含NF－κB抑制剂的医药组合物的制作方法

专利名称：含NF－κB抑制剂的医药组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药组合物、肿瘤细胞增殖抑制剂、粘着分子表达抑制剂、凋亡诱导剂、动脉硬化或癌的预防·治疗剂、恶病质治疗剂以及治疗方法。
背景技术：
近年来多次报道各种肿瘤NF-κB经常被活化。例如，膀胱癌(Hum.Gene Ther.1037～47，1999)、乳腺癌(Cancer Res.93810-3818，2001)、黑素瘤(Cancer Res.614901-4949，2001)等肿瘤中NF-κB常被活化。据认为这样的NF-κB活化可能使凋亡诱导机能失活，促进肿瘤进展。使IκB高度表达可抑制NF-κB、诱导NF-κB活性高的新生细胞特异性地细胞死亡，也提示了这一点(Hum.GeneTher.1037～47，1999)。
此外，恶病质(也称恶液质，cachexia)是恶性肿瘤、结核、糖尿病、血液病、内分泌、代谢疾病等慢性病时出现的以食欲不振、进行性体重减少、贫血、皮肤干燥、水肿等为主要症状的全身衰竭的疾病。它特别是恶性肿瘤末期患者等常见的症状，显示体重减少、贫血等为主的全身机能下降。癌症患者如果发生恶病质，并发症的危险性将增加，对化学疗法的反应变差。而且，因全身衰弱，对癌的化学疗法和放射疗法的副作用变大，也有因恶病质而死亡的。
至今尚未完全阐明恶病质发生的详细机理，但近年已得到关于其机理的线索，主要是包括白介素6(IL-6)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)等几个细胞因子的参与(最新医学1999年54卷10号2502-2507页)。例如，作为癌恶病质中各种症状的出现机理，有人认为由于恶病质其表达被诱导而过度表达的细胞因子，作用于中枢神经系统，引起摄食减少、发热、低血压、无力状态等症状，并导致糖、蛋白质、脂质的分解代谢亢进状态。
对这种恶病质的症状的抑制，给予甾体激素是有效的。对恶病质患者给予甾体激体，通过甾体激素的免疫抑制作用和由此引起的抗炎作用，通过抑制诱导恶病质的细胞因子的产生，可纠正癌恶病质的代谢异常，减轻、改善体重减少、食欲不振、无力、味觉异常、贫血等恶病质症状。然而，甾体激素的长期服用，其严重的副作用是个大问题。甾体激素由于是原来自身具有的激素，摄取的甾体激素和过剩的激素显示同样的作用，例如，通过参与肾脏对盐的再吸收，有时出现水肿和高血压等副作用。
另一方面，ω-3不饱和脂肪酸会抑制IL-6等炎症性细胞因子的产生，并影响急性期反应蛋白的合成，利用这些作用而给予EPA(二十碳五烯酸)对恶病质的改善具有一定效果。然而这样的营养制剂其作用是间接的，因此难于期待其具有显著而确实的效果。
因此，希望开发与甾体激素那样具有广泛作用的药物不同、而对恶病质具特异性且效果显著的药物。根据这样的要求，例如，酞胺哌啶酮(Thalidomide)由于具有TNF-α抑制作用，预期能改善恶病质的症状，可用作癌恶病质的治疗剂。然而，TNF-α在机体内具有血管新生之类的其它作用，因此如给予酞胺哌啶酮，会产生抑制血管新生的副作用。这样，即使是特异性较高的药物也一定会产生副作用，因此，如考虑在各种情况下使用，希望开发出具有不同作用机理的各种药物。
另一方面，对动脉硬化可使用减少胆固醇而具间接治疗效果的普伐他汀(メバロチン)等，但效果并不充分。作为癌细胞转移抑制剂尚未临床使用。金属蛋白酶抑制剂等虽在开发中，但其命运并未完全确定。众所周知，通常的抗癌药副作用强，使其使用受到显著限制。
因此，本发明的目的是提供能改善NF-κB活化所伴症状的医药组合物。
发明的揭示NF-κB是在核内发挥功能的转录因子，在其内源性抑制因子IκB存在下，它们形成复合物，作为无活性型存在于细胞质。在细胞受到TNF-α等的刺激时，诱导IκB分解，从而使NF-κB活化，活化后的NF-κB向核内移行，结合于DNA的NF-κB结合位点，调节编码参予免疫反应和炎症反应的细胞因子(例如IL-1、IL-2、IL-8、TNF-α等)及细胞间粘着分子(例如ICAM-1、VCAM-1等)基因的表达(Ghoshi，S.等，Annu.Rev.Immunol.16225-260(1998))。这样，可认为NF-κB是细胞内显示TNF-α功能的靶分子之一。
近年来，作为具有NF-κB活化抑制作用的物质，开发了以下的通式(1)表示的化合物(国际公开第WO 01/12588号；Matsumoto等，Bioorg.Med.Chem，Lett.10，865(2000))。
式中，R1为氢原子或C2～4的烷酰基，R2为下式(A)～(G)中的任一个表示的基团， 式中，R3表示C1～4的烷基。
动脉硬化和癌细胞转移都必须有血管内皮细胞粘着因子表达，因此本发明者通过使用不使粘着因子表达的药物解决问题。同样，如认为IL-6和TNF-α参与恶病质发生的机理，可认为抑制其细胞内靶分子NF-κB的机能，可能对预防/改善恶病质的症状有效。
因此，将上述化合物给予诱发了恶病质症状的模型小鼠，观察其症状，发现对恶病质症状的预防/改善有效，从而完成了本发明。本说明书中，症状是指伴随患病而引起的广泛的现象，未必仅指患者主诉的外表异常。
即，本发明的医药组合物的特征是，含有用于改善肿瘤细胞引起的至少1种症状的以下通式(1)表示的化合物或其药理学中许可的盐作为有效成分， 式中，R1为氢原子或C2～4的烷酰基，作为烷酰基，可列举乙酰基、丙酰基、丁酰基及它们的异构体基团，特别好的是乙酰基，R2为下述式(A)～(G)中的任一个表示的基团， 式中，R3为C1～4的烷基，作为烷基，可列举甲基、乙基、丙基、丁基及它们的异构体基团，特别好的是甲基、乙基。
此外，本发明的医药组合物的特征是，通过上述肿瘤细胞的凋亡而改善至少1种症状，不通过上述肿瘤细胞的凋亡而改善上述肿瘤细胞引起的至少1种症状。
本发明的医药组合物的特征是，通过抑制NF-κB的活化而改善上述肿瘤细胞引起的至少1种症状。
上述症状例如为肿瘤转移。本发明的医药组合物的特征是，通过抑制与血管内皮细胞的粘附而改善肿瘤转移。
本发明的医药组合物的特征是，通过抑制上述肿瘤细胞的增殖而改善上述肿瘤细胞引起的至少1种症状。
上述症状例如为选自何杰金病、癌恶病质、白血病的症状。上述肿瘤细胞例如是乳腺癌细胞等。
本发明的医药组合物的特征是，上述化合物为下述式(1a)或(1b)。
本发明的医药组合物的特征是，预防或改善作为上述癌恶病质的症状的体重减少、血细胞比容值减少、脂肪减少及肌肉减少中的至少1种症状。恶病质所伴的各种症状并不限于以上所述，皮肤干燥和水肿等也属于本发明的技术范围。
本发明的医药组合物的特征是，通过抑制上述肿瘤细胞形成的肿瘤内的血管新生而改善上述肿瘤细胞引起的至少1种症状。
本发明的医药组合物的特征是，含有通过抑制活化NF-κB的治疗所引起的NF-κB的上述活化可增加上述治疗的效果的以下通式(1)表示的化合物或其药理学中许可的盐作为有效成分。
式中，R1为氢原子或C2～4的烷酰基，作为烷酰基，可列举乙酰基、丙酰基、丁酰基及它们的异构体基团，特别好的是乙酰基，R2为下述式(A)～(G)中的任一个表示的基团，
式中，R3为C1～4的烷基，作为烷基，可列举甲基、乙基、丙基、丁基及它们的异构体基团，特别好的是甲基、乙基。
上述活化NF-κB的治疗可以是用抗肿瘤药的治疗，也可以是用射线照射肿瘤细胞的治疗。也可以制成含上述医药组合物和上述抗肿瘤药作为有效成分的制剂。上述抗肿瘤药，例如是喜树碱(カンプトテシン)或柔红霉素。
本发明的医药组合物的特征是，上述化合物为下式(1a)或(1b)。
本发明的用于抑制肿瘤细胞增殖的肿瘤细胞增殖抑制剂的特征是，含有下述通式(1)表示的化合物或其药理学中许可的盐作为有效成分， 式中，R1为氢原子或C2～4的烷酰基，作为烷酰基，可列举乙酰基、丙酰基、丁酰基及它们的异构体基团，特别好的是乙酰基，R2为下述式(A)～(G)中的任一个表示的基团，
式中，R3为C 1～4的烷基，作为烷基，可列举甲基、乙基、丙基、丁基及它们的异构体基团，特别好的是甲基、乙基。
本发明的肿瘤细胞增殖抑制剂的特征是，上述化合物为下式(1a)或(1b)。
本发明的用于抑制血管内皮细胞粘着分子表达的粘着分子表达抑制剂的特征是，含有下述通式(1)表示的化合物或其药理学中许可的盐作为有效成分， 式中，R1为氢原或C2～4的烷酰基，作为烷酰基，可列举乙酰基，丙酰基、丁酰基及它们的异构体基团，特别好的是乙酰基，R2为下述式(A)～(G)中的任一个表示的基团，
式中，R3为C1～4的烷基，作为烷基，可列举甲基、乙基、丙基、丁基及它们的异构体基团，特别好的是甲基、乙基。
本发明的粘着分子表达抑制剂的特征是，上述化合物为下式(1a)或(1b)。
本发明的用于诱导肿瘤细胞凋亡的凋亡诱导剂的特征是，含有下述通式(1)表示的化合物或其药理学中许可的盐作为有效成分， 式中，R1为氢原子或C2～4的烷酰基，作为烷酰基，可列举乙酰基、丙酰基、丁酰基及它们的异构体基团，特别好的是乙酰基，R2为下述式(A)～(G)中的任一个表示的基团，
式中，R3为C1～4的烷基，作为烷基，可列举甲基、乙基、丙基、丁基及它们的异构体基团，特别好的是甲基、乙基。
本发明的凋亡诱导剂的特征是，上述化合物为下式(1a)或(1b)。
本发明的动脉硬化的预防·治疗剂的特征是，包含具NF-κB抑制作用的化合物作为有效成分。上述具NF-κB抑制作用的化合物可以是下述通式(1)表示的化合物或其药理学中许可的盐， 式中，R1为氢原子或C2～4的烷酰基，作为烷酰基，可列举乙酰基、丙酰基、丁酰基及它们的异构体基团，特别好的是乙酰基，R2为下述式(A)～(G)中的任一个表示的基团，
式中，R3为C1～4的烷基，作为烷基，可列举甲基、乙基、丙基、丁基及它们的异构体基团，特别好的是甲基、乙基。
本发明的癌症预防·治疗剂的特征是，含有具NF-κB抑制作用的化合物作为有效成分。上述具NF-κB抑制作用的化合物可以是下述通式(1)表示的化合物或其药理学中许可的盐， 式中，R1为氢原子或C2～4的烷酰基，作为烷酰基，可列举乙酰基、丙酰基、丁酰基及它们的异构体基团，特别好的是乙酰基，R2为下述式(A)～(G)中的任一个表示的基团，
式中，R3为C1～4的烷基，作为烷基，可列举甲基、乙基、丙基、丁基及它们的异构体基团，特别好的是甲基、乙基。
上述预防·治疗剂也可以用于抑制癌的转移。
本发明的恶病质治疗剂的特征是，含有下述通式(1)表示的化合物或其药理学中许可的盐作为有效成分， 式中，R1为氢原子或C2～4的烷酰基，作为烷酰基，可列举乙酰基、丙酰基、丁酰基及它们的异构体基团，特别好的是乙酰基，R2为下述式(A)～(G)中的任一个表示的基团，
式中，R3为C1～4的烷基，作为烷基，可列举甲基、乙基、丙基、丁基及它们的异构体基团，特别好的是甲基、乙基。
本发明的恶病质治疗剂的特征是，上述化合物为下式(1a)或(1b)。
该治疗剂的特征是，为肿瘤患者(例如，带癌患者)的癌恶病质的治疗剂，但发生恶病质的患者其病因也可以不是癌。
本发明的恶病质治疗剂的特征是，预防或改善作为肿瘤患者(例如，带癌患者)的癌恶病质的症状的体重减少、血细胞比容值减少、脂肪减少以及肌肉减少中的至少1种症状。但恶病质所伴的各种症状并不限于以上所述，皮肤干燥和水肿等也属于本发明的技术的范围。
