专利名称：Mcp蛋白质的新型拮抗剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及通过适当诱变MCP蛋白质而产生MCP蛋白质的新型拮抗剂，具体是人MCP-1蛋白质的新型拮抗剂。
背景技术：
趋化因子是小的分泌性促炎症蛋白质，能介导白细胞从血液定向迁移到损伤部位。根据该蛋白质家族特征性保守半胱氨酸的位置，趋化因子家族可依据其结构分成C、C-C、C-X-C和C-X3-C趋化因子，它们存在着一系列对应的膜受体(BaggioliniM等，1997；Fernandez EJ and Lolis E，2002)。趋化因子通常产生在损伤部位，引起白细胞移行和激活，在炎症、免疫、体内稳态和血管生成过程中起着基础作用。这些分子因此提供了治疗干预这些过程相关疾病的可能性。具体是通过抑制特异性趋化因子和它们的受体，来预防白细胞的过度募集和激活(Baggiolini M等，2001；Loetscher P and Clark-Lewis I，2001；Godessart N and Kunkel SL，2001)。
单核细胞趋化吸引蛋白1(现称为MCP-1)是CC趋化因子家族的成员，也知道其有各种名称，如CCL2、可诱导小细胞因子A2(SCYA2)、单核细胞趋化和活化因子(MCAF)、单核细胞分泌蛋白Je、单核细胞趋化因子和HC11。此趋化因子在各种炎症疾病、不同类型肿瘤、心脏同种移植、AIDS和结核病中，能促进对损伤和感染信号反应中单核细胞和嗜碱性细胞的募集(Gu L等，1999)。
已鉴定到其结构和功能同源性蛋白质，称为MCP-2(CCL7)、MCP-3(CCL8)、MCP-4(CCL13)和Eotaxin(CCL11)。C-C趋化因子的该亚族，与可能从共同祖先序列共进化产生的其它C-C趋化因子，如RANTES或MIP-1α/β显着不同。它们具有相似的受体，结合特定的CCR2(但也结合CCR1、CCR3和CCR5)。因此这些C-C趋化因子的许多免疫和炎症激动剂和拮抗剂活性是共同的(Hughes ALand Yeager M，1999；Berhkout TA等，1997；Luster AD and Rothenberg ME，1997；Proost P等，1996)。
已通过转基因动物和其它动物模型广泛研究了MCP-1相关的生理活性，证明MCP-1在许多感染性、炎症性和自身免疫性疾病中，以及与T辅助细胞应答相关的细胞因子表达中，控制着单核细胞和其它类型细胞(如星状细胞)的募集。表现出来由MCP-1诱导的其它疾病是血管性疾病(冠脉介入手术后的再狭窄、动脉硬化、动脉粥样硬化、局部缺血梗塞、中风)和癌症相关的新血管生成(Ikeda Y等，2002；Egashira K等，2002；Gu L等，2000；Salcedo R等，2000；Gosling J等，1999；Lu B等，1998；Rutledge BJ等，1995)。
由于认为以MCP-1为靶子可作为一些疾病的潜在治疗方法，文献中已有不同类型MCP-1拮抗剂的报导，它们对MCP-1诱导的病理活动获得了或多或少的抑制作用(Dawson J，2003)。MCP-1拮抗剂的例子有N-端缺失的MCP-1突变体、天然或合成的缺失N-端2-10个氨基酸的MCP-1(Egashira K等，2000；Zhang Y andRollins BJ，1995；McQuibban GA等，2002)、抗MCP-1单克隆抗体(Ajuebor MN等，1998；Eghtesad M等，2001)、RNA aptamers(Rhodes A等，2001)、按MCP-1内部序列设计的肽(Reckless J and Grainger DJ，1999)、MCP-1拮抗肽模拟物(Kaji M等，2001)、反义寡核苷酸(WO 94/09128)、小分子(Mirzadegan T等，2000)、聚合物修饰的MCP-1(WO 02/04015)、或病毒性诱骗受体(Alexander JM等，2002；Beck CG等，2001)。
结构上，MCP蛋白质具有一个N-端环和C-端三个β折迭，上有一α螺旋(HandelTM等，1996；Lubkowski J等，1997；Blaszczyk J等，2000)。文献提供了许多结构-活性研究的例子(Gong JH and Clark-Lewis I.，1995；Zhang等，1996；Beall CJ等，1996；Steitz SA等，1998；Gu L等，1999；Hemmerich S等，1999；Seet BT等，2001)，其中通过表达N-端截短物(如在许多其它趋化因子中那样)，或残基3、8、10、13、15、18、19、24、28、30、37、38和39(按成熟的人MCP-1编号)的单个突变物，已获得了对受体或其它结合蛋白质活性和/或亲和力降低的MCP-1突变体。对Eotaxin也获得了类似结果(Mayer MR and Stone MJ，2001)。
趋化因子与蛋白聚糖(PGs)和氨醛聚糖(GAGs)的相互反应，是许多细胞信号传递可溶性分子(白介素，生长因子)的共同特征。蛋白聚糖是阴电荷蛋白质，其经过翻译后修饰在丝氨酸残基上加有氨醛聚糖侧链。碱性残基(主要是精氨酸和赖氨酸)的簇集使该蛋白能与GAGs相互反应，而GAGs是二糖重复单位如肝素、硫酸软骨素、硫酸乙酰肝素、硫酸皮肤素和透明质酸的共同特征。PGs和GAGs可以作为可溶性分子存在膜表面上，可保护该分子免受胞外环境的蛋白水解。也已提出GAGs可能有助于将细胞信号分子正确呈递给它们的特异性受体，因而也可调节靶细胞的激活。就趋化因子而言，其在炎症部位以固定梯度浓集，随之与细胞受体的相互反应和细胞的激活状态似乎受特异性GAG的调节。已清楚证明许多趋化因子，包括MCP-1能与GAGs相互反应并形成这些梯度，测定了它们的相对亲和力。因此有人提出，调节这种相互反应可提供治疗炎症疾病的方法(Hoogewerf AJ等，1997；Kuschert G等，1999；Ali S等，2001；Patel D等，2001；WO 02/28419；WO99/50246)。
然而，对GAG/MCP-1相互反应的结构要求和功能作用研究很少。已知GAGs能调节内皮细胞分泌的MCP-1的活性和产生(Douglas MS等，1997)。也有人报告MCP-1的C-端赖氨酸58和组氨酸66用丙氨酸取代后，阻止了与GAG的结合，但不影响其受体结合、Ca2+流入或趋化活性(Chakravarty L等，1998)，但本领域先前并未揭示哪些可能是MCP-1的其它GAG结合位点，哪些可能是它们消除后的体内效果。即使对某些趋化因子进行了广泛的研究，也不可能根据序列同源性预测哪些残基经非保守性取代修饰可影响到GAG结合，和可获得哪些效果，因为趋化因子的GAG结合区域具有显着的结构多样性(Lortat-Jacob H等，2002)。
发明概述已发现人MCP-1的N-端双碱基位点(精氨酸18，赖氨酸19)负责MCP-1与GAGs的相互反应。用非保守性取代(如用丙氨酸)消除此位点能产生MCP-1突变体，其不仅与GAG相互反应力降低，而且令人惊奇地在体内对MCP-1具有剂量相关的拮抗活性。可利用此现象来开发MCP-1和其它MCP蛋白的突变体，用作相应MCP蛋白质的拮抗剂。本发明制备的化合物可用于抑制表达MCP受体的白细胞的迁移和活化，从而为治疗白细胞迁移过度或失控相关的疾病，如炎症和自身免疫性疾病，提供了有用的治疗组合物。本发明的其它特征和优点将从以下详细说明中得以明白。
