骨桥蛋白、少突神经胶质细胞和髓鞘形成的制作方法

专利名称：骨桥蛋白、少突神经胶质细胞和髓鞘形成的制作方法
技术领域：
骨桥蛋白影响少突神经胶质细胞的发育。由于少突神经胶质细胞有助于髓鞘再生，所以骨桥蛋白在髓鞘再生过程中具有一定的作用。
背景技术：
骨桥蛋白是一种磷蛋白，分子量为44-66kD，其变化与该蛋白来源物种、被改良的程度如糖基化的程度有关。骨桥蛋白又称为分泌性磷蛋白1、骨涎蛋白、尿石蛋白以及早期T淋巴细胞活化抗原-1(eta-1)。骨桥蛋白是酸性的，可结合钙。骨桥蛋白含有粘着氨基酸序列Arg-Gly-Asp(RGD)，该粘着氨基酸序列主要与细胞表面αvβ3整合素相互作用，但也和αvβ1、αvβ5、α9β1和α1β1整合素相互作用。骨桥蛋白在多种不同细胞类型中均有表达，且可能具有很多功能。例如，骨桥蛋白可能在组织基质重塑或骨吸收过程中起一定的作用；作为一种粘附因子，还可能在免疫细胞功能和肿瘤转移过程中起一定作用。人类编码骨桥蛋白的单基因位于4号染色体长臂上。
在神经系统的多种细胞中也已发现骨桥蛋白。业已发现神经节和脑的多个部分的初级感觉神经元表达骨桥蛋白。因此，骨桥蛋白可能在神经发育与功能中具有一定的作用。
多发性硬化症的部分特征为神经过程脱髓鞘。脱髓鞘现象也见于中枢神经系统和周围神经系统的若干其它严重疾病，包括脊髓损伤、神经感染和神经病变。
在以脱髓鞘为特征的疾病以及患脱髓鞘啮齿动物的模型中，有证据说明可以发生髓鞘再生现象。例如，在多发性硬化症中，似乎存在周期性的脱髓鞘和髓鞘再生现象。
发明概述本发明的一个目的是提供一种方法，即以骨桥蛋白水平影响少突神经胶质细胞的分化、少突神经胶质细胞的数量以及髓鞘形成。由于神经元脱髓鞘可导致异常信号转导，所以控制髓鞘形成是有益的。中枢神经系统中，髓磷脂由少突神经胶质细胞生成。
本发明的另一目的是提供一种通过调控骨桥蛋白水平而调控髓鞘形成的方法。
本发明的又一目的是提供一种通过调控骨桥蛋白水平而调控少突神经胶质细胞分化的方法。
本发明还有一个目的是提供一种通过调控骨桥蛋白水平而调控少突神经胶质细胞迁移的方法。骨桥蛋白水平的调控可以通过影响骨桥蛋白或其受体如αvβ3的代谢来进行。骨桥蛋白的作用可通过TH1细胞介导或受到TH1细胞影响。
本发明的这些目的和其它目的是通过对骨桥蛋白抑制少突神经胶质细胞前体细胞分化的观察而达到的。因此，骨桥蛋白水平的降低导致少突神经胶质细胞的加速分化。分化的减少伴随着前体细胞的增殖。前体细胞数量的增加导致更多的前体细胞、最终导致更多的少突神经胶质细胞例如聚集在脱髓鞘区域附近。骨桥蛋白还刺激少突神经胶质细胞向脱髓鞘区域的迁移。更多数量的少突神经胶质细胞可加强髓鞘再生。
这些目的也可以通过影响靶细胞获取、结合骨桥蛋白的能力以及对骨桥蛋白响应的能力来实现。不能获取骨桥蛋白及对骨桥蛋白作出反应的细胞不会分化，而是增殖。
发明详述观察结果表明，骨桥蛋白可使人类少突神经胶质细胞系的细胞呈现异常的生长特性。当暴露于骨桥蛋白时，少突神经胶质细胞系的细胞由较大的立方形细胞变成类似于祖细胞的较小双极细胞。骨桥蛋白对神经母细胞瘤细胞则没有这种作用。少突神经胶质细胞及其前体的形态学特征已知，并可用于测定一种分子是否具有类似于骨桥蛋白的去分化或分化抑制活性。因此，骨桥蛋白可引起少突神经胶质细胞的去分化和/或阻止前体细胞或低度分化细胞分化为成熟的少突神经胶质细胞。
当骨桥蛋白水平降低时，少突神经胶质细胞祖细胞开始分化为成熟少突神经胶质细胞，该成熟少突神经胶质细胞除其它功能之外，还可使神经元髓鞘形成。
骨桥蛋白也可作为一种趋化因子。骨桥蛋白可存在于大鼠髓鞘再生病变(remyelinating lesions)处。少突神经胶质细胞祖细胞迁移进这些病变部位，并在其中参与髓鞘再生。这些细胞按骨桥蛋白浓度梯度从骨桥蛋白浓度较低的区域移动到骨桥蛋白浓度较高的区域。骨桥蛋白可引起响应细胞(包括祖细胞在内)迁移进脱髓鞘区域，并在其中产生髓鞘再生作用。
因此，骨桥蛋白可抑制少突神经胶质细胞祖细胞的分化，并诱导这种少突神经胶质细胞祖细胞迁移到含骨桥蛋白浓度较高的区域。
骨桥蛋白也可诱导巨噬细胞或小胶质细胞、或诱导两者一起迁移进入脱髓鞘部位。在那里，这些细胞可“清除”髓磷脂碎片。髓磷脂碎片的清除是髓鞘再生的前提条件。
出于本发明的这些目的，由于骨桥蛋白和其受体之间相互作用的关系，技术人员将会认识到，为了达到趋化和/或分化抑制的理想目标，两种手段中的任何一种都可以实践一下。因此，这里关于骨桥蛋白或其受体的讨论应该被认为具有同样的意义，而且如果达到了理想的结果，可适用于两者中的任何一个，例如趋化或分化控制。
骨桥蛋白的基因序列是已知的并可为技术人员所利用。因此，可利用已知的重组核酸技术(例如，如Sambrook等编辑，″Molecular CloningALaboratory Manual，”第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989和″Current Protocols in MolecularBiology，”John Wiley & Sons，N.Y.1989所述)，采用常规方法获取骨桥蛋白在所选择细胞中的表达。将骨桥蛋白核酸亚克隆入合适的载体，再导入合适的细胞，即可获得表达。该载体可以保持在染色体外，也可以整合入宿主基因组。各种控制元件可以导入载体以获得骨桥蛋白高水平表达或其受控表达。例如，增强子、特定的启动子以及剪接位点等等均可用。
在某些实施方案中，重组哺乳动物表达载体能将骨桥蛋白核酸优选地表达于特定的细胞类型(例如，组织特异的调控元件可用于表达该核酸)。组织特异的调控元件在本领域内是已知的。适当的组织特异性启动子的非限制性的例子包括，例如，神经元特异的启动子(如神经丝启动子；Byrne等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1989)865473-5477)和成纤维细胞、内胚层细胞、小胶质细胞及少突神经胶质细胞特异性启动子。发育调节启动子也包括在内，例如鼠hox启动子(Kessel等，Science(1990)249374-379)及α-胎蛋白启动子(Campes等，Genes Dev.(1989)3537-546)。
或者，如本领域内已知的，表达的控制也可利用特定的可诱导启动子而达到。例如，可使用四环素/tet激活蛋白系统，该系统采用可结合激活蛋白或可被激活蛋白诱导的操纵子元件。然而，激活蛋白结合四环素，该反应阻碍了激活蛋白与操纵子元件的结合。因此四环素抑制了操纵子元件下游克隆的转基因的表达。
因为本发明的目标之一是获取骨桥蛋白的功能，故有可能获得截短的或经修饰的骨桥蛋白，以增加或减少表达、便于处理或尽量减小副作用。因此，骨桥蛋白核酸或蛋白可通过已知的技术来处理，以获取截短或经修饰的骨桥蛋白，该蛋白可结合骨桥蛋白受体并保持产生或引发本发明所需之特殊作用的能力。
