专利名称：护骨素在治疗和／或预防纤维变性疾病中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及纤维变性疾病及结缔组织病领域。更具体地说，本发明涉及护骨素(osteoprotegerin)在治疗和/或预防纤维变性疾病尤其是硬皮病中的应用。护骨素与干扰素、TNF拮抗剂或其他抗纤维变性试剂如SARP-1的联用也包括在本发明之内。
背景技术：
纤维变性是在包括肾、心脏、肺、胃和关节等内脏器官内胶原蛋白过度产生的一种病征。
肺纤维变性是其中一种主要纤维变性疾病。特发性肺纤维变性(IPF)表现为肺泡壁病因不明地慢性发炎，逐渐纤维化。特发性间质性肺病中50％至60％的病例是由IPF或者隐原性纤维性肺泡炎引致的。
普通间质性肺炎(UIP)是间质性肺炎的一种特殊组织病理模式，是IPF肺活检中发现的典型模式。放大倍数较低时，组织呈不均质，有正常肺部、间质发炎、纤维变性和蜂窝样等不同区域。间质发炎在于淋巴细胞、浆细胞以及II型肺细胞增生相关的组织细胞的泡膜浸润。虽然增生成纤维细胞的分散病灶(成纤维细胞病灶)是早期病和活跃病的位点，通常可在小泡位置找到，但纤维变性区主要由致密非细胞胶原组成。蜂窝样区域由囊性纤维化空隙组成，内层通常为支气管上皮并充满粘液。嗜中性粒细胞可集中在粘液中。平滑肌增生常常发生在纤维变性和蜂窝样区域。鉴定UIP最有用的特征是胸膜下和隔旁分布、斑状特征以及时间异质性。
间质性发炎和纤维变性的相同模式是发生于胶原血管疾病(例如RA、SLE、进行性全身性硬化症、混合性结缔组织病，糖尿病)、尘肺病(例如石棉沉滞症)、放射性损伤、和某些药物诱发的肺病(例如由呋喃妥因(nitrofurantoin)诱发)内。
IPF的临床病程是渐进的；诊断后存活期中值为4至6年。治疗IPF通常使用强的松。对治疗的反应是可变化的，但在留下大量疤痕之前的细胞成分较多的阶段，用皮质类固醇或细胞毒素治疗早期病患者似乎更有疗效。支援姑息疗法包括高浓度氧气以减缓血氧不足，如果发生细胞感染，还包括抗生素。已经有过末期肺病患者肺移植成功的例子。
肺纤维变性涉及肝脏内结缔组织积聚，这是由于胞外基质的产生和降解不平衡造成的，而先前存在的纤维萎陷和缩聚增强了纤维变性。
肝脏纤维变性是对肝细胞坏死或损伤的一种常见反应，可经由各种各样试剂诱导发生，例如干扰肝脏动态平衡的任何过程(尤其是发炎、中毒损伤、或肝血流改变)，以及肝感染(病毒、细胞、真菌和寄生虫)。许多由先天性代谢性缺陷引起的贮积病通常与纤维变性有关，包括脂质代谢紊乱(高歇氏病(Gaucher′s disease))、糖原贮积病(尤其是III、V、VI、IX和X型)；α1-抗胰蛋白酶缺乏；在铁超负荷综合征(血色沉着病)和铜贮积病(威尔逊氏病(Wilson′sdisease))中发现的外源物质贮积；有毒代谢物积聚(如酪氨酸血病、果糖血症和半乳糖血症)；以及过氧化物酶体紊乱(泽尔韦格合征(Zellweger syndrome))。很多化学物质和药物可引致纤维变性，尤其是酒精、甲氨蝶呤、异烟肼、酚丁、甲多巴(methyldopa)、氯丙嗪、甲苯磺丁脲和胺碘酮。肝循环障碍(例如慢性心衰竭、巴-希二氏综合征(Budd-Chiari syndrome)、静脉阻塞性疾病、门静脉栓塞)和慢性胆流阻塞都可导致纤维变性。最后，先天性肝纤维变性是一种常染色体隐性畸形。
正常肝脏由肝细胞和分布在由胶原蛋白(主要为I、III和IV型)和非胶原蛋白质，包括糖蛋白(如纤连蛋白、层粘连蛋白)和多种蛋白聚糖(如硫酸肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、透明质酸盐)，组成的胞外基质内的窦状隙构成。正常情况下在汇管区(portal tracts)中找到的成纤维细胞可产生胶原、大分子糖蛋白和蛋白聚糖。
其他肝脏细胞(尤其是肝细胞和贮脂Kupffer细胞，以及内皮细胞)也能够产生胞外基质成分。贮脂细胞位于狄氏腔(space of Disse)窦内皮以下，是成纤维细胞的前体，能够增殖和产生过量胞外基质。肝脏细胞受损尤其是坏死以及炎症细胞导致胶原主动沉积形成纤维变性。从这些细胞释放出来的确切因子尚未清楚，但可能是一或多个细胞因子或者脂质过氧化产物。Kupffer细胞和活化巨噬细胞产生炎症细胞因子。坏死肝脏细胞周围形成新的成纤维细胞；胶原合成增加导致出现疤痕。纤维变性可源自纤维主动生成和正常或改性胶原的不良降解。贮脂细胞、Kupffer细胞和内皮细胞对于清除I型胶原、某些蛋白聚糖和变性胶原是重要的。这些细胞活性的改变可能使纤维变性程度发生变化。组织病理学家认为，纤维变性组织在先前存在的纤维的被动萎陷和缩聚中可变得更明显。
所以，胶原的合成增加或降解减少都会引致过多结缔组织主动沉积，这影响到肝功能1)细胞外周纤维变性损害细胞营养并导致肝细胞萎缩；2)在狄氏腔内，纤维变性组织在窦状隙周围积聚，阻塞血液中的物质自由通过到达肝细胞；3)肝静脉和汇管区周围的纤维变性影响肝的血液流动。从通过肝脏门静脉分支至窦状隙最后到达肝静脉的静脉阻力增大。可以涉及全部三条途径。
中心静脉与汇管区连接的纤维变性带也有利于吻合通道绕过正常肝细胞的动脉血分流至输出肝静脉，这进一步损害肝功能并能够加重肝细胞坏死。这种过程存在的程度决定了肝功能异常的程度例如，在先天性肝纤维变性中，较大的纤维变性带主要涉及门区(portal region)，但通常不伤害肝实质。因此，先天性肝纤维变性表现为门脉高血压，但保持肝细胞功能。
硬皮病是一种以皮肤和内脏器官纤维变性为特征的结缔组织疾病，导致器官衰竭和死亡(Black等人，1998；Clements和Furst，1996)。硬皮病有多种表现，在治疗上有各种含义。它包括局限性硬皮病(localized scleroderma)、全身性硬化症(systemic sclerosis)、硬皮病样疾病及无硬皮病(Sinescleroderma)(Smith 2000)。局限性硬皮病是一种比较罕见的皮肤病，只限于皮肤的纤维变性和表现；全身性硬化症是一种累及内脏器官的多系统疾病，而且皮肤病的程度也是不同的。全身性硬化症可以是弥漫型或局限型。局限型全身性硬化症也称CREST综合症(钙质沉积、雷诺现象、食道功能障碍、指端硬化、毛细血管扩张)。据认为，硬皮病样疾病与暴露于工业环境有关。无硬皮病只涉及内脏器官，而皮肤无改变。
硬皮病特别是全身性硬化症的主要表现是不恰当的过度胶原合成和沉积、内皮功能障碍、痉挛、由纤维变性引起的萎陷和闭塞。
硬皮病是一种比较罕见的疾病，每百万人中大约有19人发病。硬皮病的发病原因尚未清楚。然而，遗传易感性是非常重要的。异常情况包括自身免疫与内皮细胞和成纤维细胞功能的改变。事实上，全身性硬化症可能是最严重的自身免疫疾病，诊断后5年内死亡率为50％(Silman，1991)。
在诊断上，一个重要的临床参数是近端掌指关节皮肤增厚。雷诺现象是硬皮病的常见症状，几乎所有硬皮病患者均有雷诺现象。皮肤遇冷后会有色素变化，由此可作出诊断。雷诺疾病的症状是缺血和皮肤增厚。
疾病初期、加重和进展都有一些基本的隐伏生物过程，包括血管功能障碍、内皮细胞活化和损害、白细胞积聚、自身抗体的产生，以及严重时有失控的纤维变性反应，可导致死亡(Clements和Furst，1996)。成纤维细胞在该疾病的发病机制中起决定性作用。从硬皮病患者身上抽取原代成纤维细胞，其具有体内看到的许多疾病特性，主要为胞外基质合成和沉积增加，特别是胶原和纤连蛋白(fibronectin)，以及改变生长因子和细胞因子的产生，如TGFβ和CTGF(Strehlow和Korn，1998；LeRoy，1974)。
目前尚未有效的方法治愈硬皮病。有人提出一种新颖但风险很高的疗法自体干细胞移植(Martini等人，1999)。具体地说，迄今为止还没有一种硬皮病的治疗方法是针对纤维变性过程(Wigley和Boling，2000)。
鉴定与疾病风险和硬皮病进展相关的基因可能会研究出有效策略，在疾病的不同阶段作出干预。
1997年，护骨素(OPG)首先被鉴定为一种由成纤维细胞分泌出来的新颖细胞因子(Simonet等人，1997)。人OPG是一个401个氨基酸的蛋白质，含有一个21个氨基酸的信号肽，将人OPG在22位谷氨酸之前切割，产生一个380个氨基酸的成熟蛋白质。因此，OPG是一种可溶性蛋白。它是TNF受体家族的其中一个成员(Morinaga等人，1998，Yasuda等人，1998)，其N端部分含有四个富半胱氨酸的TNFR样结构域(Simonet等人，1997)。OPG已经显示在骨发育中起著作用，缺乏OPG基因的小鼠带有骨质疏松表型，而且全部骨胳为异常(Min等人，2000)。
护骨素由成骨细胞和骨髓基质细胞产生，缺少跨膜结构域并作为不具有直接信号传导能力的分泌性诱饵受体(decoy receptor)起作用。OPG通过与其天然配体护骨素配体(OPGL，也称RANKL(NF-kappaB配体的受体激活剂))相结合起作用。OPG与OPGL之间的结合阻止OPGL激活它的同源受体RANK，其为一种破骨细胞受体，对破骨分化、活化和存活至关重要。
人OPG是TNFR家族成员，是一个单拷贝基因，由5个外显子组成，长29kb基因组(Simonet等人，1997)。重组OPG分别以表观分子量为55kDa和110kDa的单体和二聚形式存在(Simonet等人，1997)。在N端结构域切断185位半胱氨酸，大概因为破坏了TNFR样结构域的SSS3二硫键导致失活，而在蛋白质C端部分切断194位氨基酸则不会改变生物活性。所以，OPG的N端TNFR样结构域足以防止破骨细胞生成(Simonet等人，1997)。