图1(A)如实施例中表达并测定的人和突变体MCP-1蛋白的氨基酸序列(下划线表示突变的氨基酸)。纯化过程中用氨基肽酶处理，除去MCP-1WT*和MCP-1WT*2A中N-端甲硫氨酸，以避免此附加残基对该蛋白质活性的任何干扰。
(B)成熟形式的人MCP-1(CCL2；SWISSPROT Acc.No P13500)、MCP-2(CCL7；SWISSPROT Acc.N°P80075)、MCP-3(CCL8；SWISSPROT Acc.No P80098)、MCP-4(CCL8；SWISSPROT Acc.No Q99616)和Eotaxin(CCL11，SWISSPROT Acc.NoP51671)。本专利申请中，MCP-1内相同的碱性残基包括括弧内能与GAGs(残基18和19)结合及其它有更多的同源性人蛋白质中相应的保守残基。所有人MCP蛋白中其它碱性的保守残基用下划线表示。
图2此图提供用[3H]-肝素和作为趋化因子的MCP-1*WT(○)或MCP-1WT*2A(●)进行肝素结合试验的结果。
图3此图提供了平衡性竞争受体结合试验的结果，通过监测加入hMCP-1(□)、MCP-1WT*(○)或MCP-1WT*2A(●)作为趋化因子，取代表达CCR2的CHO(细胞膜)的[125I]-MCP-1后的效果。
图4此图提供用THP-1细胞和作为趋化因子的重组人MCP-1(□)、MCP-1WT*(○)或MCP-1WT*2A(●)，进行转移孔趋化因子试验(transwell chemotaxis assay)的结果。
图5此图小结了用MCP-1WT*和/或MCP-1WT*2A在小鼠中进行腹膜细胞募集试验的结果。图中用*号表示对MCP-1WT*募集的细胞数抑制活性具有统计学意义的MCP-1WT*2A浓度。
图6此图小结了迟发性接触超敏试验的结果。小鼠用0.5mg/kg MCP-1WT*2A(■)或只用运载体(□)处理。以处理期间每天耳肿胀程度评定其效果。
图7此图小结了对服用博来霉素诱导肺纤维化小鼠体重的影响。将对照鼠(□)的平均体重与接受处理的鼠(腹腔内注射0.25mg/kg MCP-1WT*2A(●))或只注射PBS(○)小鼠的平均体重作比较。所示体重是各组小鼠的平均体重值。
图8此图比较了未处理和用博来霉素处理，外加腹腔内只注射PBS或0.25mg/kg MCP-1WT*2A的小鼠中的纤维化水平。纤维化水平用实施例中所述分光光度法(上)或组织学方法(下)测定。
图9此图比较了实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)动物模型只用PBS(组1)、1μgMCP-1WT*2A/小鼠(组2)、或10μg MCP-1WT*2A/小鼠(组3)处理所测得的临床评分。
图10此图比较了胶原诱导的关节炎(CIA)动物模型只用PBS、或1μgMCP-1WT*2A/小鼠处理所测得的临床评分。
图11此图比较了从只用PBS(组1)处理和攻击、用PBS处理和用卵白蛋白攻击(组2)、或用10μg/小鼠MCP-1WT*2A处理和用卵白蛋白攻击(组3)动物模型气管分离所得的细胞量。
发明的具体描述鉴于上述文献所述，尚不清楚人MCP-1的N-端特异性双碱性(氨基酸)位点是否界定了的GAG的结合位点，而此位点残基的非保守性取代可导致产生对MCP-1具有拮抗活性的分子。然而，鉴于此双碱性(氨基酸)位点在已知MCP蛋白中的保守性，以及其它碱性氨基酸和/或已知参与GAG结合的残基的保守性，可推断通过非保守性取代相应的人MCP-1中功能特征性的残基，可获得MCP蛋白的拮抗剂。
本发明的主要目的是提供由MCP蛋白突变体组成的MCP蛋白质的新颖拮抗剂，这些突变体是将人成熟的MCP-1序列中以下编号的残基组合被替代为丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸或谷氨酰胺a)18和19；b)18和/或19，加上58；c)18和/或19，加上66；d)18和/或19，加上58和66；e)18和/或19，加上以下24、44、49、75中的一个或多个。
本专利申请提供上述组合的具体实施例，即精氨酸18和赖氨酸19用丙酸取代的新颖重组MCP-1突变体获得的令人吃惊的体内和体外数据。这些结果，与其它高度保守MCP蛋白的序列和结构知识相结合，提示此双碱性(氨基酸)位点不仅在MCP蛋白质生物活性中起着主要作用，而且可在这些同源性蛋白质中进行相应的修饰以获得拮抗分子。
为获得具有拮抗性能的分子，以非保守性方式突变MCP蛋白质中的碱性残基必须是18和19位的二个残基、至少18和19位碱性残基之一加上已知参与GAG结合的残基如58和66(Chakravarty L等，1999)中至少一个、或至少18和19位碱性残基之一加上在所有的人MCP蛋白中保守的其它碱性残基(图1B；berhkoutTA等，1997)中至少一个。取代该碱性残基的氨基酸宜为非极性小氨基酸，如丙氨酸或甘氨酸，但其它氨基酸也适合，只要它们带有电荷，而且大小几乎不会干扰该蛋白质的结构，同时与GAG结合不相容，如丝氨酸、苏氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸或谷氨酰胺。
因此，本发明的主要目的是提供含有上述突变组合，和可作为MCP蛋白拮抗剂的MCP蛋白质突变体。
术语“MCP蛋白的拮抗剂”指可作为相应的成熟性全长天然产生的(野生型)MCP蛋白质的拮抗剂的任何份子。本领域的技术人员知道MCP-1拮抗剂包含有(序列)修饰。
本申请的含义中，术语MCP蛋白质包括人MCP-1、人MCP-2、人MCP-3、人MCP-4和人Eotaxin(图1B；此图显示了相应的SWISSPROT登录号)，以及具有与人成熟的MCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-4、或Eotaxin至少70％，优选80％和更优选90％同源性，并在所有上述位置中含有碱性阳电荷的氨基酸(精氨酸、赖氨酸或组氨酸)的任何其它蛋白质。
本发明的另一主题是选自以下的MCP蛋白质的拮抗剂a)上述MCP蛋白质突变体中有一个或多个加入、缺失或取代的氨基酸残基而不干扰其拮抗活性的活性突变体；b)根据(a)所述多肽或肽的序列和/或结构所设计的肽模拟物；c)多肽或肽，其含有(a)或(b)所述氨基酸序列和属于相应MCP蛋白质以外的某一蛋白质序列的氨基酸序列；d)上述(a)、(b)或(c)的活性组分、前体、盐或衍生物。
上述MCP突变体的拮抗性质，在本专利申请中以MCP-1WT*2A为例作为MCP-1的拮抗剂，可以活性突变体(形式)保持或甚至加强。该分子的类型包括所述序列的天然或人造同类物，其中有一个或多个氨基酸残基的加入、缺失或取代，只要它们用本领域已知的和下述实施例说明的方法测定时能显示本发明特征性的同样生物活性，水平相当或更高。
例如，可接受的取代应针对于不参与GAG结合的残基，如实施例中所示，用异亮氨酸取代64位的甲硫氨酸(MCP-1WT*2A；SEQ ID NO3)可改进纯化而不会改变人MCP-1的基本性能。本发明的另一目的因此是具有MCP-1WT*2A相应序列(SEQ ID NO3)的MCP-1拮抗剂。或者，除了取代针对参与GAG结合的该残基外，MCP-1拮抗剂可如已知的MCP-1 N-端缺失突变体(Egashira K等，2000；Zhang Y and Rollins BJ，1995；McQuibban GA等，2002)那样，短少2-10个N-端氨基酸，而可能获得改进的拮抗性能。