此外，本发明的恶病质治疗剂也可含有具NF-κB抑制作用的化合物作为有效成分。
本发明的治疗方法的特征是，使用用于改善肿瘤细胞引起的至少1种症状的下述通式(1)表示的化合物或其药理学中许可的盐，
式中，R1为氢原子或C2～4的烷酰基，作为烷酰基，可列举乙酰基、丙酰基、丁酰基及它们的异构体基团，特别好的是乙酰基，R2为下述式(A)～(G)中的任一个表示的基团， 式中，R3为C1～4的烷基，作为烷基，可列举甲基、乙基、丙基、丁基及它们的异构体基团，特别好的是甲基、乙基。治疗方法也包括预防方法和抑制病症发展的方法。
本发明的治疗方法的特征是，通过上述肿瘤细胞的凋亡而改善至少1种症状，也可以不通过上述肿瘤细胞的凋亡而改善上述肿瘤细胞引起的至少1种症状。此外，本发明的治疗方法的特征是，通过抑制NF-κB活化而改善上述肿瘤细胞引起的至少1种症状。
上述症状是选自例如肿瘤转移、上述肿瘤细胞增殖而引起的症状，何杰金病，癌恶病质的症状。
本发明的治疗方法的特征是，上述化合物为下式(1a)或(1b)。
本发明的治疗方法的特征是，通过抑制血管内皮细胞和白细胞的粘附，使用用于改善动脉硬化的下述通式(1)表示的化合物或其药理学中许可的盐， 式中，R1为氢原子或C2～4的烷酰基，作为烷酰基，可列举乙酰基、丙酰基、丁酰基及它们的异构体基团，特别好的是乙酰基，R2为下述式(A)～(G)中的任一个表示的基团， 式中，R3为C1～4的烷基，作为烷基，可列举甲基、乙基、丙基、丁基及它们的异构体基团，特别好的是甲基、乙基。此外，治疗方法也包括预防动脉硬化的方法和抑制动脉硬化发展的方法。
本发明的治疗方法的特征是，上述化合物为下式(1a)或(1b)。
本发明的治疗方法的特征是，包括进行活化NF-κB的治疗的步骤，以及给予含有以下通式(1)表示的化合物或其药理学中许可的盐作为有效成分的医药组合物的步骤， 式中，R1为氢原子或C2～4的烷酰基，作为烷酰基，可列举乙酰基、丙酰基、丁酰基及它们的异构体基团，特别好的是乙酰基，R2为下述式(A)～(G)中的任一个表示的基团， 式中，R3为C1～4的烷基，作为烷基，可列举甲基、乙基、丙基、丁基及它们的异构体基团，特别好的是甲基、乙基。治疗方法也包括预防方法和抑制病症发展的方法等。
上述活化NF-κB的治疗可以是给予抗肿瘤药的治疗，也可以是用射线照射肿瘤细胞的治疗。
本发明的治疗方法的特征是，上述化合物为下式(1a)或(1b)。
附图的简单说明

图1是说明具有NF-κB抑制作用的化合物抑制动脉硬化及癌转移的作用机理的示意图。
图2是表示TNF-α刺激时DHMEQ的抑制效果的图。
图3是表示TNF-α刺激时DHMEQ抑制ICAM-1、VCAM-1、E-选择素(セレクチン)表达的效果的图。
图4是表示DHMEQ抑制HUVECs与白细胞(上)或HUVECs与HL-60细胞(下)粘附的效果的图。
图5是表示DHM2EQ对ATL细胞组成型NF-κB活化的抑制作用的凝胶移位试验的解析结果的图。
图6是表示DHM2EQ对ATL细胞组成型NF-κB活化的抑制作用的报道基因试验的解析结果的图。
图7是表示DHM2EQ对ATL细胞组成型NF-κB活化的抑制作用的共焦点显微镜的解析结果的图。
图8是表示DHM2EQ对ATL细胞的增殖抑制作用的浓度依赖性解析结果的图。
图9是表示DHM2EQ对ATL细胞的增殖抑制作用随时间变化的解析结果的图。
图10是表示DHM2EQ对ATL患者未梢血细胞的增殖抑制作用的解析结果的图。
图11是表示DHM2EQ对正常未梢血单核细胞的增殖抑制作用的解析结果的图。
图12是表示DHM2EQ对ATL细胞的凋亡诱导作用的解析结果的图。
图13是表示DHM2EQ对何杰金淋巴瘤细胞的增殖抑制作用的解析结果的图。
图14是表示DHM2EQ对多发性骨髓瘤细胞的增殖抑制作用的解析结果的图。
图15是表示DHMEQ对TNF-α诱导的NF-κB活化的抑制作用的图。
图16是表示DHMEQ对MCF-7的增殖抑制作用的图。
图17是表示DHMEQ对SCID小鼠移植的人乳腺癌细胞株MCF-7的增殖抑制作用的图。
图18是表示COX-2抑制剂塞来考昔(セレコキシブ)对路易斯肺癌和HT-29的增殖抑制作用的图。
图19是表示本发明的一实施例中使p6kb-Luc转染JCA-1细胞，给予不同浓度的DHMEQ时的荧光素酶活性的图。
图20是表示本发明的一实施例中，对接种了JCA-1细胞的带癌小鼠给予DHMEQ时小鼠体重随时间变化的图。
图21是表示本发明的一实施例中，对接种了JCA-1细胞的带癌小鼠给予DHMEQ时由肿瘤直径算出的瘤重随时间变化的图。
图22是表示本发明的一实施例中，对接种了JCA-1细胞的带癌小鼠开始给予DHMEQ后第26日的肿瘤重量的图。
图23是表示本发明的一实施例中，对接种了JCA-1细胞的带癌小鼠开始给予DHMEQ后第26日的睾丸周围的脂肪重量的图。
图24是表示本发明的一实施例中，对接种了JCA-1细胞的带癌小鼠开始给予DHMEQ后第26日的腓肠肌重量的图。
图25是表示本发明的一实施例中，对接种了JCA-1细胞的带癌小鼠开始给予DHMEQ后第26日的血细胞比容值的图。
图26是表示本发明的一实施例中，对接种了JCA-1细胞的带癌小鼠开始给予DHMEQ后第26日的解剖测定的各脏器重量的表。
图27是表示本发明的一实施例中，DHMEQ对多发性骨髓瘤(MM)细胞株组成型NF-κB活化的抑制作用的结果的图。
图28是表示本发明的一实施例中，DHMEQ对多发性骨髓瘤(MM)细胞株的增殖抑制作用的结果的图。
图29是表示本发明的一实施例中，DHMEQ对多发性骨髓瘤(MM)患者细胞的增殖抑制作用的结果的图。
图30是表示本发明的一实施例中，DHMEQ对何杰金淋巴瘤(HL)细胞株组成型NF-κB活化的抑制作用的结果的图。
图31是表示本发明的一实施例中，DHMEQ对抗肿瘤药作用的增强效果的结果的图。
图32是表示本发明的一实施例中，DHMEQ对抗肿瘤药作用的增强效果起因于抑制抗肿瘤药引起的NF-κB活化的图。
图33是表示本发明的一实施例中，采用腹腔内接种了ATL细胞株的SCID小鼠，体内观察DHMEQ的效果的结果的图。
图34是表示本发明的一实施例中，观察DHMEQ对照射过射线的肿瘤细胞的凋亡增强作用的结果的图。
图35是表示本发明的一实施例中，体内观察DHMEQ对人胰腺癌的肿瘤细胞的增殖抑制作用的结果的图。
图36是表示本发明的一实施例中，观察DHMEQ与放射线并用对人胰腺癌细胞株的体外增殖抑制作用的结果的图。
实施发明的最佳方式根据本说明书的说明，本领域普通技术人员应该已明白本发明的目的、特征、优点及其概念。以下所述的发明的实施方式及具体的实施例等揭示了本发明较好的实施方式，是用于例示或说明的，本发明并不仅限于此。在本说明书揭示的本发明意图和范围之内，根据本说明书的记载，可进行各种改动和修饰，本领域普通技术人员应该能够了解。
本发明的医药组合物可改善肿瘤细胞引起的至少1种症状。为改善肿瘤细胞引起的症状可以使肿瘤细胞凋亡。该方法的对象症状可列举何杰金病、白血病等，但并不限于这些。此外，改善肿瘤细胞引起的症状也可以不通过肿瘤细胞的凋亡，例如可列举肿瘤转移、癌恶病质等，但并不限于这些。这里，不通过肿瘤细胞的凋亡意味着将本发明的医药组合物给予患部，其效果不依赖于该患部的肿瘤细胞的凋亡，但除了不依赖于凋亡的效果之外，也可以发生肿瘤细胞的凋亡。肿瘤具有与广义的癌同样的意思，例如包括淋巴系恶性肿瘤、乳腺癌、担癌、胰腺癌等。
对NF-κB的活化，目前已有涉及凋亡控制、细胞增殖、细胞分化等为代表的肿瘤形成的各个方面的报道(Albert S.Baldwin，J.Clin.Invest.107241-246(2001))。而且，已报道化学疗法或放射疗法引起癌细胞NF-κB的活化会使癌的治疗效果减弱(Albert S.Baldwin，上文)。因此，本发明者认为根据抗生素环氧醌霉素C(epoxyquinomicin C)的结构设计、合成的以上述通式(1)表示的DHMEQ如上所述对癌具有抗癌作用。
本发明者用DHMEQ观察了对成人T细胞白血病淋巴瘤(ATL)细胞的NF-κB活化的影响，发现DHMEQ能抑制ATL细胞的NF-κB的活化。此外，还用DHMEQ观察了对ATL细胞增殖的影响，发现DHMEQ不抑制正常细胞的增殖，但能抑制ATL细胞增殖。进一步考察了对ATL细胞凋亡的诱导的影响，发现DHMEQ能诱导ATL细胞的凋亡，但是不诱导正常细胞的凋亡。作为具有NF-κB抑制作用的化合物，可列举水杨酰胺衍生物(WO 01/12588A1)、Panepoxydone(Biochem.Biophys.Res.Commun.226，214-221，1996)、Cycloepoxydon(J.Antibiot.51，455-463，1998)、SN-50(J.Biol.Chem.270，14255-14258)。具有NF-κB抑制作用的化合物的制造方法记载于下列文献。Panepoxydone记载于Biochem.Biophys.Res.Commun.226，214-221，1996，Cycloepoxydon记载于J.Antibiot.51，455-463，1998，SN50记载于J.Biol.Chem.270，14255-14258，1995。
本发明者又用DHMEQ考察了对何杰金淋巴瘤细胞增殖的影响，发现DHMEQ抑制NF-κB活化的何杰金淋巴瘤细胞的增殖，但对NF-κB不活化的骨髓细胞系白血病细胞的增殖并不抑制。在用DHMEQ考察对多发性骨髓瘤细胞增殖的影响时，发现DHMEQ也抑制多发性骨髓瘤细胞的增殖。
以前的化学疗法，由于广泛地将细胞普遍的增殖机理作为靶，不仅对肿瘤细胞，对于正常细胞影响也很大，未必成为有效的治疗手段。然而，从以上述通式(1)表示的NF-κB抑制剂DHMEQ诱导NF-κB活化的白血病细胞凋亡，而同样的浓度完全不诱导人正常白细胞凋亡的实验结果(图8及11)可知，其对肿瘤细胞具有高特异性。因此，DHMEQ比以往的化学疗法副作用少，对于恶性肿瘤等肿瘤作为医药组合物更加有用。
此外，DHMEQ作为肿瘤细胞的凋亡诱导剂也有用。例如，本发明的医药组合物，由于对淋巴系恶性肿瘤细胞的增殖抑制作用以及对淋巴系恶性肿瘤细胞的凋亡诱导作用，可以预防或治疗淋巴系恶性肿瘤。作为预防或治疗对象的淋巴系恶性肿瘤的种类没有特别限定，适用于恶性淋巴瘤、白血病或骨髓瘤的预防或治疗。恶性淋巴瘤包括非何杰金淋巴瘤、何杰金淋巴瘤等，骨髓瘤包括多发性骨髓瘤等浆细胞性肿瘤等，白血病包括急性淋巴性白血病，成人T细胞白血病淋巴瘤、慢性淋巴性白血病等。
本发明的肿瘤细胞增殖抑制剂，通过抑制淋巴系恶性肿瘤细胞增殖的作用，可抑制淋巴系恶性肿瘤细胞的增殖，因此可预防或治疗淋巴系恶性肿瘤。作为增殖抑制对象的淋巴系恶性肿瘤细胞的种类没有特别限定，适用于恶性淋巴瘤细胞、白血病细胞或骨髓瘤细胞的增殖抑制。恶性淋巴瘤、白血病或骨髓瘤包括上述例示的各种淋巴系恶性肿瘤。
本发明的凋亡诱导剂，通过诱导淋巴系恶性肿瘤细胞凋亡的作用，可诱导淋巴系恶性肿瘤细胞的凋亡，因此可预防或治疗淋巴系恶性肿瘤。作为凋亡诱导对象的淋巴系恶性肿瘤细胞的种类没有特别限定，适用于恶性淋巴瘤细胞、白血病细胞或骨髓瘤细胞的凋亡诱导。恶性淋巴瘤、白血病或骨髓瘤包括上述例示的各种淋巴系恶性肿瘤。
