疏水电荷相互作用层析和血凝素层析。在一些实施方案中，高效液相色谱(HPLC)可用于纯化。
在优选的一些实施方案中，使用一种或多种以下的色谱柱纯化本发明的白蛋白融合蛋白Q琼脂糖FF柱，SP琼脂糖FF柱，Q琼脂糖高效柱，Blue琼脂糖FF柱，Blue柱，苯基琼脂糖FF柱，DEAE琼脂糖FF，或甲基柱(MethylColumn)。
此外，可利用国际公开WO 00/44772(全文内容包含在本文中作为参考)中所述的方法纯化本发明的白蛋白融合蛋白。本领域熟练技术人员可轻易改造本文所述用于纯化本发明的白蛋白融合蛋白的方法。
本发明的白蛋白融合蛋白可以从以下物质中回收通过重组技术从原核或真核宿主中制备的产物，所述宿主包括例如细菌，酵母菌，较高等的植物，昆虫，和哺乳动物细胞。根据重组制备法中所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的或非糖基化的。此外，本发明的白蛋白融合蛋白还可以包括起始的修饰的蛋氨酸残基，有时可以是宿主介导方法的结果。因此，本领域技术人员已知在所有真核细胞中翻译起始密码子编码的N末端蛋氨酸翻译后通常从任何蛋白中被高效地去除。尽管大多数蛋白上的N末端蛋氨酸在大多数原核细胞中也被有效地去除，但对于一些蛋白质，这种自原核细胞去除的过程效率很低，与N末端蛋氨酸共价连接的氨基酸的性质有关。
本发明的白蛋白融合蛋白以及结合治疗性蛋白或其片段或其变体的抗体可以和例如促进纯化的肽等标记序列融合。在一个实施方案中，标记氨基酸序列可以是六个组氨酸的肽，例如pQE载体中提供的标记(QIAGEN，Inc.，9259 EtonAvenue，Chatsworth，CA，91311)，其中许多是可以购得的。如Gentz等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86821-824(1989)所述，六个组氨酸为所述融合蛋白提供了简便的纯化。其他可用于纯化的肽标记包括，但不限于，“HA”标记，它对应于来自流感病毒红细胞凝集素蛋白(influenzahemagglutinin protein)(Wilson etal.，Cell 37767(1984))的一个表位和″FLAG″标记。
此外，本发明的白蛋白融合蛋白可以和治疗性部分偶联，所述治疗性部分例如细胞毒素，例如细胞生长抑制剂或杀细胞剂，或者放射活性金属离子，例如α-发射离子如213Bi。这种制剂的实例见美国临时申请60/355，547和WO01/79480(107页)，包含在本文中作为参考。
白蛋白融合蛋白也可以附着于固体支持物上，所述蛋白具体用于免疫测定或纯化被本发明的白蛋白融合蛋白缚束，与该白蛋白融合蛋白结合或者相连的多肽。这种固体支持物包括，但不限于，玻璃，纤维素，聚丙烯酰胺，尼龙，聚苯乙烯，聚氯乙烯或聚丙烯。
本发明还提供了该白蛋白融合蛋白的化学修饰衍生物，所述衍生物具有额外的优点，例如该多肽增加的溶解性，稳定性和循环时间，或降低的免疫源性(见美国专利4,179,337)。涉及使用聚乙二醇的实施例见WO01/79480(109-111页)，包含在本文中作为参考。
本发明的白蛋白融合蛋白的存在和量可以通过使用本领域熟悉的免疫测定法ELISA测定。
多肽的使用本文鉴定的每种多肽均有多种用法。以下的说明是示例性的并使用了已知的技术。
本发明的白蛋白融合蛋白可用于治疗，预防和/或诊断哺乳动物，优选人中的多种疾病。这种疾病包括，但不限于，本文表1的标题“生物活性”下所述的那些疾病。
本发明的白蛋白融合蛋白可以用作人和非人逆转录病毒，具体为HIV传染到未被感染的细胞的的抑制物。人逆转录病毒的传染可以被本发明的肽抑制，所述病毒包括但不限于所有HIV-1和HIV-2，以及人T淋巴细胞病毒(HTLV-I，II，III)。非人逆转录病毒的传染可以被本发明的肽抑制，所述病毒包括但不限于牛白血病病毒(bovine leukosis virus)，猫肉瘤和白血病病毒，猿肉瘤和白血病病毒，和绵羊进行性肺炎病毒。
此外，本发明的白蛋白融合蛋白可用来治疗或预防疾病或病症。对于HIV，本发明的白蛋白融合蛋白可用作预防或治疗AIDS或其他HIV相关疾病或病症的预防剂或治疗剂。
此外，本发明的白蛋白融合蛋白可用作以前未曾感染的个体急性暴露于HIV病毒后的预防措施。该肽的这种预防性用法的实例包括，但不限于，预防病毒从母亲传染到胎儿，以及其他存在HIV传染可能性的设备，例如在治疗设备中工作者暴露于含有HIV的血液产品的事故。在这样的情形下，本发明的白蛋白融合蛋白可以起到预防性疫苗的作用，其中宿主产生针对本发明的白蛋白融合蛋白的抗体，所述抗体通过例如抑制进一步的HIV感染来中和HIV病毒。
白蛋白融合蛋白可用于测定生物样品中的多肽水平。例如，放射标记的本发明的白蛋白融合蛋白可用来显影(imaging)体内的病毒结节(nodes)。测定实例在例如美国临时申请60/355,547和WO 0179480(112-122页)中给出，包含在本文中作为参考，并且为本领域技术人员所熟悉。
本发明的白蛋白融合蛋白也可用于激发抗体，所述抗体可用来测定所述治疗性蛋白，白蛋白和/或本发明的白蛋白融合蛋白自重组细胞中的蛋白表达，作为评估该宿主细胞的或生物样品中的转化的一种方法。此外，本法明的白蛋白融合蛋白可用来测定本文所述的生物活性。
转基因有机体表达本发明的白蛋白融合蛋白的转基因有机体也包含在本发明内。转基因有机体是基因被修饰的有机体，重组的，外源的或克隆的基因物质被转移至其中。这种基因物质通常称为转基因。转基因的核酸序列可以包括一种或多种转录调控序列，和其他核酸序列如内含子，所述序列对于所编码的蛋白的最佳表达和分泌是必要的。转基因可设计成导向所编码蛋白的表达，从而易化有机体或由该有机体制备的产物中回收该蛋白，所述产物例如该有机体的乳汁，血液，尿液，蛋，头发或种子。该转基因可由来自与目的动物的种类相同或不同的物种的基因组的核酸序列组成。该转基因可在通常不能发现特定核酸序列的基因组位点或转基因的通常位点上发生整合。
术语“生殖细胞系转基因有机体”指一种转基因有机体，其中基因变异或基因信息被引入生殖系细胞中，从而显示转基因有机体将遗传信息传至后代的能力。如果这种后代事实上具有一些或全部所述变异或遗传信息，那么它们也是转基因有机体。所述变异或遗传信息对于转基因接受者所属的有机体的种类是异源的，只对特定个体接受者异源，或者可以是接受者已经具备的遗传信息。在最后一种情形下，变异的或引入的基因与天然基因的表达可以不同。
转基因有机体可以是转基因人，动物或植物。通过多种不同的方法可产生转基因，所述方法包括转染，电穿孔，显微注射，胚胎干细胞中的基因打靶和重组病毒及逆转录病毒感染(见例如，美国专利4,736,866；美国专利5,602,307；Mullins等(1993)Hypertension 22(4)630-633；Brenin etal.(1997)Surg.Oncol.6(2)99-110；Tuan(ed.)，Recombinant Gene ExpressionProtocols，Methods in Molecular Biology No.62，Humana Press(1997))。可通过任何有利于多种核酸分子共转染的方法将核酸片段引入可重组的哺乳动物细胞。本领域熟练技术人员可轻易获得产生转基因动物的详细方法，包括美国专利5,489,743和美国专利5,602,307中的公开内容。美国临时申请60/355,547和WO01/79480(151-162页)还提供了其他信息，包含在文中作为参考。