天然同类物，指人或其它生物中认定的MCP蛋白质的相应序列，如小鼠MCP-1(SWISSPROT Acc.No P10148)。人造同类物，指用已知的化学合成和/或定点诱变技术或任何其他已知的合适技术制备的肽，它们提供了本领域普通技术人员可用本领域先前报导的和本专利申请实施例中提供的方法，能常规地获得并测定的一组有限数量的基本上相对应的突变或截短的肽，或多肽。
根据本发明，这些活性突变中优选的变化是众所周知的“保守性”或“安全性”取代，涉及非碱性残基。保守性氨基酸取代是用具有充分相似化学性能的氨基酸的取代，以保存该分子的结构和生物功能。已知可在上述序列中进行氨基酸插入和缺失而不会改变它们的功能，特别是如果这种插入或缺失仅涉及少数氨基酸，如10个以下，优选3个以下，并且不去除或置换蛋白质或肽功能构象的关键性氨基酸。
文献中提供了关于以天然蛋白质序列和/或结构的统计学和理化研究为基础，进行保守性氨基酸取代选择的许多模型(Rogov SI and Nekrasov AN，2001)。蛋白质设计实验已证明，采用特异性的氨基酸亚组可产生可折迭的活性蛋白质，有助于蛋白质结构中可能更易容纳的氨基酸“同义”取代的分类，该氨基酸“同义”取代可被用于检测功能和结构同类物和共生同源物(Murphy LR等，2000)。同义氨基酸分组和更优选的同义组见表1。
基于这些技术进行取代而产生的活性突变体，以及消除或增加一个或多个氨基酸产生的活性突变体，均在本发明的目的之内，即新颖的MCP蛋白突变体与GAG结合能力差，对相应的MCP蛋白的拮抗活性与最初选出的突变体相当，或如可能甚至更好。
上述替代化合物，指包括上述MCP蛋白质突变体的序列有所改变但不影响本专利申请所述基本特征，特别是所关注的它的作为拮抗剂的活性能力。类似的化合物可得自常规诱变编码DNA的技术，编码DNA序列水平上的组合技术(如DNA改组、噬菌体展示/选择)，或计算机辅助设计研究，然后如本领域先前所述和下述实施例所示进行所需活性的验证。
可获得上述MCP突变体的肽模拟物(也称为模拟肽)形式的特异性拮抗剂，其中所述肽或多肽的性质已在氨基酸侧链水平上、氨基酸手性和/或肽骨架水平上作了化学修饰。这些替代物目的是提供具有类似的或改进的治疗、诊断和/或药物学动力性能的MCP拮抗剂。
例如，当所述肽对肽酶的切割敏感时，将其注入患者可产生问题；用不可切割的肽模拟物代替特别敏感的肽键可提供更稳定因而治疗上更有用的肽。与此相似，取代L-氨基酸残基是赋予肽对蛋白酶水解不敏感的标准方法，最终的产物更类似于有机化合物而不是肽。其它有用的是氨基未端封闭基团，如叔丁氧基羰基、乙基、乙酰基、琥珀酰基、甲氧基琥珀酰基、环庚基、己二酰基、壬二酰基、1-二甲胺基萘-5-磺酰基、苄氧基羰基、芴基甲氧基羰基、甲氧基-壬二酰基、甲氧基己二酰基、甲氧基环庚基和2，4，-二硝基苯基。其它许多修饰可提供的效能提高，活性延长，纯化容易和/或半衰期增长，这已为本领域所知(WO 02/10195；Villain M等，2001)。肽模拟物中所含的优选替代“同义性”氨基酸分组见表2中所述的那些。
合成和开发肽模拟物及非肽模拟物的技术是本领域熟知的(Sawyer TK，1997；Hruby VJ and Balse PM，2000；Golebiowski A等，2001)。采用体内和体外翻译系统在蛋白质中掺入非天然氨基酸，以探索和/或改进蛋白质结构和功能的各种方法文献中也有说明(Dougherty DA，2000)。文献中报告的MCP-1拮抗性肽模拟物与MCP-1无高度同源性(Kaji M等，2001)。
本专利申请公开了具有MCP拮抗性的多肽或肽，其含有上述氨基酸序列，和属于相应MCP蛋白质以外的某一蛋白质序列的氨基酸序列的多肽或肽。后一异源性序列应可提供额外的性能但不明显损伤其拮抗活性，或提供GAG结合性能。这些额外的性能的例子是较易纯化过程，在体液中半衰期持续更长，或可胞外定位。这后一特性对上述定义所包括的融合或嵌合性蛋白质的特异性基团是特别重要的，因为它能将作为本专利申请的MCP拮抗剂的分子，定位在不仅有利于这些肽的分离和纯化，而且有利于MCP蛋白与它们的天然受体相互反应的部位。
可用于产生(c)中所述多肽或肽的其它蛋白质序列，是膜结合蛋白的胞外结构域、免疫球蛋白的恒定区、多聚化功能域、胞外蛋白质、含信号肽的蛋白质、含输出信号的蛋白质。选择一个或多个这些序列，与MCP蛋白的突变体融合，对所述制剂的具体应用也起着功能作用。作为一个通用方法，这些融合蛋白可用常规基因工程技术产生编码它们的核酸区段，将其克隆入可复制性病毒载体或质粒中，采用游离体形式或非同源性/同源性整合载体，以及转化、传染或转染为基础的技术，用于修饰原核或真核宿主细胞。这些载体应能在它们自己的转录起始/终止调节序列(选择它们是因其在所述细胞中有组成性活性或可诱导活性)控制下，在原核或真核宿主细胞中表达含有MCP拮抗剂的融合蛋白。然后可分离实质上富含此类细胞的细胞系来提供稳定的细胞系。
当该加入的蛋白质序列，如果是胞外蛋白质、含输出信号的蛋白质或含信号肽的蛋白质的序列时，可使MCP拮抗剂分泌到胞外间隙中，因而更易从培养的细胞中收集和纯化所述物质用于进一步加工，或者，可直接采用或给予所述细胞。
本发明的多肽或肽可采取其它替代形式，根据所希望的应用和/或生产方法优化，例如活性组分、前体、盐、衍生物、偶联物或复合物形式。
术语“活性”指应能保持本发明MCP突变体的功能特征，并为药学上可接受和使用的那些替代化合物。
术语“组分”指所述化合物本身的多肽链的任一片段，单独或与其结合的相关分子或残基，例如糖残基或磷酸基的联合，或最初的多肽或肽的凝聚物。这类分子也可产生自通常不会改变一级序列的其它修饰，如体内或体外的肽化学衍生(乙酰化或羰基化)，通过在肽合成和加工过程中或进一步加工步骤中，修饰其磷酸化(导入磷酸酪氨酸、磷酸丝氨酸或磷酸苏氨酸残基)或糖基化(使肽接触能影响糖基化的酶，如哺乳动物糖基化酶或脱糖基化酶)模式。
“前体”是在给予细胞或机体前或后，通过代谢和酶加工可转变成本发明化合物的化合物。
术语“盐”本文指本发明的肽、多肽或其同类物的羧基盐和氨基的酸加成盐。可通过本领域已知的方法形成羧基盐，包括无机盐，如钠、钙、铵、铁或锌盐等，含有机碱的盐是例如，含胺基如三乙醇胺、精氨酸或赖氨酸、哌啶、普鲁卡因等的那些盐。酸加成盐包括，例如，含无机酸如盐酸或硫酸的盐，含有机酸如乙酸或草酸的盐。任何一种这类盐应具有与本发明的肽或多肽或它们的同类物基本相似的活性。
术语“衍生物”本文用于指可按照已知方法从氨基酸组成的两侧链上的功能基团，或N-/C-末端基团制备的衍生物。这类衍生物包含有，例如酯或羧基的脂肪簇酰胺，和游离氨基的N-酰基衍生物，或游离羟基与酰基如醇酰基或芳酰基形成的O-酰基衍生物。
本发明MCP拮抗剂的有用的偶联物或复合物可用本领域已知的分子和方法，与受体或其它蛋白质(放射活性标记或荧光标记、生物素)相互反应而产生，为改进其治疗效果(细胞毒性剂)，或改进制剂的药物输送效果，可采用例如聚乙二醇和其它天然或或合成的聚合物(Pillai O and Panchagnula R，2001)。
本发明的化合物可用本领域熟知的方法制备，包括上述重组DNA相关技术，和化学合成技术。