骨桥蛋白核酸突变可通过标准技术如定点诱变及PCR介导的诱变而引入。优选地，在一个或多个预测的非必需氨基酸残基处进行保守氨基酸取代。“保守氨基酸取代”是指该氨基酸残基被一具有类似侧链的氨基酸残基所取代。例如，本领域对具有类似侧链的氨基酸残基家族已有所定义。该家族包括碱性侧链氨基酸(如赖氨酸、精氨酸及组氨酸)、酸性侧链氨基酸(如天冬氨酸和谷氨酸)、中性极性侧链氨基酸(如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸及半胱氨酸)、非极性侧链氨基酸(如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸及色氨酸)、分支侧链氨基酸(如苏氨酸、缬氨酸和异亮氨酸)及芳香族侧链氨基酸(如酪氨酸、苯基丙氨酸、色氨酸及组氨酸)。因此骨桥蛋白或其受体内预测的非必需氨基酸残基优选地用来自相同侧链家族的另一氨基酸残基所取代。作为一种替换方式，也可以沿着骨桥蛋白编码序列的全部或部分序列随机地引入突变，例如通过饱和诱变的方式；而且可以进行所生成突变体的骨桥蛋白活性筛选，以鉴定出仍保持活性的突变体。在诱变之后，所编码的蛋白可以进行重组表达，蛋白的活性也可以被测定。
本发明也包括反义核酸分子，即与编码蛋白的有义核酸互补的分子，例如与双链cDNA分子编码链互补或mRNA序列互补的分子，以从实质上减少骨桥蛋白或其受体的表达。相应地，反义核酸可以通过氢键与有义核酸结合。反义核酸可以与完整的骨桥蛋白或其受体的编码链互补，也可以只与其一部分互补，例如，可以与该蛋白编码区(或开放性读框)的全部或一部分互补。反义核酸分子还可以是与编码骨桥蛋白或其受体的核苷酸序列编码链的非编码区反义。非编码区(5′和3′非转译区)是编码区侧翼的5′和3′序列，它们不被翻译成氨基酸，但可具有调控作用。如果骨桥蛋白或其受体的正常表达依赖于该侧翼位点，那么该侧翼位点可以是作用的目标。
假如编码骨桥蛋白或其受体的编码链序列已知，本发明的反义核酸的设计可以根据Watson & Crick碱基配对原则。反义核酸分子可以与适当mRNA的完整编码区互补，但更优选地，反义核酸分子是这样的寡核苷酸，其只与相关mRNA的编码区或非编码区的一部分反义。例如，反义寡核苷酸可以是与骨桥蛋白mRNA翻译起始位点附近区域互补的序列。反义寡核苷酸的长度可以是例如约为5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个核苷酸序列。本发明之反义核酸可以采用本技术领域内已知的方法利用化学合成和酶促连接反应来构建。例如，反义核酸(例如反义寡核苷酸)可以用天然存在的核苷酸或多种经修饰的核苷酸以化学方式合成；这些经修饰的核苷酸是设计用于增加分子的生物稳定性，或增加反义核酸和有意核酸所形成双链体的物理稳定性，例如硫代磷酸酯衍生物、膦酸脂衍生物和吖啶取代的核苷酸均可以使用。
这种反义技术可用于产生基因敲除动物，使骨桥蛋白基因或骨桥蛋白受体基因失去功能。反义核酸分子可以针对编码序列或非编码序列，例如调控序列，如启动子。反义分子可以是RNA或DNA。由于反义分子会降解或通过细胞分裂而被稀释，所以通常反义分子使基因失活的作用是瞬时的。然而，反义构建体可配置组成型或诱导型启动子，以获得该反义分子的更多表达。
较长久的基因失活可以通过将反义构建体整合到宿主细胞基因组内的方式来达到。这一点可以通过同源重组等方法实现，正如本领域内已知的。在生殖细胞或前体细胞中的同源重组可以产生这样一种动物，其体内某一组织、器官或整个机体中骨桥蛋白基因或骨桥蛋白受体基因已失活，当整个机体基因失活时则产生了基因敲除转基因动物。
可用于生成反义核酸的经修饰核苷酸包括5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧羟甲基)尿嘧啶、5-羧甲氨基甲基-2-硫代尿苷、5-羧甲氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖queosine、次黄苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖queosine、5-甲氧基羰甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲基硫代-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-羟乙酸、wybutoxosine、假尿嘧啶、queosine、2-硫代胞嘧啶、5-甲基-2-硫代尿嘧啶、2-硫代尿嘧啶、4-硫代尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-羟乙酸甲酯、5-甲基-2-硫代尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶以及2，6-二氨基嘌呤等。或者，反义核酸可以用生物学方法产生，即将核酸以反义方向亚克隆入一个表达载体(即从被插入的核酸转录的RNA是所关注目标核酸的反义方向序列)。
本发明之反义核酸分子一般施用于某一受试对象或由受试对象原位产生后，与编码骨桥蛋白或其受体的细胞mRNA和/或基因组DNA杂交或结合，从而抑制该蛋白的表达，例如通过抑制转录和/或翻译的方式来抑制该蛋白的表达。杂交可以是通过传统的核苷酸互补作用而形成一种稳定的双链体，或者，例如在结合DNA双链体的反义核酸分子的情况下，通过与双螺旋大沟的特异性相互作用而实现，或是结合到骨桥蛋白或其受体的调控区域。
本发明之反义核酸分子给药途径的一个的例子是直接注入组织部位。或者，可以修饰反义核酸分子使之选择性地作用于靶细胞，然后全身给药。例如，为了用于全身给药，反义分子可以被修饰成能特异结合表达在靶细胞表面的受体或抗原的分子，例如，可将反义核酸分子连接到能与细胞表面受体或抗原结合的肽或抗体上。反义核酸分子也可以用本申请书所述之载体递送至细胞。为了使胞内反义分子达到足够的浓度，可将反义核酸分子置于强启动子控制下，优选使用pol II或pol III启动子。
本发明之反义核酸分子可以是一种α-异头核酸分子。α-异头核酸分子与互补RNA形成特异的双链杂交体，其两条链彼此平行(Gaultier等，Nucleic Acids Res.(1987)156625-6641)。反义核酸分子也可以包含一个甲基核糖核苷酸(Inoue等，Nucleic Acids Res.(1987)156131-6148)，或一个嵌合的RNA-DNA类似物(Inoue等，FEBS Lett.(1987)215327-330)。
本发明也包括了核酶。核酶是一些具有RNA酶活性的催化性RNA分子，能够切割与核酶杂交的单链核酸，例如mRNA。因此，核酶(例如锤头状核酶，参阅Haselhoff等，Nature(1988)334585-591)可用于在催化条件下切割相关的mRNA转录物以抑制该mRNA的翻译。具有骨桥蛋白或其受体核酸特异性的核酶可以根据骨桥蛋白或其受体的核苷酸序列而设计。例如，可以构建四膜虫L-19 IVS RNA的衍生物，其中活性位点的核苷酸序列与被切割的骨桥蛋白或其受体的mRNA核苷酸序列互补，参阅美国专利号4,987,071及5,116,742。或者，也可用骨桥蛋白mRNA从一个RNA分子库中选择具有特异RNA酶活性的催化性RNA，参阅如Bartel等，Science(1993)2611411-1418。