本发明的医药组合物、肿瘤细胞增殖抑制剂及凋亡诱导剂，对淋巴系恶性肿瘤细胞具有特异性作用，而对正常细胞几乎不产生不良影响，因此预期对淋巴系恶性肿瘤具有优良的预防、治疗作用。
通式(1)表示的化合物(特别是DHMEQ)及其药理学中许可的盐对癌细胞有用，对癌组织的间质(癌组织中由正常细胞构成的部分)细胞也有作用。特别对癌组织中的血管内皮细胞，DHMEQ不会引起凋亡，但抑制粘着因子等的表达(图5)而对癌的发展产生抑制作用。
如有炎症性刺激或物理刺激等施加于血管内皮细胞，则粘着分子的表达加强，白细胞便粘附于血管内皮细胞表面而向血管外移动。这是由于血管内皮细胞内的转录因子NF-κB活化，激活了ICAM-1、VCAM-1、E-选择素等粘着分子的表达的缘故。此外，转移可能性高的大肠癌，有报告认为E-选择素配体唾液酸化路易斯-X高度表达，活化了血管内皮细胞内的转录因子NF-κB，使大肠癌细胞容易粘附于血管内皮细胞表面，因此易渗出血管外，促进其转移。因而，认为抑制血管内皮细胞表面上的上述粘着分子的表达与动脉硬化及肿瘤转移的控制有关，NF-κB抑制剂对于动脉硬化和癌细胞的转移是有用的。
因此，本发明者用DHMEQ考察了DHMEQ对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的粘着分子表达的影响。用凝胶移位试验评价TNF-α引起的NF-κB活化，发现IκB-α的分解不受抑制，而NF-κB活化受到抑制。此外，用蛋白质印迹(ゥェスタンブロッティンダ)法考察DHMEQ对TNF-α诱导的ICAM-1、VCAM-1、E-选择素的表达的影响，发现这些粘着分子的表达受到抑制，实际上白细胞与HUVECs的粘附、白血病细胞与HUBECs的粘附均受抑制。白细胞粘附于血管壁通过脂质的蓄积等诱导动脉硬化，另一方面癌细胞的粘附引起从血管的渗出、转移。因此抑制这种粘附在前者与抗动脉硬化药、在后者与癌转移抑制药有关。因此，具有NF-κB抑制作用的上述化合物可用于抑制动脉硬化或癌细胞的转移(图1)。如以下的实施例所述，DHMEQ作为血管内皮细胞的粘着因子表达的抑制剂是有用的。
作为不依赖凋亡的效果的其它实例，有细胞增殖的抑制。本发明者用DHMEQ考察了在体外和体内对人乳腺癌细胞增殖的影响，发现DHMEQ能抑制人乳腺癌细胞的增殖。通式(1)表示的化合物及其药理学中许可的盐具有抑制乳腺癌细胞增殖的作用。因此这些化合物作为乳腺癌的预防·治疗剂是有用的。
以前，乳腺癌的治疗大体上已知有2类方法化学疗法(使用抗癌药的治疗法)和激素疗法。这些方法已知都具有使癌缩小或防止复发的效果，但也有问题。即使用抗癌药时，最大的问题是有毒性(副作用)，耐药性也是大问题。采用激素疗法时，首先有只对具有激素敏感性的癌有效的问题。具有激素敏感性的癌约占全部癌的60％，其余40％患者一开始就不适并用激素疗法。而且，激素疗法也会出现耐药性，这也成为一个大问题。因此，可以说DHMEQ对乳腺癌是非常有用的。
由于IL-6和TNF-α参与慢性病、特别是恶性肿瘤未期患者等常见的恶病质发病机理，本发明者认为抑制其细胞内靶分子NF-κB的机能对恶病质的症状的预防/改善有效，考察了DHMEQ对恶病质是否有用。即，对已诱发恶病质症状的模型小鼠给予DHMEQ，观察其症状，发现DHMEQ对恶病质症状的预防/改善是有效的。由此说明对恶病质也是有用的。
本发明的医药组合物可抑制NF-κB活化，因此认为可抑制NF-κB活化引起的环氧合酶-2(COX-2)基因的表达。而且由于可抑制环氧合酶-2的基因表达，所以也可抑制前列腺素的合成。由此认为能阻止或抑制前列腺素促进的肿瘤血管新生。因此，预期本发明的医药组合物通过抑制肿瘤内的血管新生、抑制对肿瘤的氧和营养成分的供给而呈现抗肿瘤作用，作为癌治疗剂有用。
本发明者根据其抑制化学疗法或放射疗法等活化NF-κB的治疗引起的肿瘤细胞NF-κB的活化，认为DHMEQ可增加肿瘤治疗的效果，先考察了DHMEQ增强抗肿瘤药作用的效果。即用喜树碱(CPT)、柔红霉素(DNR)等抗肿瘤药探讨了DHMEQ增强抗肿瘤药作用的效果，发现DHMEQ对每种药物都有增强其抗肿瘤药的效果。
本发明者还考察了由各抗肿瘤药处理引起的NF-κB活化。用任一种抗肿瘤药(喜树碱(CPT)、柔红霉素(DNR)、依托泊甙(ETP))处理，与处理前比较，发现肿瘤细胞内都产生一过性的3～20倍的NF-κB活性。由此阐明了DHMEQ引起的抗肿瘤药作用增强效果是由于抑制了抗肿瘤药引起的NF-κB活化而导致的。
然后，为考察DHMEQ对抗肿瘤药引起的NF-κB活化的抑制，考察了各抗肿瘤药(喜树碱(CPT)、柔红霉素(DNR))与DHMEQ并用而处理肿瘤细胞时的NF-κB活化情况。结果发现用任一抗肿瘤药处理时，通过并用DHMEQ，都能强烈抑制NF-κB活化。
另一方面，放射治疗可能产生活性酶，从而使正常组织的DNA损伤而引发别的癌或使残留的癌细胞恶化。此外，已知射线照射引起的氧化应激如果诱导NF-κB活化，会使癌细胞难以发生凋亡，对放射治疗显示抗性。因此本发明者考虑将DHMEQ和射线照射并用是否能取得协同效果，考察了DHMEQ与射线并用对肿瘤细胞的体外增殖抑制作用。结果发现DHMEQ与射线照射并用显示协同的增殖抑制作用。
这样，本发明的医药组合物，作为用抗肿瘤药的治疗或对肿瘤细胞照射射线的治疗等引起的NF-κB活化的抑制剂是有用的。用抗肿瘤药的治疗，只要是活化NF-κB的抗肿效瘤药即可，没有特别限定，可列举喜树碱、柔红霉素等。
本发明的医药组合物与用于肿瘤疾病、变应性疾病、免疫疾病、炎症性疾病等疾病的治疗并用，可增加治疗效果。本发明的医药组合物也可与活化NF-κB的治疗同时使用，也可以在活化NF-κB的治疗之后用于抑制NF-κB活化。而且，为了抑制NF-κB活化，也可预先给患有上述疾病的人及人以外的哺乳动物使用。
另一方面，目前抗癌药治疗的一大问题是常产生其基理是癌细胞排出药物的耐药性。据认为对正常细胞的作用一般难以产生耐药性。因此，这一点首先是本发明的乳腺癌预防·治疗剂的优点。其次预期其毒性低，与化学疗法比较时是一个优点。此外，如从作用机理看，不是激素疗法使用对象的激素非敏感性肿瘤也是其治疗对象，与激素疗法比较，这点是一大优点。如上所述，其临床上的大优点包括毒性少、与激素疗法的对象不重叠、对血管内皮细胞等难以产生耐药性。而且，这些方面也暗示其与现有药物广泛并用以及应用于癌症预防的可能性。
由此可见，本发明的医药组合物可用作肿瘤细胞增殖抑制剂、粘着分子表达抑制剂、凋亡诱导剂、动脉硬化或癌的预防·治疗剂、淋巴系恶性肿瘤的预防·治疗剂、乳腺癌的预防·治疗剂、恶病质治疗剂等。
因此，含有本发明的通式(1)表示的化合物作为有效成分的医药组合物对于肿瘤、恶病质、动脉硬化等的治疗(包括预防和进展抑制剂等)是有用的。
以下，详细描述本发明化合物的制造方法、使用形态、使用例(实施例)。
本发明化合物的制造方法通式(1)表示的化合物可按Wipf等的合成法(Synthesis，12号，1549-1561页，1995)制造。
以下根据下列反应式说明通式(1)表示的化合物的制造方法的一例。
步骤a制备N-(2-烷酰基苯甲酰)-2，5-二甲氧基苯胺将2，5-二甲氧基苯胺溶解于溶剂(吡啶等)中，于-78～50℃、更好在冰冷却下，加入式(7)的O-烷酰水杨酰卤的乙酸乙酯溶液，在搅拌下使其反应。加水停止反应后，加乙酸乙酯，依次用盐酸、水、碳酸氢钠水溶液、水洗涤，干燥后减压浓缩，经真空干燥得式(2)所示的N-(2-烷酰基苯甲酰)-2，5-二甲氧基苯胺化合物。该化合物可不经精制用于下一步骤。
步骤b制备3-(O-烷酰基水杨酰胺基)-4，4-二烷氧基-2，5-环己二烯酮化合物将以上所得的式(2)的化合物溶解于甲醇等溶剂，于-20～50℃、较好在冰冷却下，添加二乙酰氧基碘苯，于室温边搅拌边反应。减压浓缩后加乙酸乙酯，依次用碳酸氢钠水溶液、食盐水溶液洗涤，减压浓缩溶剂，所得残渣以柱色谱精制，得式(3)所示的3-(O-烷酰基水杨酰胺基)-4，4-二烷氧基-2，5-环己二烯酮化合物。
步骤c制备5，6-环氧-4，4-二烷氧基-3-水杨酰胺基-2-环己烯酮化合物将式(3)所示的3-(O-烷酰基水杨酰胺基)-4，4-二烷氧基-2，5-环己二烯酮溶解于溶剂(四氢呋喃、甲醇等)，于-20～50℃，较好在冰冷却下，加过氧化氢水及氢氧化钠，边搅拌边反应。在反应液中加乙酸乙酯，依次用盐酸溶液、硫代硫酸钠水溶液、食盐水溶液洗涤，空气中干燥后，真空干燥。为除去残留的原料化合物，将残渣溶解于丙酮，加对甲苯磺酸，于室温搅拌，使原料化合物分解。减压蒸除甲醇，在所得残渣中加入乙酸乙酯，用水洗涤。干燥乙酸乙酯层，所得的残留物用柱色谱精制，得式(4)所示的5，6-环氧-4，4-二烷氧基-3-水杨酰胺基-2-环己烯酮化合物。
步骤d制备5，6-环氧-2-水杨酰胺基-2-环乙烯-1，4-二酮将式(4)的5，6-环氧-4，4-二烷氧基-3-水杨酰胺基-2-环己烯酮化合物溶解于溶剂(二氯甲烷等)，于冰冷却下加入无机酸或有机酸(三氟化硼乙醚络合物等)，边搅拌边反应。于反应液中加溶剂(乙酸乙酯等)，用水洗涤，将乙酸乙酯层浓缩后，所得残渣用甲醇洗涤，得式(5)所示的5，6-环氧-2-水杨酰胺基-2-环己烯-1，4-二酮。
步骤e制备5，6-环氧-4-羟基-3-水杨酰胺基-2-环己烯酮(1a，DHM2EQ)将式(5)所示的5，6-环氧-2-水杨酰胺基-2-环己烯-1，4-二酮悬浮于溶剂(甲醇、乙醇、THF等)，于-78～50℃、较好为冰冷却下，加还原剂(硼氢化钠等)反应。在反应液中加溶剂(乙酸乙酯、二氯甲烷等)，用盐酸、水依次洗涤，溶剂层干燥后，减压浓缩，用甲醇悬浮、搅拌、洗涤，得式(1a)所示的5，6-环氧-4-羟基-3-水杨酰胺基-2-环己烯酮(DHM2EQ)。
步骤f制备3，3-二烷氧基-4，5-环氧-6-羟基-2-水杨酰胺基环己烯将式(4)的5，6-环氧-4，4-二烷氧基-3-水杨酰胺基-2-环己烯酮化合物溶解于甲醇等溶剂与碳酸氢钠水溶液的混合溶剂中，于-78～50℃、较好在冰冷却下，加入还原剂(硼氢化钠等)，边搅拌边反应。反应液中加溶剂(乙酸乙酯等)，依次用盐酸、水洗涤，溶剂层干燥后，减压浓缩，真空干燥，经柱色谱等精制，得式(6)所示的3，3-二烷氧基-4，5-环氧-6-羟基-2-水杨酰胺基环己烯。
步骤g制备5，6-环氧-4-羟基-2-水杨酰胺基-2-环己烯酮(1b DHM3EQ)将式(6)所示的3，3-二烷氧基-4，5-环氧-6-羟基-2-水杨酰胺基环己烯溶解于溶剂(丙酮等)，加对甲苯磺酸，于室温边搅拌边反应。在反应液中加溶剂(乙酸乙酯等)，用水洗涤，溶剂层干燥，减压浓缩，精制，得式(1b)的5，6-环氧-4-羟基-2-水杨酰胺基-2-环己烯酮(DHM3EQ)。
通式(1)表示的化合物是弱酸性物质，作为它们的盐有季铵盐等有机碱盐、或与各种金属的盐，例如与钠等碱金属的盐，也可以使用这些盐的形式。这些盐可用公知的方法制得。
本发明的化合物的使用形态通式(1)表示的化合物或其药理学中许可的盐可以单独使用，或与其它药物(如其它抗癌药、激素疗法药物)组合使用。
给人服用通式(1)表示的化合物或其药理学中许可的盐时，例如成人为每日约1～100mg/kg(体重)、较好为4～12mg/kg(体重)的剂量，分1～数次口服或静注，该剂量和给药次数可根据疾病种类、症状、年龄、体重、疗程、治疗效果、给药方法等适当变更。