转基因小鼠内OPG过度表达在接近完全缺乏破骨细胞的情形下会导致深度骨胳石化症。相反，切除OPG基因可引致小鼠发生严重骨胳石化症。切除OPGL或RANK也会发生深度骨胳石化症，表示这些蛋白质在调节骨吸收方面有重要的生理作用。破骨细胞和基质细胞分泌OPG和OPGL受许多激素和细胞因子通常以交互方式调节。OPG和OPGL产生的相对水平被认为最终支配骨吸收程度。过量OPGL增加骨吸收，而过量OPG抑制骨吸收。事实上，重组OPG阻断在体内外刺激破骨细胞的全部因子的作用。OPG还抑制各种动物疾病模型的骨吸收，包括卵巢切除诱导的骨质疏松症、恶性体液性高钙血症和实验性骨肿瘤转移。所以，对于过度破骨细胞活性相关的疾病而言，OPG可能是一个有效治疗选择(Kostenuik and Shalhoub，2001)。
然而，仍未有人提示护骨素参与纤维变性疾病。
发明内容
本发明是基于这样的发现给予护骨素能显著改善已建立的肺纤维变性动物模型的病症。肺纤维变性是硬皮病的其中一种表现。
因此，本发明的第一个目的在于使用护骨素制备治疗和/或预防纤维变性疾病尤其是硬皮病的药物。本发明的第二个目的在于使用表达护骨素的细胞或者含有护骨素编码序列的表达载体制备治疗和/或预防纤维变性疾病尤其是硬皮病的药物。含有护骨素和其他抗纤维变性药物如卤夫酮(halofuginone)的药物组合物，以及包括把护骨素给予人体的治疗方法也在本发明的范围之内。
图1所示为经由基因过滤微阵列分析测定的6例硬皮病患者的正常(斜阴影线)和患病(水平阴影线)成纤维细胞中OPG mRNA的表达。平均表达水平见(a)部分，而表达水平的中值见(b)部分。
图2所示为对9例硬皮病患者的OPG mRNA所作实时PCR分析。每例患者的结果表示为病变/非病变成纤维细胞内OPG mRNA的表达之比。
图3所示为经由实时PCR测定的取自5例硬皮病患者病变和非病变皮肤的活检中OPG mRNA的表达。横线表示各组表达水平的中值。
图4所示为病变和正常皮肤成纤维细胞中OPG表达的Western印迹分析。A1-A4为病变成纤维细胞，N1-N4为正常成纤维细胞。凝胶左手侧的箭头表示天然OPG(55kDa单体)及其二聚形式(110kDa)的位置。OPG Fc融合蛋白(购自R&D systems)用作抗体的阳性对照。
图5所示为OPG对AG1518人成纤维细胞内胶原合成的作用。AG1518细胞完全未经处理或者以10、20或40ng/ml OPG预处理24小时，或者以40ng OPG+抗OPG中和单克隆抗体(1μg/ml)处理24小时，或者先单独以抗OPG中和单克隆抗体然后以2ng/ml TGFβ1处理24小时。胶原合成通过ELISA测定。结果以三个测定值的平均值+S.E.M表示。
图6所示为OPG转染对人原代成纤维细胞(OBHC细胞)内I型胶原α2合成的影响。参照方法部分中所述，使OBHC细胞与pcDNA3.1/OPG(OPG)或仅与pcDNA3.1(模拟试验)转染。以TGFβ1处理后24小时通过ELISA测量条件培养基内的胶原。结果以三个测定值的平均值+S.E.M表示。
图7A所示为OPG对小鼠胚胎成纤维细胞内I型胶原α2启动子活性的影响。小鼠胚胎成纤维细胞(πS3细胞)与含有连接于萤光素酶cDNA的3.5kb胶原1α2启动子的pGL3载体转染。转染后，将细胞转移到新鲜培养基中，细胞或者未经处理(对照)，或者仅以卤夫酮(10-10M)处理12小时(HF)；以TGFβ1(5ng/ml)处理12小时(TGFβ1)；或者以TGFβ1(5ng/ml)+HF(10-8M)处理12小时(HF+TGFβ1)，伴随护骨素浓度增大。结果以三个测定值的平均值表示。*表示P＜0.05，**表示P＜0.01。
图7B所示为经过仅与TGFβ培养或者与TGFβ并结合不同数量的OPG培养后在CTGF启动子存在下报导基因表达的程度。
图8所示为用卤夫酮在体外处理硬皮病患者的病变和非病变成纤维细胞之后，对护骨素mRNA所作的逆转录酶PCR分析。以1％琼脂糖-溴化乙锭染色的凝胶显示病变成纤维细胞(词尾A)和非病变成纤维细胞(词尾N)中护骨素(上)和GAPDH(下)的RT PCR反应产物。
图9所示为体内给予护骨素对用博来霉素处理过的小鼠肺纤维变性发展的影响。A小鼠体重随护骨素的处理时间而变化。结果以气管内滴注博来霉素后每日测量的平均体重(克/组)表示。B给予博来霉素导致的死亡率。结果以每组10只动物的死亡平均数表示。
图10所示为体内给予护骨素对用博来霉素处理过的小鼠肺纤维变性发展的影响。A给予博来霉素后12天测量的肺纤维变性程度。肺部用trichrome染色。结果以每只存活动物受纤维变性影响的代表性肺叶的百分比表示。B给予博来霉素后12天测量的肺胶原沉积程度。测量每只存活动物代表性肺叶的羟基脯氨酸含量。
具体实施例方式
根据本发明，使用DNA基因过滤微阵列技术(DNA gene filtermicroarraytechnology)来鉴定取自全身性硬化症(硬皮病)患者中纤维变性病变的皮肤成纤维细胞与相同患者正常皮肤成纤维细胞相比的差异表达基因。在硬皮病成纤维细胞中持续下调的一个基因是护骨素(OPG)，也叫破骨细胞生成抑制因子。在9例测试患者中有7例的异常成纤维细胞与正常成纤维细胞相比表达极低水平OPG mRNA。这些结果得到实时PCR分析的证实。另外，对从硬皮病患者异常皮肤的整个活检样品分离出来的总RNA进行实时RP-PCR分析，结果显示与临床上正常、年龄、性别和解剖位置匹配的对照活检相比，得到的总RNA的OPG mRNA水平较低。病变成纤维细胞的OPG蛋白也比相同患者分离出来的正常成纤维细胞的少。OPG在体外能够使成纤维细胞与OPG cDNA转染后，或者用重组蛋白处理后TGFβ介导的胶原合成减少。OPG的另一种体外活性是抑制TGFβ诱导的结缔组织生长因子(CTGF)表达。CTGF正常情况下诱导成纤维细胞内胞外基质成分的合成。
这些体外数据也得到从已有动物模型取得的体内数据进一步支持。给予护骨素能减少博来霉素诱导的肺纤维变性模型的肺纤维变性并降低胶原沉积。从组织角度上看，用护骨素处理的动物的肺与未经处理的幼鼠的肺是类似的。
所以，本发明涉及一种物质在制备治疗和/或预防纤维变性疾病的药物中的应用，所述物质选自以下组a)含有SEQ ID NO2或SEQ ID NO4的多肽；b)含有SEQ ID NO2或SEQ ID NO4的22到401氨基酸的多肽；c)含有1、2、3或4个护骨素富半胱氨酸结构域的多肽；d)含有SEQ ID NO2或SEQ ID NO4的22到194氨基酸的多肽；e)(a)到(d)的任何一个突变蛋白，其中氨基酸序列与(a)到(d)中至少一个序列至少有40％或50％或60％或70％或80％或90％的同一性；f)(a)到(d)的任何一个突变蛋白，其中该突变蛋白是由在温和严格条件或高度严格条件下能与编码(a)到(d)任何一个突变蛋白的DNA序列的互补序列杂交的DNA序列编码；g)(a)到(d)的任何一个突变蛋白，其中所述氨基酸序列的任何改变都是用保守性氨基酸取代(a)到(d)的氨基酸序列；h)(a)到(g)任何一个突变蛋白的盐或同种型、融合蛋白、功能衍生物、活性片段或环形排列的衍生物。
本领域技术人员将会懂得，根据本发明，刺激内源护骨素释放或加强其活性的物质可同样地用来治疗和/或预防纤维变性疾病，尤其是硬皮病。所述物质可以是成熟护骨素本身，或者是护骨素结合OPGL从而阻止OPGL与RANK结合以防治启动信号传导通过RANK的任何片段。这样一种物质可以是例如针对OPGL的抗体。已经知道OPG与OPGL结合，该相互作用阻止OPGL与其受体RANK结合。因此，本领域技术人员将会懂得，任何阻止OPGL与其受体RANK结合的物质，或者任何阻断RANK活性或信号传导的其他试剂，都具有与护骨素预防和/或治疗纤维变性疾病，尤其是硬皮病相同的活性。阻断OPGL与RANK结合的试剂可以是例如针对OPGL的拮抗抗体。阻断RANK活性的试剂还可以是例如针对RANK的拮抗抗体。其他阻断OPGL/RANK相互作用的试剂可以是干扰这两种蛋白质相互结合的化合物，也可以是抑制信号传导通过RANK受体的任何其他化学或生物抑制剂。
已经克隆了人护骨素的全长cDNA，如所附序列表的SEQ ID NO1所示，相应的氨基酸序列如所附序列表的SEQ ID NO2所示。关于这些序列的描述可以在网址www.ncbi.nlm.nih.gov中查到，其编号为AB_008821，以及参见Morinaga等人(1998)等人所述。Simonet等人(1997)描述了护骨素的同种型或多态形式。Simonet等人(1997)的cDNA如所附序列表的SEQ ID NO3所示，而相应的氨基酸序列如所附序列表的SEQ ID NO4所示。两个序列都可在网址www.ncbi.nlm.nih.gov中查到，其编号为U94332。Morinaga等人和Simonet等人发现的两个蛋白质之间的差别仅在于氨基酸位置263，分别是天冬氨酸或丙氨酸。
本文使用的术语“护骨素”指的是上述(a)到(h)考虑的任何一种物质。
本文使用的术语“预防和/或治疗”包括对疾病的形成、发展、进程或者疾病的任一个、某些或全部症状的形成、发展或进程的任何减轻、减缓，或者部分的、实质性的或完全的防止或阻断。
