专利名称：包含红细胞生成素的稳定的药物组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及稳定的包含红细胞生成素(EPO)的新型药物组合物。
EPO是一种控制哺乳动物红细胞形成的糖蛋白激素。其可以作为骨髓中的红细胞系祖细胞的生长和/或分化因子并且可以使其增殖和分化成红细胞。
背景技术：
天然存在的人EPO是由肾产生的并且是刺激血红细胞产生的体液血浆因子。其刺激骨髓中定向红细胞系祖细胞的分裂和分化。(Goldwasseret等人，J.Biol.Chem.，249，4202-4211，1974，Sherwoodet等人，Endocrinology，103，866-870，1978)。其是在成人的肾(Sherwood等人，Endocrinology，103，866-870，1978)和胎儿的肝(Zanjani等人，J.Lab.Clin.Med.，89，640-644，1977)中产生的。
将EPO的药物组合物给药于生物体可以刺激和/或加速红细胞的产生。EPO的药物组合物被用来治疗慢性肾衰、癌症化疗继发的贫血和与人免疫缺陷病毒感染的齐多夫定治疗有关的贫血及其它类型的贫血(Danna等人，临床应用中的红细胞生成素-国际展望。纽约，NYMarcel Dekker；301-324，1990；Eschbach in sod.，N.England J.of Med.，316，2，73-78，1987；Krane，Henry Ford Hosp.Med.J.，31，3，177-181，1983)。
人EPO基因在哺乳动物细胞中表达的产物——重组EPO被用于EPO药物组合物中(EP 148605，EP 205564，EP255231)。在现有技术中还对一些EPO类似物和衍生物进行了描述EP 640619、EP 668351、WO9412650、EP 1064951、WO 0232957、WO 9533057、US 5916773、WO09902710、US 5580853、US 5747446、US 5919758和US 6107272。
在EP 178665、EP 178576、US 5661125、WO 0061169中对包含人血清白蛋白的EPO药物组合物进行了描述。人血清白蛋白可能会造成变态反应(Stafford CT等人，Ann Allergy，61(2)，85-88，1988)。此外，当药物组合物包含人血液产品时还存在病毒感染的危险。因此，需要稳定并且不含人血液产品如白蛋白的EPO药物制剂。
EP 306824、EP 607156、EP 528313和EP 528314描述了用脲作为EPO稳定剂的药物组合物。
EP 306824、EP 178665、GB 2171304、EP 528314、EP 528313和EP1002547描述了EPO的冷冻干燥制剂。
US 5376632描述了一种使用α和β环糊精的药物制剂。
EP 607156、EP 528313和EP 178665描述了包含抗菌的防腐剂如苄醇、尼泊金酯类、苯酚类、以及其混合物的水性EPO药物组合物。
EP 909564、EP 528314、EP 430200和WO 0061169描述了氨基酸和/或氨基酸和非离子洗涤剂的组合作为稳定剂的应用。
WO 0187329描述了不同的聚乙二醇化的EPO类似物的药物组合物。所描述的药物组合物实际上是以硫酸盐缓冲剂的应用为基础的。
RU 2128517、WO 0061169、EP 528313、EP 607156、EP 528314、EP178665中所描述的一些药物组合物是在枸橼酸盐缓冲剂中进行制备的。