通式(1)表示的化合物或其药理学中许可的盐可配合药理学中许可的载体，制成乳剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、糖浆剂等制剂口服给药，或制成注射剂等制剂皮下、肌肉内、腹腔内或静脉内注射，或制成栓剂等制剂直肠内给药，或制成喷雾剂等制剂喷雾至口腔或呼吸道粘膜，或制成软膏或贴剂等制剂涂布或贴附于患部(如皮肤或粘膜等)非经口给药。
乳剂和糖浆剂等液体制剂可使用水、蔗糖、山梨糖醇、果糖等糖类，聚乙二醇、丙二醇等二醇类，麻油、橄榄油、豆油等油类，对羟基苯甲酸酯类等防腐剂，草莓、薄荷等香精等作为添加剂而制得。胶囊剂、片剂、散剂、颗粒剂等可使用乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露糖醇等赋形剂，淀粉、褐藻酸钠等崩解剂，硬脂酸镁、滑石粉等润滑剂，聚乙烯醇、羟丙纤维素、明胶等粘合剂，脂肪酸酯等表面活性剂，甘油等增塑剂等作为添加剂而制得。
注射剂例如可使用盐溶液、葡萄糖溶液或它们的混合物作为载体而制得。栓剂例如可使用可可脂、氢化脂肪或羟酸等作为载体而制得。喷雾剂例如可使用乳糖、甘油等作为不刺激使用者口腔和呼吸道粘膜、且将有效成分分散成微细粒子而易于吸收的载体而制得，制剂品种有气溶胶、干粉等。
可使用1种或2种以上常用作制剂原材料的各种有机或无机载体作为药理学中许可的载体配制制剂。具体可列举水、药理学中许可的有机溶剂、胶原、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧乙烯基聚合物、褐藻酸钠、水溶性葡聚糖、羧甲基淀粉钠、果胶、黄原胶、阿拉伯胶、酷蛋白、明胶、琼脂、甘油、丙二醇、聚乙二醇、凡士林、石蜡、硬脂醇、硬脂酸、人血清白蛋白、甘露糖醇、山梨糖醇、乳糖等。
作为制剂时使用的添加剂，固体制剂中例如可用赋形剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂，液体制剂中例如可使用溶剂、助溶剂、悬浮剂、等渗剂、缓冲剂、无痛化剂等。根据需要还可用防腐剂、抗氧剂、着色剂、甜味剂、填充剂、增量剂、增湿剂、表面活性剂、稳定剂、杀菌剂、螯合剂、pH调节剂、表面活性剂等制剂添加剂。这些添加剂可根据制剂的单位剂型等适当选择。这些添加剂中较好是选择通常制剂中使用的成分，例如稳定剂、杀菌剂、缓冲剂、等渗剂、螯合剂、pH调节剂、表面活性剂等。
添加剂的具体例子列举如下。
稳定剂人血清白蛋白；甘氨酸、半胱氨酸、谷氨酸等L-氨基酸；葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖等单糖类；甘露糖醇、肌醇、木糖醇等糖醇；蔗糖、麦芽糖、乳糖等二糖类；葡聚糖、羟丙基淀粉、硫酸软骨素、透明质酸等多糖类及其衍生物等糖类；甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙甲纤维素、羧甲纤维素钠等纤维素衍生物等。
表面活性剂聚氧乙二醇脱水山梨醇烷基酯、聚氧乙烯烷基醚类、脱水山梨醇单酰基酯类、脂肪酸甘油酯类等表面活性剂。
缓冲剂硼酸、磷酸、乙酸、柠檬酸、ε-氨基己酸、谷氨酸及它们的盐(如钠盐、钾盐、钙盐、镁盐等碱金属盐或碱土金属盐)。
等渗剂氯化钠、氯化钾、糖类、甘油等。
螯合剂依地酸钠、柠檬酸等。
制剂中通式(1)表示的化合物或其药理学中许可的盐(有效成分)的含有率可在1～90重量％之间变动。例如，在选择片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂等剂型时，有效成分较好含有5～80重量％。采用糖浆剂等液体制剂时，较好含有有效成分1～30重量％。采用非经口给药的注射剂时，较好含有有效成分1～10重量％。
通式(1)表示的化合物或其药理学中许可的盐的制剂化，可使用赋形剂(乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇等糖类，马铃薯、小麦、玉米等淀粉，碳酸钙、硫酸钙、碳酸氢钠等无机物，结晶纤维素等)、粘合剂(淀粉糊、阿拉伯胶、明胶、褐藻酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、羟丙纤维素、羟甲纤维素等)、润滑剂(硬脂酸镁、滑石粉、加氢植物油、聚乙二醇、硅油)、崩解剂(淀粉、琼脂、明胶粉末、结晶纤维素、CMC·Na、CMC·Ca、碳酸钙、碳酸氢钠、褐藻酸钠等)、矫味剂(乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇、芳香精油类等)、溶剂(注射用水、灭菌精制水、麻油、豆油、玉米油、橄榄油、棉籽油等)、稳定剂(氮、二氧化碳等惰性气体，EDTA、巯基乙酸等螯合剂，亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠、L-抗坏血酸、雕白粉等还原性物质等)、防腐剂(对羟苯甲酸酯、氯丁醇、苄醇、酚、苯扎氯铵等)、表面活性剂(加氢蓖麻油、吐温80、20等)、缓冲剂(柠檬酸、乙酸、磷酸的钠盐、硼酸等)、稀释剂等，采用公知的方法进行。
以下详细说明本发明的实施例。以下说明中，如无特别指明，均采用下列标准实验手册记载的方法或其经修饰或改良的方法J.Sambrook，E.F.Fritsch&T.Maniatis(Ed.)，Molecular cloning，a laboratory manual(3rdedition)，Cold SpringHarbor Press，Cold Spring Harbor，New York(2001)；F.M.Ausubel，R.Brent，R.E.Kingston，D.D.Moore，J.G Seidman，J.A.Smith，K.Struhl(Ed.)，CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons Ltd.。在使用市售的试剂盒和测定装置时，如无特别指明，均使用它们所附说明书的方法。
以下实施例所用的式(1a)表示的化合物(DHMEQ)按WO 01/12588 A1的实施例1～5记载的方法制得。以下有时将式(1a)表示的化合物称为“DHM2EQ”，将式(1b)表示的化合物称为“DHM3EQ”。
(实施例1)用凝胶移位试验(Gel shift assay；电泳迁移率变动分析(Electrophoreticmobility shift assay(EMSA)))考察NF-κB的活化，对HUVECs(在日本庆应医院用脐带配制)，DHMEQ 3μg/ml能完全抑制TNF-α(Techne)、IL-1β(PEPROTECH EC LTD)、LPS(Sigma)引起的NF-κB活化。图2显示以TNF-o刺激HUVECs时，DHMEQ对NF-κB活化的抑制作用。实验方法如下。
如下所述，用DHMEQ对HUVECs进行预处理。即添加以甲醇稀释的DHMEQ，其加入量为培养液量的1％量，使其在HUVECs培养液中的浓度达到数据显示的浓度，于37℃、5％CO2中培养2小时。
对DHMEQ进行了2小时预处理的HUVECs以及未处理的HUVECs，分别用10ng/ml TNF-α、10ng/ml IL-1β、10μg/ml LPS刺激(即添加至各培养液中，于37℃、5％CO2中培养数据所示的时间(0、5、10、30分钟))，采集细胞试样。收集的细胞以400μl的缓冲液A(10mM HEPES(Sigma)pH 7.9、1.5mMDTT(Merch)、0.1mM PMSF(Sigma)悬浮，静置15分钟后，以15000×g离心5分钟，除去上清液。再加400μl缓冲液A，以15000×g离心5分钟，除去上清液。然后，加40μl缓冲液C(20mM HEPESpH 7.9、25％甘油(关东化学)、420mMNaCl(关东化学)、1.5mM MgCl2(关东化学)、0.2mM DTT、0.2mM PMSF)，用手指轻叩，使细胞悬浮，静置20分钟后，以1500×g离心5分钟，回收上清液，将其作为核提取物。加4μl以下的合成寡核苷酸(Promega)、2μl的[γ-32P]-ATP(Amersham)、2μl的10×T4PNK缓冲液(0.5M Tris-HCl(Sigma)pH 7.6、0.1mM MgCl2、50mM DTT、1mM亚精胺·HCl(Sigma)、1mM EDTA(关东化学))，加蒸馏水至全量为18μl。再加10单位/μl的T4多聚核苷酸激酶(Takara)2μl，使其在37℃反应10分钟。反应后，加TE缓冲液(10mM Tris-HClpH 7.5、1mM EDTA)80μl终止反应。将其用Nick柱(Amersham)精制，得到以32P标记的NF-κB探针。
合成寡核苷酸5’-AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C-3’(序列编号1)3’-TCA ACT CCC CTG AAA GGG TCC G-5’(序列编号2)然后，加5×结合缓冲液(375mM NaCl、75mM Tris-HClpH7.0、7.5mMEDTA、7.5mM DTT、37.5％甘油、1.5％NP-40(ナカラィテスク)、0.5μg/mlBSA(Sigma)4μl、调整至1μg/μl的poly dI-dC(Amersham)1μl和5μg一份的核提取物，加蒸馏水至全量为17μl。在超移位(Super Shift)用的试样中再加抗p65抗体(Santa Cruz)0.5μg一份。在其中加以32P标记的NF-κB探针3μl，于25℃培养30分钟。其后，在预先通电流1小时的4％聚丙烯酰胺凝胶(6.7mM丙烯酰胺(30/2；和光)、1.25ml 10×TBE缓冲液(0.9M Tris-硼酸(关东化学)pH 8.3、20mM EDTA)、42ml H2O、500μl APS(过氧化硫酸铵；关东化学)、50μl TEMED(关东化学))的孔中加20μl该试样，以150V进行电泳。电泳后，将凝胶移至滤纸上，用凝胶干燥器干燥，让其使胶片感光。
(实施例2)用蛋白质印迹法(Western blotting)考察DHMEQ对TNF-α刺激时ICAM-1、VCAM-1、E-选择素(E-selectin)表达的影响，发现单用TNF-α时ICAM-1、VCAM-1的表达在刺激后9小时达到峰值，而E-选择素的表达在刺激后6小时达到峰值，但如图3所示，用DHMEQ预处理2小时的HUVECs可显著抑制所有这些粘着分子的表达。实验方法如下。