本发明另一主题是含有编码本发明MCP突变体DNA序列的DNA分子，它们含有基本上相同的核苷酸序列。“基本上相同的核苷酸序列”包括借助于遗传密码子的简并性编码上述给定氨基酸序列的所有其它核酸序列。
本发明还包括含有上述DNA的表达载体、用此类载体转化的宿主细胞，和通过在适当的培养基中培养所述转化细胞并收集表达的蛋白质制备本发明MCP拮抗剂的方法。
可将编码本发明蛋白质的DNA序列插入和连接入适当的质粒中。一旦形成表达载体，可将其导入适当的宿主细胞，表达该载体来产生所需的蛋白质。
采用适当的表达载体，上述本发明的任何重组蛋白质可在真核细胞(如酵母菌、昆虫或哺乳动物细胞)或原核细胞中有效表达。可采用本领域已知的任何方法。
例如，可用本领域熟知技术，将上述任一方法获得的编码所述蛋白质的DNA分子插入到适当构成的表达载体中。用同聚物尾接或限制性连接将双链cDNA连接于质粒载体，涉及采用合成的DNA接头或平端连接技术利用DNA连接酶连接该DNA分子，并用碱性磷酸酶处理来避免不需要的连接。
为了能表达所需蛋白质，表达载体还应含有特定的核苷酸序列，此序列含有与编码所需蛋白质DNA相连接的转录和翻译调控信息，以此种方式可使基因表达和产生所述蛋白质。为了转录该基因，必须先由RNA聚合酶鉴定启动子，RNA聚合酶结合启动子后启动转录过程。有各种各样的此类启动子可用，它们的工作效率不同(强和弱启动子)。
对于真核细胞宿主，可采用不同的转录和翻译调控序列，取决于该宿主的性质。它们可来源于病毒，如腺病毒、牛乳头瘤病毒、猿猴病毒等，其中调控信号与具有高表达水平的特定基因相连。例子是疱疹病毒的TK启动子、SV40的早期启动子、酵母菌的gal4基因启动子等。可选择转录启动调控信号以便抑制和活化，从而调节该基因的表达。
将含有编码本发明蛋白质的核酸序列的DNA分子插入已操作性连接于转录和翻译调控信号，因而能将所需基因序列整合入宿主细胞的载体中。
也可通过导入能够选择含有表达载体的宿主细胞的一种或多种标志，以选择受该导入的DNA稳定转化的细胞。这类标志还可向营养缺陷性宿主提供光营养、抗微生物抗性，如抗生素或重金属如铜等的抗性。可将该选择性标志基因直接连接于待表达的DNA基因序列，或通过共转染导入同一细胞中。
也可采用该载体的附加元件来获得本发明蛋白质的最佳产量，特别是用于选择含有质粒或病毒载体的特定细胞；借助该元件可易于识别含有该载体的受体细胞并从不含该载体的受体细胞中选出它们；在特定宿主中产生该载体所需的拷贝数；以及是否需要能使该质粒“穿梭”于不同种宿主细胞之间。
一旦制备好用于表达的含所述构建物的载体或DNA序列后，可用各种合适的方法转化、转染、偶联、原生质融合、电穿孔、磷酸钙沉淀、直接显微注射等中的任一种，将该DNA构建物导入合适的宿主细胞中。
宿主细胞可以是原核或真核细胞。优选为真核宿主，例如哺乳动物细胞诸如人、猴、小鼠和中国仑鼠卵巢(CHO)细胞，因它们能向蛋白质分子提供翻译后修饰，包括正确折迭或在正确位点糖基化。酵母菌也能进行翻译后肽的修饰包括糖基化。已有许多利用强启动子序列和高拷贝数质粒的重组DNA策略，可用于在酵母菌中生产所需蛋白质。酵母菌可识别克隆的哺乳动物基因产物上的前导序列，并分泌带有前导序列的肽(即前肽)。
导入所述载体后，在选择性培养基上培养宿主细胞，该培养基的选择是能使含有载体的细胞生长。克隆基因序列的表达导致产生所需的蛋白质。
本发明的这些目的可通过将本专利申请所提供的的关于MCP蛋白质拮抗剂的内容，与常用的分子生物学技术知识相结合而实现。许多综述(Makrides SC，1999)和书籍提供了怎样采用载体和原核或真核宿主细胞来克隆和产生重组蛋白质的技术，如以下系列化书籍的一些题目“A Practical Approach”牛津大学出版社出版(“DNA Cloning2Expression Systems”，1995；“DNA Cloning 4MammalianSystems”，1996；“Protein Expression”，1999；“Protein Purification Techniques”，2001)。
化学合成技术的例子是固相合成和液相合成。当固相合成时，例如，将待合成的肽的C-末端相应氨基酸固定在一种有机溶剂不溶的支持物上，通过交替重复反应，将含氨基和受相应保护基团保护的侧链功能基团的氨基酸，从C-末端一个接一个地缩合连接至N-末端，并使该肽结合于树脂的氨基酸或氨基的保护基团释放，以此种方式延伸肽链。固相合成方法主要分成tBoc法和Fmoc法，取决于所用的保护基团类型。通常采用的氨基保护基团包括tBoc(叔丁氧基羰基)，Cl-Z(2-氯苄氧羰基)，Br-Z(2-溴苄氧羰基)，Bzl(苄基)，Fmoc(9-芴基甲氧羰基)，Mbh(4，4’-二甲氧基二苯甲基)，Mtr(4-甲氧基2，3，6-三甲基苯磺酰基)，Trt(三苯甲基)，Tos(甲苯磺酰基)，Z(苄氧基羰基)和Cl2-Bzl(2，6-二氯苄基)；胍基保护基团为NO2(硝基)和Pmc(2，2，5，7，8-五甲基苯丙二氢吡喃-6-磺酰基)；羟基保护基团为tBu(叔丁基)。合成所需肽后，使其经历脱保护反应从固相支持物上切下。这种肽切除反应对Boc法可用氟化氢或硫酸三氟甲烷进行，对Fmoc法用TFA进行。全合成性MCP蛋白质见文献(BrownA等，1996)。
本发明的天然、合成或重组的MCP拮抗物的纯化，可采用用于此目的的任何一种已知方法进行，即任何常规方法包括抽提、沉淀、层析、电泳等。可用于优先纯化本发明蛋白质的另一种纯化方法是亲和层析法，该方法使用单克隆抗体或亲和基团，其能结合靶蛋白并生产和固定在柱中所含凝胶基质上。使含有所述蛋白的不纯制品通过此柱。所述蛋白质通过肝素或特异性抗体结合于该柱上，杂质则流穿而过。洗涤后，通过改变pH或离子强度从凝胶上洗脱所述蛋白质。或者，可采用HPLC(高效液相层析)。可采用常用于蛋白质纯化的水乙腈溶剂进行洗脱。本发明包括本发明化合物的纯化制品。本文所用的纯化制品指含有本发明化合物干重至少1％，优选至少5％的制品。
本发明另一目的是将上述MCP拮抗剂用作药物，特别是用作药物组合物中的活性成分(与药学上可接受的运载体、赋形剂、稳定剂或稀释剂组合配制)，以治疗或预防因MCP蛋白质不良活性致使表达其受体的白细胞过度迁移和激活所致的相关疾病，如自身免疫病和炎症疾病及细菌和病毒感染。这些疾病的非限制性例子有以下关节炎、类风湿关节炎(RA)、牛皮癣关节炎、牛皮癣、骨关节炎、系统性红斑狼疮(SLE)、全身性硬化症、硬皮病、多肌炎、肾小球肾炎、纤维化、肺纤维化、变态性或过敏性疾病、皮炎、IV型过敏也称为迟发性过敏反应或DTH、哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、炎症性肠病(IBD)、Crohn’s病、溃疡性结肠炎、多发性硬化症、败血性休克、HIV感染、移植、移植物抗宿主疾病(GVHD)、子宫内膜移位症、胰腺炎、甲状腺炎、脑病。
回顾关于本主题的文献，MCP蛋白质拮抗剂可作为药物组合物的活性成分，用于治疗或预防MCP蛋白不良活性相关的其它疾病，如血管疾病(冠脉介入手术后再狭窄、动脉硬化、动脉粥样硬化、局部缺血、中风)或癌症。
因此，本发明的另一主题是治疗或预防上述疾病的方法，该方法包括给予有效量的本发明MCP蛋白拮抗剂。