发明概述本发明的目的是提供一种能有益地稳定EPO的包含EPO的药物组合物。
本发明提供了一种如权利要求1所述的包含EPO的稳定的新型药物组合物。在从属权利要求中对优选的实施方案进行了叙述。本发明还提供了如权利要求21所述的方法和如权利要求22所述的应用。
本发明的药物组合物是用可药用的pH缓冲系统来进行制备的并且包含两种稳定剂的组合泊洛沙姆多元醇(氧化乙烯和氧化丙烯的共聚物)和多羟基醇。
本发明的组合物稳定了EPO，同时优选不含除EPO外的来源于人或动物的添加剂(例如血清蛋白)。该药物组合物还任选地包含等张调节剂和/或一种或多种可药用的赋形剂。本发明的药物组合物适用于人和兽药并且为适于给药的形式、尤其是适于胃肠外应用，例如肌内、皮下和/或静脉内应用的形式。在特别优选的实施方案中，本发明的药物组合物是液体，更优选地是水性液体形式。
图1表示在40℃(±2℃)下储存1个月后包含EPO的本发明样品和参照样品的SDS-PAGE分析。
图2表示在40℃(±2℃)下存储1个月与在冰箱中储存1个月相比包含EPO的参照样品的SDS-PAGE分析。
图3表示在40℃(±2℃)下存储1个月与在冰箱中储存1个月相比包含EPO的本发明样品和参照样品的SDS-PAGE分析。
图4表示在冰箱中储存10个星期时包含EPO的本发明样品和参照样品的SDS-PAGE分析。
图5表示在25℃(±2℃)下储存10个星期时包含EPO的本发明样品和参照样品的SDS-PAGE分析。
图6表示在40℃(±2℃)下储存1个月时(40)与将各样品在冰箱中储存1个月时(HL)本发明样品和参照样品的相对响应EPO-ELISA(％)。
图7表示在25℃(±2℃)下储存10个星期时(25)与将各样品在冰箱中储存10个星期时(HL)本发明样品和参照样品的相对响应EPO-ELISA(％)。
本发明以及优选实施方案的描述现已令人吃惊地发现，包含非离子表面活性剂泊洛沙姆多元醇(氧化乙烯和氧化丙烯的共聚物)和多羟基醇并且优选不含除EPO外的来源于人和/或动物的添加剂的药物组合物有益地稳定了EPO。
本发明提供了EPO的药物组合物，其包含
a.治疗有效量的EPO，b.可药用的pH缓冲系统，c.泊洛沙姆多元醇，和d.多羟基醇。
本发明还提供了一种除组分a-d外还任选地包含下面组分的EPO药物组合物e.等张调节剂和/或f.一种或多种其它可药用赋形剂。
本发明的组合物优选不含来源于人或动物的添加物。
术语‘红细胞生成素(EPO)’指的是具有引起骨髓细胞增加网织红细胞和血红细胞生产的体内生物学活性的蛋白，并且选自人EPO和下面所定义的衍生物以及类似物。
术语‘EPO的治疗有效量’指的是能够产生EPO的治疗作用的EPO量。
术语‘稳定剂’指的是对EPO具有稳定作用的可药用的赋形剂。
术语‘EPO的稳定性’指的是维持EPO的含量和维持EPO的生物学活性。EPO的稳定性特别是可受到下面过程的影响EPO吸附到容器壁上、EPO的变性或降解和形成聚集体例如EPO二聚物和/或EPO多聚体和/或更高分子量的类似分子。这些过程可能是由于样品与不同的条件相接触而发生的，例如高温、不适宜的容器、使用了错误的EPO稳定剂、光照、不适宜的储存方法和/或不适宜的分离过程。
术语“不含来源于人和/或动物的添加剂”是指不有意地向组合物中加入得自人和/或动物并且不同于EPO的添加剂，如血清白蛋白如HSA或BSA，或者如果它们在开始时存在于EPO制剂中的话，在EPO的纯化和/或分离过程中已经被分离或降低至不可避免的痕量水平，优选被降低至用标准的分析方法一般检测不到的水平。
已经令人吃惊地发现，在本发明组合物中所配制的EPO在高于冰箱温度的温度下(例如2-8℃)、尤其是在室温下(即低于25℃)并且甚至在更高的温度(例如40℃)下改善了其稳定性。这意味着该组合物可以不需要进行冷却地长期储存(在室温下储存10星期以上)，其活性不会显著降低并且不会显著降解。