对DHMEQ预处理2小时的HUVECs和未处理的HUVECs分别以10ng/mlTNF-α刺激，采集细胞试样。在其中加裂解缓冲液(20mM Tris-HClpH8.0、150mM NaCl、2mM EDTA、100mM NaF(关东化学)、400mM Na3VO4(关东化学)、1％NP-40、1μg/ml亮抑蛋白酶肽(leupeptin；(财)微生物化学研究所)、1μg/ml抗蛋白酶(antipain；(财)微生物化学研究所)、1mM PMSF)，在冰上每5分钟搅拌1次，在30分钟内使其溶解，其后以15000×g离心10分钟，回收上清液。该上清液的蛋白质浓度以考马斯亮蓝液(Bio-Rad)定量，调整浓度后加3×SDS进样缓冲液(150mM Tris-HClpH6.8、30％甘油、3％SDS(关东化学)、0.03mg/ml溴酚蓝、150μl/ml 2-巯基乙醇(关东化学))，加入的量为所加的裂解缓冲液的一半，煮沸5分钟。将其作为试样，用12.5％聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。电泳后，将凝胶内的蛋白质转至PVDF膜(Amersham)上，用含5％脱脂乳(skim milk；雪印)的TBS缓冲液(20mM Tris-HClpH7.6、137mM NaCl)封闭。然后用ICAM-1(Santa Cruz)、VCAM-1(Santa Cruz)、E-选择素(Santa Cruz)各自的抗体，使PVDF膜与抗体反应，再与各自适合的二次抗体(ICAM-1、VCAM-1及E-选择素的二次抗体(Amersham及Santa Cruz))反应。然后用ECL法显色，使胶片感光。
(实施例3)如图4所示，将白细胞(用实验者的血液配制)、HL-60细胞(由细胞库购入)一起用TNF-α刺激，3、6、9小时后的细胞粘附数依赖时间而增加，但以DHMEQ3μg/ml处理使其粘附显著受抑。该浓度的DHMEQ对HUVECs既不显示毒性，也不显示增殖抑制。实验方法如下。
在24孔板的每孔中加入HUVECs，培养至铺满。培养基的组成为9.8g/L培养基199(ニッスィ供应)、1.8g/L NaHCO3(Wako)、10ml/L 1M Hepes缓冲液(Sigma)、30mg/L ECGS(Becton Dickinson)、6ml/L肝素钠注射液(武田药品)、10％热灭活的FBS(JRH)。其后进行以下实验。经DHMEQ预处理2小时的HUVECs与未处理的HUVECs分别以10ng/ml TNF-α刺激，评价刺激后0、3、6、9小时的白细胞和人急性早幼粒细胞性白血病株HL-60细胞对HUVECs的粘附。这次，使用比重离心分离法分离的单核细胞作为白细胞。
用TNF-α刺激后，各孔用HBSS+(ニッスィ提供)洗涤2次，用500μl培养基(培养基组成9.8g/L培养基199(ニッスィ供应)、1.8g/L NaHCO3(Wako)、10ml/L 1M Hepes缓冲液(Sigma)、30mg/LECGS(Becton Dickinson)、6ml/L肝素钠注射液(武田药品)、10％热灭活的FBS(JRH))进行培养基交换，加入孔中，使白细胞浓度为2.5×105细胞/孔、HL-60细胞为7×104细胞/孔。于5％CO2、37℃培养1小时，其后用HBSS+缓和洗涤3次，将该状态拍照，计数与HUVECs粘附的细胞。
如上所述，可以认为DHMEQ能不显示毒性和增殖抑制地抑制NF-κB活化，也能抑制HUVECs与白细胞和白血病细胞的粘附，所以在实验和临床中能长期使用，非常有用。
(实施例4)DHM2EQ对成人T细胞白血病淋巴瘤(ATL)细胞的组成型NF-κB活化的抑制作用(1)凝胶移位试验用以下方法探讨存在于细胞核内的转录因子是否结合于启动子的具有特定碱基序列的部位。
2×106个ATL细胞株(MT-1、TL-0ml)和对照细胞株(K562、Jurkat+TNF)用10μg/ml的DHM2EQ处理12小时，从各细胞株获得核提取液。再从未经DHM2EQ处理的各细胞株得到同样的核提取液。细胞株MT-1和TL-0ml是用HTLV-1转化的细胞株，这些细胞株的NF-κB已活化。细胞株K562(髓细胞系的白血病细胞株)是未测出组成型NF-κB的细胞株(阴性对照)、Jurkat+TNF是经TNF处理的Jurkat细胞株(阳性对照)。
用[γ-32P]-ATP和多聚核苷酸激酶(PNK)对NF-κB共有序列寡聚体(Promega)进行未端标记，制作32P标记的NF-κB探针。
用20μl的体积混合相当于2μg蛋白质的量的核提取液和相当于10000cpm的NF-κB探针，在室温反应30分钟。在7.5％聚丙烯酰胺凝胶中让反应后的溶液电泳，凝胶干燥后，用X射线使胶片感光。
结果如图5所示。图中左边6个泳道中，“-”表示未经DHM2EQ处理的结果，“+”表示经DHM2EQ处理的结果。右边2个泳道的阳性对照中的“-”和“+”，如右边所表示的那样，“comp”表示非标记探针竞争抑制(“+”是在竞争分子存在下的实验)的结果，表明信号在NF-κB结合序列中具特异性。
如图5所示，经DHM2EQ处理，ATL细胞株(MT-1、TL-0ml)的NF-κB信号几乎消失。另一方面，K562则未观察到NF-κB的活化。
(2)报道基团试验(荧光素酶试验)为了研究NF-κB的转录活性，将重复具有6拷贝NF-κKB结合序列的人工启动子启动的荧光素酶构建物(6kB-Luc质粒)作为报道基团，将该质粒DNA一过性导入ATL细胞株(MT-1，TL-0ml)及对照细胞株(K562)(用DMRIE-C(INVITROGEN)以2×105个细胞/转染的规模转染)。自12小时后开始，用5μg/ml的DHM2EQ进行处理，在48小时后回收细胞，将NF-κB的转录活性作为荧光素酶活性进行评价。对未经DHM2EQ处理的各细胞株也同样进行评价。所有实验进行3次，算出平均值和标准偏差。
结果以图6表示。图中“-”和“+”分别表示未经DHM2EQ处理的结果和经过DHM2EQ处理的结果。
如图6所示，ATL细胞株(MT-1、TL-0ml)经DHM2EQ处理，荧光素酶活性约被抑制50％，认为DHM2EQ对ATL细胞株的NF-κB转录活性具抑制作用。另一方面，阴性对照细胞株(K562)中未发现荧光素酶活性。
(3)共焦点显微镜解析据认为DHN2EQ能抑制NF-κB的亚单位p65向核移行。因此，以10μg/ml的DHM2EQ处理ATL细胞株(MT-1、TL-0ml)24小时，使用荧光标记的抗p65抗体，以共焦点显微镜考察p65的分布。对未经DHM2EQ处理的各细胞株也同样进行了考察。
结果如图7所示。图中“-”和“+”分别表示未经DHM2EQ处理的结果和经DHM2EQ处理的结果。
如图7所示，ATL细胞株(MT-1、TL-0ml)核中黑色消失，经DHM2EQ处理显示p65向核的移行受到抑制。
由上述(1)～(3)的结果可确认，DHM2EQ能抑制ATL细胞的组成型NF-κB活化。
(实施例5)DHM2EQ对ATL细胞增殖的抑制作用(1)DHM2EQ的增殖抑制作用的浓度依赖性解析在96孔板上分别接种ATL细胞株(MT-1、TL-0ml)及对照细胞株(K562)的细胞，1×105个/孔，加DHM2EQ至最终目标浓度分别为2、5、10μg/ml。用只加等体积溶剂DMSO的孔(0μg/ml)作为对照。培养72小时后，用MTT试验法测定细胞的生存率。相对MTT值(Relative MTT value)按DHM2EQ处理细胞的MTT值对DHM2EQ未处理细胞的MTT值之比，即(DHM2EQ处理细胞的MTT值/DHM2EQ未处理细胞的MTT值)×100(％)求得。
结果以图8表示。图中的□表示K526的结果，▲表示TL-0ml的结果，■表示MT-1的结果。
如图8所示，ATL细胞株(MT-1、TL-0ml)的细胞增殖与DHM2EQ的添加浓度成比例地受抑制，而对照细胞株(K562)的细胞增殖几乎未受抑制。
(2)DHM2EQ的增殖抑制作用的经时解析在ATL细胞株(MT-1、TL-0ml)及对照细胞株(K562)中添加DHM2EQ，使最终浓度为10μg/ml，进行12、24、48、72小时培养，用MTT试验法考察增殖抑制作用。用只加等体积溶剂DMSO的孔作对照。与上述(1)同样求得相对MTT值。
如果如图9所示。图中□、▲、■分别表示K562、TL-0ml、MT-1的结果。
如图9所示，ATL细胞株(MT-1、TL-0ml)的细胞增殖随DHM2EQ处理时间成比例地受到抑制，而对照细胞株(K562)的细胞增殖几乎未受抑制。
(3)DHM2EQ对ATL患者未梢血细胞增殖的抑制作用自ATL患者未梢血分离单核细胞，再分离出ATL细胞。对3例患者分离的ATL细胞添加DHM2EQ使最终浓度为10μg/ml，进行24小时培养，用MTT试验法考察增殖抑制作用。用只加等体积溶剂DMSO的试样作为对照，通过DHM2EQ处理细胞的MTT值对DHM2EQ未处理细胞的MTT值之比，即(DHM2EQ处理细胞的MTT值/DHM2EQ未处理细胞的MTT值)，评价增殖抑制作用。
结果于图10表示。
如图10所示，可确认DHM2EQ对任一ATL患者所得的ATL细胞均显示增殖抑制作用。
(4)DHM2EQ对正常未梢血单核细胞的增殖抑制作用自正常未梢血分离单核细胞，添加DHM2EQ使最终浓度为2、5、10μg/ml，进行72小时培养，用MTT试验法考察增殖抑制作用。用只加等体积溶剂DMSO的试样(0μg/ml)作对照。以对照(DHM2EQ未处理)的MTT值为100％，按与该值的比表示细胞生存率(cell viability)。
结果于图11表示。
如图11所示，DHM2EQ对正常未梢血单核细胞几乎不显示增殖抑制作用。
由上述(1)～(4)的结果确认DHM2EQ抑制ATL细胞的增殖，而不抑制正常细胞的增殖。
(实施例6)DHM2EQ对ATL细胞凋亡的诱导作用在ATL细胞株(MT-1、TL-0ml)及对照细胞株(K562)中添加DHM2EQ，使最终浓度达10μg/ml，进行72小时培养后，经染色，用荧光显微镜观察核的浓缩或断裂，进行凋亡的考察。对只加等体积溶剂DMSO的试样也进行同样考察。
结果于图12表示。图中“-”表示未经DHM2EQ处理(仅加DMSO)的结果，“+”表示DHM2EQ处理的结果。
如图12所示，经DHM2EQ处理可诱导ATL细胞株(MT-1、TL-0ml)凋亡，观察到核断裂，而未经DHM2EQ处理的细胞及对照细胞株(K562)未观察到凋亡。
由这一结果确认，DHM2EQ诱导ATL细胞的凋亡，但并不诱导正常细胞的凋亡。
(实施例7)DHM2EQ对何杰金淋巴瘤细胞增殖的抑制作用与实施例2同样进行DHM2EQ对何杰金淋巴瘤细胞增殖的抑制作用的经时解析及浓度依赖性解析。作为何杰金淋巴瘤细胞，采用何杰金淋巴瘤细胞株KMH-2及L540。
结果用图13表示。图中■、○、●分别表示K562、KMH-2、L-540的结果。
如图13所示，DHM2EQ与添加浓度成比例地抑制何杰金淋巴瘤细胞株(KMH-2、L-540)的细胞增殖，而对对照细胞株(K562)的细胞增殖几乎无抑制作用。并且DHM2EQ与处理时间成比例地抑制何杰金淋巴瘤细胞株(KMH-2、L-540)的细胞增殖，而对对照细胞株(K562)则几乎不经时地抑制细胞增殖。
由这些结果确认，DMH2EQ抑制NF-κB组成型活化的何杰金淋巴瘤细胞的增殖，而对NF-κB未活化的对照细胞的增殖无抑制作用。
(实施例8)DHM2EQ对多发性骨髓瘤细胞增殖的抑制作用与实施例2同样进行DHM2EQ对多发性骨髓瘤细胞增殖抑制作用的浓度依赖性解析。作为多发性骨髓瘤细胞采用多发性骨髓瘤细胞株196TIB。
结果示于图14。图中，“-”表示未经DHM2EQ处理的结果，“+”表示经DHM2EQ处理的结果。
如图14所示，DHM2EQ与添加浓度成比例地抑制多发性骨髓瘤细胞株(196TIB)的细胞增殖。
由上述结果确认，DHM2EQ抑制多发性骨髓瘤细胞的增殖。