所述药物组合物除MCP拮抗剂外，可含适当的药学上可接受的运载体、生物相容性运载体和适合给予动物的添加剂(如生理盐水)，甚至可含有促进该活性化合物加工成为药学上可用的制品的辅助剂(如赋形剂、稳定剂或稀释剂)。这类组合物实际上可与具有协同作用的其它治疗组合物合用，或与本发明MCP突变体以协同方式合用。例如，已证明CC-趋化因子拮抗剂与环胞菌素合用有类似的协同性能(WO 00/16796)。另外，可采用其它已知具有治疗作用的组合物来治疗特定的疾病(如IFN-β治疗多发性硬化症，可溶性肿瘤坏死因子(TNF)受体治疗类风湿关节炎)。
可按符合给药方式需要的可接受方法配制药物组合物。例如，文献中已报导了采用生物材料和其它聚合物递送药物，及不同的技术和方法验证给药的具体方式(Luo B and Prestwich GD，2001；Cleland JL等，2001)。
“有效量”指所述活性成分的给药量足以影响疾病进程和严重程度，导致病理过程减轻或缓和。有效量取决于给药途径和病人状况。
“药学上可接受的”指包含不会干扰所述活性成分生物活性作用，并对给予的宿主无毒性的任何运载体。例如，肠胃道外给药时，上述活性成分以单位剂量形式配制在运载体，如盐水、葡萄糖溶液、血清白蛋白和Ringer溶液中，供注射用。
为建立所述活性成分理想的血液水平，本领域技术人员可利用并确定给药的可接受方式。例如，可通过各种肠胃道外途径给药，如皮下、静脉内、皮内、肌肉内、腹腔内、鼻内、透皮、直肠内、口服或口颊途径。肠胃道外给药可以是药团注射或长时间逐步灌输。非肠胃道给药的制剂包括无菌水溶液或非水溶液、悬浮液和乳液，可含有本领域已知的辅助剂或赋形剂，可按常规方法制备。此外，所述活性化合物的悬浮液可作为适当的油性注射悬液给予。合适的亲脂性溶剂或运载体包括脂肪油类，例如芝麻油或合成的脂肪酸酯，例如油酸乙酯或甘油。水性注射用悬浮液可含有能增加悬液粘度的物质，如羧甲基纤维素钠、山梨醇和/或葡聚糖。任选地，该悬浮液也可含稳定剂。药物组合物包含适合注射给药的溶液，含有约0.01-99％，宜含约20-75％的活性化合物和赋形剂。可以直肠给药的组合物包括栓剂。
可理解，给药剂量取决于接受者的年龄、姓别、健康状况和体重、同时也取决于并行治疗(如果有的话)、治疗的频率和所需效果的性质。剂量应视各个对象而定，这是该领域技术人员知道和可确定的。对于每一治疗所需的总剂量可以是按分次剂量方式或以一次剂量方式给予。本发明的药物组合物可单独给药或与其它针对该疾病或针对该病其它症状的治疗剂联合给药。通常活性成分的每日剂量在每公斤体重0.01-100毫克。通常每天每公斤1-40毫克分成几次给予或以缓释形式给予，有效地获得所需结果。再次或后续给药的剂量可与初次或原先给予个体的剂量相同、较少或较高。
本发明通过参考具体实施例进行描述，但描述的内容包括本领域技术人员可执行的所有修饰和替代，这些均不超出本文权利要求所述的内容和目的。
现在本发明将通过以下实施例进行描述，这些实施例不以任何方式构成对本发明的限制。实施例将参考附图进行以下说明。
具体实施例方式
实施例1非肝素结合MCP-1突变体MCP-1WT*2A的体外特征材料和方法MCP-1突变体MCP-1WT*和MCP-1WT*2A的表达MCP-1突变体通过体外PCR诱变编码人MCP-1(hMCP-1；图1；SEQ ID NO1)，特别是成熟形式的人MCP-1的DNA序列而产生，其相应于该前体分子的24--99区段(SWISSPROT Acc No P135OO)。
首先产生编码称为MCP-1WT*的活性突变体MCP-1蛋白的质粒。其中在编码人MCP-1序列的N-端(24-99)加上一个甲硫氨酸起始密码子，一个内部甲硫氨酸(前体蛋白的87位氨基酸和成熟蛋白的64位氨基酸)用异亮氨酸替代。当该质粒用于在大肠杆菌中表达时，此种替代可避免形成含甲硫氨酸亚砜的不良MCP-1种类，而不影响MCP-1的典型性能(Paavola CD等，1998)。将得到的序列，称为MCP-1WT*，通过采用以pET3质粒为基础的质粒克隆入大肠杆菌中并在其中表达(Paavola CD等，1998)，产生含77个残基的蛋白质(图1A；SEQ ID NO2)。
然而该表达MPC-1WT*的质粒进一步由一PCR片段的克隆所诱变，所述PCR片段编码在人MCP前体中41和42位(在成熟蛋白的18和19位)上取代精氨酸和赖氨酸的2个丙氨酸，此种诱变产生与MCP-1WT*有相同长度和纯化性能的MCP-1突变体MCP-1WT*2A(图1，SEQ ID NO.3)。
获得的所有构建物用标准分子生物学技术控制(PCR诱变和扩增、DNA测序、限制性酶消化)，克隆过程维持在大肠杆菌DH5α菌株中进行。选择的编码序列具有可用于在大肠杆菌中表达的最适密码子(Kane JF，1995)。
将编码MCP-1WT*和MCP-1WT*2A的pTE3质粒转移到大肠杆菌BL21(pLYs)衍生菌株TAP302中，所得菌株用于上述MCP-1突变体的重组表达(Paavola CD等，1998)。此方案包括采用氨基肽酶去除N-端甲硫氨酸，如此获得的重组MCP-1突变体具有与天然成熟形式相同的长度(76个氨基酸；图1B)。通过质谱验证此重组蛋白的同一性。
MCP-1WT*和MCP-1WT*2A的层析法试验将MCP-1WT*和MCP-1WT*2A加载到肝素Sepharose柱上或SP Sepharose阳离子交换柱上。两柱均用10mM磷酸钾(PH7.5)平衡，用同一缓冲液配的0到1MNaCl以线性梯度洗脱该蛋白质。
MCP-1WT*和MCP-1WT*2A的肝素结合试验将包括0.02-30μM范围的MCP-1WT*突变体以磷酸缓冲盐水(PBS)配成系列稀释液，与170nM的[3H]-肝素37℃培育1小时。将每份样品20微升一式三份转移到配有硝酸纤维滤膜的96孔P81 Unifilter板(Whatman Inc)中。用200微升PBS，真空泵洗涤该板三次去除未结合的标记肝素。各孔加入闪烁液(50微升)，在β计数仪上计数放射活性(每孔一分钟)。用Prism程序分析数据(GraphPad Software)。
平衡竞争受体结合试验此试验在稳定表达MCP-1受体(CCR2)的中国仓鼠卵巢细胞的膜上进行，采用闪烁亲近测定法(SPA)，以[125I]-MCP-1作为示踪剂。按[125I]供应商(Amersham)说明书，从重组的成熟MCP-1产生放射标记的趋化因子(比活性2200mCi/mole)。用结合缓冲液(50mM HEPES pH7.2，1mM CaCl2，5mM MgCl2，0.15M NaCl0.5％BSA)配制未标记MCP-1突变体的系列稀释液(范围10-6～10-12M)制备竞争剂。
在PBS中重悬麦胚SPA珠(Amersham)至50mg/ml，以结合缓冲液稀释至10mg/ml，此试验的最终浓度为0.25mg/孔。将表达CCR2的细胞膜-80℃保存，以结合缓冲液稀释至80μg/ml。最终的膜浓度为2μg/孔，[125I]-MCP-1为0.1nM。室温震摇培育此板4小时。在β计数仪上计数放射活性(每孔一分钟)。用Grafit程序分析一式三份样品(Erithacus Software)。
结果文献显示测定MCP-1的肝素/GAG结合性能有不同方法(Hoogewerf AJ等，1997；Kuschert G等，1999；Ali S等，2001；Patel D等，2001；Chakravarty L等，1998)。
在大肠杆菌中表达两种MCP-1突变体，其序列基于成熟形式的人MCP-1(图1)。第一种为MCP-1WT*，对应于成熟的人MCP-1前体，具有已知能消除甲硫氨酸氧化可能性而不会干扰MCP-1经典的结合性能和活性的突变(Paavola CD等，1998)。第二种突变体为MCP-1WT*2A，基于此“活性”突变体的序列表达，其中N-端双碱性氨基酸位点已用丙氨酸残基取代。