本发明还包括形成三螺旋结构的核酸分子。例如，通过以与骨桥蛋白调控区(如骨桥蛋白启动子和/或增强子)互补的核苷酸序列为靶序列，形成阻碍靶细胞内骨桥蛋白基因转录的三螺旋结构，从而可以抑制骨桥蛋白基因的表达。一般可参阅Helene，Anticancer Drug Dis.(1991)6(6)569；Helene Ann，NY Acad.Sci.(1992)66027；以及Maher，Bioassays(1992)14(12)807。
在优选的实施方案中，可以对本发明之核酸分子的碱基、糖基或磷酸基主链部分进行修饰，以改善该分子的例如稳定性、可杂交性或可溶性。例如，可以修饰核酸的脱氧核糖磷酸基主链以产生肽核酸(参阅Hyrup等Bioorganic & Medicinal Chemistry(1996)45)。本申请书中所使用的术语“肽核酸”或“PNA”指的是核酸类似物，例如DNA类似物，其中脱氧核糖磷酸主链被假肽主链取代，而只有四种天然核碱基被保留。PNA的中性主链已被证明可在低离子强度的条件下特异性地杂交到DNA和RNA上。PNA寡聚物的合成可使用标准的固相肽合成方案来实现，正如前述Hyrup等(1996)和Perry-O’Keefe等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1996)9314670文中所述。
正如本申请书所公开的，碱基配对并非是阻断骨桥蛋白或其受体表达的必不可少的条件，适配体是与特定的核酸相互作用的核酸，其作用方式和蛋白与蛋白之间相互作用或蛋白与核酸之间相互作用的方式相同，即依赖于变化、其它吸引力和构象。
此外某些类似物不一定就是核酸，蛋白或碳水化合物也可以对骨桥蛋白或其受体核酸具有特异性，并因此而阻碍其转录或翻译。
如果骨桥蛋白或其生物活性部分以重组的方法产生，优选地基本上不含培养基，即培养基仅占蛋白制备物体积的约20％、10％、5％以下或更少。
如果骨桥蛋白或其一部分以化学合成的方法产生，优选地基本不含化合物前体或其它化合物，也就是说，把它与从参与该蛋白合成的化合物前体或其它化合物分开。相应地，这种骨桥蛋白制备物含有约30％、20％、10％、5％以下或更少(按干重计)的化合物前体或非骨桥蛋白化合物。
由于少突神经胶质细胞及其前体对髓鞘再生很重要，一个合适的宿主细胞将是少突神经胶质细胞或少突神经胶质细胞前体。作为转化细胞的位点，由这样的经转化细胞产生的骨桥蛋白表达可作为天然存在的少突神经胶质细胞前体或少突神经胶质细胞迁移的焦点。
适合用于转化的宿主细胞为胶质细胞，例如分泌骨桥蛋白的小胶质细胞。同样，由经转化的胶质细胞产生的骨桥蛋白将为少突神经胶质细胞前体迁移到一个特定位点提供了刺激。骨桥蛋白还将导致少突神经胶质细胞延迟分化。少突神经胶质细胞成熟的减少以及少突神经胶质细胞前体的增殖增加了在特定位点少突神经胶质细胞的最终数目，从而促进或增加了髓鞘再生过程。
另一种适合用于转化的细胞是成纤维细胞或其它可以定位到特定位点的内胚层细胞。成纤维细胞可以在特定的位点表达骨桥蛋白，从而增加了少突神经胶质细胞前体的数量。
这种已转化细胞可被置于需要髓鞘再生的部位，往往是在中枢神经系统内。因此，用于植入已转化细胞的多种已知的外科方法均可用来在所需部位获得表达骨桥蛋白的细胞。
或者，可将纯化的骨桥蛋白或其截短的生物学有效部分滴注入某一部位，或将其置入一释放装置中，例如硅橡胶植入物等。这样，骨桥蛋白就可在需要髓鞘再生的部位以预定的速率局部释放。骨桥蛋白可将细胞吸引到该部位。
因为骨桥蛋白是由诸如少突神经胶质细胞前体和小胶质细胞等细胞表达的，所以，它是这些细胞群体的一种标志。因此，检测骨桥蛋白是鉴定诸如少突神经胶质细胞前体等细胞的一种手段。很多不同的方法都可用于探索少突神经胶质细胞前体细胞的这个性质，如RIA、ELISA、TaqMan、Northern印迹法或荧光分析。
例如，针对骨桥蛋白的抗体可用于鉴定活跃地产生和分泌骨桥蛋白的细胞。该抗体可以针对骨桥蛋白或骨桥蛋白mRNA，其中所述mRNA可以是单独的也可以是与核糖体结合。正如本领域中所知的，抗体可以被直接地或间接地标上标记；间接标记时，骨桥蛋白抗体可通过另一分子，例如某种结合分子或另一种抗体而被识别。
很多不同的分子均可用于直接标记骨桥蛋白抗体，如某种放射性标记、酶标记、荧光化合物标记及化学发光化合物标记等等。各种标记物可以用本领域中已知的技术附于抗体分子上，例如可用某种已标记的氨基酸前体、或通过其它代谢手段，如通过化学方法将标记物以共价键结合到抗体分子上，或者利用某种接头分子标记，等等。然后再用某种合适的检测手段确定已标记的抗体分子的存在。可检测物质的例子包括各种酶、辅基、荧光物质、发光物质、生物发光物质和放射性物质等。合适的酶的例子包括辣根过氧化酶、碱性磷酸酶、半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶。合适的辅基复合物例子包括链亲和素/生物素和亲和素/生物素。合适的荧光物质的例子包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白等。发光材料的一个例子是鲁米诺。生物发光物质的例子包括萤光素酶、萤光素和水母发光蛋白。合适的放射性物质的例子包括125I，131I，35S或3H等。
在间接检测结合抗体的情况下，可使用能结合骨桥蛋白抗体的抗体。例如，如果骨桥蛋白抗体是从某种非人类的物种中制备的话，二级抗体可以是针对该物种的同种异型决定簇的抗体。或者，骨桥蛋白抗体的独特型决定族可以作为靶分子。或者，其它可以鉴定骨桥蛋白抗体的结合分子也可以使用。例如，如果该骨桥蛋白抗体是可被蛋白A或蛋白G识别的IgG分子，那么蛋白A或蛋白G就可以是经标记的报道分子。上文所讨论的各种标记物均可用于标记蛋白A或蛋白G。另一个这样的结合分子对是利用生物素来标记抗体分子，然后用标记的亲和素分子来探测生物素标记的抗体分子。
或者，核酸可用于检测存在于少突神经胶质细胞前体内的骨桥蛋白。这样的核酸被称为适配体，可以从本领域已知的寡核苷酸库中获取。
骨桥蛋白核酸也可以被检测。在这种情况下，检测骨桥蛋白表达的一种合适的方法是监测骨桥蛋白信息的存在。检测信息的已知方法包括Northern印迹法、Taqman分析、原位杂交等等。标记骨桥蛋白特异的核酸探针并使之与骨桥蛋白mRNA杂交。杂交之后，再使用适当的检测手段来显示可用上述许多手段中的任何一种标记的骨桥蛋白探针。如同上述基于蛋白的系统的利用，骨桥蛋白探针核酸可被直接地标上标记物，或者用另一个已被标记的报道分子可用于识别所结合的探针。
作为少突神经胶质细胞前体的一种趋化因子，骨桥蛋白可用于表征和分离少突神经胶质细胞前体以及可移动的少突神经胶质细胞。监测细胞运动性的分析方法是本领域内已知的，例如，可将骨桥蛋白黏附于琼脂糖等半固体基质上，然后让能识别并向趋化因子移动的细胞暴露于被结合的骨桥蛋白，以测定是否有任何细胞能够进入基质。