基因治疗编码本法明的白蛋白融合蛋白的构建体可用作基因治疗方案的一部分来递送治疗有效量的白蛋白融合蛋白。在体内将核酸引入细胞的一种方法是利用含有编码本发明的白蛋白融合蛋白的核酸的病毒载体。使用病毒载体感染细胞的优点是大部分目的细胞可以获得核酸。此外，例如通过病毒载体内所含的cDNA，在摄入病毒载体核酸的细胞中有效地表达该病毒载体内编码的分子。所述白蛋白融合蛋白延长的血浆半衰期甚至可以补偿可能的低表达水平。
逆转录病毒载体和腺病毒相关病毒载体可用作重组基因递送系统在体内转移编码白蛋白融合蛋白的外源性核酸分子。这些载体提供了将核酸转移入细胞的有效递送，并且被转移的核酸被稳定整合入宿主的染色体DNA。这种载体的实例，使用它们的方法，以及其优点和非病毒递送方法在美国临时申请60/355,547和WO01/79480(151-153页)中详细描述，包含在本文中作为参考。
编码本发明白蛋白融合蛋白的基因的基因递送系统可以通过多种方法被引入病人中。例如，基因递送系统的药物制剂可以例如通过静脉注射被系统导入，且该蛋白在目的细胞中的特定转导主要原因在于基因递送载体提供的转导特异性，转录调控序列控制该受体基因表达而导致的细胞类型或组织类型表达的特异性，或者二个因素的结合。在其他实施方案中，由于重组基因被非常局部化地引入动物中，其起始递送更加局限。例如，基因递送载体可以通过导管(见美国专利5,328,470)或通过立体方法注射(Stereotactic injection)(例如Chen等(1994)PNAS 913054-3057)被引入。基因治疗构建体的药物制剂可以基本上由可接受的稀释剂中的基因递送系统组成，或者可以包括包埋有该基因递送载体的缓释基质。如果白蛋白融合蛋白可以自例如逆转录载体等的重组细胞中完整地产生，所述药物配制剂可以包含一种或多种产生该白蛋白融合蛋白的细胞。其他的基因治疗法在美国临时申请60/355,547和WO01/79480(153-162页)中描述，包含在本文中作为参考。
药物或治疗组合物本发明的白蛋白融合蛋白或其配制剂可以通过包括肠外(例如皮下或肌肉内)注射或静脉内输注等的任何传统方式给药。所述治疗可以由单剂量或一段时间内的多剂量(plurality of doses)组成。此外，给药所述剂量或多剂量的频率低于与没有和白蛋白融合的治疗性蛋白的给药频率。
本发明的白蛋白融合蛋白可以单独给药，可取地以药物配制剂和一种或多种可接受的载体的形式给药。所述载体必须是“可接受的”，其含义是能够与所述白蛋白融合蛋白相容，而对接受者无害。通常，所述载体是无菌且不含致热原的水或盐溶液。本发明的白蛋白融合蛋白尤其适合作为水溶液载体中的配制剂，例如无菌无致热原的水，盐溶液或其它等张溶液，这是由于其在溶液中的保质期延长。例如，本发明的药物组合物可以在分装前数周，数月或更长时间预先配成水溶液。
可根据所述白蛋白融合蛋白在溶液配制剂中具有延长的保质期来制备含有白蛋白融合蛋白的配制剂。如上所述，许多这些治疗性蛋白与HA融合后其保质期显著增长或延长。
在适合给药气溶胶的情况下，使用标准方法可将本发明的白蛋白融合蛋白配制成气溶胶。术语“气溶胶”包括本发明的白蛋白融合蛋白的任何含气悬浮相，它能够被吸入细支气管或鼻通道。具体地，气溶胶包含本发明白蛋白融合蛋白的含气悬浮小液滴，可以在有刻度剂量的吸入器或雾化器，或在喷雾器中产生。气溶胶还包括悬浮于气体或其它载体气体中的本发明化合物的干粉组合物，例如可以通过从吸入器中吹出而被递送。
该配制剂可方便地配成单位剂量形式并通过任何制药领域已知的方法制备。这种方法包括将白蛋白融合蛋白和组成一种或多种附加成分的载体结合的步骤。通常所述配制剂是通过将所述活性成分和液体载体或者细碎粒状的固体载体或者两种载体按照一致的方式紧密结合，然后如果有必要，对所述产物塑造形状。
适合肠外给药的配制剂包括水性和非水性的无菌注射液以及水性和非水性的悬液，所述注射液含有抗氧化剂，缓冲液，抑菌剂和使得所述配制剂适合给药接受者的溶质；所述悬液包括悬浮剂和增稠剂。该配制剂可置于单位剂量或者多剂量容器中，例如密封的安瓿，小瓶或注射器，并可储存在冻干的条件下，只需在使用前加入无菌的液体载体，例如注射用水。可从无菌粉末制备即时注射液和悬液。剂量配制剂(Dosage formulations)含有的治疗性白蛋白的摩尔浓度或剂量低于治疗性蛋白的非融合(non-fused)的标准配置剂，因为本发明的许多白蛋白融合蛋白的血清半衰期延长。
作为一个实施例，本发明的治疗性白蛋白包含一个或多个治疗性蛋白区，其剂量形式可以根据该白蛋白融合蛋白的效力相对于该治疗性蛋白的效力计算，同时还考虑到白蛋白融合蛋白比天然治疗性蛋白的血清半衰期和保质期延长。例如，在由与全长治疗性蛋白融合的全长HA组成的白蛋白融合蛋白中，等单位剂量表示更大的试剂重量但给药频率却减少了。
本发明的配置剂或组合物可以和试剂盒一起包装，或者包含在试剂盒中，并含有说明书或包装插入页说明该白蛋白融合蛋白组分延长的半衰期。例如，这种说明书或包装插入页可以说明考虑到本发明的白蛋白融合蛋白的增长(extend)或延长(prolong)的保质期而推荐的储存条件，例如时间，温度和光。这种说明书或包装插入页还可以说明本发明的白蛋白融合蛋白的具体优势，例如便于储存需要在野外，受约束的医院、临床或办公室外使用的配置剂。如上所述，本发明的配置剂可以是液体形式的，并且在次理想环境的条件下储存而不会显著丢失治疗活性。
本发明还提供了通过对病人给药可药用的载体中的治疗有效量的本发明的白蛋白融合蛋白或者编码本发明的白蛋白融合蛋白的多核苷酸(“白蛋白融合多核苷酸”)来治疗和/或预防疾病或病症的方法(例如，本文公开的任何一种或多种疾病或病症)。
可通过本领域已知的方法确定给药本发明的白蛋白融合蛋白和/或多核苷酸的有效剂量，所述方法的参数是生物半衰期，生物利用度和毒性，包括使用例如表1的对比文件中描述的常规体外和体内研究的数据，使用本领域熟练技术人员已知的方法。
按与良好的医疗实践一致的方式配置并给药该白蛋白融合蛋白和/或多核苷酸，并考虑到个体病人的临床状况(尤其是单独使用白蛋白融合蛋白和/或多核苷酸治疗的副作用)，递送的位点，给药方法，给药的时间安排，以及其它医师已知的因素。本文的“有效量”是基于上述考虑因素而确定的。
例如，确定递送物质的有效量有赖于多种因素，例如该物质的化学结构和生物活性，病人的年龄和体重，需要治疗的准确情况和严重性，以及给药的途径。治疗的频率有赖于多种因素，给药每剂白蛋白融合蛋白或多核苷酸构建体的量以及受者的健康和病史。准确的量，给药次数，以及给药的时间安排可以由主治医师或有经验的医师确定。
本发明的白蛋白融合蛋白和多核苷酸可以给药任何动物，优选给药哺乳动物和鸟类。优选的哺乳动物包括人，犬，猫，小鼠，大鼠，兔子，绵羊，牛，马和猪，具体优选人。
通常主张本发明的白蛋白融合蛋白给药较低剂量(未融合的治疗性蛋白的摩尔基数)或给药的频率低于未融合的治疗性蛋白。治疗有效量剂量指化合物的剂量足以降低HIV在体内的滴度，缓解症状或疾病稳定或延长病人的生存期或提高生活质量。
本发明的白蛋白融合蛋白的优点在于它们可以模拟连续输注“经典药物”，即相同的抑制活性需要较少的蛋白当量。
本发明的白蛋白融合蛋白具有以下其它优点(i)基于HIV感染的表型的剂量最优化设计，以适合HIV的特定生长，病毒负荷或抵抗性特性(例如快速和慢速生长)；和(ii)在治疗期间控制/维持药物浓度在有效的浓度内。此外，当多肽(例如T-20和T-1249)是疏水性时，其和白蛋白的融合增加其溶解性，也可使生物利用度增加并可配制成更高浓度的配置剂。