(实施例9)DHMEQ抑制MCF-7细胞的NF-κB与DNA结合的作用1、方法1-1核提取物的制备以MCF-7细胞(牛津大学Adrian L.Harris教授分给)接种2个平皿，每个60ml平皿接种4ml，浓度为1×105细胞/ml。次日，将60mm平皿中的培养基合并2ml，用配制成1、3、10μg/ml的DHMEQ处理2小时后，以20ng/ml的TNF-α进行处理。TNF-α处理30分钟后将60mm平皿中的培养基用吸管抽去，细胞用外用PBS-洗涤2次，加1ml冷PBS-，用橡皮头细胞刮棒刮下细胞(2次)，加入15ml离心管中，2个60mm平皿收集的细胞置15ml离心管中，以1000rpm离心5分钟，除去上清液。在其中加入冷PBS-700μl，吸移细胞后收集在1.5mlEppendorf离心管(2次)，以3500rpm离心5分钟，除去上清液。以下操作在冰中进行。悬浮于缓冲液A(10mM HEPESpH 7.9，1.5mM DTT，0.2mMPMSF)400μl中，旋涡搅拌后静置15分钟，以13000rpm离心5分钟除去上清液。在每一管中加缓冲液A400μl，以13000rpm离心5分钟，除去上清液。然后，将收集的核悬浮于40μl缓冲液C(20mM HEPES-KOHpH 7.9、25％甘油、420mM NaCl、1.5mM MgCl2、0.2mM EDTA、0.5mM DTT、0.2mM PMSF)，静置20分钟后，以13000rpm离心5分钟，将上清液回收于ェッペン中，作为核提取物。
1-2探针的制备将4μl的1.75pmol/μl寡核苷酸(PromegaMadison，MA)、2μl的10×T4 PNK缓冲液(500mM Tris-HClpH8.0、100mM MgCl2、50mM DTT)及10μl的蒸馏水混合，再加2μl的[γ-32P]-ATP、2μl的T4 PNK，于37℃培养10分钟，然后加80μl的TE缓冲液(10mM Tris-HClpH 8.0、1mM EDTA)，使反应停止。
然后，将Nick柱安装在架上，在柱下放置废液瓶，除去上下的空隙，将已填充该柱的TE缓冲液回收至废液瓶。将约3ml的蒸馏水沿壁加至柱上，在废液瓶中回收。这时将100μl标记的DNA溶液不沿壁而加到柱上。在下面准备1.5ml的Eppendorf离心管，柱上加入400μl蒸馏水，回收流出的溶液至Eppendorf离心管中(级分1)。下面准备新的Eppendorf离心管，再在柱上加入400μl蒸馏水，在Eppendorf离心管中回收流出的溶液(级分2＝标记的寡核苷酸)。滴定结束时，压紧空隙，分别用盖格计数器测定柱和级分1、级分2。确认级分2＞柱＞级分1。
使用时，精制的标记DNA探针用蒸馏水稀释到约3×104cpm/μl。
DNA探针的碱基序列如下。
5’-ATGTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3’(序列编号3，J.Biol.Chem.277，24625-24630，2002)。
1-3结合反应及凝胶电泳在5×结合缓冲液(375mM NaCl，75mM Tris-HClpH 7.0，7.5mM EDTA，7.5mM DTT，37.5％甘油，1.5％NP-40，1.25mg/ml BSA)4μl、1μg/ml poly dI-dc(Amersham Pharmacia Biotech，Inc)1μl、核提取物含蛋白量5μg的一份中，加水至总量为17μl。向其加3μl的DNA探针，混和后于25℃培养20分钟。其后将20μl反应液移至含4％聚丙烯酰胺凝胶的孔中，用0.25×TBE缓冲液，在150V电泳。电泳后将凝胶干燥，使胶片感光。
2、结果未经DHMEQ处理的对照细胞以TNF-α处理30分钟后，观察到显示NF-κB与DNA结合的电泳带，而经DHMEQ处理的细胞，NF-κB与DNA的结合受到浓度依赖性地抑制，以10μg/ml的浓度能完全抑制NF-κB与DNA的结合(图15)。
因此，DHMEQ对TNF-α诱导的NF-κB活化显示抑制作用。
(实施例10)DHMEQ对乳腺癌细胞的体外抗肿瘤作用在DHMEQ为10、50μg/ml时对人乳腺癌细胞株MCF-7(NF-κB并不经常活化的肿瘤)培养24、48、72小时，考察增殖抑制作用，与对照比较，以10μg/ml的浓度在24小时时有39％细胞生存，在48、72小时分别有25％和17％的细胞生存，以50μg/ml的浓度在24小时后未发现有生存的细胞(图16)。这说明细胞增殖的抑制具有浓度及时间依赖性。
从以上实验结果确认，DHMEQ能时间依赖性地抑制癌细胞的增殖，但短时间内以较高浓度诱导凋亡的作用也少，可见具有与抗癌药不同的机理。这就暗示可使用DHMEQ作为体内副作用少的药物。
详细实验方法如下。
将MCF-7接种于6孔板，浓度为1×105/孔，次日将上清液换成DHMEQ为10、50μg/ml的培养基(5ml)以及仅含与不同浓度的DHMEQ等量的DMSO(用于溶解DHMEQ)的对照培养基(5ml)。每组用3孔试验。将此时作为0时间，培养24、48、72小时后用胰蛋白酶+EDTA剥离细胞，用台盼蓝计数细胞，算出平均值和标准偏差。分别与仅含DMSO的对照细胞比较，得出数据并标绘曲线。
(实施例11)DHMEQ对人乳腺癌细胞的体内抗肿瘤作用对SCID小鼠(日本クレァ)皮下肿瘤模型给予4mg/kg的DHMEQ，每周3日，测定经时肿瘤体积，考察肿瘤增殖抑制作用。同时测定小鼠体重。结果发现具有显著的肿瘤增殖抑制作用(图17)。未见小鼠死亡和体重减轻。
详细实验方法如下。
在6周龄的SCID小鼠背部皮下接种悬浮于PBS 100μl中的1×106个MCF-7细胞。将DHMEQ悬浮于0.5％甲基纤维素液(甲基纤维素ナカラィテスク)200μl，使剂量为4mg/kg。于MCF-7接种的次日起腹腔内给予含药物的悬浮液或0.5％甲基纤维素液200μl，每周3次(每组8只)。每7日以游标卡尺测定肿瘤的长径和短径，用(长径)×(短径)2/2算出肿瘤体积。同时测定体重。
在已有的乳腺癌治疗剂的动物实验中，所谓的抗癌药其肿瘤增殖抑制作用有许多数据。与具有类似机理的药物比较本药的有效性时，使用近年阐明其抑制肿瘤增殖的有效性的抗炎药COX-2抑制剂较为适当。尚未见COX-2抑制剂对MCF-7有效的报道，但跟其它与MCF-7同样常用的癌细胞的增殖抑制作用(图18对路易斯肺癌、HT-29显示COX-2抑制剂塞来考昔(celecoxib；Pharmacia)的有效性)相比较，可得出至少有同等以上的效果的结论。实验方法如下(Cancer Res.，60，1306-1311，March 1，2000)。在C57/B16小鼠的后肢接种路易斯肺癌106个细胞，对于自接种日开始给予分别混合有塞来考昔(G.D.Searle/Monsanto Co.提供)160、480、1600、3200ppm的饲料的组(n＝20/组)，用体积描记器(Plethysmometer)测定肿瘤体积，每周2次。在裸小鼠后肢接种HT-29人大肠癌细胞株106个细胞，在肿瘤体积达到100mm3时开始口服160ppm，每周测定1次。数据为平均值+SD。
由上述可知，DHMEQ具有不依赖凋亡的强抗肿瘤作用，且暗示其副作用低。因此，也可知DHMEQ不仅对乳腺癌原发灶的增殖抑制、对癌从原发灶向其它组织转移有效，对于抑制预后的乳腺癌转移、预防乳腺癌也有效。
目前，唯一使用的乳腺癌预防药是抗雌激素剂他莫昔芬(tamoxifen；AstraZeneca)(北美获承认，日本未确认其有用性，使用未获承认)。他莫昔芬的作用机理在于与雌激素受体结合，拮抗、抑制女性激素雌激素的结合。因此，他莫昔芬的癌症预防效果仅限于具激素敏感性的乳腺癌。不能预防激素非敏感性乳腺癌的发生。而且，他莫昔芬有引发子宫体癌的副作用。在激素疗法药物以外，还没有药物显示其抑制乳腺癌发生的作用。本药物与以前具有强细胞抑制作用的药物具有不同的机理。因此今后可能用于癌的预防。而且，本药引起NF-κB失活，也在COX-2级联的上游抑制与NF-κB同样成为炎症中心的介质COX-2的产生。
结论1)本发明的药物的毒性极低，所以具有与抗癌药等完全不同的优点。
2)其抗癌谱与仅以激素敏感性癌为对象的激素疗法有很大不同。因此从临床上考虑，新颖性极高。
3)此外，从最近引入注目的乳腺癌的化学预防的观点来看，作为有新的机理的药物是有希望的。
(实施例12)毒性试验如下进行DHMEQ的急性毒性试验。将DHMEQ溶于10％DMSO的盐水+吐温80l滴，腹腔给予ICR小鼠，观察24小时后小鼠的生死及状态。其结果是，给予0.156、0.313、0.625、1.25、2.5mg/小鼠时生存，5mg/小鼠当日死亡。当日死亡的小鼠解剖见脏器有沈着、少量腹水。5mg/小鼠约相当于250mg/kg。算出急性毒性LD50为187.5mg/kg。
(实施例13)为测定通式(1)表示的化合物或其药理学中许可的盐对恶病质的效果，使用诱发恶病质的BALB/C裸小鼠作为人恶病质患者的模型小鼠。这时使用雄激素非敏感性人前列腺癌细胞株JCA-1诱发恶病质症状。
为测定DHMEQ抑制NF-κB活性的作用，以NF-κB转录活性为指标，测定对应于不同浓度的DHMEQ的NF-κB活性。报道基因使用具有NF-κB结合序列的重复6拷贝的启动子的下游有荧光素酶基因作报道基因的载体构建物(p6kb-Luc)。用GenePOETER(商标；Gene Therapy Systems)将此报道基因质粒转染至JCA-1细胞。转染14小时后，在细胞培养基中添加2.5、5、10、20、40μg/ml的DHMEQ，再培养8小时，回收细胞，测定荧光素酶活性。作为对照，采用不进行任何处理的细胞，以及仅用不含DHMEQ的溶剂(这里是DMSO)处理的细胞，同时进行实验。测定各荧光素酶活性，将其绝对值按其杀细胞率标准化后表示。所有实验独立进行3次，算出平均值和标准偏差。结果表示于图19。
由图19可见，细胞内的NF-κB活性，如果给予的DHMEQ浓度越高，则抑制作用越明显。由此可知，DHMEQ能浓度依赖性地抑制JCA-1细胞的NF-κB活性。
(实施例14)为了测定DHMEQ对恶病质症状的效果，用上述裸小鼠制作恶病质模型小鼠。在6周龄裸小鼠胁腹皮下接种悬浮于PBS100μl中的1×107个JCA-1细胞(以下称带癌小鼠)。经接种的小鼠于接种14日后，在可触诊的部位肿瘤增大的时候，随机分成3组，第2组(Gr2；13只)每日给予8mg/kg体重的DHMEQ，第3组(Gr3；13只)每日给予DMSO，第4组(Gr4；11只)什么都不给予。将未接种JCA-1细胞的正常裸小鼠作为第1组(Gr1；14只)(以下称正常小鼠)。在给予DHMEQ的次日起，每日测定体重(图20)和由肿瘤直径算出的肿瘤重量(图21)。开始给予DHMEQ的第26日，将所有小鼠解剖，测定肿瘤重量(图22)、睾丸周围的脂肪重量(图23)、腓肠肌重量(图24)、血细胞比容(图25；血中细胞成分对全血量的容积比，可将血液离心而测定)，将每组测定值合计。