先通过肝素层析测定了后一取代对MCP-1性能的影响。加载在此层析柱上后，此二突变体的洗脱图形显着不同，这是因为洗脱MCP-1WT*所需的NaCl浓度为0.54M NaCl，而MCP-1 WT*2A使用的洗脱液为0.24M NaCl。在SP Sepharose柱上利用阳离子交换层析测得的差异较小(0.55M NaCl对0.27M NaCl)。
该层析介质上的洗脱图形比较，提供了因碱性氨基酸的非特异性静电作用对肝素结合性能的贡献的定量指标(ProudfootA等，2001)。阳离子交换层析获得的NaCl浓度之差，是减去从肝素层析获得的浓度而得到的。按照此方法，当所得数字为正时(此例为0.02M)，可得到的结论是鉴定到的与肝素的特异性相互反应与MCP-1WT*2A中的双碱性氨基酸位点突变相关。
然后用氚化肝素和表达MCP-1突变体的大肠杆菌系列稀释液，直接测定与肝素的结合(图2)。将该稀释液加到硝酸纤维滤膜上分离得到蛋白质-肝素复合物。硝酸纤维支持物能有效保留蛋白质，因而能评价结合于该蛋白质的放射标记的肝素量。此方法证实与MCP-1WT*相比，MCP-1WT*2A的肝素结合性能显着降低。
最后，进行平衡竞争受体结合试验以证明MCP-1WT*2A的肝素结合性能降低对特异性受体CCR2结合的影响(图3)。将含有放射标记的MCP-1样品与两种突变体之一或MCP-1的系列稀释液混合，与由稳定表达CCR2的CHO细胞制备的膜一起培育。虽然MCP-1WT*和MCP-1蛋白显示了几乎相同的结合图形，但MCP-1WT*2A突变体显示对CCR2的亲和力降低20倍，因为它的IC50为1.73±0.6nM，相比较其它两种测试蛋白为0.08±0.045nM，显示该肝素结合缺陷性MCP-1突变体维持了高亲和力。
实施例2非肝素结合性MCP-1突变体在细胞募集模型中的特征分析材料和方法趋化作用试验此试验在配有5μm孔径膜(Neuroprobe)的24孔transwell趋化小室(Costar)中用人前单核细胞系(THP-1)进行。重组MCP-1蛋白质用600微升含5％灭活胎牛血清(FCS)、2mM谷氨酰胺和25mM HEPES(Ph7.2)的RPMI培养液进行系列稀释(范围10-6-10-12M)，这些样品放在孔下部，而将TPH-1细胞(以同一培养液配成10×106细胞/ml的细胞悬液100微升)置于插片中。在5％CO2下37℃培育小室3小时。然后取出样品转移到1.5ml试管，200g离心5分钟。将沉淀细胞重悬于100ml PBS中并用Coulter计数仪(Beckman)计数。用Prism程序分析数据(GraphPad Software)。
腹膜细胞募集试验给8-12周龄雌性BALB/c小鼠腹膜内注射10微克/0.2ml用无菌无脂多糖的PBS稀释的重组MCP-1WT*或MCP-1WT*2A蛋白质以诱导细胞募集。当测定MCP-1WT*2A的拮抗性能时，在给予激动剂(MCP-1WT*)前30分钟，给予用0.2ml相同无菌液稀释的所示量的该蛋白质。给予激动剂后16小时吸入CO2处死小鼠，用5毫升PBS进行腹腔灌洗三次。合并灌洗液，600g离心10分钟，重悬沉淀细胞至最终体积1ml，用血球计数仪计数诱引出的白细胞总数。
结果已采用细胞募集试验对与MCP-1相关的不同的蛋白质的性能作特征鉴定(Ajuebor MN等，1998；Reckless J and Grainger DJ，1999；Kaji M等，2001)。
在人单核细胞(THP-1细胞系)趋化试验中，MCP-1WT*2A获得的结果与实施例1所述受体-结合试验获得的结果极其相符。MCP-1WT*2A能诱导THP-1趋化的强应答(超过基线6倍)，虽然最大活性见于10nM，而与之相比，1nM野生型蛋白诱导了超过基线9倍的增加(图4)。
也用腹膜细胞募集试验评价了作为MCP-1拮抗剂或激动剂的MCP-1WT*2A的活性(图5)。当给予MCP-1WT*和MCP-1WT*2A时，该肝素结合缺陷性突变体在MCP-1WT*能引起大量募集的剂量(10μg/小鼠)时，不能诱导细胞募集到腹腔中。另外，如果在给予MCP-1WT*前30分钟给予MCP-1WT*2A，MCP-1WT*诱导的细胞募集以剂量依赖方式受到显着拮抗。因此，废除MCP-1中的GAG结合位点可产生能在体内抑制MCP-1诱导的细胞募集的MCP-1拮抗剂。
实施例3；非肝素结合性MCP-1突变体在动物模型中的特征鉴定材料和方法迟发性接触过敏模型如前人所述进行了小鼠耳肿胀试验以测定接触性过敏反应(Garrigue JL等，1994)。简言之，在小鼠剃毛的腹部皮肤局部施加25微升丙酮/橄榄油(4∶1)中含有0.5％的2，4-二硝基氟苯(DNFB；Sigma Chemical Co)的溶液到使其预致敏。五天后在右耳施加20微升用同一载体配的0.2％DNFB，左耳只施加该载体。从第5天到第9天每日腹腔给予0.5mg/kg(10μg/小鼠)的MCP-1WT*治疗小鼠，或对照组只给PBS。在DNFB攻击前1小时给予第一次治疗。用可调厚度仪(MitutoyoCorp)测量耳朵的厚度，从攻击后的值减去攻击前值，再减去单用载体攻击的对侧耳朵测得的肿胀值，估计耳朵肿胀。
博来霉素诱导的肺纤维化模型第0天气管内给予C57BL/6雌性小鼠博来霉素(3.75U/kg，在25微升PBS中)。吸入博来霉素1小时后，测试动物腹腔内给予0.2ml PBS中的0.25mg/kg的MCP-1WT*2A；或只给予0.2ml PBS。每日给予这种治疗，持续10天。每日记录体重减轻情况和死亡百分数。第10天所有小鼠用CO2窒息处死，将4个肺叶置于-80℃测定羟脯氨酸水平，作为胶原沉积的指标，并加工1个肺叶作肺纤维化的组织学测定。通过分析羟脯氨酸确定肺胶原总水平。简言之，用组织撕裂器和Tris-HCl(pH7.6)将肺叶做成匀桨，然后与琥石树脂115℃培育过夜。将柠檬酸/醋酸缓冲液、异丙醇、氯胺-T和DAB溶液加入样品中，60℃放置30分钟。样品冷却至室温，保持10分钟，在分光光度计上读取560nm的值。还将右肺叶固定在10％福尔马林中，然后石蜡包埋、切片和用Masson’s三色溶液染色，以组织学方法测定肺纤维化。在光显微镜下测定组织学变化。采用半定量评分法，计算纤维化面积百分率，进行博来霉素诱导的肺炎症和纤维化的形态学评价。
实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)模型第0天注射0.2ml含MOG35-55肽(200μg)和结核分枝杆菌(500μg)的弗氏完全佐剂(CFA；Difco Lab)乳液，左腹侧皮下免疫雌性小鼠(8周龄；C57BL/6NCrIBR品系；体重18-22克)。立即腹腔内给予百日咳毒素(400微升含0.5MNaCl，15mM Tris(pH7.5)，0.017％ Triton X-100的缓冲液中含500纳克毒素)。第二天给动物第二次腹腔内注射含百日咳毒素的相同溶液。第7天小鼠右侧腹部皮下注射给予第二剂含MOG35-55肽(200μg)的CFA。此程序导致在大约第18-20天时发病，呈现进行性麻痹，从尾部开始进行性上升到前肢。