虽然不会受到其限制，但本发明的药物组合物优选地由上述组分a.-d.，或任选地a.-e.、a.-d.加f.或a.-f.所组成。
在现有技术公知的一些药物组合物中，用非离子洗涤剂如聚山梨醇酯80作为EPO的稳定剂。使用泊洛沙姆多元醇(氧化乙烯和氧化丙烯的共聚物)和/或多羟基醇比使用聚山梨醇酯类物质有利，这是因为可以用凝胶过滤法作为测定EPO二聚物、EPO多聚体以及由EPO分子的聚集而产生的相关高分子量物质的分析方法。聚山梨醇酯类物质会与EPO二聚物一起被洗脱下来。因此，不能用凝胶过滤法作为包含聚山梨醇酯类物质的药物组合物中EPO二聚物的检测方法。因此，使用泊洛沙姆多元醇(氧化乙烯和氧化丙烯的共聚物)和多羟基醇的组合有助于更容易地检测EPO的稳定性、增加安全性和使得可以更容易地对EPO药物组合物的质量进行控制。
本发明的药物组合物优选地是一种液体并且特别是一种水性药物组合物。该类液体组合物可以不需要进行会降低EPO的生物学活性或甚至使其活性丧失的重建、稀释或另外的制备步骤地直接用于胃肠外应用如皮下、静脉内或肌内应用，并且还有助于避免应用时发生的其它技术问题。因此，使用液体药物组合物比使用冷冻干燥制剂更实用。对于EPO临床制剂的制备而言，与冷冻干燥制剂相比，一般优选液体并且特别是水性EPO制剂，这是因为冷冻干燥组合物的重建过程费时、有造成蛋白制剂不适当处理的风险、或者可能被不适当地重建，并且通常需要用某些添加剂如稳定剂来保留足够的药物活性。
本发明的药物组合物最优选不含来源于人或动物的添加剂如人血清蛋白(尽管进行了血液筛查，但是其仍然有被可传播物质感染的危险)。此外，虽然重组的EPO一般可以被很好地耐受，但是偶然会观察到皮疹和荨麻疹，这表明对于该EPO制剂的一些组分，如人血清白蛋白具有高过敏性。
本发明的药物组合物适宜地是在等渗溶液中制备的并且预期其是可药用的，不会造成副作用如超敏性。
不考虑EPO的生物学活性，也不考虑其合成或制造方法，本发明的药物组合物可以用于所有形式的EPO，包括EPOα、EPOβ、EPOω和具有不同同种型的其它EPO、以及特定的EPO同种型、EPO突变蛋白、EPO片断、EPO类似物如EPO二聚物、NESP(重组人EPO的高糖基化类似物)、基因活化的EPO、聚乙二醇化的EPO、含有EPO的杂种分子、EPO片断、含有EPO的融合蛋白(低聚物和多聚体)、具有改性的糖基化特性的EPO，所说的合成或制造方法非限制性地包括天然EPO和重组EPO(由cDNA或者基因组DNA制造的)的分离、合成、转基因和基因活化法。
本发明药物组合物的每个剂量可以包含500至100000单位或更多的EPO(1IU相当于约10纳克重组EPO)。一般而言，认为有效量为1至500IU/kg体重，并且更优选地为50至300IU/kg体重，当将EPO皮下给药时尤其如此。所说的有效量还进一步取决于被治疗个体的种属和大小、被治疗的特定情况或疾病以及其严重程度和给药途径。在优选的实施方案中，将药物量制备成每个剂量提供选自约1000IU、约2000IU、约3000IU、约4000IU、约10000IU、约20000IU、约25000IU、约40000IU、约50000IU、约60000IU和约100000IU的量。
本发明的药物组合物可以被填充到安瓿、注射器、多剂量药筒和小瓶中。这使得其可以以每个剂量0.2至20ml的适宜体积进行应用。