实验结果如下所述。首先，给予8mg/kg体重的DHMEQ组(Gr2)，相对于非给药组(Gr3，Gr4)，其体重减少显著受抑(图20)。但是，上述浓度的DHMEQ未观察到肿瘤消退的效果(图21、图22)。实验结束时(DHMEQ给药开始后第26日)的测定中，DHMEQ给药组(Gr2)的睾丸周围的脂肪重量(图23)和腓肠肌重量(图24)，相对于非给药组(Gr3、Gr4)，重量的减少显著受抑。DHMEQ给药组(Gr2)的血细胞比容值相对于非给药组(Gr3、Gr4)也有显著的恢复倾向。实验结束时测定各组的各脏器重量，进行比较考察，确认给予DHMEQ对各脏器未见不良影响(图26)。
如上所述，观察到通过对接种JCA-1细胞而引发癌、引起恶病质症状的小鼠给予DHMEQ，即使在对所患癌的大小和重量不产生影响的浓度，也能缓和和抑制恶病质症状。
(实施例15)DHMEQ对多发性骨髓瘤(MM)细胞株组成型NF-κB活化的抑制作用用10μg/ml的DHMEQ对2×106个MM细胞株KMM1、RPMI8226、U266的细胞处理12小时，配制各细胞株的核提取液，用与实施例4的(1)同样的方法进行凝胶移位试验，考察DHMEQ的NF-κB抑制作用。结果表明，经DHMEQ处理，MM细胞株的NF-κB信号消失(图27的A)。将经TNF处理的Jurkat(Jurkat+TNF)用作阳性对照。图中的“comp”是非标记探针的竞争抑制实验的结果，表明信号对于NF-κB结合序列具有特异性。
其次，以10μg/ml的DHMEQ处理MM细胞株KMM1、RPMI8226、U266，配制各细胞株的核提取液，用与实施例4的(1)同样的方法进行凝胶移位试验，探讨不同时间的NF-κB抑制作用。其结果示于图27的B。由此可确认，DHMEQ处理后1小时，NF-κB活化大体上受抑制，在16小时时，NF-κB的活化抑制仍然持续。
其次用报道基因试验研究NF-κB的活性抑制作用。首先，将6kB-Luc质粒DNA经转染引入MM细胞株KMM1、RPMI8226、U266(用DMRIE-C(INVITROGEN)以2×105个细胞/转染的规模进行转染)。12小时后开始用5μg/ml的DHMEQ进行12小时处理，探讨DHMEQ的NF-κB转录抑制作用。其结果示于图27的C。由此可知，DHMEQ处理的MT-1及TL-0ml与未处理组相比，NF-κB的转录约被抑制50％。因此DHMEQ显示NF-κB的转录抑制作用。
(实施例16)DHMEQ对多发性骨髓瘤(MM)细胞株的增殖抑制作用为了考察DHMEQ浓度对细胞增殖抑制的影响，用MM细胞株KMM1、RPMI8226、U266根据与实施例5的(1)同样的方法，判定细胞生存率。其结果示于图28的A。图中的横轴表示DHMEQ的浓度，纵轴表示经处理的细胞的MTT值对DHMEQ未处理细胞的MTT值的相对值，即(DHMEQ处理/未处理)×100％。由图28的A可见，DHMEQ与浓度成比例地抑制细胞株KMM1、RPMI8226、U266的细胞增殖。
其次，为了考察DHMEQ在不同时间对增殖抑制的影响，用MM细胞株KMM1、RPMI8226、U266，按与实施例5的(2)同样的方法，用MTT试验法观察不同时间地增殖抑制作用。其结果示于图28的B。图中的横轴表示DHMEQ的浓度，纵轴表示DHMEQ处理细胞对未处理细胞的MTT值的相对值，即(DHMEQ/未处理)×100％。由图28的B可知，DHMEQ对MM细胞株KMM1、RPMI8226、U266细胞增殖的抑制作用与处理时间成比例。
为了考察DHMEQ对MM细胞株凋亡的诱导，以10μg/ml浓度培养MM细胞株KMM1、RPMI8226、U266，分别用时0、24、48小时，经膜联蛋白V染色考察调亡。其结果示于图28。由此可知经DHMEQ处理，MM细胞株KMM1、RPMI8226、U266生成膜联蛋白V阳性细胞，说明DHMEQ能诱导凋亡。
此外，为了确认DHMEQ诱导MM细胞株的凋亡，用10μg/ml的浓度对MM细胞株KMM1、RPMI8226、U266培养72小时，经ヘキスト染色，用荧光显微镜观察核的浓缩或断裂，考察其凋亡。结果示于图28的D。观察到MM细胞株KMM1、RPMI8226、U266经DHMEQ处理后的核断裂的图象。由以上结果可确认，DHMEQ诱导ATL细胞的凋亡。
(实施例17)DHMEQ对多发性骨髓瘤(MM)患者细胞的增殖抑制作用其次，为了考察DHMEQ对多发性骨髓瘤(MM)患者细胞的增殖抑制作用，从患者骨髓分离MM细胞(MM1、MM2、MM3)，在DHMEQ浓度为10μg/ml时培养48小时，用MTT试验法考察增殖抑制作用。其结果示于图29的A。从正常末梢血分离单核细胞(PBMC)用作对照。图中纵轴表示DHMEQ处理细胞的MTT值对未处理细胞的相对值，即(DHMEQ处理/未处理)×100％。如图29的A所示，自多发性骨髓瘤(MM)患者分离的MM细胞的增殖受DHMEQ抑制，并与浓度成比例，而自正常末梢血分离的单核细胞几乎不受影响。
由此可见，DHMEQ对MM患者的MM细胞具有增殖抑制活性，而对正常单核细胞几乎无作用，可作为副作用少的医药组合物发挥作用。
为了考察DHMEQ对多发性骨髓瘤(MM)患者细胞的凋亡的诱导作用，对多发性骨髓瘤(MM)患者的细胞在DHMEQ浓度10μg/ml时培养72小时，进行ヘキスト染色，用荧光显微镜观察核的浓缩或断裂，考察细胞的凋亡。其结果示于图29的B。如图29的B所示，确认多发性骨髓瘤(MM)患者的MM细胞经DHMEQ处理，其凋亡被诱导，核发生断裂。
(实施例18)DHMEQ对何杰金淋巴瘤(HL)细胞株组成型NF-κB活化的抑制作用用10μg/ml的DHMEQ对2×106个HL细胞株KMH2、L428、L540、HDLM2的细胞和对照细胞株K562进行12小时的处理，从各细胞株得到核提取液，用与实施例4的(1)同样的方法进行凝胶移位试验，考察NF-κB的抑制作用。其结果表明DHMEQ使HL细胞株的NF-κB信号几乎消失(图30的A)。细胞株K562(髓细胞系的白血病细胞株)是未发现NF-κB组成型活化的细胞株，用作阴性对照。另一方面，经TNF处理的Jurkat(Jurkat+TNF)用作阳性对照。图中的“comp”表示使用非标记探针的竞争抑制实验，信号对NF-κB结合序列具特异性。
其次，用10μg/ml的DHMEQ处理HL细胞株KMH2、L540，从各细胞株得到核提取液，用与实施例4的(1)同样的方法进行凝胶移位试验，考察不同时间的NF-κB抑制作用。结果确认，处理后1小时NF-κB的活化大体上受抑制，NF-κB的活化抑制在16小时时仍然持续(图30的B)。
NF-κB是由p50、p65、c-Rel的各组成因子构成的复合体。因此对HL细胞株KMH2、L428、L-540、HDLM2中经组成型活化的NF-κB的组成因子进行考察。与实验1记载的方法同样，使用抗NF-κB的p50、p65、c-Rel的抗体进行超移位。结果示于图30的C。如图30的C所示，观察到特别是p50存在超移位，可以确认在所有的HL细胞株中有p50存在于复合体中。
在L428和KMH2中经DHMEQ处理后仍残存弱信号。因此考察了这些信号是否具有对DHMEQ有抗性的NF-κB的特异性组成因子。此外，用5μg/ml的DHMEQ处理HL细胞株KMH2、L428、L-540、HDLM2 12小时，用抗NF-κB的p50、p65、c-Rel的抗体，与实施例1记载的方法同样地对残存的NF-κB的成分进行超移位。其结果示于图30的D。如图30的D所示，残存的成分主要是p50，得到与图30的C同样的结果，认为不存在对DHMEQ显示抗性的特殊组成因子。
(实施例19)DHMEQ对抗肿瘤药的作用的增强效果用喜树碱(CPT)、柔红霉素(DNR)、依托泊甙(ETP)作为抗肿瘤药，考察DHMEQ对抗肿瘤药的作用的增强效果。抗肿瘤药作用及其增强效果按实施例5的(2)所记载的MTT试验法考察。其结果示于图31。本实施例中，使用KMH2细胞。图中的横轴表示各抗肿瘤药的浓度及DHMEQ浓度。将每一抗癌药的浓度分3阶段，对它们分别按只用DHMEQ、只用抗肿瘤药、两者并用进行考察。DHMEQ使用10μg/ml的浓度，处理时间为48小时。纵轴表示处理细胞相对于未处理细胞的MTT值的相对值，即(处理/未处理)×100％。图31的A用喜树碱(CPT)作为抗肿瘤药，B用柔红霉素(DNR)作抗癌药，C用依托泊甙(ETP)作抗肿瘤药。结果表明对所有抗肿瘤药，DHMEQ均显示对抗肿瘤药效果的增强作用。
(实施例20)DHMEQ的抗肿瘤药作用的增强效果起因于抑制抗肿瘤药的NF-κB活化为了考察各抗肿瘤药处理引起的NF-κB活化，以各抗肿瘤药(喜树碱(CPT)、柔红霉素(DNR)、依托泊苷(ETP))处理肿瘤细胞时的NF-κB活化通过实施例4的(1)记载的凝胶移位试验进行测定。其结果示于图32的A。在本实施例中，细胞采用KMH2。图中各图下方将所得的信号定量化，表示处理前作为1时的相对值。如图32的A所示，用任一种抗肿瘤药进行处理时，与处理前的活性比较，肿瘤细胞中NF-κB活性一过性地达到3至20倍。
为了考察肿瘤细胞中经喜树碱(CPT)和柔红霉素(DNR)诱导的NF-κB的组成因子，与实施例1记载的方法同样，用抗NF-κB的p50、p65、c-Rel的抗体进行超移位。其结果示于图32的B。如图32的B所示，可知经喜树碱(CPT)或柔红霉素(DNR)处理的肿瘤细胞中活化的NF-κB主要含有p50。
其次，为了研究DHMEQ对抗肿瘤药引起的NF-κB活化的抑制作用，测定了各抗肿瘤药(喜树碱(CPT)、柔红霉素(DNR))与DHMEQ并用，处理肿瘤细胞时的NF-κB的诱导，进行实施例4的(1)记载的凝胶移位试验，考察不同时间对NF-κB的抑制作用。其结果示于图32的C。在本实施例中，细胞用KMH2。图中在各图下方将所得信号定量化，表示以处理前作为1时的相对值。如图32的C所示，用任一种抗肿瘤药进行处理，并用DHMEQ均强烈抑制NF-κB的诱导。
(实施例21)用腹腔内接种了ATL细胞株的SCID小鼠，考察DHMEQ在体内的效果。先对SCID(Male C.B17-scid/scid scid/scid)小鼠(CB17系统、5周龄，雄性；SLCJapan，Inc(Shizuoka，Japan))以1mg的IL-2受体抗体(TM-β1；J.Immunol、1472222-2228，1991)处理3～5日，在腹腔内接种3-4×107个ATL细胞株MT-2细胞。其后，这些小鼠在1个月内每周腹腔内给予3次溶解于0.5％CMC(羧甲纤维素；Sigma)液的DHMEQ 4mg/kg体重或12mg/kg体重，观察生存率及小鼠的状态。对照组同样在1个月内每周3次腹腔内给予不含DHMEQ的0.5％CMC液。其结果示于图33。生存曲线按Kaplan-Myer法计算，用Cox-Mantel检验判定统计学显著性。如图33所示，DHMEQ 4mg/kg组(DHMEQ(+))在实验开始后约200日，6只中有4只生存，而对照组(DHMEQ(-))的5只全部死亡，统计学上差异显著(Cox-Mantel检验；p＜0.05)。而DHMEQ 12mg/kg给药组(DHMEQ(+))，于实验开始后约30日6只中有5只生存，而非给药组(DHMEQ(-))5只中有4只死亡，统计学上差异显著(Cox-Mantel检验；p＜0.05)。且给药组(DHMEQ(+))小鼠体重等未见异常，使用DHMEQ 4mg/kg的3倍剂量也未见毒性。结果表明，DHMEQ在体内可挽救移值ATL细胞的小鼠个体免于死亡。