实验第7天(大约在通常发生疾病前的1-3天)开始每只动物的治疗持续连续21天。从第7天开始，通过临床评分检查各个小鼠是否存在麻痹，评分如下0＝无疾病症状0.5＝尾部分麻痹1＝尾麻痹1.5＝尾麻痹+单侧后肢部分麻痹2＝尾麻痹+后肢力弱或后肢部分麻痹2.5＝尾麻痹+后肢部分麻痹(骨盆以下)3＝尾麻痹+后肢完全麻痹3.5＝尾麻痹+后肢完全麻痹+失禁4＝尾麻痹+后肢麻痹+前肢力弱或部分麻痹5＝垂死或死亡如下所示用三组动物，每组10只进行实验。组1用PBS治疗作为阳性对照。组2每日用腹腔注射0.05mg/kg的MCP-1WT*2A治疗。组3每日用腹腔注射0.5mg/kg的MCP-1WT*2A治疗。将MCP-1WT*2A突变体蛋白溶于无菌水中，然后以无菌PBS稀释(200微升/小鼠)获得所需浓度。
胶原诱导的关节炎(CIA)模型第0天在雄性小鼠(8-12周龄；DBA/1品系；18-22克体重)的尾根部皮内注射0.2ml含牛II型胶原(100微克；Morwell Diagnostics)和结核分枝杆菌(400μg)的弗氏完全佐剂(CFA；Difco Lab)乳液使其免疫。
大约从第16-20天开始出现炎症症状，影响一个或多个肢体。根据观察到的前爪和后爪的指(趾)存在的炎症作临床评分，给动物疾病的严重程度分等级如下0＝无疾病症状0.5＝1-5个指/趾有炎症症状1＝6-10个指/趾有炎症症状1.5＝11-15个指/趾有炎症症状2＝16-20个指/趾有炎症症状临床总评分＞0.5的二组(n＝10小鼠)每日治疗连续7天，腹腔注射PBS(对照组)或0.05mg/kg的MCP-1WT*2A。末次治疗后24小时处死所有动物。
卵白蛋白诱导的肺炎症(OVA)模型研究使用雌性小鼠(8-10周龄；Balb/c品系)。腹腔内注射在总体积200微升中以2毫克2％氢氧化铝(Serva)沉淀的10微克卵白蛋白(Sigma)致敏小鼠。在725微升无LPS的0.9％NaCl中混合25微升卵白蛋白(2mg/ml)、250微升氢氧化铝，4℃沉淀3-4小时，制备氢氧化铝2％/卵白蛋白溶液。致敏后15天，治疗和攻击小鼠，每组6只，分组如下组1用无LPS的0.9％NaCl攻击并用PBS治疗(基线)组2用卵白蛋白攻击并用PBS治疗(阴性对照)组3用卵白蛋白攻击并用0.5mg/kg的MCP-1WT*2A治疗在连续5天每次攻击前30分钟腹腔内注射(200微升)给予PBS或MCP-1WT*2A。在用异氟烷吸入麻醉下，用卵白蛋白(15微克沉淀的卵白蛋白重悬在50微升无LPS的0.9％NaCl中)鼻内攻击小鼠。攻击后72小时，致死性腹腔注射300微升以0.9％NaCl配的14％乌拉坦(v∶v)处死小鼠。修剪除去气管的结缔组织，制造一小切口，将直径75mm的导管插入气管中。用一缝线栓住导管使其附着于1毫升针筒。原位用0.4ml PBS充满肺。轻轻按摩脱落细胞，抽出肺中的液体，收集到置于冰上的塑料试管中。重复此过程4次，将每只动物收集的细胞悬液在冰上合并得到最终体积约1.4ml。用血细胞计数器对2倍倍比稀释的细胞悬液台盼兰染色计数细胞。
结果在许多文章中，特别是采用转基因小鼠的文章中，已特征分析了MCP-1的体内特性(Lu B等，1998；Rutledge BJ等，1995)。采用人类炎症和疾病的动物模型测定MCP-1WT*2A，证实了用腹腔细胞募集模型获得的此MCP-1肝素结合缺陷性突变体的拮抗活性。
迟发性接触过敏反应是一种动物模型，其中T细胞介导的半抗原-特异性皮肤炎症可用耳朵肿胀试验测定。已在能组成性产生高水平血清MCP-1的转基因小鼠中显示了增强的接触性过敏反应(Mizumoto N等，2001)。采用接触致敏剂2，4-二硝基氟苯(DNFB)作半抗原攻击正常小鼠的耳朵皮肤。整个治疗期限间，当与只用运载体治疗的小鼠所观察到的效果相比，腹腔给予MCP-1WT*2A(在用DNFB攻击时开始治疗)治疗的小鼠耳朵持续肿胀显着较低(图6)。
在肺部炎症/纤维化模型中测定了MCP-1WT*2A的性能，因为已知MCP-1在肺或皮肤炎症过程中诱导了前胶原的沉积(Hogaboam CM等，1999)。
小鼠气管内灌注博来霉素后分别在7-10天导致肺炎症和纤维化、胶原在肺中显着积累及体重快速下降(Chen ES等，2001)。记录小鼠腹腔给予MCP-1WT*2A或只给予PBS治疗1小时后再接触博来霉素后整10天中的体重，进一步与不用博来霉素处理的对照组比较。如清楚显示的那样，从第二天起，PBS治疗的对照小鼠与MCP-1WT*2A治疗小鼠相比，体重损失量高得多(图7)。第10天用二种不同方法处死小鼠后评价了肺纤维化和炎症。已知博来霉素能提高肺羟脯氨酸的合成(此合成与胶原合成和纤维化成比例)(Madtes DK等，1999)。只用PBS治疗小鼠测到的羟脯氨酸水平显着高于接受腹腔注射MCP-1WT*2A的小鼠组测到的水平。确实，后一组的水平相当于非博来霉素处理小鼠。另一半定量组织学评估证实，MCP-1WT*2A治疗组与对照组相比纤维化总水平显着降低(图8)。
抗MCP-1抗体和缺乏功能性MCP-1基因的转基因小鼠证明，MCP-1对例如与单纯疱疹病毒诱导的脑脊髓炎(HSM)和实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)、多发性硬皮病动物模型中相关的中枢神经系统的巨噬细胞募集和炎症起着关键作用(Nakajima H等，2001；Huang DR等；2001)。给予MCP-1WT*2A后，两种测试剂量都显着提高了EAE动物模型的临床评分(图9)。
如上所述，MCP-1具有很强的纤维化作用。在胶原诱导关节炎(CIA)模型中测定了MCP-1WT*2A拮抗此MCP-1活性的能力。此时MCP-1WT*2A也显着改进了治疗小鼠的临床评分(图10)。
由于肺中不同白细胞亚组的积累和激活而产生了哮喘特征性的肺过敏性炎症和支气管过敏反应(BHR)。用抗体阻断MCP-1，显着减轻了BHR和炎症(GonzaloJA等，1998)。在卵白蛋白诱导的肺炎症(OVA)模型中，就减少细胞募集而言，MCP-1WT*2A获得了显着的改进(图11)。
鉴于本发明实施例中的双碱性氨基酸位点的突变，加上已知参与MCP-1和GAG结合的其它残基，如组氨酸66和赖氨酸58(Chakravarty L等，1999)，在所有MCP中都是保守的(图1B)，可根据本专利申请的发现设计出具有拮抗活性的其它MCP突变体。
具体说，MCP拮抗剂可以是人成熟的MCP-1(SEQ ID NO4)、MCP-2(SEQID NO5)、MCP-3(SEQ ID NO6)、MCP-4(SEQ ID NO；7)或Eotaxin(SEQID NO8)的位点18和19、18和58(或66)、19和58(或66)的双突变体，以及位点18、19和58(或66；此序号对应于人成熟的MCP-1的序号)的三突变体。除位点18和19外其它可突变的残基是经鉴定在所有人MCP蛋白质中高度保守的其它碱性残基(残基24、44、49、75；图1B)。
这些替代分子的性能可用上述任一方法及本领域已知的其它验证方法测定。许多其它有用的趋化因子相关技术(重组表达、体外试验、转基因动物)可见文献综述(“Chemokine Protocols”，Methods in Molecular Biology vol.138，HumanaPress，2000；”Chemokine Receptors”，Methods in Enzymology vol.288，AcademicPress，1997)。
表1
表2
参考资料Ajuebor MN等人，Br J Pharmacol(英国药理学杂志)，125319-326，1998.