例如，未融合的T-20的临床试验中使用了典型的50mg每天两次的剂量(Zhang 2002，Kilby 2002，Kilby 1998)，且在未融合的T-1249的临床试验中使用12.5mg/天到200mg/天的剂量，并显示了剂量相关的HIV抑制作用(Gulick，2002)。预期本发明的白蛋白融合蛋白中T-20或T-1249的剂量或给药频率(即活性部分的摩尔当量)小于未融合的T-20或T-1249的剂量或给药频率。
白蛋白融合蛋白和/或多核苷酸可以通过口服，经直肠，经肠外，脑池内，阴道内，腹膜内，经局部(例如通过粉剂，药膏，胶体，药滴或经皮贴剂)，经颊，或作为口腔或鼻内喷雾剂的方式给药。“可药用的载体”指任何无毒的固体，半固体或液体滤液，稀释剂，胶囊制备材料或其它配制剂辅料。本文所用术语“肠外”给药方式包括静脉内，肌肉内，腹膜内，胸骨内，皮下和关节内注射和输注。
以例如美国临时申请60/355,547和WO01/79480(129-130页)中所述的持续释放系统适宜地给药本发明的白蛋白融合蛋白和/或多核苷酸，该文献包含在本文中作为参考。
对于肠外给药，在一个实施方案中，通常通过按所需的纯度以单位剂量可注射(溶液，悬液或乳液)的形式混合所述白蛋白融合蛋白和/或多核苷酸和可药用的载体，该载体在使用的剂量和浓度下对受者无毒并与配制剂内的其他成分相容。例如，所述配制剂可选不包括氧化剂和其他已知对治疗有害的化合物。
本发明的白蛋白融合蛋白和/或多核苷酸可以单独给药或者和其他治疗剂联合给药。可以和本发明的白蛋白融合蛋白和/或多核苷酸联合给药的白蛋白融合蛋白和/或多核苷酸药剂包括，但不限于，抗逆转录病毒制剂如蛋白酶，逆转录酶，整合酶和组装抑制物；化疗剂，抗生素，类固醇和非类固醇抗炎药剂，传统的免疫治疗剂，和/或例如美国临时申请60/355,547和WO01/79480(132-151页)中所述的治疗剂的治疗，这些文献包含在本文作为参考。可将上述药物的组合同时给药，例如作为混合物同时给药，分别但同时给药；或者序贯给药。所述的给药包括联合的药剂作为治疗性混合物被同时给药的情况，并且还包括联合的药剂分别但同时给药的方法，例如通过分开的静脉内给药通道输入同一个体。“联合”给药进一步包括分开给予化合物或药剂，先给第一种，然后是第二种。
适宜用于本发明的药物组合物包括这样的组合物，其中含有能够获得其预期目的有效量的活性成分。
在特定的实施方案中，本发明的白蛋白融合蛋白和/或多核苷酸可以和逆转录病毒制剂，核苷/核苷酸逆转录抑制剂(NRTIs)，非核苷逆转录抑制剂(NNRTIs)，和/或蛋白酶抑制剂(PIs)联合给药。
本发明还提供了药物包或试剂盒，所述药物包或试剂盒包含一个或几个容器，其中充满一种或几种包含本发明的白蛋白融合蛋白的药物组合物的成分。可选地这样的容器携带由调控药物或生物制品的生产，使用或销售的政府机构规定格式的说明，该说明反映该机构批准了为人类用药所进行的生产，使用和销售。
对发明作了一般性描述后，通过参考以下实施例可以轻易理解相同的内容，所述实施例是用来说明而非限制本发明的。
无需进一步的说明，本领域普通技术人员即可以利用前述和下列的实施例，制造并利用本发明发现的改变，并实施要求保护的方法。因此以下实施例旨在具体说明本发明的一些具体实施方案，不应被理解为以任何方式限制本发明。
实施例实施例1构建N-末段和C-末端白蛋白-(GGS)4GG接头克隆载体重组白蛋白表达载体pDB2243和pDB2244已在专利申请WO 00/44772中描述。重组白蛋白表达载体pAYE645和pAYE646已在英国专利申请0217033.0中描述。修饰质粒pDB2243以在所述白蛋白多肽的C末端引入一种DNA序列，该序列编码14个氨基酸的多肽接头N-GGSGGSGGSGGSGG-C((GGS)4GG，“N”和“C”表示该多肽序列的方向)，使得另一种多肽链可以随后被插入(GGS)4GG接头的C末端产生普通构型的C-末端白蛋白融合物，白蛋白-(GGS)4GG-多肽。类似地，修饰质粒pAYE645以在所述白蛋白多肽的N末端引入编码(GGS)4GG接头的DNA序列，使得另一种多肽链可以随后被插入(GGS)4GG接头的N末端产生白蛋白-(GGS)4GG-多肽的常规构型的N-末端白蛋白融合物。
Sleep，D等(1991)Bio/Technology 9，183-187和专利申请WO 00/44772中所述的质粒pDB2243含有酵母PRBI启动子和酵母ADH1终止子，它们提供了适当的转录启动子和转录终止子序列。用BamHI完全消化质粒pDB2243，用T4 DNA聚合酶和dNTPs使凹陷的末端变成平端，并最后再连接产生质粒pDB2566。
双链的合成的寡核苷酸接头Bsu36I/HindIII接头是通过退火合成的寡核苷酸JH033A和JH033B而合成的。
JH033A5′-TTAGGCTTAGGTGGTTCTGGTGGTTCCGGTGGTTCTGGTGGATCCGGTGGTTAATA-3′(SEQ ID NO12)JH033B5′-AGCTTATTAACCACCGGATCCACCAGAACCACCGGAACCACCAGAACCACCTAAGCC-3′(SEQ ID NO13)退火后的Bsu36I/HindIII接头与HindIII/Bsu36I切割的pDB2566连接以产生质粒pDB2575X，该质粒包含白蛋白编码区，其C末端具有(GGS)4GG肽接头。
含有酵母PRBI启动子和酵母ADHI终止子的质粒pAYE645提供适当的转录启动子和转录终止子序列，其描述见英国专利申请0217033.0.。使用限制性酶AflII完全消化质粒pAYE645，并用限制性酶HindIII部分消化，然后分离包含酵母PRB1启动子3’末端和rHA编码序列的DNA片段。质粒pDB2241在专利申请WO 00/44772中描述，并用AflII/HindIII消化，分离包含酵母PRB1启动子5’末端和酵母ADH1终止子的DNA片段。然后将来自pAYE645的AflII/HindIII DNA片段克隆入AflII/HindIII Pbd2241载体DNA片段以产生出质粒pDB2302。使用PacI/XhoI完全消化质粒pDB2302，并分离6.19kb的片段，凹陷的末端用T4 DNA聚合酶和dNTPs处理成平端，并再连接形成质粒pDB2465。使用ClaI将质粒pDB2465线性化，凹陷的末端用T4 DNA聚合酶和dNTPs处理成平端，并再连接形成质粒pDB2533。使用BlnI将该质粒线性化，凹陷的末端用T4 DNA聚合酶和dNTPs处理成平端，并再连接形成质粒pDB2534。使用BmgBI/BglII完全消化质粒pDB2534，分离6.96kb DNA片段并与两个双链寡核苷酸接头VC053/VC054和VC057/VC058中的一个相连，以产生质粒pDB2540，或与两个双链寡核苷酸接头VC055/VC056和VC057/VC058中的一个相连，以产生质粒pDB2541。
VC053
5′-GATCTTTGGATAAGAGAGACGCTCACAAGTCCGAAGTCGCTCACCGGT-3′(SEQ ID NO14)VC0545′-pCCTTGAACCGGTGAGCGACTTCGGACTTGTGAGCGTCTCTCTTATCCAAA-3′(SEQ ID NO15)。
VC0555′-GATCTTTGGATAAGAGAGACGCTCACAAGTCCGAAGTCGCTCATCGAT-3′(SEQ ID NO16)。