通过利用少突神经胶质细胞前体和少突神经胶质细胞在骨桥蛋白作用下的可移动性，以及使用诸如上文所述的抗体分子等结合分子，可以形成纯化少突神经胶质细胞前体或少突神经胶质细胞的一种手段。例如，可将被骨桥蛋白趋化的细胞从一混合细胞群体中区分出来。再如，可用一种骨桥蛋白抗体从一群细胞中分离少突神经胶质细胞前体或少突神经胶质细胞。例如，骨桥蛋白抗体可被固定在诸如小珠、培养板表面等固体基质上，并暴露于一混合细胞群体。被该抗体结合的细胞可与那些未被该抗体结合的细胞分离，以获得一个少突神经胶质细胞和/或少突神经胶质细胞前体富集的群体。
或者，使用一种如本申请书所教导的筛选分析法，可以鉴定并使用一种在结合靶细胞时诱导这些细胞迁移到所需部位的激动剂分子。该激动剂可从大量的候选化合物中被鉴定出来。
本文中所谓的“激动剂”是指当结合到骨桥蛋白受体上时，与激动剂相比，它能够激活所需的胞内和/或细胞响应的分子组分。
本文中术语“部分激动剂”是指当结合到受体上时，与激动剂相比，它能够较低程度地激活胞内和/或细胞响应的分子组分(例如骨桥蛋白但不限于骨桥蛋白)。
本文中术语“候选化合物”指的是适合用于筛选技术的化合物。这样的化合物可以通过常规的药物开发过程发现，该药物开发过程涉及鉴定某种受体特异的内源性配体和/或筛选抗某一受体的候选化合物(这样的筛选需要用竞争性试验来评价功效)；或通过使用包括使用抗体和重组核酸在内的生物技术方法来发现。
本发明提供了一种方法(本文中又称为“筛选分析”)以鉴定可与骨桥蛋白受体结合的或对骨桥蛋白活性有刺激或抑制作用的调节剂，即候选化合物或受试化合物或试剂(例如肽、拟肽(peptidomimetics)、小分子或其它药物)。
在一个实施方案中，本发明提供多种筛选候选化合物或受试化合物的分析方法，其中该候选化合物或受试化合物可与骨桥蛋白受体结合，或可调控骨桥蛋白受体或其生物活性部分的活性。本发明之受试化合物可通过本技术领域内已知的许多组合库方法中的任何方法制备，其中所述组合库方法包括生物库法、空间可寻址的平行固相或液相库法、需要使用重叠法的合成库法、“一珠一化合物”库法，以及使用亲和层析选择的合成库法。其中生物库方法仅限于肽库，而另四种方法则可适用于肽、非肽寡聚物或小分子化合物库(Lam，Anticancer Drug Des.(1997)12145)。
在本技术领域内可查到分子库合成方法的例子，例如DeWitt等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1993)906909；Erb等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1994)9111422；Zuckermann等，J.Med.Chem.(1994)372678；Cho等，Science(1993)2611303；Carrell等，Angew Chem.Iht.Ed.Engl.(1994)332059；Carell等，Angew Chem.Int.Ed.Engl.(1994)332061；以及Gallop等，J.Med.Chem.(1994)371233。
化合物库可存在于溶液中(例如，Houghten Bio/Techniques(1992)13412-421)，或珠上(Lam，Nature(1991)35482-84)、芯片上(Fodor，Nature(1993)364555-556)、细菌上(美国专利号5,223,409)、孢子上(美国专利号5,571,698；5,403,484；和5,223,409)、质粒上(Cull等，Proc.Natl.Aead.Sci.USA(1992)891865-1869)或噬菌体上(Scott等，Science(1990)249386-390；Devlin，Science(1990)249404-406；Cwirla等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1990)876378-6382；以及Felici，J.Mol.Biol.(1991)222301-310)。
在一个实施方案中，分析是以细胞为基础而进行的。在该分析中，先让在细胞表面上表达骨桥蛋白受体或其生物活性部分的细胞与一受试化合物接触，然后测定该受试化合物与骨桥蛋白受体结合的能力。该细胞可以是例如酵母细胞或源自哺乳动物的细胞。受试化合物与骨桥蛋白受体结合的能力可通过以下方式来测定，例如使受试化合物与放射性同位素或酶标记物偶联，使得该受试化合物与骨桥蛋白受体或其生物活性部分的结合可通过检测复合体中标记化合物的方式来测定。又如，该受试化合物可以用125I、35S、14C或3H直接地或间接地标记，放射性同位素可通过射电辐射直接计数或通过闪烁计数而测出。或者，受试化合物可以用辣根过氧化酶、碱性磷酸酶或萤光素酶等酶标记后，通过测定适宜底物到产物的转换来检测。
该分析也可以是使用带标记骨桥蛋白的竞争性分析。这样，本分析之步骤包括使在细胞表面表达骨桥蛋白受体或其生物活性部分的细胞与骨桥蛋白接触以形成一种试验混合物，再使该试验混合物与受试化合物接触并测定受试化合物与骨桥蛋白受体相互作用的能力。其中，测定受试化合物与骨桥蛋白受体相互作用的能力包括测定受试化合物比已知化合物优先与骨桥蛋白受体或其生物活性部分结合的能力。
在另一实施方案中，分析也是以细胞为基础的分析，包括使在细胞表面表达骨桥蛋白受体或其生物活性部分的细胞与受试化合物接触，以及测定该受试化合物调控(例如刺激或抑制)骨桥蛋白受体或其生物活性部分活性的能力。测定受试化合物调控骨桥蛋白受体或其生物活性部分活性的能力，可以通过以下测定过程来实现例如，测定骨桥蛋白受体与骨桥蛋白结合的能力，或骨桥蛋白受体与骨桥蛋白相互作用的能力，或产生IL-12的能力。已知很多细胞表面分子可以结合骨桥蛋白，如CD44和αv、α6、β1、β3和β5链。α链和β链是整合素的亚基。
受体可以通过非配体分子激活，这些非配体分子不一定抑制配体的结合但可导致受体的结构变化，以引起受体的聚集、二聚体化或成簇现象，从而可导致受体活化。
这样，可以针对骨桥蛋白受体的多个部分产生抗体。这些可以激活骨桥蛋白受体的抗体可以通过标准的分析方法例如监测IL-12的产生而测定，而且可加以选择。
上述抗体可用已知的技术来制备。由于涉及分子图谱定位尤其是表位图谱定位，所以单克隆抗体可能是首选的。单克隆抗体可以针对细胞表面所表达的完整受体，也可以针对已知在细胞表面所形成的肽。Geysen等人的第5,998,577号美国专利中所述的方法可用于许多种相关的肽的制备。
骨桥蛋白受体或其部分或片段，均可作为免疫原使用以通过那些制备多克隆抗体和单克隆抗体的标准技术制备可结合该蛋白的抗体。全长的骨桥蛋白受体可作为免疫原使用，或者，本发明提供的骨桥蛋白受体的抗原性肽片段可作为免疫原使用。骨桥蛋白受体的抗原性肽至少包含8个(优选地为10、15、20、30或30个以上)已知序列的氨基酸残基，并包含一个骨桥蛋白受体的表位，使得针对该肽的抗体与该蛋白形成一种特异的免疫复合体。
在一相关的方面，抗原性肽所包含的表位是与该受体的特定部分结合的骨桥蛋白受体区域，或是已知具有特定功能的区域。
使用骨桥蛋白受体免疫原制备抗体的方式通常是用该免疫原给一个合适的对象(如兔、山羊、小鼠或其它哺乳动物)进行免疫接种。合适的免疫原制剂可包含例如重组表达的骨桥蛋白受体或化学合成的骨桥蛋白受体。该制剂还可包含佐剂，例如弗氏完全或不完全佐剂，或类似的免疫刺激剂。用免疫原性骨桥蛋白受体制剂对合适对象的免疫可诱导多克隆反应。