本文使用的术语“纤维变性疾病”指的是涉及纤维变性的疾病，可以是例如由慢性炎症或组织修复和再生引起。纤维变性可涉及人体内任何器官，例如皮肤、肺、胰、肝或肾。因此，本发明还涉及纤维变性疾病的治疗和/或预防，例如肝硬化、肺间纤维变性、迪皮特朗挛缩(Dupuytren’s contracture)、瘢痕疙瘩和其它疤痕/伤口的不正常愈合、手术后缝合和反应性纤维变性、以及慢性心衰竭，特别是心肌梗塞之后。其他可用护骨素治疗的疾病包括伤口愈合疾病，尤其是肺部伤口愈合，包括慢性肺炎并最后导致肺表面纤维变性或疤痕。涉及肺炎的病症包括例如特发性肺纤维变性、肉状瘤病、支气管肺发育不良、纤维增生性ARDS，以及肺部适应症或全身性疾病例如类风湿关节炎(Krein等人，2001)。
纤维变性一般涉及结缔组织的产生或增生，替换某一给定器官的功能专用组织。因此，在本发明一优选实施例中，纤维变性疾病是结缔组织病。
在一优选实施例中，纤维变性疾病是硬皮病。
本文所用的术语“硬皮病”指的是称之全身性硬化症或全身性硬皮病。这些术语在本专利申请中是同义的。全身性硬化症是一种不明病因的慢性病，表现为皮肤、关节结构和内脏器官(尤其是食道、胃肠道、肺、心和肾)出现分散性纤维化、退化性改变和血管异常。它可以是局限性、混合性、全身性、弥漫型或局限型。
术语“硬皮病”较佳指的是局限性硬皮病、全身性硬皮病、弥漫型硬皮病或局限型硬皮病以及叠加综合征。
局限性硬皮病主要影响皮肤，但也会影响下面的肌肉和骨胳。然而，它通常不会累及内脏器官。局限性硬皮病是病情相对较轻的硬皮病，可与全身性硬皮病的表面症状相似，例如显微镜下皮肤活检的表现。
全身性硬皮病包括多种症状和多组症状，如CREST综合征、局限型与弥漫型。全身性硬皮病又叫进行性全身性硬化症或家族性进行性全身性硬化症。全身性硬皮病可以影响例如皮肤、血管和/或内脏器官。当它累及皮肤时，它可导致皮肤增厚，大多数常见于手和脸。当它累及血管时，它可引起雷诺疾病。全身性硬化症的最严重情况是累及内脏器官，可导致残废甚至死亡。除此之外，全身性硬化症包括硬皮病肺病、硬皮病肾危象、心脏表征、包括疲劳或局限型CREST在内的肌肉无力、胃肠蠕动异常和痉挛以及中枢、周边和自主神经系统异常。对于神经系统异常，最常见的是先有腕管综合征，继而三叉神经痛。
局限型硬皮病可以例如限于手指，虽然也可累及脸和颈。
弥漫型硬皮病包括皮肤绷紧，也可发生在手腕以上的位置(或肘)。弥漫型硬皮病有多种亚型，例如内脏器官纤维变性但皮肤无绷紧的“硬皮病无硬皮病(scleroderma sine scleroderma)”和发生在家族中较少见的家族性进展性全身性硬化症。
叠加综合症指硬皮病患者还有其它自身免疫疾病(如狼疮、类风湿关节炎等)，例如弥漫型硬皮病与狼疮迭加。硬皮病症状也可以是混合型结缔组织病(MCTD)或者未分化型结缔组织病(UCTD)的一部分。
本文使用的术语“护骨素”指的是含有所附序列表的SEQ ID NO2或4(二者均为人)的全部或一部分序列的蛋白质，及其盐、同种型、突变蛋白、活性片段、功能衍生物和环形排列的衍生物。来自人以外的其他物种的OPG，例如小鼠或大鼠，也可用于本发明中，只要蛋白质之间有足够同一性，使该蛋白质具有生物活性，而且在人体内不会引起明显的免疫反应。
较佳的是，术语“护骨素”指缺少信号肽的成熟蛋白。该信号肽含有SEQID NO2或4所示的OPG的N端21个氨基酸，即含有SEQ ID NO2或4的22到401氨基酸的成熟蛋白。本文使用的术语“护骨素”还包括对硬皮病或其他纤维变性疾病表现所希望的活性的SEQ ID NO2或4的任何片段、部分、结构域或亚结构域。蛋白质片段、同种型、差异性糖基化或唾液酸化形式、或者该蛋白质的一或多个结构域都可用在本发明中，只要它们对纤维变性疾病具有有益的效果，最好具有至少可比拟全长蛋白的效果。有益的效果可在以下实施例描述的其中一个体内或体外试验中，或者在任何其它充分证明对纤维变性疾病，尤其是硬皮病的效果的试验中测定。
例如，参照Simonet等人，1997所述，护骨素的N端部分包括一富含半胱氨酸的TNFR样结构域。含有该结构域的片段在体外试验中保留了OPG的生物活性。因此，优选的OPG片段含有OPG的TNFR样结构域，特别是含有SEQ ID NO2或4的22到194氨基酸的片段。
根据本发明，护骨素可以是天然存在的，即天然蛋白，或者是重组蛋白。重组生产可在诸如酵母菌细胞或哺乳动物细胞，优选中国仓鼠卵巢(CHO)细胞等真核细胞、HEK细胞(人胚肾细胞)或人成纤维细胞或细胞系中进行。它还可以在原核细胞中生产，如大肠杆菌。
已经发现，护骨素可以以单体或二聚体形式存在(Simonet等人，1997)。所以，本发明的OPG可以是单体、二聚体或多聚体。
护骨素的一个或多个位点最好被糖基化。它也可以是非糖基化的，取决于特定的需要以及产生或分离蛋白质的来源。
本文的术语“盐”既指护骨素分子或其同类物的羧基盐，又指氨基的酸加成盐。羧基盐可通过本领域已知的方法形成，包括无机盐，如钠、钙、铵、铁或锌盐等等，那些与有机碱，例如三乙醇胺、精氨酸或赖氨酸、哌啶、普鲁卡因等胺形成的盐。酸加成盐包括例如与诸如盐酸或硫酸等无机酸形成的盐，以及与诸如乙酸或草酸等有机酸形成的盐。当然，任何这样一些盐必须保留与本发明有关的护骨素生物活性，即对纤维变性疾病尤其是硬皮病具有有益的效果。
护骨素的同种型或剪接变体也可用在本发明中，只要它们能够抑制疾病的进展和/或该疾病的症状。
如本文所用，术语“突变蛋白”指的是护骨素的类似物，其中天然护骨素的一个或多个氨基酸残基被不同的氨基酸残基所替代，或被缺失，或者一个或多个氨基酸残基被插入护骨素的天然序列中，并且与野生型护骨素相比，其活性最好至少相同甚至更高。OPG的生物活性可通过例如测定OPG与其天然配体OPGL之结合来确定。评估蛋白质与蛋白质相互作用的测定法已为本领域技术人员所知。这些测定法的例子是ELISA型结合测定法，免疫沉淀测定法，或者在任何其他合适的系统如BIAcore系统中进行测定。这些突变蛋白可用已知的合成方法和/或定点诱变技术或任何其他合适的已知技术制备。
任何这样一种蛋白质最好具有一成熟护骨素充分复制的氨基酸序列，从而具有与护骨素基本上相似的活性。用以下实施例所解释的测定法可测试护骨素突变蛋白的活性。例如，测量经OPG处理的成纤维细胞中胶原合成量是评估护骨素突变蛋白的活性的一个恰当试验。
本发明的突变蛋白包括由在严格条件下杂交于编码护骨素的DNA或RNA的核酸(如DNA或RNA)所编码的蛋白质。术语“严格条件”是指本领域一般技术人员常规地称为“严格的”杂交条件以及随后的洗涤条件。参照Ausubel等人，Current Protocol in Molecular Biology(分子生物学的目前方案)，同上，Interscience，N.Y.，§§6.3和6.4(1987，1992)，以及Sambrook等人(Sambrook，J.C.，Fritsch，E.F.，and Maniatis，T.(1989)Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，NY)。
不起限制作用，严格条件的例子包括洗涤条件，在低于所研究的杂交体的Tm计算值12-20摄氏度下，如在2×SSC和0.5％SDS中洗涤5分钟，在2×SSC和0.1％SDS中洗涤15分钟；在0.1×SSC和0.5％SDS，于37摄氏度洗涤30-60分钟并且在0.1×SSC和0.5％SDS，于68摄氏度洗涤30-60分钟。本领域一般技术人员知道，严格条件还依赖于DNA序列、寡核苷酸探针(如10-40碱基)或混合的寡核苷酸探针的长度。如果使用混合探针，优选使用四甲基氯化铵(TMAC)来代替SSC。参考Ausubel(同上)。
任何这样的突变蛋白优选具有与护骨素充分复制的氨基酸序列，从而具有与护骨素基本上相似或者甚至更高的生物活性。
护骨素的一种易测活性是其降低胶原合成的能力。只要突变蛋白有降低胶原合成的活性，就可被认为具有与护骨素实质上相似的活性。因此，可通过对任一给定的突变蛋白进行常规实验来确定该突变蛋白是否实质上具有与护骨素相同的活性。
在一个优选实施例中，任何这类突变蛋白具有与成熟护骨素序列至少40％的同一性或同源性。更佳地，它具有至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，或最佳地至少90％的同一性或同源性。
同一性反映两个或多个多肽序列或者两个或多个多核苷酸序列之间的关系，通过比较这些序列而确定。通常，同一性指两个多核苷酸或两个多肽序列在各自要比较的序列长度中，它们的核苷酸与核苷酸或者氨基酸与氨基酸之间的对应是完全一样的。
对于其对应不是完全一样的序列，可以确定“序列百分比”。通常把待比较的两个序列进行序列对比，得出这两个序列之间的最大相关性。这可包括在其中一个或两个序列中插入“缺口(gap)”以增加对比度。比较每一个序列的整个长度(所谓的全域性对比(global alignment))，或者比较它们的较短的限定长度(所谓的区域性对比(local alignment))可确定序列百分比，前者特别适合长度相等或长度差不多的序列，后者更适合长度不相等的序列。
两个或多个序列同一性和同源性的比较方法已为本领域技术人员所熟知。例如，Wisconsin序列分析软件包9.1版(Devereux J等人，1984)所提供的程序，又例如程序BESTFIT和GAP均可用于确定两个多核苷酸之间的同一性百分比与两个多肽序列之间的同一性百分比及同源性百分比。BESTFIT采用Smith和Waterman的“区域性同源性”算法(1981)，找出两个序列间最佳的一相似区域。其它确定两个序列间同一性和/或相似性的程序也已为本领域所知，例如BLAST程序家族(Altschul S F等人，1990，Altschul S F等人，1997，登入NCBI主页www.ncbi.nlm.nih.gov可查询得到)与FASTA(Pearson WR，1990，Pearson 1988)。