VC0565′-pCCTTGAATCGATGAGCGACTTCGGACTTGTGAGCGTCTCTCTTATCCAAA-3′(SEQ ID NO19)。
VC0575′-pTCAAGGACCTAGGTGAGGAAAACTTCAAGGCTTTGGTCTTGATCGCTTTCG CTCAATACTTGCAACAATGTCCATTCGAAGATCAC-3′(SEQ ID NO20)。
VC0585’-GTGATCTTCGAATGGACATTGTTGCAAGTATTGAGCGAAAGCGATCAAGACCAAAGCCTTGAAGTTTTCCTCACCTAGGT-3′(SEQ ID NO21)。
通过退火合成的寡核苷酸JH035A和JH035B，合成双链的合成的寡核苷酸接头，BglIIlAgeI接头。
JH035A5′-GATCTTTGGATAAGAGAGGTGGATCCGGTGGTTCCGGTGGTTCTGGTGGTTCCGGTGGTGACGCTCACAAGTCCGAAGTCGCTCA-3′(SEQ ID NO22)JH035B5′-CCGGTGAGCGACTTCGGACTTGTGAGCGTCACCACCGGAACCACCAGAACCACCGGAACCACCGGATCCACCTCTCTTATCCAAA-3′(SEQ ID NO23)
将退火后的BglII/AgeI接头连接入BglII/AgeI切割的pDB2540以产生质粒pDB2573X，该质粒包含白蛋白编码区和在其N末端的(GGS)4GG肽接头。
实施例2N-末端和C-末端白蛋白-T-1249融合物的构建构建N-末端T-1249-(GGS)4GG-白蛋白表达质粒通过连接两个合成的DNA片段产生包含T-1249的氨基酸序列的DNA克隆，所述DNA片段的每一个都是从两个互相重叠的合成的寡肽制备的。DNA片段1是通过退火寡核苷酸5′-GTGAGATCTTTGGATAAC-AGATGGCAAGAATGGGAACAAAAGATTAC-3′(SEQID NO 24) 和5′-CACGAGCTTGTTCCAACAAAGCAGTAATCTTTTGTTCCCATTC-3′(SEQID NO25)，然后用Taq DNA聚合酶进行引物延伸反应以产生双链DNA片段而产生的。通过类似的方法产生DNA片段2，使用的寡核苷酸是5′-GTGAGCTCAAATTCAACAAGAAAAGAACGAATACGAATTGCAAAAGTTGGACAAGTGGG-3′(SEQ ID NO26)和5′-CACGGATCCACCGAACCATTCCCACAAAGAAGCCCACTTGTCCAACTTTTGCAATTCGTATTC-3′(SEQ ID NO27)。然后用限制性内切酶BglII/AluI消化DNA片段1，并用限制性内切酶AluI/BamHl消化DNA片段2。然后将这两个片段连接于载体pLITMUS29(New England Biolabs)中，用BglII和BamHl消化产生pLIT-T-1249-N。
使用BamHI和BglII完全消化质粒pLIT-T-1249-N。将0.14kb DNA片段接入BamHI，BglII消化的pDB2573内以产生质粒pDB2667。在EP-A-286424中公开并被Sleep，D.，等(1991)Bio/Technology 9，183-187描述的“中断(disintegration)”质粒pSAC35提供了适宜的酵母菌载体序列。使用NotI完全消化质粒pDB2667并分离3.15kb N末端T-1249-(GGS)4GG-rHA表达盒，然后将该表达盒连接到NotI小牛小肠磷酸酶处理过的pSAC35中，以产生质粒pDB2681。
构建C-末端白蛋白-(GGS)4GG-T-1249表达质粒使用正向引物5′-GTGGGATCCGGTGGTTGGCAAGAATGGGAACAAAAGATTAC-3′(SEQID NO28)和反向引物5′-CACAAGCTTATTAGAACCATTCCCACAAAGAAGC-3′(SEQ ID NO29)从pLIT-T-1249-N扩增PCR片段。使用BamHI和HindIII完全消化所得片段，并接入类似地用BamHl和HindIII消化的载体pLITMUS29中，以产生pLIT-T-1249-C。使用HindIII部分消化质粒pDB2575，然后用BamHI完全消化。分离所需的6.55kb DNA片段并与来自质粒pLIT-T-1249-C的0.13kbBamHI/HindIII片段连接以产生质粒pDB2668。
在EP-A-286 424中公开并由Sleep，D.，等(1991)Bio/Technology 9，183-187描述的“中断”质粒pSAC35提供了适宜的酵母菌载体序列。使用NotI完全消化质粒pDB2668并分离3.15kb C末端rHA-(GGS)4GG-T-1249表达盒，然后将该表达盒连接到NotI小牛小肠磷酸酶处理过的pSAC35中，以产生质粒pDB2682。
实施例3构建N-末端和C-末端白蛋白-T-20融合物基本克隆的产生T-20序列的克隆可通过以下方法进行，对从细胞培养上清中的HIV-1中分离的RNA进行RT-PCR，从而扩增PCR片段，使用的正向引物为5′-GTGCCTTGGAATGCTAGTTG-3′(SEQ ID NO30)，反向引物为5′-CTTAAACCTACCAAGCCTCC-3′(SEQ ID NO31)，然后将T-20的序列克隆到载体pCR4-TOPO(Invitrogen)中产生pCR4-HIV-T-20。
构建N-末端T-20-(GGS)4GG-白蛋白表达质粒使用正向引物DS2235′-CTCTAGATCTTTGGATAAGAGATACACCAGCTTAATACACTCCTTAATTGAA G-3′(SEQ ID NO32)和反向引物DS2245′-CCACCGGATCCACCAAACCAATTCCACAAACTTGCCCATTTATC-3′(SEQ ID NO33)从pCR4-HIV-T-20中扩增PCR片段。使用BglII和BamHI以及0.13kb DNA片段将所述DNA片段完全消化，并将该片段偶联到类似地用BglII和BamHI消化的pDB2573内，以产生pDB2593。通过“中断”质粒pSAC35提供适当的酵母载体序列，该质粒在EP-A-286 424中公开并被Sleep，D.，等(1991)Bio/Technology 9，183-187描述。NotI N-末端T-20-(GGS)4GG-rHA表达盒分离自pDB2593，纯化后接入NotI消化的pSAC35(已经小牛小肠磷酸酶处理)，从而产生出两个质粒，第一个质粒pDB2595，其含有表达方向和LEU2相同的NotI表达盒，而第二个质粒pDB2596含有NotI表达方向和LEU2相反的表达盒。
构建C-末端白蛋白-(GGS)4GG-T-20表达质粒使用正向引物DS2255′-TGGTGGATCCGGTGGTTACACCAGCTTAATACACTCCTTAATTGAAGAATCGC-3′(SEQ ID NO34)和反向引物DS2265′-AATTAAGCTTATTAAAACCAATTCCACAAACTTGCCCATTTATCTAATTCC-3′(SEQ ID NO35)从pCR4-HIV-T-20扩增PCR片段。使用BamHI和HindIII以及0.13kb DNA片段将所述DNA片段完全消化，并将该片段偶联到类似地用BamHI和HindIII消化的pDB2575内，以产生pDB2594。通过“中断”质粒pSAC35提供适当的酵母载体序列，该质粒在EP-A-286 424中公开并被Sleep，D.，等(1991)Bio/Technology 9，183-187描述。NotIC-末端rHA-(GGS)4GG-T-20表达盒分离自pDB2594，纯化后接入NotI消化的pSAC35(已经小牛小肠磷酸酶处理)，从而产生出两个质粒，第一个质粒pDB2597含有表达方向和LEU2相同的NotI表达盒，而第二个质粒pDB2598含有表达方向和LEU2相反的NotI表达盒。