该溶液的优选pH范围为约6至约8，更优选为约6.8至约7.5，并且最优选为约7.0。优选使用磷酸盐缓冲剂系统，尤其是磷酸氢二钠和磷酸二氢钠如NaH2PO4×2H2O/Na2HPO4×2H2O。用于维持约6至约8的理想pH范围的其它适宜缓冲剂系统非限制性地包括枸橼酸钠/枸橼酸、醋酸钠/醋酸、和任何其它现有技术中已知的可药用pH缓冲剂。枸橼酸盐缓冲剂可能会造成注射部位疼痛。因此，对于胃肠外应用更优选磷酸盐缓冲剂。
pH缓冲剂系统、尤其是磷酸盐缓冲剂的浓度取决于制剂的所需pH。优选的浓度范围为10至50mM，更优选为15至35mM，最优选地为15至25mM。可以加入pH-调节剂，例如但不限于HCl、NaOH、枸橼酸或枸橼酸钠。
本发明的药物组合物包含非离子表面活性物质泊洛沙姆多元醇和多羟基醇的组合。在泊洛沙姆多元醇中，优选使用Pluronic F68。优选泊洛沙姆多元醇的浓度为至1％(m/v)的范围，更优选为0.05％(m/v)至0.5％(m/v)，最优选为0.1％(m/v)。所说的多羟基醇选自甘油、山梨醇、甘露醇、木糖醇等等。其中，优选使用山梨醇和甘油，最优选使用甘油。多羟基醇的优选浓度为0.1％(m/v)至10％(m/v)，更优选为0.5％(m/v)至6％(m/v)，最优选为1％至3％(m/v)。
本发明的药物组合物还任选地包含能使本发明的制剂与人的血液等渗的物质。典型的适宜等张调节剂在现有技术中是众所周知的，并且非限制性地包括选自甘露醇、甘氨酸、葡萄糖和无机盐如NaCl、CaCl2的物质。优选用NaCl作为本发明制剂的等张调节剂。
虽然如上所述的那样优选使用泊洛沙姆多元醇(氧化乙烯和氧化丙烯的共聚物)和多羟基醇的组合作为EPO稳定剂的制剂，本发明的药物制剂除上述组分a.、b.和如果需要的话任选的组分e.和f.外还可以任选地包含一种以上类型的稳定剂。
这种另外的EPO稳定剂优选选自表面活性剂如甘醇酯和甘油酯、聚乙二醇酯和醚、脱水山梨醇衍生物/聚山梨醇酯类物质(例如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80)和聚合物(PVP)。其中，聚合物浓度优选为1％。最优选的是浓度为0.5％的聚合物PVP K12。
本发明的药物组合物还任选地包含一种或多种可药用的赋形剂。适宜的可药用赋形剂包括聚乙二醇、羟丙基纤维素、甲基纤维素、和氨基酸如甘氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-谷氨酸、L-2-苯丙氨酸、L-苏氨酸。
本发明的组合物可用于制备治疗和/或预防EPO适用的疾病的药物。医学应用的实例包括其中需要刺激血红细胞(RBC)增殖、存在内源性激素不足、失血或患者具有贫血的指征、或者骨髓对内源性激素响应能力低下的各种治疗。这些医学适应症有例如恶性疾病(即任何类型的实体癌，或血液癌，包括白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤)的贫血、由恶性疾病的化疗/放疗导致的贫血、慢性疾病(包括例如自身免疫性疾病如类风湿性关节炎和肝炎)的贫血、AIDS患者，尤其是这些用AZT治疗的患者的贫血、早产儿贫血、与(慢性)肾衰有关的贫血、地中海贫血、自身免疫性溶血性贫血、再生障碍性贫血、和与手术(用于改善用于自体输血的手术前献血以刺激和增加血红蛋白水平以对抗大量失血或增加骨髓移植个体红细胞生成水平)、疲劳、疼痛、慢性心衰、节律障碍或痴呆的治疗有关的贫血、用来降低非血管和非心脏手术同种异体输血需要的手术前应用以及EPO适用的其它适应症。
用下面的实施例来对本发明进行说明，但是并不是要用其对本发明进行限制。
实施例分析方法用下面的分析方法来对本发明的药物组合物进行分析使用免疫检测的SDS-PAGE、分子排阻色谱法(SEC)、EPO-ELISA和使用小鼠进行的体内生物学活性试验。