(实施例22)并用DHMEQ与射线照射时的协同作用考察DHMEQ在体外对人胰腺癌的肿瘤细胞增殖抑制作用。在SCID小鼠(7只)的右背部皮下接种2×106的人胰腺癌细胞株PK-2，每日腹腔内注射(i.p.)DHMEQ 12mg/kg 200μl，共5日。其后，每7日测定肿瘤的长径和短径，用(长径)×(短径)2×0.5算出肿瘤体积。其结果示于图34。如图34所示，可知使用DHMEQ可显著抑制肿瘤细胞的增殖。
其次，考察DHMEQ对经射线照射的肿瘤细胞的凋亡的增强作用。对用6小时给予DHMEQ 10μg/ml的人胰腺癌细胞株Colo357、照射20Gy的射线并经培养6小时的人胰腺癌细胞株Colo357、照射20Gy射线后立即以6小时给予DHMEQ 10μg/ml的人胰腺癌细胞株Colo357，分别以膜联蛋白-V和PI(碘化丙锭)双重染色，用流式细胞计量术测定处于凋亡初期阶段的细胞(右下)，算出其比率。其结果示于图35。如图35所示，单用DHMEQ对人胰腺癌细胞株Colo357不诱导凋亡。与此相反，以20Gy射线照射后给予DHMEQ的细胞，与单用20Gy射线进行照射的细胞相比，可见诱导凋亡的能力约增强3倍。
还考察了DHMEQ与放射并用对人胰腺癌细胞株的体外增殖的抑制作用。将5×105的人胰腺癌细胞株Panc-1、PK-8、Colo357接种于10cm平皿，于2日后以2.5Gy或10Gy的射线照射，然后并用组给予10μg/ml的DHMEQ，历时4小时，24小时后对细胞进行计数。将射线照射结束后或添加药物时的时间作为0时间。其结果示于图36。根据该图，仅与药物DHMEQ接触4小时，对人胰腺癌细胞株PK-8、Colo357有充分的增殖抑制作用，其效果相当于2.5Gy的射线照射。对放射有抗性且单用DHMEQ无效的Panc-1，并用射线照射和DHMEQ，对各自治疗的抗性均消失。对于Colo357和Panc-1，DHMEQ与射线照射并用显示协同的增殖抑制作用，2.5Gy的照射效果增加到相当于4倍的10Gy。
产业上利用的可能性本发明可以提供能改善NF-κB活化所伴的症状的医药组合物。
序列表<110>学校法人庆应义塾(KEIO UNIVERSITY)<120>含NF-κB抑制剂的医药组合物<130>PCT/628<150>JP 02/185866<151>2002-06-26<150>JP 03/37167<151>2003-02-14<160>3<170>PatentIn版本3.1<210>1<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>发明人梅泽一夫发明人川合阳子发明人堀江良一发明人渡边俊树发明人户井雅和发明人松本岳发明人堀口裕发明人中岛淳<220>
<223>合成DNA<400>1agttgagggg actttcccag gc 22<210>2<211>22<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>合成DNA<400>2tcaactcccc tgaaagggtc cg 22<210>3<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成DNA<400>3atgtgagggg actttcccag gc 2权利要求
1.医药组合物，其特征在于，含有用于改善肿瘤细胞所致的至少1种症状的由下列通式(1)表示的化合物或其药理学中许可的盐作为有效成分， 式中，R1为氢原子或C2-4的烷酰基，R2为下式(A)～(G)中的任一个表示的基团， 式中，R3表示C1-4的烷基。
2.如权利要求1所述的医药组合物，其特征还在于，通过上述肿瘤细胞的凋亡而改善至少1种症状。
3.如权利要求1所述的医药组合物，其特征还在于，不通过上述肿瘤细胞的凋亡而改善由上述肿瘤细胞引起的至少1种症状。
4.如权利要求3所述的医药组合物，其特征还在于，通过抑制NF-κB的活化而改善由上述肿瘤细胞引起的至少1种症状。
5.如权利要求3所述的医药组合物，其特征还在于，上述症状为肿瘤转移。
6.如权利要求5所述的医药组合物，其特征还在于，通过抑制与血管内皮细胞的粘附而改善肿瘤转移。
7.如权利要求1所述的医药组合物，其特征还在于，通过抑制上述肿瘤细胞的增殖而改善由上述肿瘤细胞引起的至少1种症状。
8.如权利要求1所述的医药组合物，其特征还在于，上述症状是选自何杰金病、癌恶病质、白血病的症状。
9.如权利要求3所述的医药组合物，其特征还在于，上述肿瘤细胞是乳腺癌细胞。
10.如权利要求1所述的医药组合物，其特征还在于，上述化合物为下式(1a)或(1b)。
11.如权利要求8所述的医药组合物，其特征还在于，预防或改善作为上述癌恶病质的症状的体重减少、血细胞比容值降低、脂肪减少和肌肉减少中的至少1种症状。
12.如权利要求3所述的医药组合物，其特征还在于，通过抑制上述肿瘤细胞形成的肿瘤内的血管新生而改善上述肿瘤细胞引起的至少1种症状。
13.医药组合物，其特征在于，含有下列通式(1)表示的化合物或其药理学中许可的盐作为有效成分，该有效成分通过抑制活化NF-κB的治疗引起的NF-κB的上述活化可增加上述治疗的效果， 式中，R1为氢原子或C2-4的烷酰基，R2为下式(A)～(G)中的任一个表示的基团， 式中，R3表示C1～4的烷基。
14.如权利要求13所述的医药组合物，其特征还在于，上述活化NF-κB的治疗是使用抗肿瘤药进行的治疗。
15.如权利要求13所述的医药组合物，其特征还在于，上述活化NF-κB的治疗是对肿瘤细胞使用射线进行照射的治疗。
16.如权利要求14所述的医药组合物，其特征还在于，含有上述抗肿瘤药作为有效成分。
17.如权利要求14所述的医药组合物，其特征还在于，上述抗肿瘤药是喜树碱或柔红霉素。
18.如权利要求13所述的医药组合物，其特征还在于，上述化合物为下式(1a)或(1b)。
19.用于抑制肿瘤细胞的增殖的肿瘤细胞增殖抑制剂，其特征在于，含有下列通式(1)表示的化合物或其药理学中许可的盐作为有效成分， 式中，R1为氢原子或C2～4的烷酰基，R2为下式(A)～(G)中的任一个表示的基团， 式中，R3表示C1～4的烷基。
20.如权利要求19所述的肿瘤细胞增殖抑制剂，其特征还在于，上述化合物为下式(1a)或(1b)。
21.用于抑制血管内皮细胞的粘着分子的表达的粘着分子表达抑制剂，其特征在于，含有下列通式(1)表示的化合物或其药理学中许可的盐作为有效成分， 式中，R1为氢原子或C2～4的烷酰基，R2为下式(A)～(G)中的任一个表示的基团， 式中，R3表示C1～4的烷基。
22.如权利要求21所述的来自血管内皮细胞的粘着分子表达抑制剂，其特征还在于，上述化合物为下式(1a)或(1b)。
23.用于诱导肿瘤细胞的凋亡的凋亡诱导剂，其特征在于，含有下述通式(1)表示的化合物或其药理学中许可的盐作为有效成分， 式中，R1为氢原子或C2～4的烷酰基，R2为下式(A)～(G)中的任一个表示的基团， 式中，R3表示C1～4的烷基。
24.如权利要求23所述的凋亡诱导剂，其特征还在于，上述化合物为下式(1a)或(1b)。
25.动脉硬化的预防·治疗剂，其特征在于，含有具有NF-κB抑制作用的化合物作为有效成分。
26.如权利要求25所述的预防·治疗剂，其特征还在于，具有NF-κB抑制作用的化合物是下列通式(1)表示的化合物或其药理学中许可的盐， 式中，R1为氢原子或C2～4的烷酰基，R2是下式(A)～(G)中的任一个表示的基团， 式中，R3表示C1～4的烷基。
27.癌的预防·治疗剂，其特征在于，含有具有NF-κB抑制作用的化合物作为有效成分。
28.如权利要求27所述的预防·治疗剂，其特征还在于，具有NF-κB抑制作用的化合物是下列通式(1)表示的化合物或其药理学中许可的盐， 式中，R1为氢原子或C2～4的烷酰基，R2为下式(A)～(G)中的任一个表示的基团， 式中，R3表示C1～4的烷基。
29.如权利要求27所述的预防·治疗剂，其特征还在于，用于抑制癌的转移。
30.恶病质的治疗剂，其特征在于，含有下列通式(1)表示的化合物或其药理学中许可的盐作为有效成分， 式中，R1为氢原子或C2～4的烷酰基，R2为下式(A)～(G)中的任一个表示的基团， 式中，R3表示C1～4的烷基。
31.如权利要求30所述的恶病质的治疗剂，其特征还在于，上述化合物为下式(1a)或(1b)。
32.如权利要求30所述的恶病质的治疗剂，其特征还在于，所述治疗剂为肿瘤患者的癌恶病质的治疗剂。
33.如权利要求30所述的恶病质的治疗剂，其特征还在于，预防或改善作为肿瘤患者的癌恶病质的症状的体重减少、血细胞比容值降低、脂肪减少和肌肉减少中的至少1种症状。
34.恶病质的治疗剂，其特征在于，包含具有NF-κB抑制作用的化合物作为有效成分。
35.治疗方法，其特征在于，使用用于改善肿瘤细胞所致的至少1种症状的由下述通式(1)表示的化合物或其药理学中许可的盐， 式中，R1为氢原子或C2～4的烷酰基，R2为下式(A)～(G)中的任一个表示的基团， 式中，R3表示C1～4的烷基。
36.如权利要求35所述的治疗方法，其特征还在于，通过上述肿瘤细胞的凋亡而改善至少1种症状。
37.如权利要求35所述的治疗方法，其特征还在于，不通过上述肿瘤细胞的凋亡而改善上述肿瘤细胞引起的至少1种症状。
38.如权利要求35所述的治疗方法，其特征还在于，通过抑制NF-κB的活化而改善上述肿瘤细胞引起的至少1种症状。
39.如权利要求35所述的治疗方法，其特征还在于，上述症状是选自因肿瘤转移、上述肿瘤细胞的增殖而引起的症状，何杰金病，癌恶病质的症状。
40.如权利要求35所述的治疗方法，其特征还在于，上述化合物为下式(1a)或(1b)。
41.治疗方法，其特征在于，使用下列通式(1)表示的化合物或其药理学中许可的盐，通过抑制血管内皮细胞与白细胞的粘附而改善动脉硬化， 式中，R1为氢原子或C2～4的烷酰基，R2为下式(A)～(G)中的任一个表示的基团， 式中，R3表示C1～4的烷基。
42.如权利要求41所述的治疗方法，其特征还在于，上述化合物为下式(1a)或(1b)。
43.治疗方法，其特征在于，包括进行活化NF-κB的治疗的步骤，以及给予含有以下述通式(1)表示的化合物或其药理学中许可的盐作为有效成分的医药组合物的步骤， 式中，R1为氢原子或C2～4的烷酰基，R2为下式(A)～(G)中的任一个表示的基团， 式中，R3表示C1～4的烷基。
44.如权利要求43所述的治疗方法，其特征还在于，上述活化NF-κB的治疗是给予抗肿瘤药的治疗。
45.如权利要求43所述的治疗方法，其特征还在于，上述活化NF-κB的治疗是对肿瘤细胞用射线进行照射的治疗。
46.如权利要求43所述的治疗方法，其特征还在于，上述化合物为下式(1a)或(1b)。
全文摘要
本发明提供了医药组合物，该组合物含有用于改善肿瘤细胞所致的症状的由通式(1)表示的化合物或其药理学中许可的盐作为有效成分，式中，R
文档编号A61P9/00GK1674881SQ0381497
公开日2005年9月28日 申请日期2003年6月26日 优先权日2002年6月26日
发明者梅泽一夫, 川合阳子, 堀江良一, 渡边俊树, 户井雅和, 松本岳, 堀口裕, 中岛淳 申请人:学校法人庆应义塾