本文所使用的术语“抗体”指的是免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，也就是含有特异结合骨桥蛋白受体的抗原结合位点。特异结合骨桥蛋白受体的分子是指结合骨桥蛋白受体，但基本上不结合样品(如天然含有骨桥蛋白受体的生物样品)中其它分子的分子。免疫球蛋白分子的免疫活性部分的例子包括F(ab)和F(ab′)2片段，该两种片段可以通过用酶例如胃蛋白酶来处理抗体的方式而产生。
本文所使用的术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组分”指的是这样一群抗体分子，其只含有一种能与该骨桥蛋白受体的一特定表位发生免疫反应的抗原结合位点。因此，单克隆抗体组分一般显示对某一特定表位的单一结合亲合力。
该免疫对象中的抗体滴度可以用标准的技术在一定的时期内监测，例如使用固定化的骨桥蛋白受体进行酶联免疫吸附分析(ELISA)。如果需要的话，针对骨桥蛋白受体的抗体分子可以从哺乳动物(例如从血液中)分离出来并用众所周知的技术进一步纯化以获取IgG组分，例如采用蛋白A色谱法。在免疫后的某一适当时间，例如当抗体滴度最高的时候，可以从该免疫对象中获取抗体产生细胞，并用于以标准技术来制备单克隆抗体，例如最初由Kohler等，Nature(1975)256495-497一文所述的杂交瘤技术、人类B细胞杂交瘤技术(Kohler等，Immunol.Today(1983)472)、EBV杂交瘤技术(Cole等，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy(1985)，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96)或trioma技术。
产生杂交瘤的技术是众所周知的(通常参阅Current Protocols inImmunology(1994)Coligan等编辑，John Wiley & Sons，Inc.，New York，NY)。简而言之，是将永生细胞系(一般是骨髓瘤细胞)与用所研究的免疫原按上述方法免疫的哺乳动物的淋巴细胞(一般是脾细胞)融合，再筛选所产生的杂交瘤细胞培养上清液，以鉴定能产生可与骨桥蛋白受体结合的单克隆抗体的杂交瘤。
许多用于融合淋巴细胞和永生细胞系的熟知方案中的任何一个都可用于产生单克隆抗体(参阅如Current Protocols in Immunology，见上文；Galfre等，Nature(1977)266550-552；Kenneth，Monoclonal AntibodiesANew Dimension In Biological Analyses，Plenum Publishing Corp.，NewYork，NY(1980)；以及Lerner，Yale J.Biol.Med.(1981)54387-402等)。此外，普通技术人员也将会理解这类方法有着许多也很有用的变化形式。
通常，永生细胞系(例如骨髓瘤细胞系)与淋巴细胞来源于同一种哺乳动物。例如，小鼠杂交瘤细胞可以通过来源于经本发明的免疫原制剂免疫的小鼠的淋巴细胞与小鼠的永生细胞系融合的方式而产生，该永生细胞系的例子包括对含有次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶脱氧核苷的培养基(“HAT培养基”)敏感的骨髓瘤细胞系。很多骨髓瘤细胞系都可按照标准的技术参与融合，如P3-NS1/l-Ag4-1，P3-x63-Ag8.653或Sp2/O-Agl4骨髓瘤细胞系。所述骨髓瘤细胞可购自ATCC。
通常，对HAT敏感的小鼠骨髓瘤细胞用聚乙二醇(PEG)与小鼠脾细胞融合。然后用HAT培养基选择融合所得的杂交瘤细胞，该培养基将杀死未融合和未正确融合的骨髓瘤细胞(未融合的脾细胞于几天后死亡，因为它们未被转化)。产生本发明之单克隆抗体的杂交瘤细胞可通过筛选杂交瘤细胞培养上清液中结合骨桥蛋白的抗体而检测出来，例如，采用标准的ELISA分析法来检测。
优选地，该单克隆抗体是基本上或完全地来源于人类。因此，可采用本领域内已知的方法，使用人类抗体构架中含有非人类互补决定区的嵌合抗体。参阅PCT公开号WO 87/02671；欧洲专利申请号184,187；欧洲专利申请号171,496；欧洲专利申请号173,494；PCT公开号WO 86/01533；美国专利号4,816,567；欧洲专利申请号125,023；Better等，Science(1988)2401041-1043；Liu等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1987)843439-3443；Lin等，J.Immunol.(1987)1393521-3526；Sun等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1987)84214-218；Nishimura等.，Canc.Res.(1987)47999-1005；Wood等，Nature(1985)314446-449；Shaw等，J.Natl.Cancer Inst.(1988)801553-1559；Morrison，Science(1985)2291202-1207；Oi等，Bio/Techniques(1986)4214；美国专利号5,225,539；Jones等，Nature(1986)321552-525；Verhoeyan等，Science(1988)2391534；以及Beidler等，J.Immuno1.(1988)1414053-4060。
人类抗体可以用体外技术制备。完全人类抗体尤其适用于人类患者的治疗。这样的抗体可以用转基因小鼠产生，该小鼠不会表达内源性免疫球蛋白重链和轻链基因，但能表达人类重链和轻链基因。Abgenix公司(Fremont，CA)用携带部分人类免疫球蛋白库的小鼠在小鼠中制造人类单克隆抗体。他们用所选择的抗原以标准方式免疫转基因小鼠。针对该抗原的单克隆抗体可以用常规的杂交瘤细胞技术获得。转基因小鼠体内的人类免疫球蛋白外源基因在B细胞分化和随后进行的类别转换和体细胞突变的时候发生了重排。
除了制备单克隆抗体-分泌性杂交瘤细胞的方式，还可以用骨桥蛋白或其受体筛选重组的组合免疫球蛋白库(例如抗体噬菌体展示库)，从而分离出结合骨桥蛋白或其受体的免疫球蛋白库成员，以此方式来鉴定和分离单克隆抗体。产生和筛选噬菌体展示库的试剂盒已经商品化(例如，PharmaciaRecombinant Phage Antibody System，目录号27-9400-01；以及StratageneSurfZAPPhage Display Kit，目录号240612)。