使用免疫检测的SDS-PAGE加载的样品是用不含还原剂的加载缓冲液制备的。使用垂直的SDS-PAGE凝胶NuPAGE Bis-Tris 12％，8×8cm，1.0mm厚，在MOPS SDS电泳缓冲液(Invitrogen)中15个泳道(Invitrogen)。电泳在200V的恒定电压下进行1小时。在从该凝胶电迁移到硝酸纤维素膜后，分两步进行免疫检测。在第一步中使用一级抗体(抗-huEPO，小鼠，单克隆)。在第二步中，使用轭合到辣根过氧化物酶上的二级抗体(抗-小鼠IgG，兔，多克隆)。加入过氧化物酶底物引发了形成蓝色复合物的酶反应。
EPO-ELISASystem EPO-ELISA Quantikine IVD，R&D Systems是以双抗体夹心法为基础的。用预涂了对EPO具有特异性的单克隆(鼠科动物)抗体的微量滴定板孔来对样品或标准品进行培养。EPO结合到该板上所固定的抗体上。在除去样品或标准品后，将该孔用与辣根过氧化物酶轭合的抗-EPO多克隆(兔)抗体培养。在第二次培养期间，该抗体-酶轭合物结合到被固定的EPO上。向这些孔中加入色原并通过酶反应对其进行氧化从而形成一种蓝色复合物。所产生颜色的量直接与结合成EPO抗体复合物的轭合物的量成比例，而轭合物的量又直接与样品或标准品中EPO的量成比例。
SEC用SEC来确定得自FP1至FP8的EPO含量为2000IU/ml至10000IU/ml的样品中EPO二聚物和相关高分子量物质的比例。使用欧洲药典方案的极限试验(欧洲药典2002，第4版，红细胞生成素浓溶液)。
体内生物学活性使用欧洲药典中所述的缺氧小鼠进行的体内生物学活性测定方案。生物学活性的估算也是根据欧洲药典的方案进行的(欧洲药典-1997；生物学分析和试验结果的统计分析；平行线模型)。根据欧洲药典的要求，所估算的生物活性值应当在所标活性的80％至120％之间。该方法的目标是所注射的EPO含量(值)(10000IU/ml)达到80％至120％之间并且所得的结果代表了生物学活性的估计值而不是其精确值。置信限应当在标示活性64％至156％之间的范围内。
对EPO药物组合物的稳定性进行试验的条件HL-参照2至8℃，冰箱40 40℃±2℃，75％±5％相对湿度，恒温恒湿箱25 25℃±2℃，60％±5％相对湿度，恒温恒湿箱实施例1稳定性试验制备下面的制剂组合物FP1至FP8FP1聚山梨醇酯80(0.03％(重量/体积(w/v)))，甘氨酸(0.5％(w/v))，磷酸盐缓冲剂(20mmol/l)，NaCl(100mmol/l)FP2甘氨酸(0.5％(w/v))，甘油(1.4％(w/v))，磷酸盐缓冲剂(32mmol/l)FP3甘氨酸(0.5％(w/v))，Pluronic F68(0.1％(w/v))，磷酸盐缓冲剂(20mmol/l)，NaCl(90.6mmol/l)FP4山梨醇(4.5％(w/v))，Pluronic F68(0.1％(w/v))，磷酸盐缓冲剂(20mmol/l)FP5葡聚糖70(1％(w/v))，NaCl(123mmol/l)，磷酸盐缓冲剂(20mmol/l)FP6甘油(2％(w/v))，Pluronic F 68(0.1％(w/v))，NaCl(17.1mmol/l)磷酸盐缓冲剂(20mmol/l)FP7甘油(2％(w/v))，PVP K12(0.5％(w/v))，磷酸盐缓冲剂(20mmol/l)FP8PVP K12(0.5％(w/v))，NaCl(123mmol/l)，磷酸盐缓冲剂(20mmol/l)如下所述的那样，制剂中的EPO含量被设定为2000IU/ml或10000IU/ml。