实施例4酵母菌的转化和培养条件公开于WO 95/23857，WO 95/33833和WO 94/04687中的酵母菌株被转化成Sleep D.，等(2001)Yeast 18，403-421中描述的亮氨酸原养型。取出转化体转移到缓冲的基本培养基上(BMM，Kerry-Williams，S.M.等(1998)Yeast14，161-169描述)并在30℃温育直到生长的量足够进行进一步的分析。
实施例5白蛋白T-20融合蛋白的表达和纯化rHA融合物在摇瓶培养中表达，并使用标准白蛋白通过SDS测定其表达水平。rHA-GS-T-20和T-20-GS-rHA的发酵培养(如WO 00/44772所述)上清中的表达水平均＞2g.L-1。
C-末端T-20纯化使用WO 00/44772描述的标准rHASP-FF条件和洗脱缓冲液纯化C-末端T-20。然后使用标准rHA DE-FF条件纯化洗脱物，但在洗脱缓冲液中额外加入了200mM NaCI(该盐浓度不是最优化的，因此可以有变化)。随后浓缩纯化后的物质并用PBS渗滤。
N-末端T-20纯化使用标准rHA SP-FF条件和洗脱缓冲液纯化N-末端T-20。然后使用标准rHA DE-FF条件纯化洗脱物。使用标准洗脱缓冲液和含有200mMNaCl的标准洗脱液洗脱DE-FF。两种洗脱物在SDS-PAGE上的表现不同，并分别作为DE-FF洗脱物#1和DE-FF洗脱物#2被处理。这两种纯化后的物质随后被浓缩至＞5mg/ml并使用10kDa分子量的截留膜(cut-off membranes)以7倍连续体积的PBS进行渗滤。
实施例6通过在4-12％梯度SDS非还原胶体上去除样品，并使用抗-HSA抗体进行Western蛋白印迹，从而表征纯化后的T-20白蛋白融合蛋白。结果显示于图9中。插图说明(A)胶体为Blue Gel；(B)抗-HSA Western蛋白印迹。如下表加样

“SPT9901”是酵母菌发酵培养物上清，它不含有白蛋白或白蛋白融合物。该物质用来显示Western蛋白印迹上检测到的免疫交叉反应是由于表达白蛋白融合蛋白的酵母菌株产生了一些特定的种类，而不是由于抗体和酵母菌(宿主)来源的成分之间的非特异交叉反应性。
实施例7白蛋白T-20融合蛋白的药代动力学动物模型通过单次静脉注射或皮下注射在第0天将白蛋白融合T-20(350μg/kg)给药每组各三只雄性和三只雌性兔子。抽取血样用于测定基线的抗原水平和静脉给药检测物质后5分钟，10分钟，20分钟，30分钟，45分钟，1小时，2小时，4小时，8小时，24小时(1天)，48小时(2天)，72小时(3天)，5天，7天，9天，11天，和14天的抗原水平和基线的抗原水平，以及皮下注射后30分钟，1小时，2小时，4小时，8小时，24小时(1天)，48小时(2天)，72小时(3天)，5天，7天，9天，11天，和14天的抗原水平。
变量药代动力学(PK)变量血浆浓度时间曲线下面积(AUC)，最大浓度(Cmax)，最大浓度时间(tmax)，平均停留时间(mean residence time)，吸收和分布的半衰期(如果适用)，清除，分布体积。
分析方法可用抗人白蛋白ELISA测定白蛋白融合的T-20血浆浓度。白蛋白融合的T-20用于产生标准曲线。ELISA的检测限是5ng/ml。
统计学方法分析个体血浆浓度通过非线性回归分析每只动物的白蛋白融合的T-20的血浆浓度-时间分布图。小于＜5ng/mL的值按5ng/mL处理。从测定的浓度中减去基线测定的浓度值。产生的任何负值都归零。通过最小平方法将数据转化指数模型。对静脉给药后的分布图，使用开放的双隔室模型(open two-compartmentmodel)。对于皮下给药后的分布图，使用一级输入(first-order input)和滞后时间(lag time)的开放单隔室模型(open one-compartment model)。
在皮下治疗的组中，药物动力学分析限于对前七天的血浆浓度水平的分析，这是由于以后推定的抗体形成使得血浆浓度的测定不可信。
在静脉给药治疗组，使用线性梯形规则(linear trapezoidal rule)计算AUC直到最后的测定值(AUC0-14d)。
由于皮下给药组中对前七天的限制，额外计算两组的直至7天的AUC(AUC0-7d)并替换皮下给药组的AUC0-7d。
总结和比较分析总结每种给药途径的个体PK结果(最小值，中间值，最大值，平均值，标准差)。
对主要变量进行了双向差异分析(two-way analysis of variance)，所述变量包括清除半衰期，AUC和Cmax(均转化为log形式)。固定的因素是给药途径。评估治疗组间的适当对照。还考虑到不等差异(unequal variances)的可能性。
为进行分析，假定In(半衰期)，In(AUC)和In(Cmax)都是标准分布的。使用双侧90％可信区间，在α水平为0.1时，比较给药途径间的生物利用度(绝对生物利用度)。
结果T-20-AFP在每个时间点的浓度平均值和标准差都显示在图13中。
在通过静脉给药治疗的动物中，T-20-AFP水平显示的分布期为约10小时，然后是较慢的清除期(elimination phase)。T-20-AFP的水平在14天内保持在100ng/mL以上。
在以皮下注射治疗的动物中，经过2.3小时的平均迟滞期后，出现了T-20-AFP水平。在注射后24到48小时之间，达到峰值水平。在7天内，下降曲线与静脉给药治疗组的曲线几乎完全相同。该时间点后，T-20-AFP水平急剧下降，可能表明抗体有干扰。因此，7天以后测定的值不包括在药代动力学分析中。
结论经静脉应用后T-20-AFP从血浆中清除的最终的平均半衰期是81小时，经皮下应用的半衰期是76小时。这两组的半衰期极为一致，差异在统计学上是不显著的。
静脉应用后，分布期持续10小时，而平均半衰期为4.1小时，然后进入清除期。皮下给药后，平均滞后时间(average lag-time)是2.3小时，然后T-20-AFP的水平升高，其平均吸收半衰期为7.9小时。
皮下应用后，生物利用度的0到7天AUC是72％，而Cmax是28％。这些数据证明了白蛋白显著延长T-20肽的血浆半衰期的能力。据报道，人体内对应于皮下给药45和180mg的T-20肽其终末半衰期(Terminal half-life)分别是3.46和4.35小时(Zhang X等，2002)。加上上述从兔子中获得的数据，估计在人体内与白蛋白融合的T-20肽的血浆半衰期可延长至少10倍。
实施例8白蛋白T-20融合蛋白的体外效力在体外利用细胞-细胞融合试验测定HIV肽白蛋白融合物的抗病毒活性。基本上，将Jurkat细胞悬液(2×106/ml)与HIV抑制剂或对照蛋白溶液以及HIV-1(1.5×105/ml)混合，每种样品均重复测定8次，并在37℃温育4天。评估每种样品的细胞-细胞融合的数量和质量，通过融合事件比对照组的减少测定抗病毒活性。纯化的蛋白和酵母细胞培养物上清适宜这种方法。