此外，特别适用于产生和筛选抗体显示库之方法和试剂的例子可在如下文献中查到美国专利号5,223,409；PCT公开号WO 92/18619；PCT公开号WO 91/17271；PCT公开号WO 92/20791；PCT公开号WO 92/15679；PCT公开号WO 93/01288；PCT公开号WO 92/01047；PCT公开号WO 92/09690；PCT公开号WO 90/02809；Fuchs等，Bio/Technology(1991)91370-1372；Hay等，Hum.Antibody Hybridomas(1992)381-85；Huse等。Science(1989)2461275-1281；以及Griffiths等，EMBO J.(1993)25(12)725-734。
因此，使用这样的表位，即可鉴定与之结合的抗体。该抗体的重链和轻链被克隆，并被用于产生噬菌体显示Fab片段。例如，重链基因可以被克隆到一个质粒载体内，使得重链可以被细菌分泌。轻链基因可以被克隆到一个噬菌体外壳蛋白基因内，使得轻链可以被表达在噬菌体表面上。用与噬菌体融合的人类轻链库(随机采集)感染表达非人类重链的细菌。所产生的子代噬菌体即可展示杂合抗体(人类轻链/非人类重链)。所选择的抗原用于以淘筛方式筛选与选定抗原结合的噬菌体。鉴定这样的噬菌体可能需要经过几轮筛选。
从可结合选定抗原的选定噬菌体分离人类轻链基因。然后，用所选定的人类轻链基因来指导如下的人类重链基因选择步骤。将选定的人类轻链基因插入载体由细菌表达。用与噬菌体融合的人类重链库来感染可表达选定人类轻链的细菌。所产生的子代噬菌体显示了人类抗体(人类轻链/人类重链)。
然后，用选定的抗原以淘筛的方式筛选与选定抗原结合的噬菌体。在该步骤选出的噬菌体显示了完全人类抗体，它可识别被原来选出的非人类单克隆抗体识别的同样表位。这些可编码重链和轻链的基因很容易被分离，并可进一步处理以产生人类抗体。Jespers等人叙述了该项技术(Bio/Technology(1994)12899-903)。
骨桥蛋白抗体(例如单克隆抗体)可用于通过标准的技术例如亲和色谱法或免疫沉淀法来分离骨桥蛋白。这样的抗体可促进来源于细胞的天然骨桥蛋白的纯化和由宿主细胞表达的重组骨桥蛋白的纯化。而且，这样的抗体可用于检测(例如细胞裂解物中或细胞培养上清液中的)骨桥蛋白，以评价骨桥蛋白表达的丰度和模式。在诊断方面作为临床试验步骤的一部分，骨桥蛋白抗体可用于监测组织中的蛋白水平，例如，测定一种具体治疗方法的功效。
可激活骨桥蛋白受体的抗体可加以修饰，以尽量减小与骨桥蛋白介导的功能无关的活性，例如产生IL-12。因此，该抗体分子可被截短或发生突变，以尽量减小或除去除骨桥蛋白激活作用以外的活性。例如，对某些抗体来说，只有结合抗原的部分是所需的。因此，抗体的Fc部分可被除去。
表达骨桥蛋白受体的细胞与抗体接触而被激活。然后，被激活的细胞与多种分子接触，以鉴定那些改变受体活性的分子，无论是提高活化水平或是降低活化水平。符合这些标准的分子可在未用抗体处理但能表达骨桥蛋白受体的细胞上测试，以观察其对未被激活的细胞的作用。然后再用已知的技术对靶分子进行测试和修饰，以作为候选药物用于治疗与骨桥蛋白代谢异常相关的疾病。
本发明的筛选分析法既适用于可溶性骨桥蛋白受体也适用于膜结合的骨桥蛋白受体。在含有可溶性骨桥蛋白受体的无细胞分析法的情况下，本技术领域中已知的膜增溶剂可用于将受体保持在溶液中。这类增溶剂的例子包括非离子型去污剂，例如正辛基葡萄糖苷、正十二烷基葡萄糖苷、正十二烷基麦芽糖苷、辛酰基-N-甲基葡萄糖胺、癸酰基-N-甲基葡萄糖胺、Triton X-100、Triton X-114、Thesit、异十三烷基聚(乙二醇醚)n、3-[(3-胆酰胺丙基)二甲胺基]-1-丙磺酸盐(CHAPS)、3-[(3-胆酰胺丙基)二甲胺基]-2-羟基-1-丙磺酸盐(CHAPSO)或N-十二烷基＝N，N-二甲基-3-氨溶-1-丙磺酸盐。
固定骨桥蛋白、其受体或其靶分子，可能是一种合乎需要的做法，以便于其中任一种或两种蛋白的复合形式与非复合形式之间的分离，并便于实现分析的自动化。试验化合物与骨桥蛋白或其受体的结合，或骨桥蛋白或其受体在候选化合物存在或不存在这两种不同的情况下与靶分子之间的相互作用，可在任何适合于容纳该反应物的容器内实现。这类容器的例子包括微滴定板、试管和微离心管。在一个实施方案中，可在融合蛋白中引入一个结构域，使得上述任一种或两种蛋白可与基质结合。例如，谷胱甘肽-S-转移酶/骨桥蛋白融合蛋白、或谷胱甘肽-S-转移酶/靶融合蛋白可被吸附在谷胱甘肽琼脂糖珠上(Sigma Chemical，St.Louis，MO)。或者，可以使用谷胱甘肽衍生的微滴定板，然后再与该试验化合物一起，或与该试验化合物以及不被吸附的靶蛋白一起，或与受试化合物和骨桥蛋白一起，在有利于复合物形成的条件(例如在生理盐浓度和pH值条件下)下培养。培养完毕后，洗涤琼脂糖珠或微滴定板培养孔以除去任何未结合的组分，并按照如上所述的方法直接或间接地测定复合物的形成。或者，可将该复合物从基质上解离下来，并使用标准技术测定骨桥蛋白结合或活性的水平。
其它将蛋白固定在基质上的技术也可用于本发明的筛选分析。例如，可以利用生物素和链亲和素的结合作用来固定骨桥蛋白或其受体或靶分子。生物素标记的分子可以用本技术领域中众所周知的技术(如生物素化试剂盒，Pierce Chemicals，Rockford，IL)从生物素-NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)来制备，并固定于链亲和素包被的96孔培养板内(Pierce Chemicals)。
或者，易与骨桥蛋白、其受体或靶分子反应但不干扰其与靶分子结合的抗体可在该培养板的培养孔内衍生，未被结合的靶分子或骨桥蛋白通过抗体结合而滞留在培养板的孔内。检测这类复合物的方法，除了上述用于GST(谷胱甘肽-S-转移酶)固定的复合物的方法以外，还包括使用易与骨桥蛋白或靶分子反应的抗体所进行的复合物免疫检测法，以及依赖于骨桥蛋白相关酶活性检测的酶联试验。
在另一实施方案中，通过以下方法鉴定了骨桥蛋白功能的调控子使细胞与一候选化合物接触，并测定所诱导的mRNA或蛋白在该细胞中的表达。在该候选化合物存在和不存在这两种不同的情况下，对特定mRNA或蛋白的表达水平进行比较。在上述比较的基础上，该候选化合物即可被鉴定为骨桥蛋白功能的调控子。
在本发明的另一方面，骨桥蛋白或其受体可作为“诱饵蛋白”而用于双杂交试验或三杂交试验(参阅例如美国专利号5,283,317；Zervos等，Cell(1993)72223-232；Madura等，J.Biol.Chem.(1993)26812046-12054；Bartel等，Bio/Techniques(1993)14920-924；Iwabuchi等，Oncogene(1993)81693-1696；以及PCT公开号WO 94/10300)，以鉴定与骨桥蛋白或其受体结合或相互作用并调节骨桥蛋白活性的其他蛋白。
在另一实施方案中，希望尽量减少骨桥蛋白的产生或反应性，例如，当希望缺乏少突神经胶质细胞成熟时就是如此。骨桥蛋白的拮抗剂能够通过某种方式抑制天然骨桥蛋白的一种或多种活性，例如，通过竞争地与骨桥蛋白受体结合而不将其激活。因此，可以用一种功能受限的变体进行治疗而产生特殊的生物效果。相对于用天然存在的骨桥蛋白进行治疗，用上述这种保留了天然蛋白一部分生物活性的变体对治疗对象进行治疗可减少副作用。