将各自EPO含量为10000IU/ml的样品FP1至FP8在40℃(±2℃)下储存1个月(40)。用在40℃(±2℃)下储存了1个月的磷酸盐缓冲液中的EPO原药作为阳性对照(PK)用于测定EPO二聚物的含量。将该样品进行SDS-PAGE分析；各泳道的样品装载量为0.4μg。图1显示了其结果。
图1的图例说明泳道 样品1 空泳道2 预着色的SDS-PAGE MW标准品，低程，Bio-Rad，4μl装载量3 空泳道4 EPO-BRP(欧洲药典的EPO标准品)5 FP1 40
6 FP2 407 FP3 408 FP4 409 FP5 4010FP6 4011FP7 4012FP8 4013PK14空泳道15预着色的SDS-PAGE MW标准品，低程，Bio-Rad，4μl装载量图2显示了在冰箱(HL)中和在40℃(±2℃)(40)下储存1个月的各自EPO含量为10000IU/ml的样品FP1至FP4的SDS-PAGE。用在40℃(±2℃)下储存了1个月的磷酸盐缓冲液中的EPO原药作为阳性对照(PK)用于测定EPO二聚物的含量。各泳道的样品装载量为0.4μg。
图2的图例说明泳道 样品1 空泳道2 预着色的SDS-PAGE MW标准品，低程，Bio-Rad，4μl装载量3 空泳道4 EPO-BRP(欧洲药典的EPO标准品)5 FP1 HL6 FP2 HL7 FP3 HL8 FP4 HL9 FP1 4010FP2 4011FP3 40
12FP4 4013PK14空泳道15预着色的SDS-PAGE MW标准品，低程，Bio-Rad，4μl装载量图3显示了在冰箱(HL)中和在40℃(±2℃)(40)下储存1个月的各自EPO含量为10000IU/ml的样品FP5至FP8的SDS-PAGE。用在40℃(±2℃)下储存了1个月的磷酸盐缓冲液中的EPO原药作为阳性对照(PK)用于测定EPO二聚物的含量。各泳道的样品装载量为0.4μg。
图3的图例说明泳道 样品1 空泳道2 预着色的SDS-PAGE MW标准品，低程，Bio-Rad，4μl装载量3 空泳道4 EPO-BRP(欧洲药典的EPO标准品)5 FP5 HL6 FP6 HL7 FP7 HL8 FP8 HL9 FP5 4010FP6 4011FP7 4012FP8 4013PK14空泳道15预着色的SDS-PAGE MW标准品，低程，Bio-Rad，4μl装载量图4显示了在冰箱(HL)中储存10个星期的各自EPO含量为10000IU/ml的样品FP1至FP8的SDS-PAGE。用在40℃(±2℃)下储存了1个月的磷酸盐缓冲液中的EPO原药作为阳性对照(PK)用于测定EPO二聚物的含量。各泳道的样品装载量为0.4μg。
图4的图例说明泳道 样品1 空泳道2 预着色的SDS-PAGE MW标准品，低程，Bio-Rad，4μl装载量3 空泳道4 EPO-BRP(欧洲药典的EPO标准品)5 FP1 HL6 FP2 HL7 FP3 HL8 FP4 HL9 FP5 HL10FP6 HL11FP7 HL12FP8 HL13PK14空泳道15预着色的SDS-PAGE MW标准品，低程，Bio-Rad，4μl装载量图5显示了在25℃(±2℃)下储存10个星期(25)的各自EPO含量为10000IU/ml的样品FP1至FP8的SDS-PAGE。用在40℃(±2℃)下储存了1个月的磷酸盐缓冲液中的EPO原药作为阳性对照(PK)用于测定EPO二聚物的含量。各泳道的样品装载量为0.4μg。
图5的图例说明泳道 样品1 空泳道