本发明可用的护骨素突变蛋白，或其编码核酸，包括由基本一致的、作为置换肽或多核苷酸序列所构成的有限集合，这些物质可由本领域一般技术人员基于本文的教导和指导，在无需过多试验的情况下，通过常规方法制得。
根据本发明，突变蛋白的优选改变是已知的“保守性”置换。护骨素的多肽或蛋白质的保守性氨基酸置换，可包括一组内同义氨基酸，这些同义氨基酸有足够相似的物理化学特性以致于在组成员之间的置换将保持分子的生物功能(Grantham，1974)。很清楚，还可在上述氨基酸序列中插入或缺失氨基酸，而不改变它们功能，尤其是如果这些插入或缺失只涉及到少数氨基酸，比如少于30个，较佳地少于10个，并且不取消或置换那些对功能构象至关重要的氨基酸，比如半胱氨酸残基。由这些插入和/或缺失所产生的蛋白质和突变蛋白属于本发明的范围之内。
较佳地，同义氨基酸(synonymous amino acid)组为表1所定义的那些；更佳地，同义氨基酸组为表2所定义的那些；最佳地，相似氨基酸组为表3所定义的那些。
表1 优选同义氨基酸组氨基酸 同义组SerSer，Thr，Gly，AsnArgArg，Gln，Lys，Glu，HisLeuIle，Phe，Tyr，Met，Val，LeuProGly，Ala，Thr，ProThrPro，Ser，Ala，Gly，His，Gln，ThrAlaGly，Thr，Pro，AlaValMet，Tyr，Phe，Ile，Leu，ValGlyAla，Thr，Pro，Ser，GlyIleMet，Tyr，Phe，Val，Leu，IlePheTrp，Met，Tyr，Ile，Val，Leu，PheTyrTrp，Met，Phe，Ile，Val，Leu，TyrCysSer，Thr，CysHisGlu，Lys，Gln，Thr，Arg，HisGlnGlu，Lys，Asn，His，Thr，Arg，GlnAsnGln，Asp，Ser，AsnLysGlu，Gln，His，Arg，LysAspGlu，Asn，AspGluAsp，Lys，Asn，Gln，His，Arg，GluMetPhe，Ile，Val，Leu，MetTrpTrp表2 更好的同义氨基酸组氨基酸 同义组
SerSerArgHis，Lys，ArgLeuLeu，Ile，Phe，MetProAla，ProThrThrAlaPro，AlaValVal，Met，IleGlyGlyIleIle，Met，Phe，Val，LeuPheMet，Tyr，Ile，Leu，PheTyrPhe，TyrCysCys，SerHisHis，Gln，ArgGlnGlu，Gln，HisAsnAsp，AsnLysLys，ArgAspAsp，AsnGluGlu，GlnMetMet，Phe，Ile，Val，LeuTrpTrp表3 最好的同义氨基酸组氨基酸 同义组SerSerArgArgLeuLeu，Ile，MetProProThrThrAlaAlaValVal
GlyGlyIleIle，Met，LeuPhePheTyrTyrCysCys，SerHisHisGlnGlnAsnAsnLysLysAspAspGluGluMetMet，Ile，LeuTrpMet可通过在蛋白质内的产生氨基酸置换，得到用于本发明的护骨素多肽或蛋白的突变蛋白，其例子包括任何已知的方法步骤，如在Mark等人的美国专利4959314，4588585，4737462；Koths等人的美国专利5116943，Namen等人的美国专利4965195；Chong等人的美国专利4879111，和Lee等人的美国专利5017691中所述的方法；以及美国专利4904584(Shaw等人)中所述的赖氨酸置换蛋白质。
术语“融合蛋白”指的是一种多肽，其中包含护骨素，或其突变蛋白，并和其他蛋白质(如在体液中有更长保留时间的蛋白)融合在一起。融合蛋白包含与能够改善分子的生物活性例如在人体内的半衰期的蛋白质全部或功能部分融合的护骨素全部或功能部分。一优选实施例中的融合蛋白包括免疫球蛋白(Ig)融合。包含与免疫球蛋白(Ig)全部或一部分融合的护骨素全部或一部分的融合蛋白是高度优选的。它们可以是单体或多聚体，异源或同源多聚体。融合蛋白最好含有免疫球蛋白恒定区，特别是免疫球蛋白的Fc部分。免疫球蛋白是IgG1或IgG2同种型的实施例是本发明更优选的。融合最好是Fc融合。
因此，护骨素可以与另一蛋白质、多肽等融合，例如免疫球蛋白或其片段。融合可以是直接的，或者通过短连接肽，该连接肽的长度可以短至1-3个氨基酸残基，或长达例如13-20氨基酸残基。所述连接肽可以是引入的位于护骨素序列与免疫球蛋白序列之间的，例如序列为E-F-M(Glu-Phe-Met)的三肽，或含Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met的13聚氨基酸连接肽序列。
本文使用的“功能衍生物”涵盖护骨素的衍生物，以及它们的突变蛋白和融合蛋白，这些物质可用本领域已知的手段，从作为残基侧链或作为N末端或C末端基团存在的官能团制备而得，并且只要它们仍然是医学上可接受的，即它们没有破坏蛋白的与护骨素的活性基本相似的活性，并且不会使含该物质的组合物具有毒性，那幺它们就被包括在本发明中。所以，一优选实施例的功能性衍生物包括连于一个或多个官能团的至少一个部分，而所述官能团是氨基酸残基的一个或多个侧链。
本发明高度优选的部分是聚乙二醇(PEG)侧链。PEG侧链可掩盖抗原位点并且延长与它们连接的物质在体液中的停留时间。其他的衍生物包括羧基的脂肪酯，羧基通过与氨或伯胺或仲胺反应而形成的酰胺，氨基酸残基的自由氨基与酰基部分(如烷酰基或碳环芳酰基基团)形成的N-酰基衍生物，或自由羟基(如丝氨酰基或苏氨酰基残基的羟基)与酰基部分形成的O-酰基衍生物。
护骨素、其突变蛋白和融合蛋白的“活性片段”涵盖单独的蛋白质分子多肽链或其与相关分子或残基相连(如糖或磷酸残基)的多肽链的任何片段或前体，或蛋白质分子或糖残基自身的聚集体，只要所述片段具有与护骨素基本上相似的活性。
本发明还涉及核酸分子在制备治疗和/或预防硬皮病的药物中的应用，其中该核酸分子含有的核酸序列编码具有以下氨基酸序列之一的多肽a)含有SEQ ID NO2或SEQ ID NO4的多肽；b)含存SEQ ID NO2或SEQ ID NO4的22到401氨基酸的多肽；c)含有1、2、3或4个护骨素富半胱氨酸结构域的多肽；d)含有SEQ ID NO2或SEQ ID NO4的22到194氨基酸的多肽；e)(a)到(d)的任何一个突变蛋白，其中氨基酸序列与(a)到(d)中至少一个序列至少有40％或50％或60％或70％或80％或90％的同一性；f)(a)到(d)的任何一个突变蛋白，其中该突变蛋白是由在温和严格条件或高度严格条件下能与编码(a)到(d)任何一个突变蛋白的DNA序列的互补序列杂交的DNA序列编码；g)(a)到(d)的任何一个突变蛋白，其中所述氨基酸序列的任何改变都是用保守性氨基酸取代(a)到(d)的氨基酸序列；h)(a)到(g)任何一个突变蛋白的同种型、融合蛋白或活性片段。
用于制备治疗和/或预防纤维变性疾病的药物。本发明还涉及所述核酸分子在治疗和/或预防结缔组织疾病，尤其是硬皮病中的应用。
根据本发明，护骨素也可以以含有所述核酸分子的载体形式给予人体。所以，本发明还涉及含有所述核酸分子的载体在制备治疗和/或预防硬皮病或另一种纤维变性疾病的药物中的应用。载体最好是表达载体，含有操作性连接于护骨素编码序列全部或一部分的启动子。另一优选实施例的载体是基因治疗载体。基因治疗载体为本领域所公知，大多数是病毒衍生而成的载体，例如腺病毒载体或慢病毒载体。
根据本发明，护骨素也可以以产生和/或分泌护骨素的细胞形式给予人体。所以，本发明还涉及表达护骨素的细胞在制备治疗和/或预防硬皮病或另一种纤维变性疾病的药物中的应用，即涉及治疗和/或预防硬皮病或另一种纤维变性疾病的细胞疗法。此细胞可以是产生天然护骨素的细胞和/或产生重组护骨素的转染细胞。最好是表达和分泌高含量蛋白的细胞，例如过度表达的细胞，其携带高拷贝数目的表达载体，而该载体含有一编码护骨素的核酸分子。
由于成纤维细胞表示纤维变性机制，所以它们是抗纤维变性和治疗硬皮病的最合适的细胞。因此，本发明最好采用表达护骨素的成纤维细胞。
本发明还涉及一种制备治疗和/或预防纤维变性疾病尤其是硬皮病药物的细胞，该细胞含有一包括编码护骨素全部或一部分的核酸分子的载体。经过基因改造产生本发明的多肽的细胞也在本发明的范围之内。
在通常不表达护骨素抑制剂或抑制剂表达数量不足的细胞中，使用表达载体来诱导和/或增强内源性产生护骨素抑制剂的方法，也在本发明构思中。所以本发明利用称为内源性基因激活(EGA)的技术产生所需要的蛋白质。
本发明优选使用一些组合治疗。故本发明的药物最好还包括·干扰素，特别是干扰素β
·肿瘤坏死因子(TNF)拮抗剂，特别是可溶性TNFR，例如可溶性p55(TBPI)和/或可溶性p75(TBPII)·其他抗硬皮病试剂·选自以下组的的抗硬皮病试剂卤夫酮、ACE抑制剂、钙离子通道阻断剂、质子泵抑制剂、非类固醇抗炎药(NSAIDs)、COX抑制剂、皮质类固醇、四环素、己酮可可碱、布西拉明(bucillamine)、香叶基香叶基转移酶抑制剂(geranylgeranyl transferase inhibitor)、rotterlin、脯氨基-4-羟化酶抑制剂、c-蛋白酶抑制剂、赖氨基-氧化酶抑制剂、松弛素(relaxin)、卤夫酮、前列腺素、前列环素、内皮素-1、氧化氮、血管紧张素II抑制剂、抗氧化剂或SARP-1。