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序列表<110>应用研究系统ARS控股(Applied Research Systems ARS Holding N.V.)<120>MCP蛋白质的新型拮抗剂<130>WO512<160>8<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>99<212>PRT<213>智人<400>1Met Lys Val Ser Ala Ala Leu Leu Cys Leu Leu Leu Ile Ala Ala Thr1 5 10 15Phe Ile Pro Gln Gly Leu Ala Gln Pro Asp Ala Ile Asn Ala Pro Val20 25 30Thr Cys Cys Tyr Asn Phe Thr Asn Arg Lys Ile Ser Val Gln Arg Leu35 40 45Ala Ser Tyr Arg Arg Ile Thr Ser Ser Lys Cys Pro Lys Glu Ala Val50 55 60Ile Phe Lys Thr Ile Val Ala Lys Glu Ile Cys Ala Asp Pro Lys Gln65 70 75 80
Lys Trp Val Gln Asp Ser Met Asp His Leu Asp Lys Gln Thr Gln Thr85 90 95Pro Lys Thr<210>2<211>77<212>PRT<213>合成性构建物<400>2Met Gln Pro Asp Ala Ile Asn Ala Pro Val Thr Cys Cys Tyr Asn Phe1 5 10 15Thr Asn Arg Lys Ile Ser Val Gln Arg Leu Ala Ser Tyr Arg Arg Ile20 25 30Thr Ser Ser Lys Cys Pro Lys Glu Ala Val Ile Phe Lys Thr Ile Val35 40 45Ala Lys Glu Ile Cys Ala Asp Pro Lys Gln Lys Trp Val Gln Asp Ser50 55 60Ile Asp His Leu Asp Lys Gln Thr Gln Thr Pro Lys Thr65 70 75<210>3<211>77<212>PRT<213>合成性构建物<400>3
Met Gln Pro Asp Ala Ile Asn Ala Pro Val Thr Cys Cys Tyr Asn Phe1 5 10 15Thr Asn Ala Ala Ile Ser Val Gln Arg Leu Ala Ser Tyr Arg Arg Ile20 25 30Thr Ser Ser Lys Cys Pro Lys Glu Ala Val Ile Phe Lys Thr Ile Val35 40 45Ala Lys Glu Ile Cys Ala Asp Pro Lys Gln Lys Trp Val Gln Asp Ser50 55 60Ile Asp His Leu Asp Lys Gln Thr Gln Thr Pro Lys Thr65 70 75<210>4<211>76<212>PRT<213>智人<400>4Gln Pro Asp Ala Ile Asn Ala Pro Val Thr Cys Cys Tyr Asn Phe Thr1 5 10 15Asn Arg Lys Ile Ser Val Gln Arg Leu Ala Ser Tyr Arg Arg Ile Thr20 25 30Ser Ser Lys Cys Pro Lys Glu Ala Val Ile Phe Lys Thr Ile Val Ala35 40 45Lys Glu Ile Cys Ala Asp Pro Lys Gln Lys Trp Val Gln Asp Ser Met50 55 60
Asp His Leu Asp Lys Gln Thr Gln Thr Pro Lys Thr65 70 75<210>5<211>76<212>PRT<213>智人<400>5Gln Pro Asp Ser Val Ser Ile Pro Ile Thr Cys Cys Phe Asn Val Ile1 5 10 15Asn Arg Lys Ile Pro Ile Gln Arg Leu Glu Ser Tyr Thr Arg Ile Thr20 25 30Asn Ile Gln Cys Pro Lys Glu Ala Val Ile Phe Lys Thr Lys Arg Gly35 40 45Lys Glu Val Cys Ala Asp Pro Lys Glu Arg Trp Val Arg Asp Ser Met50 55 60Lys His Leu Asp Gln Ile Phe Gln Asn Leu Lys Pro65 70 75<210>6<211>76<212>PRT<213>智人<400>6
Gln Pro Val Gly Ile Asn Thr Ser Thr Thr Cys Cys Tyr Arg Phe Ile1 5 10 15Asn Lys Lys Ile Pro Lys Gln Arg Leu Glu Ser Tyr Arg Arg Thr Thr20 25 30Ser Ser His Cys Pro Arg Glu Ala Val Ile Phe Lys Thr Lys Leu Asp35 40 45Lys Glu Ile Cys Ala Asp Pro Thr Gln Lys Trp Val Gln Asp Phe Met50 55 60Lys His Leu Asp Lys Lys Thr Gln Thr Pro Lys Leu65 70 75<210>7<211>75<212>PRT<213>智人<400>7Gln Pro Asp Ala Leu Asn Val Pro Ser Thr Cys Cys Phe Thr Phe Ser1 5 10 15Ser Lys Lys Ile Ser Leu Gln Arg Leu Lys Ser Tyr Val Ile Thr Thr20 25 30Ser Arg Cys Pro Gln Lys Ala Val Ile Phe Arg Thr Lys Leu Gly Lys35 40 45Glu Ile Cys Ala Asp Pro Lys Glu Lys Trp Val Gln Asn Tyr Met Lys50 55 60
His Leu Gly Arg Lys Ala His Thr Leu Lys Thr65 70 75<210>8<211>74<212>PRT<213>智人<400>8Gly Pro Ala Ser Val Pro Thr Thr Cys Cys Phe Asn Leu Ala Asn Arg1 5 10 15Lys Ile Pro Leu Gln Arg Leu Glu Ser Tyr Arg Arg Ile Thr Ser Gly20 25 30Lys Cys Pro Gln Lys Ala Val Ile Phe Lys Thr Lys Leu Ala Lys Glu35 40 45Ile Cys Ala Asp Pro Lys Lys Lys Trp Val Gln Asp Ser Met Lys Tyr50 55 60Leu Asp Gln Lys Ser Pro Thr Pro Lys Pro65 70
权利要求
1.由MCP蛋白的突变体组成的MCP蛋白质的拮抗剂，其特征在于，其中人类成熟的MCP-1序列中以下编号的残基组合被替代为丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸或谷氨酰胺a)18和19；b)18和/或19，加上58；c)18和/或19，加上66；d)18和/或19，加上58和66；e)18和/或19，加上以下24、44、49、75的一个或多个。
2.如权利要求1所述的拮抗剂，其中残基18和19被丙氨酸所替代。
3.如权利要求1或2所述的拮抗剂，其中MCP蛋白是人MCP-1、人MCP-2、人MCP-3、人MCP-4或人Eotaxin。
4.如权利要求1或2所述的拮抗剂，其中MCP蛋白是与人类成熟MCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-4或Eotaxin具有至少70％同源性的蛋白质。
5.MCP蛋白质拮抗剂选自a)如权利要求1至5所述MCP蛋白质拮抗剂的活性突变体，其中已加入、缺失、或替代了一个或多个氨基酸残基而不干扰其拮抗活性；b)根据(a)所述多肽或肽的序列和/或结构设计的肽模拟物；c)多肽或肽，其含有(a)或(b)所述氨基酸序列和属于相应MCP蛋白质以外的某一蛋白质序列序列的氨基酸序列；d)上述(a)、(b)、或(c)的活性组分、前体、盐或衍生物。
6.如权利要求5所述的MCP拮抗剂，其中(a)所述的多肽或肽具有SEQ IDNO3相应的序列。
7.如权利要求5所述的MCP拮抗剂，其中(c)所述的多肽或肽含有属于一个或多个以下这些蛋白质序列膜结合蛋白质的胞外结构域，免疫球蛋白恒定区，多聚体结构域，胞外蛋白质，含信号肽的蛋白质，含输出信号的蛋白质，的氨基酸序列。
8.如权利要求5或7所述的MCP拮抗剂，其中所述的拮抗剂是与选自放射活性标记、生物素、荧光标记、细胞毒性剂、药物输送剂的分子相偶联或复合的活性形式。
9.含有编码如权利要求1至7所述MCP拮抗剂的DNA序列的DNA分子，其特征在于，该DNA分子包含基本上相同的核苷酸序列。
10.含有如权利要求9所述DNA分子的表达载体。
11.用权利要求10所述载体转化的宿主细胞。
12.如权利要1至8所述的MCP拮抗剂的制备方法，该方法包括培养权利要求11所述的转化细胞并收集表达的蛋白质。
13.如权利要求1至8所述MCP拮抗剂的纯化制品。
14.所述MCP拮抗剂作为药物的用途。
15.如权利要求1至8所述MCP拮抗剂用作治疗或预防白细胞过度迁移和活化相关疾病的药物组合物中活性成分的用途。
16.如权利要求15所述的用途，其中所述疾病是炎症性疾病、自身免疫性疾病或感染。
17.如权利要求1至8所述MCP拮抗剂用作治疗或预防血管性疾病或癌症的药物组合物中活性成分的用途。
18.含有如权利要求1至8所述MCP拮抗剂作为活性成分的药物组合物。
19.白细胞过度迁移和活化相关疾病的治疗或预防方法，其特征在于，该方法包括给予有效量的权利要求1至8所述的MCP拮抗剂。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述疾病是炎症性疾病、自身免疫性疾病或感染。
21.血管性疾病或癌症的治疗或预防方法，其特征在于，该方法包括给予有效量的权利要求1至8所述的MCP拮抗剂。
全文摘要
通过在MGP蛋白质N－末端进行非保守性取代消除其GAG结合位点制造MCP突变，可获得MCP蛋白，特别是MCP－1蛋白质的新型拮抗剂。本发明制备的化合物可用于治疗或预防MCP蛋白不良活性相关疾病，如炎症疾病、自身免疫性疾病、血管性疾病和癌症。
文档编号A61K38/19GK1665839SQ03813007
公开日2005年9月7日 申请日期2003年4月9日 优先权日2002年4月10日
发明者A·普罗德富特, M·科斯科-维尔博伊斯, T·亨德尔 申请人:应用研究系统Ars股份公司