通过筛选突变体例如截短型突变体的组合库，或通过获得拮抗性抗体等方式，可以鉴定骨桥蛋白的拮抗剂，正如上文所述的鉴定激动剂。
由于可以制备大量的纯骨桥蛋白或其受体，故可确定可能的功能区域之构象的物理特征以用于合理化药物设计。一旦弄清了一个区域的形状和离子结构，就可以确定应该与那些区域相互作用的候选药物的结构，然后在未用过该药物的细胞、动物和患者中进行试验。能够产生这种3维结构信息的方法包括X-射线结晶学、核磁共振波谱学和分子模建等。该3维结构还为鉴定其它已知蛋白质类似构象的区域创造了条件，对于这样的区域，存在着有效的已知药物。
作为防止少突神经胶质细胞前体细胞分化和促进这些前体细胞增殖以增加其数量的制剂，骨桥蛋白可在治疗方面用于促进少突神经胶质细胞群在体内某特定部位的增殖和扩大。由于少突神经胶质细胞可在中枢神经系统内产生髓磷脂，所以骨桥蛋白的使用是在中枢神经系统内脱髓鞘部位促进髓鞘再生的一种手段，例如，在多发性硬化症和其它以脱髓鞘为特征的疾病情况下。
骨桥蛋白与表达其受体的响应细胞结合。整合素受体例如αvβ3可与骨桥蛋白结合。少突神经胶质细胞前体的骨桥蛋白受体表达水平很高。
骨桥蛋白刺激表达αv链的细胞内IL12的产生。αv链在骨细胞、少突神经胶质细胞和神经胶质细胞内，以及在经溶血卵磷脂处理的动物中表达水平很高。αv链可与多种β链相连。
α6链可由星形胶质细胞和微神经胶质细胞很好地表达。β1和β3也可由这些类型的细胞很好地表达。β5当由星形胶质细胞和微神经胶质细胞表达时，β5可比由少突神经胶质细胞和少突神经胶质细胞前体表达时以更高的水平表达。
β3链也与IL12的表达相关。β3链的表达随着少突神经胶质细胞的分化而下降。β1和β5链也与骨桥蛋白的新陈代谢过程相关。
因此，减少骨桥蛋白影响的另一方法是尽量降低骨桥蛋白受体的表达，或占据骨桥蛋白受体使得该受体不能与骨桥蛋白结合。通过降低例如αv链、β3链或它们两者的表达就可达到这一目的。降低表达的目的可通过例如定点诱变、利用反义链分子等等实施。αv和β3的基因序列是为技术人员所熟知和易得的。出于本发明之目的，抑制被认为是失活和其它类似术语的同义词，其结果是骨桥蛋白受体在不受干扰的条件下，不会在同样的水平上起作用，因此，与骨桥蛋白相关的功能，例如趋化或防止前体的分化等功能被降低了。
或者，与骨桥蛋白受体结合但没有骨桥蛋白活性的分子可用于阻断受体。这样的分子可以通过使用表达骨桥蛋白受体的细胞之方式来鉴定。可以让这些细胞与许多分子接触以鉴定那些与骨桥蛋白受体结合但没有骨桥蛋白活性的分子。筛选例如具有αvβ3结合活性的分子的方法是本技术领域内已知的，例如，可使用表达或过量表达αvβ3的细胞或经转化的表达重组αvβ3的细胞。
抑制受体的分子可以是任何一种分子、肽、碳水化合物、有机分子或其组合。例如，许多现有的药物与特定的受体配体是无关的，但具有类似于天然配体例如骨桥蛋白的构象或电荷或两者兼有。
测定骨桥蛋白受体活性的方法是众所周知的，例如IL12的产生。分析IL12的方法在本技术领域内也是已知的。
防止骨桥蛋白与受体结合的另一方法是使用这样的抗体，该抗体与骨桥蛋白或其受体结合的方式将阻止骨桥蛋白与其受体结合。获取抗骨桥蛋白或骨桥蛋白受体的抗体的方法在本技术领域内是已知的。在那些为与骨桥蛋白或其受体结合而形成的抗体中，可用一种竞争性分析方法来鉴定那些抑制骨桥蛋白与其受体结合的抗体。
在另一实施方案中，与受体结合但并不激活该受体的被截短或经修饰的骨桥蛋白，可按照本文中所讲授的方法制备。
由于骨桥蛋白是通过细胞表面受体而起作用的，该受体触发细胞质、核蛋白和核酸之间一连串的分子间相互作用，最终达到特定基因的活化和/或失活，例如IL12的活化和/或失活。受体下游的那些细胞内元件是提高或抑制骨桥蛋白功能的合适目标。经发现可干扰骨桥蛋白级联信号的候选化合物也许是一个合适的药物靶标。
核酸分子、骨桥蛋白及其受体、抗体及其调节因子，例如本发明的激动剂和拮抗剂可被掺入适合于施用的药物组合物。这类组合物通常含有该活性成分以及可药用载体。如本文中所使用的，术语“可药用载体”意在包括适合于施用的任何和所有的溶剂、分散介质、赋形剂、载体、稀释剂、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。将这样的介质和试剂用于医药活性物质的做法是本技术领域内众所周知的。除了某些常规的介质或试剂与活性化合物不相容的情况，可考虑在组合物内使用这类介质和试剂。辅助的活性化合物也可被加入该组合物内。
本发明之药物组合物是以适合于预定给药途径的方式而配制的。给药途径的例子包括肠胃外施用(例如静脉内、皮内、皮下)、经口(例如吸入)、透皮(局部的)、粘膜和直肠给药。用于肠胃外、皮内或皮下给药的溶液或悬浮液可包括以下组分无菌稀释剂，例如注射用水、生理盐水、非挥发性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗菌剂，例如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，例如EDTA；缓冲剂，例如醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及调节渗透压的试剂，例如氯化钠或葡萄糖。pH值可用酸或碱来调节，例如HCl或NaOH。肠胃外制剂可密封于安瓿瓶、一次性注射器，或玻璃或塑料制成的各种剂量的小瓶。
适合于注射用的药物组合物包括用于即时制备无菌注射液或分散剂的无菌水溶液(水溶性)或分散剂以及无菌粉末。对于静脉内施用，适合的载体包括生理盐水，抑菌水，Cremophor EL(BASF；Parsippany，NJ)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，该组合物都必须无菌而且应具有一定的流动性以便于注射。它在制造和储存条件下都必须是稳定的，必须加以处理以抵抗微生物例如细菌和真菌的污染。其载体可以是含有例如水、乙醇、多羟基化物(例如丙三醇、丙二醇、液态聚乙二醇等)及其适当混合物的溶剂或分散介质。为了维持适当的流动性，可使用包衣，例如卵磷脂；若在分散剂的情况下，则可通过维持所需的颗粒大小来维持流动性；以及使用表面活性剂。为了预防微生物的作用，可使用多种抗细菌剂和抗真菌剂，例如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等。在许多情况下，优选是在该组合物内加入等渗剂，例如糖、甘露醇和山梨糖醇之类的多元醇、或氯化钠。注射型组合物的延迟吸收，可通过在组合物内加入延迟吸收的试剂而实现，例如加入单硬酯酸铝和明胶。
无菌可注射溶液的制备是将该活性化合物以所需的剂量且根据需要与上述一种成分或几种成份的组合一起加入适当的溶剂，随后进行过滤灭菌。通常，分散剂制备是将该活性化合物加入无菌载体(其含有基本的分散介质)以及所需的上述其他成份。在制备无菌注射液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是从先前灭菌过滤的溶液通过真空干燥和冷冻干燥形成活性成分与任何其他所需成份的粉末。