SARP-1是一种对纤维变性疾病如硬皮病具有有益效果的蛋白质(WO02/46225)。根据本发明，如WO02/46225中描述的SARP-1的片段、同种型、活性部分、融合蛋白或功能衍生物可与护骨素联用。
所有治疗可以同时、先后或分开使用。
含有一或多种上述物质以及护骨素的药物组合物在本发明的范围之内。
虽然目前还没有治愈硬皮病的方法，但现正使用一些试剂或疗法来治疗硬皮病症状。可用作本发明组合治疗的这样一些抗硬皮病药物，可参见本文引用的参考文献Leighton(2001)或Wigley和Sule(2001)。
干扰素主要因其对病毒复制和细胞增殖有抑制作用而为人所认知。例如，干扰素-γ在促进免疫和炎症反应中起重要作用。据说干扰素β(IFN-β，I型干扰素)有抗炎作用。
在本发明另一实施例中，护骨素与TNF拮抗剂结合使用。TNF拮抗剂以几种方式发挥其活性。首先，拮抗剂能以足够的亲和力和特异性结合或封蔽TNF分子本身，以致部分或基本上中和了TNF表位或负责与TNF受体结合的表位(下文称为“遮蔽性拮抗剂”)。例如，一种遮蔽性拮抗剂可以是针对TNF的抗体。
另一方面，TNF拮抗剂可抑制TNF结合后由细胞表面受体激活的TNF信号通道(下文称为“信号拮抗剂”)。TNF拮抗剂易于鉴定并通过常规方法筛选评价，即在体外敏感细胞系，如TNF能引起其增殖和分泌免疫球蛋白的人B细胞中用候选拮抗剂对天然TNF活性的影响来评价。该试验包含不同稀释度，例如，试验所用TNF摩尔量的0.1倍至100倍，的候选拮抗剂的TNF制剂，以及无TNF或只有拮抗剂的对照(Tucci等人，1992)。
封蔽拮抗剂是本发明优选使用的TNF拮抗剂。在封蔽拮抗剂中，优选使用那些以高亲和力结合TNF并具有低免疫原性的多肽。特别优选使用可溶性TNF受体分子和抗TNF的中和抗体。例如，可溶性形式TNF-R I(p55)和TNF-R II(p75)可用于本发明。这些平截型受体是本发明更优选的拮抗剂，其包括受体的胞外结构域或其功能部分，例如，EP914431叙述了平截型可溶性TNF-I型和TNF-II型受体。
平截型TNF受体是可溶的，在尿和血清中检测到30kDa或40kDa的TNF抑制性结合蛋白，这两种TNF抑制性结合蛋白分别称为TBPI和TBPII(Engelmann等人，1990)。根据本发明，护骨素与TNF拮抗剂和/或干扰素可同时、先后或分开使用。
根据本发明，优选TNF拮抗剂是TBPI和TBPII，与护骨素联用。该受体分子的衍生物、片段、区段和生物活性部分，按功能装配成本发明用的受体分子。受体分子的这种生物活性等价物或衍生物，指的是多肽部分或编码该受体分子的序列部分，其大小足够并能以亲和力结合TNF，以致抑制或阻断与膜结合的TNF受体的相互作用。
本发明另一优选实施例中，可溶性人TNF-RI(TBPI)是本发明用的TNF拮抗剂。欧洲专利EP308378、EP398327和EP433900描述了天然和重组的可溶性TNF受体分子及其生产方法。
虽然在疾病早期可能有利于阻断TNF-α，在晚期也作过讨论，但TNF自身对硬皮病具有有益的效果(Abraham等人，2000)。所以，本发明还涉及护骨素和TNF-α结合使用来治疗或预防硬皮病，特别是进展期疾病。本发明也可使用TNF-α或TNF-β。
本发明还涉及用于治疗和/或预防纤维变性疾病，尤其是硬皮病，的药物组合物，其含有护骨素，可任选地掺有与一或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。该药物组合物也包括上述任何其它成分，特别是干扰素、TBP或COX抑制剂。
本发明的药物组合物还包括含有本发明核酸分子的载体或表达护骨素的细胞。
药物组合物的活性成分，即本发明的多肽、核酸或细胞、或其组合以及以上提到的物质组合，可以以各种方式给予个体。给药途径包括皮内、透皮(例如在缓释剂型中)、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、口服、硬膜外、局部、和鼻内的途径。可以使用任何其他在治疗上有效的给药途径，例如通过上皮或内皮组织的吸收或通过基因疗法(其中编码活性成分的DNA分子被施用于病人(如通过载体)，这导致了该活性成分在体内表达和分泌。此外，本发明的蛋白质可与其他一些生物活性物质成分(例如药学上可接受的表面活性剂、赋形剂、载体、稀释剂和运载体)一起施用。
“药学上可接受的”的定义包括任何载体，其并不干扰活性成份的生物活性的有效性，并且给予后对宿主无毒性。例如，对肠胃外给药而言，活性蛋白质可在诸如盐水、葡萄糖溶液、血清白蛋白和Ringer氏溶液等载体中，配制成用于注射的单位剂型。
对于肠胃外给药(如静脉内、皮下、肌内)来说，活性蛋白质可以与药学上可接受的肠胃外载体(例如水、盐水、葡萄糖溶液)以及维持渗透压(如甘露醇)或化学稳定性(如防腐剂和缓冲剂)的添加剂一起配制成溶液、悬浮液、乳液或冻干粉末。制剂可用常用的技术进行灭菌。
本发明的活性蛋白质的生物利用度也可通过延长分子在人体中半衰期的偶联法加以改善，例如如PCT专利申请WO92/13095中所述的那样，把分子连于聚乙二醇。
活性蛋白质的治疗有效量是一个有很多变量的函数，包括受体类型、本发明的物质与其受体的亲和力、受体显示的任何残余细胞毒活性、给药途径、患者的临床状况。
“治疗有效量”是指给予时，本发明的物质在体内导致对疾病的发展或进程具有有益的效果。给予于个体的剂量(作为单剂或多剂)可随各种不同因素而变化，包括OPG的药物动力学特性、给药途径、患者症状和特征(性别、年龄、体重、健康状况、体格)、病症的程度、并行的治疗、治疗的频率和所需的效果。对已建立的剂量范围进行调整和操作在本领域技术人员的技能之内。
根据本发明，多肽的剂量为大约0.0001-100mg/kg或大约0.01-10mg/kg体重，或大约0.1-5mg/kg或大约1-3mg/kg体重。如上所述，这取决于很多治疗判断。本发明的药物可以每日一次、每隔一日一次、或每星期三次。
每天的剂量通常分开几次或通过持续释放方式给予，以便有效地得到所需效果。第二次或随后的给药剂量可以与第一次或以前给予于个体的剂量相同、更小或更大。第二次或随后的给药可以在疾病发作之中或之前给予。
本发明还涉及一种治疗和/或预防纤维变性疾病，尤其是硬皮病的方法，其包括把有效量的本发明的物质给予有需要的患者，可任选地与药学上可接受的载体一起给予。另外，按照本发明也可给予产生本发明护骨素或核酸分子的细胞，其可任选地包含在一表达载体中。
表达载体可全身性给予。较佳地，表达载体通过肌内注射给予。另一优选给药途径是吸入途径，特别当疾病涉及肺纤维变性时。另一种优选给药途径是局部给予含有OPG序列的表达载体，或本发明的OPG多肽，特别当累及皮肤时。
本发明还涉及一种药物组合物的制备方法，其包括使有效量的护骨素与药学上可接受的载体混合，以及涉及一种关节炎的治疗和/或预防方法，其包括把有效抑制量的护骨素给予有需要的宿主。
所有在本文引用的文献，包括期刊文章或摘要，公开或未公开的美国或外国的专利申请，授权的美国或外国的专利或任何其他文献，通过在此引用而全部纳入本文，包括所引用的文献中所出现的所有的数据、表格、附图和文本。此外，在本文所引用的文献中所引用的全部文献内容，也通过在此引用而全部纳入本文。
对已知方法步骤、常规方法步骤、已知方法或常规方法的引用，并非表示本发明的任何方面、描述或实例已在相关领域中被公开、教导或暗示。
前面对具体实例的描述对本发明的普遍本质作了如此全面的披露，以致于其他人可以通过运用本领域技能内的知识(包括本文所引用的参考文献的内容)，在没有过分试验的情况下，在不脱离本发明的总体概念的情况下，很容易地修改或变动这些具体实例以便用于各种应用。因此，基于本文所给的教导和指导，这些变动和修改被认为被包括在所公开的实施例的等价范畴内。应理解，本文的措词或术语是为了描述而非用于限制，所以本说明书的术语或措词应由熟练技术人员，根据本文所给的教导和指导并结合本技术领域一般技术人员的知识，作出解释。
以上为对本发明进行的叙述，参照以下提供的实施例将会更容易理解本发明的内容，但以下实施例是用于阐述而不意味着对本发明的限制。
实施例方法病人样品从9例年龄和性别相当的弥漫型皮肤全身性硬化症患者的病变或非病变皮肤(通常是前臂皮肤)钻取2立方毫米，进行活组织检查。所有患者都符合美国风湿学会关于全身性硬化症诊断的标准。
成纤维细胞培养如前所述(Abraham等人，1991)，通过体外培养，自活检获得成纤维细胞。简言之，将活检组织切片，置于灭菌塑料皿或塑料瓶中。室温干燥15分钟后，活检切片附在组织培养塑料上，再在由DMEM组成的成纤维细胞生长培养基(FGM)中培养，所述DMEM含有10％胎牛血清(FCS)、2mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、100单位/ml盘尼西林、100μg/ml链霉素、50μg/ml艮他霉素和2.5μg/ml两性霉素B。在湿空气和5％二氧化碳的环境中培养2-3星期后，经胰蛋白酶简单处理使成纤维细胞生长晕(outgrowth)脱离出来，再在不含艮他霉素和两性霉素B的FGM中培养。实验采用第2和5代之间的成纤维细胞。成纤维细胞表型通过他们在单层和三维胶原凝胶培养基中的一般形态而加以确认。