PMT1菌株中产生的T-20标准酵母菌产生的rHA-GS-T-20和T-20-GS-rHA被纯化，并在上述试验中筛选其抗病毒活性。对照包括培养基对照(RPMI)，1和3μM重组白蛋白。RHA-GS-T-20的浓度为3μM，在该浓度下，RHA-GS-T-20不显示任何HIV抑制效应，而且融合事件的平均数量与重组白蛋白(Recombumin)对照组相等。这些结果显示在图10中。使用纯化后的T-20-GS-rHA获得了类似的结果(2次洗脱，见实施例6)，但至少1μM的浓度显示了较小的抗病毒效应。O-连接的甘露糖基化很可能解释rHA-GS-T-20缺乏抗HIV活性或T-20-GS-rHA较低的抗HIV活性。该假设由以下试验支持。
Pmt1菌株产生的T-20为减少0-连接的糖基化，磷酸甘露糖转移酶1基因缺陷(pmt1)缺陷的酵母菌株可用于表达rHA-GS-T-20并且目前可观察到显著的抗病毒活性。50％抑制浓度在4和13nM之间(图10)，提示T-20肽的抗病毒活性在类似的范围内(Wild CT等1994.PNAS 919770-9774)。
实施例9C-末端T-1249白蛋白融合蛋白的表达和纯化在摇瓶培养中表达rHA融合物，并使用白蛋白标准品通过SDS-PAGE测定表达水平。发酵培养物(如WO 00/44772中所述，在pH5.5)上清液中rHA-GS-T-1249的表达水平＞2g.L-1。
使用WO 00/44772中所述的标准rHA SP-FF条件和洗脱缓冲液纯化C-末端T-1249。然后使用WO 00/44772中所述的标准rHA SP-FF条件纯化洗脱物，但标准rHA洗脱液是用于洗涤弃去部分并另外含有200mM NaCl的标准rHA洗脱缓冲液进行额外的洗脱。随后纯化后的物质被浓缩到＞5mg/mL并使用10kDa分子量的截留膜以7个连续体积的PBS进行渗滤。
实施例10C末端T-1249白蛋白融合蛋白纯化后的鉴定将样品转移到4-12％的梯度SDS非还原胶体上，并用抗-HAS抗体进行Western蛋白印迹，通过上述方法鉴定纯化后的C-末端T-1249白蛋白融合蛋白。结果显示在图11中。插图说明(A)胶体为Blue Gel；(B)抗-HSAWestern蛋白印迹。如下加载样品

实施例11纯化后白蛋白T-1249融合物的体外效力纯化标准(PMT1)酵母菌株产生的T-1249-GS-rHA(实施例9)并在上述试验中检测其抗病毒活性。图12显示了在10和100nM之间获得50％抑制浓度(IC50)。
参考文献Boyd，M.R.et al.，″Discovery of Cyanovirin-N，a Novel HumanImmunodeficiency Virus-Inactivating Protein That Binds Viral Surface EnyelopeGlycoproteingpl20Potential Applications to Microbicide Development″，Antimicrobial Agents and Chemotherapy，411521-1530(1997)。
Chan，D.C.et al.，″Evidence that a prominent cavity in the coiled coil ofHIV type 1 gp41 is an attractive drug target″，Proc.Natl.Acad.Sci USA，9515613-15617(1998)Chan，D.C.et al.，″HIV entry and its inhibition″，Cell，93681-684；(1998)。
Church，J.A.et al.，″Safety and antiretroviral activity of chronicsubcutaneous administration of T-20 in human immunodeficiency virus1-infected children″，The Pediatric Infectious Disease Journal，21653-659(2002)。
Cohen，C.J.et al.，″Long-Term Treatment with Subcutaneous T-20，aFusion Inhibitor，in HIV-Infected PatientsPatient Satisfaction and Impact onActivities of Daily Living″，AIDS Patient Care andSTDs，16327-335(2002)。
D′Souza，M.P.et al.，″Current Evidence and Future Directions forTargeting HIV Entry″，JAMA，284215-222(2000)Doranz，B.J.，″The use ofEnvelope for HIV therapeuticsfrom vaccines to co-receptors″，EmergingTherapeutic Targets，4423-437(2000)。
Eckert，D.M.et al.，″Design of potent inhibitors of HIV-1 entry from thegp41 N-peptide region″，PNAS，9811187-11192(2001)。
Eckert，D.M.et al.，″Inhibiting HIV-1 EntryDiscovery of D-PeptideInhibitors thatTarget the gp41 Coiled-Coil Pocket″，Cell，99103-115(1999)。
Este，J.A.，″HIV Resistance to Entry Inhhibitors″，AIDS Reviews，3121-132(2001)Greenberg，M.L.，″Enfuvirtide(T-20)and T-1249 resistanceobservations from phase II clinical trials of enfuvirtide in combination with oralantiretrovirals and a phaseI/II dose-ranging monotherapy trial of T-1249″，Antiviral Ther.，7S 106-S 107(2002)。
Gulick，R.et al.，″Complete analysis of T-1249-101Safety，pharmacokinetics and antiviral activity of T-1249，a peptide inhibitor of HIVmembrane fusion″，Program and abstracts of the42 Interscience Conference onAntimicrobial Agents and Chemotherapy，Sept.27-30，2002，San Diego，California.Abstract H-1075。