2 预着色的SDS-PAGE MW标准品，低程，Bio-Rad，4μl装载量3 空泳道4 EPO-BRP(欧洲药典的EPO标准品)5 FP1 256 FP2 257 FP3 258 FP4 259 FP5 2510FP6 2511FP7 2512FP8 2513PK14空泳道15预着色的SDS-PAGE MW标准品，低程，Bio-Rad，4μl装载量图6显示了相对于在冰箱中存储1个月(HL)的样品FP1至FP8而言，在40℃(±2℃)下存储1个月(40)的各自EPO含量为10000IU/ml的样品FP1至FP8的相对EPO-ELISA响应(％)。
图7显示了相对于在冰箱中存储10个星期(HL)的样品FP1至FP8而言，在25℃(±2℃)下存储10个星期(25)的各自EPO含量为10000IU/ml的样品FP1至FP8的相对EPO-ELISA响应(％)。
稳定性试验的结果使用免疫检测的SDS-PAGE表明在室温下，在本发明的药物组合物(FP6)中不会出现EPO聚集体例如EPO二聚物和相关的高分子量物质(图1-5)。在升高的温度下，它们以少量存在。将本发明的药物组合物与其中使用聚山梨醇酯类物质和氨基酸(甘氨酸)的组合的药物组合物FP1在升高的温度下(在40℃下一个月)的EPO稳定性进行比较(图1、2、3)，显示在FP1中形成了EPO二聚物。EPO二聚物的形成是EPO稳定性的重要因素之一。所测量到的EPO聚集体，例如EPO二聚物和相关的高分子量物质在使用后还可能造成不希望出现的副作用并且可能会使用该药物组合物进行治疗的患者感到不舒服。这些聚集体还可能引起有机体的免疫响应，从而使得必需停止用EPO进行的治疗。
在升高的温度下(40℃，1个月；图6)，与所制备的其它药物组合物(FP1-FP5、FP7、FP8)相比，本发明药物组合物(FP6)表现为当与其它制剂相比时，被吸附到FP6的小瓶上的EPO低于或等于其它制剂。在室温下，该吸附作用相当或更好(图7)。吸附到小瓶上的量增加将降低EPO的稳定性，从而将降低整体生物学活性。
在现有技术中已经用氨基酸作为制剂中EPO的稳定剂。但是，氨基酸并不是总能表现出稳定EPO的作用。在图6和7中，可以看出在室温(25℃下10个星期)和升高的温度下(40℃下1个月)，包含甘氨酸的药物组合物FP2和FP3的稳定性比不包含甘氨酸的药物制剂FP4、FP5、FP6和FP8的稳定性低，并且也比包含甘氨酸的FP1低。使用不同稳定剂的正确组合可以得到高EPO稳定性，但是并不能预见到其适宜的组合。通过本发明的药物组合物，令人吃惊地发现泊洛沙姆多元醇(氧化乙烯和氧化丙烯的共聚物)以及多羟基醇的组合稳定了EPO。
将用SEC测量的EPO二聚物和相关高分子量物质的比例与样品的稀溶液(浓度为2％)进行比较。该极限试验的结果如下面的表1所示表1
*表示由于安慰剂中的聚山梨醇酯类物质，不能测定二聚物的比例**表示由于葡聚糖，不能测定二聚物的比例。
在大多数样品中还检测到了少量高分子量的相关物质，但是在该表述中并没有包括该物质。
体内生物学活性是用在25℃下储存10个星期的EPO含量为10000IU/ml的样品FP6来测量的。所得结果如下面的表2所示表2
该结果表明所估算的生物学活性在所需范围内并且符合欧洲药典的要求。该置信限也在所需的范围内。
实施例2和3EPO药物组合物的组成在表3和4中分别叙述了本发明实施例2和3的组合物(以药物组合物形式存在)。
表3
表4
物质的品质Epoetin欧洲药典所要求的质量(欧洲药典质量)，Pluronic F68、山梨醇、甘油、NaCl、Na2HPO4×2H2O、NaH2PO4×2H2O、NaOH、注射用水欧洲药典质量。
包含EPO的药物组合物的制备含Pluronic F68的安慰剂溶液的制备在室温下，在磁力搅拌器上首先将缓冲剂(Na2HPO4×2H2O，NaH2PO4×2H2O)溶解于注射用水中，然后将NaCl、一种多元醇(甘油或山梨醇)溶解于其中，最后向其中加入稳定剂Pluronic F68。然后用1M NaOH将其pH调至7.0-7.1。得到一种澄清的无色溶液。