RNA的分离按照制造商的方案，用Trizol(Life Technologies)从早期传代成片的硬皮病成纤维细胞中提取总RNA。最终的RNA沉淀重悬于经灭菌DEPC处理过的水中，浓度为1μg/μl，储存于-80℃。
cDNA探针合成取2μg总RNA与1.3μl细胞因子特异性引物(R&D Systems，cat.no.GAC11)混合，70℃下在0.5毫升微量离心管(eppendorf tube)内培育2分钟。再把离心管冷却至50℃，保持2分钟，然后，加入反应混合物，该混合物含有2μl 5X反应缓冲液(250mM Tris-HCl pH8.3、375mM氯化钾和15mM氯化镁)、1μl 10X dNTP混合物(5mM dGTP、5mM dCTP和5mM dTTP)、3.5μlα32P-dATP(3000Ci/mmol，Amersham，cat.no.PB10204)、0.5μl DTT(100mM)和1μl Superscript II逆转录酶(Life Technologies)。反应混合物用吸管头(pipetting)混匀一下，50℃培养25分钟。加入含1mg/ml糖原的1μl 0.1M EDTApH8.0终止反应。再按照制造商的使用说明，用Chromaspin-200 DEPC-H2O层析柱(Clontech)从无掺入的脱氧核苷酸纯化标记cDNA。通过Czerenkov计数鉴定含有cDNA的馏分。70℃下峰值馏分(通常为收集的全部6个馏分中第2个馏分)用含1mM EDTA的0.1倍体积1M氢氧化钠处理20分钟，使RNA水解，70℃下再以等体积含2.5μg人Col-1 DNA(Life Technologies)的1M磷酸二氢钠中和20分钟。加热处理中和后的cDNA探针，再将其直接加入到杂交混合物中。
与基因过滤微阵列杂交将含0.5μg/ml鲑鱼精DNA(Life Technologies)的5ml表达杂交液(ExpressHybridization solution)(Clontech)装在转动瓶中，转动瓶置于Hybaid杂交烘箱(MWG Biotech)，68℃使基因过滤微阵列(人细胞因子表达阵列，R&DSystems，cat.no.GA001)在此表达杂交液中预杂交2小时。之后，预杂交液被新鲜杂交液所置换，所述新鲜杂交液含有比活性为0.25至1×106cpm/ml的cDNA探针制剂。68℃杂交16-20小时。杂交后，68℃过滤器用2X SSC/1％SDS洗4次，每次20分钟，用0.1X SSC/0.5％SDS洗2次，每次15分钟。然后，将过滤器密封在Saran wrapTM中，室温暴露于K型成像磷感屏(Biorad)不同的时间(4小时到4天)。
影像分析成像磷感屏用Biorad的个人FX磷光影像分析仪扫描，分辨率为50μm。将所得的16位数字文件转为可用Arrayvision软件(Imaging Research Inc.)分析的TIF格式和影像。我们测量每个样品滴在过滤器上两斑点的384基因的像素密度。减去背景信号，得到阵列中每对斑点的平均像素密度(相等于表达水平)。
通过RT-PCR技术确认选定基因的微阵列结果每个病人样品各取1μg总RNA，用寡脱氧胸苷酸(oligo dT)引物(Promega)使总RNA在20μl反应体积中逆转录，该反应体积含5mM氯化镁、10mMTris-HCl、50mM氯化钾、0.1％Trition X-100、dATP、dGTP、dCTP和dTTP各1mM、0.5单位重组的RNasin核糖核酸酶抑制剂(Promega)及15单位AMV逆转录酶(Promega)。反应混合物在42℃培养60分钟，95℃加热5分钟，再用无菌水稀释至200μl。用特异性引物对使逆转录酶反应稀释液在Taqman(PEApplied Biosystem 7700)进行实时PCR分析，所用的特异性引物对是根据基因过滤制造商提供的数据库查询号护骨素-112F 5’CTG CGC GCT CGTGTT TCT(SEQ ID NO5)和护骨素-185R 5’AAT GAA GGT ACT TTG GAGGAA ACG(SEQ ID NO6)，运用Primer Express软件(PE Applied Biosystems)针对护骨素而设计。将所得结果标准化为每个样品中管家基因甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的表达，并以折迭变化来表示，由异常病人样品的表达值除以该患者相应的正常样品的表达值来确定。
人护骨素全cDNA编码序列的克隆基于EMBL数据库已有的cDNA序列(查询号U94332)，用下列引物通过逆转录酶PCR在含0.3mM dNTPs、1mM硫酸镁、5μl正常人的真皮(包皮)成纤维细胞cDNA模板(用上述方法制备)、5μl 10X Pfx扩增缓冲液(LifeTechnologies)和1μl铂Pfx DNA聚合酶(Life Technologies)的50μl反应混合物中克隆OPG的全长cDNA编码序列OPG F(正向)5’CGG GAT CCGCCACCA TGA ACA AGT TGC TGT GCT(SEQ ID NO7)和OPG R(反向)5’AAGCTC GAG TTA TAA GCA GCT TAT TTT各50pmole。94℃反应混合物加热2分钟，再按下列条件进行35次PCR94℃15秒，55℃30秒和68℃1分钟。用1X TAE缓冲液中的1％琼脂糖凝胶(Life Technologies)对扩增产物作分析。用Wizard PCR纯化试剂盒(Promega)从凝胶中纯化预测的分子量(1205bp)迁移的PCR产物。
取100ng凝胶纯化的DNA，按照制造商的条件以限制酶BamHI和XhoI(Pharmacia)消化，按上述方法再次纯化，并按照标准分子生物技术用T4 DNA连接酶(New England Biolabs)与用BamHI/XhoI消化的质粒pcDNA3.1(+)(Invitrogen)连接。用Biorad基因脉冲仪(Biorad Gene Pulser)通过电穿孔使连接产物转到大肠杆菌株TOP 10F’(Invitrogen)中。从所得克隆生长而成的5ml培养基分离质粒DNA，并用T7和pcDNA3.1AS引物(Invitrogen)在AppliedBiosystems 3700测序仪中进行自动测序分析以确定OPG的序列。
检测从病变和正常真皮成纤维细胞中分离的蛋白质提取物中的护骨素按照上述方法培养硬皮病患者和对照受试者的低代细胞病变和正常成纤维细胞，通过含1mM EDTA的PBS在37℃处理细胞单层5分钟，以收获所述成纤维细胞。离心回收分离出来的细胞并重悬于50μl PBS中，用50μl样品缓冲液(20％SDS、0.2％溴苯酚蓝、50％甘油、1M Tris pH6.8)处理，-80℃冷冻，然后解冻。根据制造商的方案，用BCA试剂盒(Pierce)测定蛋白质内容物。取约10μg蛋白质用0.1倍体积DTT(0.1M)处理，根据制造商的使用说明在4-12％SDS聚丙烯酰胺凝胶(Novex)上运行。再利用Novex wetblot装置(30V，1小时)将蛋白质带转移到硝酸纤维素膜上。4℃将纤维素膜在含5％脱脂奶粉的PBS中封闭过夜，再用PBST冲洗。这些膜与0.5μg/ml一级抗体(R&D systems，抗OPG单克隆抗体，cat no.MAB8051)在PBST/1％BSA中室温摇动培养1小时。然后，先用PBST彻底冲洗膜，再与稀释1/3000的二级抗体(抗小鼠辣根过氧化物酶，Sigma)在PBST/1％BSA中培养。最后，在研究和观察之前，用ECL试剂和HyperfilmTM(Amersham)彻底冲洗膜。
用ELISA测定经重组OPG处理的或经过OPG/pcDNA3.1载体转染后的成纤维细胞的细胞培养上清液中的I型胶原参照Shi-wen等人(Shi-Wen等人，1997)所述，用捕获ELISA系统在体外测定培养人成纤维细胞中的胶原合成。简言之，使AG1518人真皮成纤维细胞(购自ATCC)保持在含5％FCS和2mM谷氨酰胺的DMEM(LifeTechnologies)中。通过胰蛋白酶化作用收获细胞，以70％铺满率接种在48孔细胞培养板(Falcon)内含5％血清的培养基中，8小时后转移到不含血清的培养基中。经过24小时后，除去培养基并换上含50μM L-抗坏血酸盐(Wako PureChemical Industries)和浓度递增的人重组护骨素(OPG-Fc，购自R&D systems)且不含血清的新鲜培养基。16小时后，在培养基中加入TGFβ1(PeproTech)至终浓度为2ng/ml，再经过24小时后，回收培养基，离心除去残留细胞，稀释，按下文所述的方法进行ELISA试验测定I型胶原。
胶原合成的测定也可在与OPG cDNA(pcDNA3.1-OPG)转染后的原代人成纤维细胞(OBHC细胞)中进行或在以下的模拟转染试验(仅有pcDNA3.1载体)中进行通过胰蛋白酶化作用收获OBHC细胞并以50％铺满率接种在48孔板内的完全培养基中。按照制造商的使用说明，用Fugene V转染试剂(Roche)将质粒转染到OBHC细胞。转染后5小时，用含有L抗坏血酸盐且不含血清的新鲜培养基置换原有培养基，过夜，然后按以上所述的方法用TGFβ1(10ng/ml)处理24小时。