Gustafson，K.R.et al.，″Isolation，Primary Sequence Determination，andDisulfide Bond Structure of Cyanovirin-N，an Anti-HIV (HumanImmunodeficiency Virus) Protein from the Cyanobacterium Nostocellipsosporum″，Biochemical and Biophysical Research Communications，238223-228(1997)。
Hanna，S.L.et al.，″Resistance mutation in HIV entry inhibitors″，AIDS，161603-1608((2002)。
Kilby，J.M.et al.，″Potent suppression ofHIV-1 replication in humans byT-20，a peptide inhibitor ofgp41-mediated virus entry″，Nature Medicine 41302-1307(1998)。
Kilby，J.M.et al.，″Potent suppression ofHIV-1 replication in humans byT-20，a peptide inhibitor of gp41-mediated virus entry″，Nature Medicine，41302-1307(1998)。
Kilby，J.M.et al.，″The Safety，PlasmaPharmacokinetics，and AntiviralActivity of Subcutaneous Enfuvirtide(T-20)，a Peptide Inhibitorofgp41-Mediated Virus Fusion，in HIV-Infected Adults″，AIDS Research andHuman Retroviruses，18685-693(2002)LaBranche，C.C.，″HIV fusion and itsinhibition″，Antiviral Research，5095-115(2001)。
Lalezari，J.et al.，″A controlled phase II trial assessing three dosesof T-20in combination with abacavir，amprenavir，low dose ritonavir and efivarenz innonnucleoside naive protease inhibitor experienced HIV-1 infected adults″，Program and abstracts of The 8th Conference on Retroviruses and OpportunisticInfections；February4-8，2001；Chicago，IL.Abstract LB5(2001)Qureshi et al.，″Characterization of a putative cellular receptor forHIV-1transmembrane glycoprotein using synthetic peptides″，AIDS，4553-558(1990)。
Rimsky L.T.et al.，″Potent suppression ofHIV-1 replication in humans byT-20，a peptide inhibitorof gP41-mediated virus entry″，Nature Med.，41302-1307(1998)Root，M.J.et al.，″Protein Design of an HIV-1 EntryInhibitor″，Science，291884-888(2001)。
Wei，X.et al.，″Emergence of Resistant HumanImmunodeficiency VirusType 1 in Patients Receiving Fusion Inhibitor (T-20) Monotherapy″，Antimicrobial Agents and Chemotherapy，461896-1905(2002)。
Wild，C.T.et al.，″A Synthetic Peptide fromHIV-1 gp41 Is a PotentInhibitor of VirusMediated Cell-Cell Fusion″，AIDS Research and HumanRetroviruses，91051-1053(1993)Wild，C.T.et al.，″A synthetic peptide inhibitor of humanimmunodeficiency virus replicationCorrelation between solution structure andviral inhibition″，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，8910537-10541(1992)Wild，C.T.et al.，″Peptides corresponding to a predictive a-helical domainof human immunodeficiency virus type 1 gp41 are potent inhibitors of virusinfection″，Proc.Natl。
Acad.Sci.，919770-9774(1994)SCRIP Magazine，September 2002，pp.7-10NAIDS 2001UNAIDS AIDS Epidemic Update December 2001Zhang Xet al.，″Pharmacokinetics of plasma enfuvirtide after subcutaneousadministration to patients with human immunodeficiency virusinverse Gaussiandensity absorption and 2-compartment disposition″.Clinical Pharmacology andTherapeutics 7210-19(2002)。
http∥199.105.91.6/treatment/Drug/ID 141.ASPhttp∥www.thebo dy.com/gmhc/issues/apr01/T-20.htmlUS 5,464,933US 5,656,480US 5,821,081US 5,843,882US 6,060,065US 6,068,973US 6,133,418
US 6,258,782US 6,348,568WO 94/28920WO 99/48513WO 99/59615WO 01/03723WO 01/37896EP 0 652 895所述的具体实施方案是对本发明各个方面的单独描述，而不用来限制本发明的范围，功能上相同的方法和组分都在本发明的范围内。实际上，通过说明书和附图的内容，除本说明显示和描述的内容以外的对本发明的各种修饰，对于本领域熟练技术人员是显而易见的。此种修饰落入所附权利要求的范围内。
以上引用的每篇对比文件的全文内容都包含在本文中作为参考。
权利要求
1.一种白蛋白融合蛋白，它包含HIV融合抑制肽或其片段或变体，和白蛋白或其片段或变体，其中所述自蛋白或其片段或变体具有白蛋白活性。