口服组合物一般包括惰性稀释剂或可食用的载体。它们可被密封在明胶胶囊内或被压成片剂。为了口服治疗的目的，活性化合物可与赋形剂一起成型并以片剂、锭剂或胶囊剂的形式使用。口服组合物也可以用液态载体制备而作为漱口液使用，该液态载体中的化合物经口腔途径应用，或者漱口后吐出或者咽下。
药学上相容的粘合剂和/或佐剂材料可被加入而成为组合物的一部分。片剂、丸剂、胶囊、锭剂等可包含以下任何成份或性质类似的化合物粘合剂，例如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂，例如淀粉或乳糖；崩解剂，例如藻酸、Primogel或玉米淀粉；润滑剂，例如硬脂酸镁或Sterotes；助滑剂，例如胶状二氧化硅；甜味剂，例如蔗糖或糖精；或调味剂，例如薄荷、水杨酸甲酯或橙色调味剂。为了以吸入方式给药，化合物可从含有适当挥发剂(例如二氧化碳之类的气体)的加压容器或分配器或雾化器以气雾剂喷雾的形式递送。
系统性给药也可通过透粘膜或透皮的方式。对于透粘膜或透皮给药，在制剂中使用了与所渗透屏障对应的渗透剂。这样的渗透剂在本技术领域内是众所周知的，例如，用于粘膜给药的渗透剂包括去污剂、胆汁盐以及梭链孢酸衍生物。粘膜给药可通过使用鼻腔喷雾或栓剂来实现。对于透皮给药，如本技术领域内众所周知的，可将活性化合物配入软膏、药膏、凝胶或油膏。
该化合物也可制成栓剂的形式(例如使用具润滑材料的常规栓剂基料，其熔解温度为哺乳动物体温，如可可脂和其他甘油脂)，或制成灌肠剂的形式用于直肠灌肠。
在一实施方案中，该活性化合物与可防止该化合物过快地从体内排出的载体一起制成药剂，例如控制释放的剂型，包括植入物和微胶囊递送系统。可以使用可生物降解、生物相容性聚合物，例如乙烯醋酸乙烯酯共聚物、聚酐、聚甘醇酸、胶原、聚原酸酯以及聚乳酸。
制备这类药剂的方法对于熟悉本技术者将是显而易见的。各种材料也可以通过商业途径从Alza Corporation和Nova Pharmaceuticals，Inc.等公司购得。脂质体悬浮液(其含有用单克隆抗体靶向被感染细胞的脂质体)也可用作为可药用载体。这些载体可按照为熟悉本技术者已知的方法制备，例如，按照美国专利号4,522,811所述的方法制备。
为了给药方便和剂量一致，以单位剂量的形式配制口服或注射用组合物是特别有利的。本文中所谓的单位剂量形式指的是形体上独立的单位，适合于作为单位剂量用于所治疗的对象；每个单位含有所需的医药载体和算出的预定活性化合物含量，以产生所希望的治疗效果。取决于疾病的类型和严重性，给患者输入约1μg/kg至15mg/kg(例如0.1至20mg/kg)的抗体是一种可供选择的初始剂量，无论是一次或多次地分别给药，还是连续地输注。典型的日剂量范围可从约1μg/kg至100mg/kg或以上，这取决于以上提到的因素。对于几天或更长时间的重复性给药，根据具体情况，应维持治疗直至出现所希望的抑制疾病症状的效果。但是，其他剂量的疗程也可能会有效。治疗的进展情况可以常规的技术和分析很容易地监测。WO 94/04188专利披露了一示范性剂量的疗程。本发明之单位剂量的规格受制于且直接依赖于该活性化合物的独特性质和所欲达到的具体治疗效果，以及这种治疗用活性化合物配制技术上的固有局限性。
由于骨桥蛋白可用于治疗脱髓鞘疾病，故最好是将活性成分递送至中枢神经系统。因此，可使用已知的立体定位注射法将活性成分输入脊髓液或直接输入脑。使药物穿越血脑屏障的方法则是众所周知的。
本申请书中所引用的所有参考文献均以其整体而引述在此。
对于熟悉本技术领域的人员很明显的一点是，对本说明书所讨论的内容可进行各种各样的修改和改变而不背离本发明之精神和范围。
权利要求
1.一种调控少突神经胶质细胞分化的方法，其包括减少少突神经胶质细胞及其前体细胞暴露于骨桥蛋白。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述减少是通过使所述少突神经胶质细胞及其前体暴露于特异结合骨桥蛋白的抗体而实现的。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述减少是通过灭活骨桥蛋白受体而实现的。
4.如权利要求3所述的方法，其中使所述受体暴露于骨桥蛋白拮抗剂。
5.如权利要求3所述的方法，其中使所述受体暴露于结合所述受体的抗体。
6.一种调控少突神经胶质细胞分化的方法，其包括调控少突神经胶质细胞或其前体细胞上骨桥蛋白受体的活性。
7.一种在需要髓鞘再生的位点处诱导髓鞘再生的方法，其包括减少少突神经胶质细胞及其前体细胞在所述位点暴露于骨桥蛋白，以增加所述位点处少突神经胶质细胞前体的数量，然后增加所述前体细胞暴露于骨桥蛋白，以促进所述前体细胞分化为少突神经胶质细胞，其中所述少突神经胶质细胞加强了髓鞘再生。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述减少是通过利用与骨桥蛋白特异结合的抗体而实现的。
9.如权利要求7所述的方法，其中所述减少是通过灭活骨桥蛋白受体而实现的。
10.如权利要求7所述的方法，该方法进一步包括使远离所述位点的细胞暴露于骨桥蛋白，其中骨桥蛋白是一种化学趋化因子并引起响应细胞向所述位点的迁移。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述骨桥蛋白是由星形胶质细胞分泌的。
12.如权利要求10所述的方法，其中所述骨桥蛋白是由暴露于骨桥蛋白激动剂的细胞表达的。
13.如权利要求10所述的方法，其中所述骨桥蛋白是由暴露于结合骨桥蛋白受体的抗体的细胞表达的。
14.获取能诱导细胞向需要髓鞘形成的位点迁移的分子的方法，其包括使表达骨桥蛋白受体的细胞暴露于候选分子；鉴定与所述受体结合的那些候选分子；使少突神经胶质细胞的前体细胞暴露于所述经鉴定的候选分子；以及鉴定诱导所述前体细胞迁移的那些候选分子。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述能诱导迁移的分子是骨桥蛋白激动剂或反向激动剂。
16.获取能诱导少突神经胶质细胞去分化或阻止少突神经胶质细胞前体细胞分化的分子的方法，其包括使表达骨桥蛋白受体的细胞暴露于候选分子；鉴定与所述受体结合的那些候选分子；使少突神经胶质细胞前体细胞暴露于所述经鉴定的候选分子；以及鉴定能阻止所述前体细胞分化为成熟少突神经胶质细胞的那些候选分子。
17.获取能诱导少突神经胶质细胞去分化或阻止少突神经胶质细胞前体细胞分化的分子的方法，其包括使表达骨桥蛋白受体的细胞暴露于候选分子；鉴定与所述受体结合的那些候选分子；使少突神经胶质细胞暴露于所述经鉴定的候选分子；以及鉴定能诱导所述少突神经胶质细胞去分化的那些候选分子。
全文摘要
骨桥蛋白是少突神经胶质细胞前体细胞的标记。骨桥蛋白也调控少突神经胶质细胞分化和中枢神经系统的髓鞘形成。骨桥蛋白诱导少突神经胶质细胞前体的迁移。
文档编号A61K45/00GK1662249SQ03814788
公开日2005年8月31日 申请日期2003年6月24日 优先权日2002年6月25日
发明者J·梅里尔, 朴素芬, O·霍克瓦, 纪中启, F·卡马乔, S·布施, 汪敏, 陈婷, R·J·迪纳斯坦, 姚正斌, 陈阳德, 张新, K·尚德罗斯, 李岚 申请人:安万特药物公司