4℃，用在PBS(pH7.4)中的5μg/ml山羊抗人I型胶原(SouthernBiotechnology Associates.Inc.)包被MaxiSorp板(Nunc)，过夜。然后清除抗体溶液，板在室温下用PBS-1％BSA封闭1小时，再用PBS/0.05％Tween 20(PBST)洗4次。取三份100μl条件培养基样品进行测试。此样品室温培养2小时，再用PBST洗4次。室温下使样品与稀释1∶2000的生物素化山羊抗人I型胶原抗体(Southern Biotechnology Associates.Inc.)培养1小时，再用PBST洗4次。然后，在室温下再使样品与稀释1∶4000的与HRP-链霉抗生物素偶合的抗体(Zymed)摇动培养1小时。最后，样品用PBST洗4次。加入OPD基质(Sigma cat.no.P9187)，静置10分钟，出现颜色。加入20％H2SO4mix终止反应，板在496nm处读数(Victor2多标记计数器(Victor2multilabel counter，Wallac)。运用Molecular Probes的CyQuant细胞增殖分析试剂盒(C-7026)使得到的结果标准化为细胞数。
CTGF-SEAP启动子分析以寡核苷酸5’-ATCTCGAGGGCCACTCGTCCCTTGTCC(SEQ ID NO9)和5’-ATAAGCTTGGAGTCGCACTGGCTGTCTCC(SEQ ID NO10)进行PCR扩增人CTGF(结缔组织生长因子)基因报导子区(788bp)，从而构建CTGF-SEAP启动子-报导基因质粒。将经过凝胶纯化的扩增产物亚克隆到pSEAP2-基质(basic)(Clontech)。
将NIH 3T3成纤维细胞(ATCC)接种在T-75烧瓶中，与5μg CTGF-SEAP和1μg pcDNA3.1(Invitrogen)质粒共转染。就800μg/ml G418(Sigma)选择细胞。
建立与CTGF-SEAP启动子-报导基因稳定整合的克隆，并分析克隆，选择最敏感的一个克隆作基于细胞的试验研究。
将此克隆的细胞(CTGF-SEAP)以每孔10,000个细胞接种在96孔板内含0.5％FCS的DMEM中。第二日，加入新鲜培养基并且在不加入或加入不同浓度的TGFβ和OPG(护骨素)的情况下使细胞培养多72小时，然后收集上清液作SEAP试验。
按照制造商的方案(Clontech kit)测定SEAP表达。
体外研究第1日通过气管内给予在生理盐水中的博来霉素(0.075IU)来诱导雄性小鼠肺纤维变性。将小鼠分为不同的3组，每组10只动物。第1组每日接受皮下注射5mg/kg OPG(在生理盐水中)。第2组每日接受皮下注射0.5mg/kgOPG。第3组每日接受皮下注射生理盐水。第4组包括年龄和性别相当的未经处理的幼鼠。每日测量体重，第12日处死全部小鼠。分离出各个肺叶测定羟基脯氨酸(Smith等人，1994)，或者肺叶经福尔马林固定，以石蜡包埋，用于组织学研究。肺解剖面的胶原染tri-chrome或苦天狼星红(Bancroft andStevens)，为每个肺的纤维变性程度计分。
在体外经卤夫酮处理的硬皮病患者的成纤维细胞中OPG mRNA的半定量逆转录酶PCR分析按上述方法，使病变和非病变成纤维素细胞保持在培养基中。细胞单层(铺满70％)用卤夫酮(10-8M)(Collgard Pharmaceuticals)处理12小时。过了处理期后，收获细胞，运用Trizol方法分离总RNA。取1μg总RNA，按上述方法进行逆转录酶PCR，采用对护骨素特异的PCR引物(OPG 740 F 5’ACGCCT AAC TGG CTT AGT GT(SEQ ID NO11)和OPG 1280R 5’CTG ATTGGA CCT GGT TAC CT SEQ ID NO12)。经过30次PCR之后，反应产物在染有溴化乙锭的1％琼脂糖凝胶上运行，拍照，用Kodak 1D数字科学软件分析。通过对凝胶提取的DNA作直接测序，证实以预测分子量迁移的PCR产物为护骨素。作为基因组DNA污染的对照，对含有合适的RNA但无逆转录酶的逆转录酶反应混合物进行PCR反应。用对GAPDH特异的PCR引物扩增逆转录酶反应作为阳性对照，分析初始反应中输入RNA的完整性和数量。
I型胶原α2启动子活性使小鼠胚胎成纤维细胞(πS3细胞)保持在含2％FCS和2mM谷氨酰胺的DMEM-F12培养基中。通过胰蛋白酶化作用收获细胞，以50％铺满率接种在48孔细胞培养板中。第2日，按照制造商的使用说明，以Fugene V试剂(Roche)将细胞与含有连接于萤光素酶cDNA(英国伦敦Royal Free Hospital的Dr.David Abraham提供)的3.5kb胶原1α2启动子的pGL3载体(Promega)在不含血清的培养基中转染。经过5小时转染后，将细胞转移到含2％FCS的新鲜培养基中，并在0、1、10或100ng/ml重组人护骨素存在下单独用卤夫酮(HF)(10-10M)，单独用TGFβ1(5ng/ml)或者HF(10-8M)+TGFβ1(5ng/ml)处理12小时。过了处理期后，将细胞转移到含有2％FCS和2mM谷氨酰胺的完全培养基中，48小时后，运用购自Promega的Bright-Glo检测系统测定每孔萤光素酶的活性。得到的结果表示为相对发光单位并标准化用Cyquant试剂盒(Molecular Probes)在平行实验中测定的每孔含有的细胞数。
实施例1病变成纤维细胞的护骨素mRNA相对于非病变成纤维细胞明显下调对6例硬皮病患者的正常和异常成纤维细胞样品进行基因过滤微阵列分析。护骨素(OPG)的平均表达水平示于图1a，每例患者的数值示于图1b。
得到的微阵列结果通过对9例患者分离出的RNA样品作实时PCR分析(使用对OGP特异的PCR引物)以进一步确认。结果示于图2，表示为表达水平的折叠变化(病变除以非病变)。在测试的9例患者中有7例的病变成纤维细胞中OPG与同一患者的非病变成纤维细胞相比下调至少2倍。
同一例患者的非病变与病变成纤维细胞之间所看到的表达差异可能是两组群体之间培养条件之差别引致，因为正常人真皮成纤维细胞的原代培养基的OPG mRNA表达不会显著改变细胞传代(数据未示出)。另外，对硬皮病患者异常皮肤的整个活检样品的总RNA作实时RT-PCR分析，结果显示其护骨素mRNA相对于从同一患者临床正常的解剖位置相匹配的皮肤低(图3)。
实施例2 从蛋白质水平上看硬皮病患者的病变成纤维细胞的护骨素相对于非病变成纤维细胞下调为了确定护骨素mRNA是否反映护骨素的改变，利用抗人护骨素单克隆抗体通过Western印迹分析测定了年龄和性别相当的受试者中解剖位置相匹配的正常皮肤成纤维细胞与病变皮肤成纤维细胞的OPG含量。结果示于图4。在3/4正常成纤维细胞中可清楚地检测到护骨素单体和二聚体，只有一个正常样品中显示较弱表达。而对异常成纤维细胞，全部4个测试样品都依稀看到一条单体带。以重组表达的OPG-Fc融合蛋白作为染色的阳性对照。
实施例3人OPG的克隆为了对OPG的体内外活性作特性分析，通过逆转录酶PCR克隆全cDNA编码序列，所用的引物基于已公开的OPG序列，其位于预测的启动密码子和终止密码子的侧边。对所得OPG cDNA克隆(在pcDNA3.1中)作序列分析，结果显示与Morinaga等人，(Morianga等人，1998)公开的OPG核苷酸序列有100％同一性，但与Simonet等人(1997)公开的序列相差一个氨基酸(参见SEQ ID NO2和4)。
实施例4人真皮成纤维细胞系内OPG I型胶原合成的影响在L-抗坏血酸盐存在下培养的成纤维细胞分泌胶原进入培养基中，以致可运用ELISA测定胶原。人成纤维细胞通过上调胶原合成来应答促纤维变性细胞因子TGFβ1的刺激。因此，我们测试了重组护骨素(护骨素-Fc融合蛋白)对AG1518C成纤维细胞内TGFβ1诱导的胶原合成的影响。开始TGFβ1处理之前在成纤维细胞培养基中加入护骨素，其能够以剂量依赖方式抑制TGFβ1介导的胶原合成的增加(图5)。当在中和抗OPG单克隆抗体存在下进行实验时，对胶原合成无影响。类似地，在重组OPG不存在下仅给予抗OPG也不影响胶原合成，提示所看到的胶原合成的减少是OPG的特有作用。
在原代人成纤维细胞(OBHC)与含有OPG全长编码序列的质粒(pcDNA3.1/OPG)转染后也观察到对胶原合成的类似作用。在与OPG质粒转染的OBHC中，无发现增加胶原合成来应答TGFβ1刺激的现象，与模拟(pcDNA3.1空载体)转染的OBHC相反(图6)。
实施例5OPG处理使小鼠胚胎成纤维细胞内I型胶原α2启动子的基础活性和TGFβ1诱导的活性大大降低为了评估OPG使胶原合成减少是否是由于对胶原启动子活性的作用所引起的，我们在I型胶原α2启动子的3.5kb区调控下检查了OPG处理对已经与含有报导基因cDNA、萤光素酶的质粒转染的小鼠胚胎成纤维细胞的影响。胶原启动子对此构造体的刺激导致萤光素酶基因的转录激活，而萤光素酶基因的活性可在其基质萤火虫萤光素存在下通过发光分析法测定。
用1ng/ml到100ng/ml OPG处理，能明显降低胶原启动子活性的基础水平(图7A，对照)。受到TGFβ1刺激之后，胶原启动子活性至少增大2倍(图7A，TGFβ1)。当同时用100ng/ml OPG处理细胞，胶原启动子活性显著下降(P＜0.05)。