2.权利要求1的白蛋白融合蛋白，它包括HIV env或其片段或变体，和白蛋白或其片段或变体。
3.权利要求1的白蛋白融合蛋白，其中所述HIV融合抑制肽是与HIVenv结合的肽。
4.权利要求1的白蛋白融合蛋白，其中所述HIV融合抑制肽是HIVgp41或其片段或变体。
5.权利要求1的白蛋白融合蛋白，其中所述HIV融合抑制肽是与HIVgp41结合的肽。
6.权利要求1的白蛋白融合蛋白，其中所述HIV融合抑制肽是T-20或T-1249，或T-20或T-1249的片段或变体。
7.权利要求1的白蛋白融合蛋白，其中所述白蛋白融合蛋白包含至少两种HIV融合抑制肽或其片段或其变体。
8.权利要求7的白蛋白融合蛋白，该融合蛋白包含第一HIV融合抑制肽或其片段或变体，和第二HIV融合抑制肽或其片段或变体，其中所述第一HIV融合抑制肽或其片段或变体与所述第二HIV融合抑制肽或其片段或变体不同。
9.权利要求1的白蛋白融合蛋白，其中与非融合状态下的HIV融合抑制肽或其片段或其变体的体内半衰期相比，所述白蛋白活性具有延长HIV融合抑制肽或其片段或变体在体内的半衰期的能力。
10.权利要求1的白蛋白融合蛋白，还包含一种或多种其它HIV融合抑制肽或其片段或变体，或一种或多种其它白蛋白或其片段或变体。
11.权利要求1的白蛋白融合蛋白，其中所述融合蛋白还包含一个化学部分。
12.权利要求1的白蛋白融合蛋白，其中HIV融合抑制肽或其片段或变体与白蛋白的N末端或该白蛋白片段或变体的N末端融合。
13.权利要求1的白蛋白融合蛋白，其中HIV融合抑制肽或其片段或变体与白蛋白的C末端或该白蛋白片段或变体的C末端融合。
14.权利要求1的白蛋白融合蛋白，其中HIV融合抑制肽或其片段或变体与白蛋白的内部区或该白蛋白片段或变体的内部区融合。
15.权利要求1的白蛋白融合蛋白，其中HIV融合抑制肽或其片段或变体通过接头与白蛋白或该白蛋白的片段或变体分离。
16.权利要求1的白蛋白融合蛋白，其中该白蛋白融合蛋白包括以下结构式R2-R1；R1-R2；R2-R1-R2；R2-L-R1-L-R2；R1-L-R2；R2-L-R1；或R1-L-R2-L-R1，其中R1是至少一种治疗性蛋白，肽或多肽序列(包括其片段或变体)，且不必要是相同的治疗性蛋白，L是接头且R2是血清白蛋白序列(包括其片段或变体)。
17.权利要求1的白蛋白融合蛋白，其中所述白蛋白融合蛋白的体内半衰期比处于未融合状态的HIV融合抑制肽的体内半衰期长。
18.权利要求1的白蛋白融合蛋白，其中与白蛋白或其片段或其变体融合的HIV融合抑制肽或其片段或其变体，其体外生物活性高于未融合状态下的HIV融合抑制肽或其片段或其变体的体外生物活性。
19.权利要求1的白蛋白融合蛋白，其中与白蛋白或其片段或其变体融合的HIV融合抑制肽或其片段或其变体，其体内生物活性高于未融合状态下的HIV融合抑制肽或其片段或其变体的体内生物活性。
20.权利要求1的白蛋白融合蛋白，所述蛋白在酵母中表达。
21.权利要求20的白蛋白融合蛋白，其中所述酵母是糖基化缺陷的。
22.权利要求20的白蛋白融合蛋白，其中所述酵母是糖基化和蛋白酶缺陷的。
23.权利要求1的白蛋白融合蛋白，所述蛋白被哺乳动物细胞表达。
24.权利要求1的白蛋白融合蛋白，所述白蛋白融合蛋白被哺乳动物细胞表达在培养物中。
25.一种组合物，其包含权利要求1-24中任意一项的白蛋白融合蛋白和载体。
26.一种药物组合物，其包含有效量的权利要求1-24中任意一项的白蛋白融合蛋白和可药用的载体或赋形剂。
27.治疗病人的疾病或病症的方法，包括给药有效量的权利要求1的白蛋白融合蛋白的步骤。
28.治疗患有可用HIV融合抑制肽治疗的HIV感染的病人的方法，包括给药有效量的权利要求1的白蛋白融合蛋白的步骤。
29.延长HIV融合抑制肽或其片段或其变体的体内半衰期的方法，包括将所述HIV融合抑制肽或其片段或其变体与白蛋白或白蛋白片段或变体融合的步骤，所述白蛋白或其片段或变体足以延长非融合状态下的该HIV融合抑制肽或其片段或其变体的体内半衰期。
30.延长哺乳动物体内HIV融合抑制肽的的半衰期的方法，所述方法包括将所述HIV融合抑制肽与白蛋白相连接，形成白蛋白融合的HIV融合抑制肽，并将所述白蛋白融合的HIV融合抑制肽给药所述哺乳动物，从而将所述白蛋白融合的HIV融合抑制肽的半衰期延长，超过未连接白蛋白的HIV融合抑制肽的半衰期的至少两倍。
31.一种核酸分子，包含编码权利要求1的白蛋白融合蛋白的多核苷酸序列。
32.包含权利要求31的核酸分子的载体。
33.含有权利要求31的核酸分子的宿主细胞。
34.抑制HIV传染到细胞的方法，包括将细胞与有效浓度的权利要求1的白蛋白融合蛋白或核酸构建体接触有效的一段时间，从而使所述细胞不被病毒所感染，所述核酸构建体能够表达有效浓度的权利要求1所述的白蛋白融合蛋白。
35.中和宿主中的HIV的方法，包括对宿主给药有效浓度的权利要求1的白蛋白融合蛋白或核酸构建体，使得宿主产生的免疫应答足以中和病毒，并抑制病毒感染宿主中未被感染的细胞，所述核酸构建体能够表达有效浓度的权利要求1所述的白蛋白融合蛋白。
36.中和宿主中的HIV的方法，包括对宿主给药有效浓度的权利要求1的白蛋白融合蛋白激发的抗体，从而抑制宿主中未被感染的细胞的病毒感染。
37.最小化用HIV融合肽治疗哺乳动物的副作用的方法，所述方法包括给药白蛋白融合的HIV融合抑制肽或能够对所述哺乳动物表达所述HIV融合抑制肽的核酸构建体。
38.生产权利要求1的白蛋白融合蛋白的方法，所述方法包括(a)提供一种核酸，所述核酸包含编码可在细胞或有机体内表达白蛋白融合蛋白的核苷酸序列；(b)在细胞或有机体中表达所述核酸以形成白蛋白融合蛋白；和(c)纯化所述白蛋白融合蛋白。
39.权利要求38的方法，其中所述白蛋白融合蛋白在糖基化缺陷的酵母菌菌株中表达。
40.权利要求38的方法，其中所述白蛋白融合蛋白在有糖基化能力的酵母菌菌株中表达。
41.用于诱导哺乳动物中对HIV感染的免疫力的疫苗组合物，包括可药用的载体和治疗有效量的权利要求1的白蛋白融合蛋白或能够表达有效浓度的权利要求1所述的白蛋白融合蛋白的核酸构建体。
42.根据权利要求41的疫苗组合物，其中所述哺乳动物是人。
43.诱导哺乳动物中对HIV感染的免疫力的方法，包括对哺乳动物给药治疗有效量的根据权利要求41的疫苗组合物。
44.根据权利要求43的方法，其中所述哺乳动物是人。
全文摘要
本发明涉及包含例如T－20和/或T－1249肽(包括，但不限于其片段及其变体)等的HIV融合抑制肽的蛋白，所述蛋白显示抗逆转录病毒活性，并融合于白蛋白(包括，但不限于白蛋白的片段及变体)。这些融合蛋白在本文中统称“本发明的白蛋白融合蛋白”。这些融合蛋白显示延长的保质期和/或延长的或治疗性活性。本发明包括治疗性白蛋白融合蛋白，组合物，药物组合物，配制剂和试剂盒。本发明还包括编码本发明的白蛋白融合蛋白的核酸分子，以及含有这些核酸的载体，由这些核酸和载体转化的宿主细胞，和使用这些核酸，载体和/或宿主细胞制备本发明的白蛋白融合蛋白的方法。本发明还涉及抑制HIV－诱导的细胞融合的组合物和方法。本发明还涉及抑制HIV传染至未感染细胞的组合物和方法。
文档编号A61P31/18GK1642567SQ03806968
公开日2005年7月20日 申请日期2003年2月7日 优先权日2002年2月7日
发明者汉斯-彼得·豪泽, 托马斯·韦默, 达雷尔·斯利普 申请人:达尔塔生物技术有限公司