据报导，植物生物碱卤夫酮是I型胶原合成的特异性抑制剂(Granot等人，1993)。当成纤维细胞用低浓度的卤夫酮(10-10M)处理时，我们发现胶原启动子活性随着护骨素浓度增大(从1ng/ml到100ng/ml)而剂量依赖性地降低，测试的OPG剂量最高，这种降低非常明显(100ng/ml，P＜0.01)(图7A，HF)。卤夫酮能够抑制TGFβ1诱导的胶原启动子活性(McGaha等人2002)。OPG还能够通过剂量依赖方式抑制TGFβ1诱导的胶原启动子活性增加来加强卤夫酮的作用。这种作用在100ng/ml OPG时尤为明显(P＜0.01)，该浓度下胶原启动子的活性几乎恢复至基础水平(图7，HF+TGFβ1)。
实施例6TGFβ介导的结缔组织生长因子反式激活为OPG所削弱结缔组织生长因子(CTGF)是一个38-kD富含半胱氨酸的蛋白质，它刺激成纤维细胞产生胞外基质元件。据报，在很多纤维变性人组织中都发现CTGF过度表达，包括肺、皮肤、肝、肾和血管。TGFβ在体外激活人肺成纤维细胞的CTGF基因转录。用分泌型碱性磷酸酶(SEAP)构建一个CTGF启动子-报导基因作为报导基因，其表达可在条件培养基而不是在细胞提取物中测定。
细胞表达使CTGF-SEAP报导基因与TGFβ和0.46、1.4或4.6μg/ml OPG一起培养。该实验的结果示于图7B。与OPG一起培养抑制了TGFβ诱导的CTGF表达，这进一步表示OPG的抗纤维变性活性。
实施例7经卤夫酮处理的硬皮病患者成纤维细胞中OPG mRNA的表达卤夫酮能够使成纤维细胞内胶原合成下调的机制尚未有完整的阐述。因此，我们通过逆转录酶PCR检查了卤夫酮对成对硬皮病患者病变和非病变成纤维细胞中OPG mRNA的表达的影响。
在10-8M卤夫酮处理后12小时进行测定，发现全部测试样品(3个正常，2个异常)的病变和非病变成纤维细胞的OPG mRNA表达都有上调(至少3倍)(图8)。令人感兴趣的是，在基因过滤微阵列分析实验中，OPG是用卤夫酮处理成纤维细胞后上调最大的其中一个基因(数据未示出)。
实施例8体内给予OPG防止博来霉素诱导的小鼠肺纤维变性给予C57BL/6小鼠单次气管内注射博来霉素，结果在14日内快速诱导肺纤维变性，表现为肺间质内胶原沉积增多(Hattori等人，2000)。为了测定给予OPG是否可能免于发展为纤维变性或确实能减缓疾病严重性，我们测试了每日注射OPG对博来霉素处理小鼠的影响。
给各有10只小鼠的3组动物单次气管内滴注博来霉素。给予博来霉素后第一日开始皮下注射OPG。第一组接受高剂量(5mg/kg)，第二组接受低剂(0.5mg/kg)。对照小鼠接受每日皮下注射生理盐水。作为比较，研究还包括第4组小鼠，它们完全未经过处理且年龄和性别相匹配(幼鼠)。
用博来霉素处理后动物立即生病。这引起体重快速下降并可导致死亡，此情形与未经处理的动物(它们的健康状况保持良好，体重维持正常)相反(图9A)。以低剂量OPG处理的小鼠体重下降的程度与对照小鼠相当。此组动物的死亡率似乎也较高(图9B)。接受高剂量OPG处理的小鼠恢复情况则好得多，它们的体重只在治疗最初5日下降。这也反映在此组动物的死亡率较低(＜10％)。
在给予博来霉素后第12日，处死所有存活小鼠。肺的组织学分析揭示与对照动物的纤维变性病变涵盖约70％肺表面积相比，高剂量OPG处理的动物受纤维变性影响的肺表面积大大减少(图10A)。高剂量OPG处理的小鼠的肺相对于对照小鼠具有大大减少的羟基脯氨酸含量(P＜0.05)，与未经博来霉素处理的小鼠相当(幼鼠组，图10B))。在低剂量OPG处理的小鼠中也观察到羟基脯氨酸含量降低，虽然因为此组的存活小鼠数目太少未达到统计学意义。羟基脯氨酸含量是衡量胶原沉积的一个参数。此处结果表示OPG处理能有效地减少肺的胶原沉积。
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权利要求
1.一种物质在制备治疗和/或预防纤维变性疾病的药物中的应用，其特征在于所述物质选自以下组内a)含有SEQ ID NO2或SEQ ID NO4的多肽；b)含有SEQ ID NO2或SEQ ID NO4的22到401氨基酸的多肽；c)含有1、2、3或4个护骨素富半胱氨酸结构域的多肽；d)含有SEQ ID NO2或SEQ ID NO4的22到194氨基酸的多肽；e)(a)到(d)的任何一个突变蛋白，其中氨基酸序列与(a)到(d)中至少一个序列至少有40％或50％或60％或70％或80％或90％的同一性；f)(a)到(d)的任何一个突变蛋白，其中该突变蛋白是由在温和严格条件或高度严格条件下能与编码(a)到(d)任何一个突变蛋白的DNA序列的互补序列杂交的DNA序列编码；g)(a)到(d)的任何一个突变蛋白，其中所述氨基酸序列的任何改变都是用保守性氨基酸取代(a)到(d)的氨基酸序列；h)(a)到(g)任何一个突变蛋白的盐或同种型、融合蛋白、功能衍生物、活性片段或环形排列的衍生物。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述纤维变性疾病是一种结缔组织病。
3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于所述纤维变性疾病是硬皮病。
4.如上述权利要求中任一项所述的应用，其特征在于所述物质是单体或二聚体。
5.如上述权利要求中任一项所述的应用，其特征在于所述物质的一个或多个位点被糖基化。
6.如上述权利要求中任一项所述的应用，其特征在于所述融合蛋白包括免疫球蛋白(Ig)融合。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述Ig融合是Fc融合。
8.如上述权利要求中任一项所述的应用，其特征在于所述功能衍生物包括连于一个或多个官能团的至少一个部分，而所述官能团以氨基酸残基的一个或多个侧链的形式存在。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于所述部分是聚乙二醇部分。
10.一种核酸分子在制备治疗和/或预防纤维变性疾病的药物中的应用，其中该核酸分子含有的核酸序列编码具有以下氨基酸序列之一的多肽a)含有SEQ ID NO2或SEQ ID NO4的多肽；b)含有SEQ ID NO2或SEQ ID NO4的22到401氨基酸的多肽；c)含有1、2、3或4个护骨素富半胱氨酸结构域的多肽；d)含有SEQ ID NO2或SEQ ID NO4的22到194氨基酸的多肽；e)(a)到(d)的任何一个突变蛋白，其中氨基酸序列与(a)到(d)中至少一个序列至少有40％或50％或60％或70％或80％或90％的同一性；f)(a)到(d)的任何一个突变蛋白，其中该突变蛋白是由在温和严格条件或高度严格条件下能与编码(a)到(d)任何一个突变蛋白的DNA序列的互补序列杂交的DNA序列编码；g)(a)到(d)的任何一个突变蛋白，其中所述氨基酸序列的任何改变都是用保守性氨基酸取代(a)到(d)的氨基酸序列；h)(a)到(g)任何一个突变蛋白的同种型、融合蛋白、或活性片段。
11.如权利要求10所述的应用，其特征在于所述纤维变性疾病是结缔组织病。
12.如权利要求10或11所述的应用，其特征在于所述纤维变性疾病是硬皮病。
13.如权利要求10-12中任一项所述的应用，其特征在于所述核酸分子包括表达载体序列。
14.如权利要求13所述的应用，其特征在于所述载体序列是基因治疗载体序列。
15.一种能在细胞中诱导和/或增强内源性产生权利要求1所述多肽的载体在制备治疗和/或预防纤维变性疾病尤其是硬皮病的药物中的应用。
16.一种含有权利要求10至15中任一项所述核酸分子的细胞在制备治疗和/或预防纤维变性疾病尤其是硬皮病的药物中的应用。
17.一种表达权利要求1至9中任一项所述物质的细胞在制备治疗和/或预防纤维变性疾病尤其是硬皮病的药物中的应用。
18.一种经过基因改造产生权利要求1至9中任一项所述多肽的细胞在制备治疗和/或预防纤维变性疾病尤其是硬皮病的药物中的应用。
19.如上述权利要求中任一项所述的应用，其特征在于所述药物还包括干扰素，可同时、先后或分开使用。
20.如权利要求19所述的应用，其特征在于所述干扰素是干扰素β。
21.如上述权利要求中任何一项所述的应用，其特征在于所述药物还包括肿瘤坏死因子(TNF)拮抗剂，可同时、先后或分开使用。
22.如权利要求21所述的应用，其特征在于所述TNF拮抗剂是TBPI和/或TBPII。
23.如上述权利要求中任一项所述的应用，其特征在于所述药物还包括抗硬皮病试剂，可同时、先后或分开使用。
24.如权利要求23所述的应用，其特征在于所述抗硬皮病试剂选自以下组内卤夫酮、ACE抑制剂、钙离子通道阻断剂、质子泵抑制剂、非类固醇抗炎药、COX抑制剂、皮质类固醇、四环素、己酮可可碱、布西拉明、香叶基香叶基转移酶抑制剂、rotterlin、脯氨基-4-羟化酶抑制剂、c-蛋白酶抑制剂、赖氨基-氧化酶抑制剂、松弛素、卤夫酮、前列腺素、前列环素、内皮素-1、氧化氮、血管紧张素II抑制剂、抗氧化剂或SARP-1。
25.一种纤维变性疾病尤其是硬皮病的治疗和/或预防方法，其特征在于所述方法包括把有效量的权利要求1至24中任一项所述的物质，任选地和药学上可接受的载体给予有需要的患者。
全文摘要
本发明涉及护骨素(osteoprotegerin)在治疗和/或预防纤维变性疾病尤其是硬皮病中的应用。
文档编号A61K48/00GK1658895SQ03813308
公开日2005年8月24日 申请日期2003年3月26日 优先权日2002年4月10日
发明者C·鲍尔, C·普拉特尔－齐贝克 申请人:应用研究系统Ars股份公司