EPO溶液的制备将所计算体积的EPO溶液(是根据EPO活性来进行计算的)加入到安慰剂溶液中。就在这一步之前，取出相同体积的安慰剂溶液。用磁力搅拌器在低转速下对该溶液进行搅拌。得到一种澄清的无色溶液。
然后，将两种浓度的包含EPO的药物组合物溶液用使用孔径为0.2μm的PVDF(聚偏二氟乙烯)膜的膜滤器无菌过滤灭菌(空气洁净水平为100级)PVDF。将0.8ml滤液填充到2ml的进行了洗涤和灭菌的小瓶中(所说的小瓶是由无色的管状I型水解玻璃形成的)，用由溴丁基橡胶制成的弹性塞将其封闭，并用铝帽将其密封。
权利要求
1.一种稳定的红细胞生成素(EPO)药物组合物，其中所说的组合物包含a.治疗有效量的EPO，b.可药用的pH缓冲系统，c.泊洛沙姆多元醇，和d.多羟基醇。
2.如权利要求1所述的组合物，其中所说的组合物不含来源于人和/或动物的添加剂。
3.如权利要求1或2所述的组合物，其中所说的组合物还任选地包含e.等张调节剂和/或f.一种或多种可药用的赋形剂。
4.如权利要求1至3中任意一项所述的组合物，其中所说的组合物是水性的。
5.如权利要求1至4中任意一项所述的组合物，其中用药用量的EPO进行配制从而使得每个剂量提供的EPO量为约500至约100000IU EPO。
6.如权利要求5所述的组合物，其中所说的药用量被配制成每个剂量可以提供选自约1000IU、约2000IU、约3000IU、约4000IU、约10000IU、约20000IU、约25000IU、约40000IU、约50000IU、约60000IU和约100000IU量的EPO。
7.如权利要求1至6中任意一项所述的组合物，其中所说的pH缓冲系统提供了约6至约8的pH。
8.如权利要求7所述的组合物，其中所说的pH缓冲系统提供了约6.8至约7.5的pH。
9.如权利要求7所述的组合物，其中所说的pH缓冲系统提供了约7.0的pH。
10.如权利要求1至9中任意一项所述的组合物，其中所说的pH缓冲系统是磷酸盐缓冲剂。
11.如权利要求1至10中任意一项所述的组合物，其中所说的泊洛沙姆多元醇选自非离子表面活性剂。
12.如权利要求11所述的组合物，其中所说的泊洛沙姆多元醇是Pluronic F68。
13.如权利要求11所述的组合物，其中所说的泊洛沙姆多元醇的含量为约0.05％至约0.5％。
14.如权利要求11所述的组合物，其中所说的泊洛沙姆多元醇的浓度为约0.1％。
15.如权利要求1至14中任意一项所述的组合物，其中所说的多羟基醇选自甘油、山梨醇、甘露醇和/或木糖醇。
16.如权利要求15所述的组合物，其中所说的多羟基醇是甘油。
17.如权利要求15所述的组合物，其中所说多羟基醇的浓度为约0.1％至约10％。
18.如权利要求15所述的组合物，其中所说多羟基醇的浓度为约2％至约5％。
19.如权利要求1至18中任意一项所述的组合物，其中所说的等张调节剂选自无机盐。
20.如权利要求19所述的组合物，其中所说的等张调节剂是NaCl。
21.一种制备包含红细胞生成素(EPO)的组合物的方法，其包括将EPO与泊洛沙姆多元醇和多羟基醇进行混合，其中制备了如权利要求1至20中任意一项所述的组合物。
22.如权利要求1至20中任意一项所述的组合物在制备用于治疗和/或预防选自下述疾病的药物中的用途恶性疾病，即任何类型的实体癌、或包括白血病在内的血液病学癌、淋巴瘤和多发性骨髓瘤的贫血、由恶性疾病的化疗/放疗导致的贫血、慢性疾病，包括例如自身免疫性疾病如类风湿性关节炎和肝炎的贫血、AIDS患者，尤其是用AZT治疗的患者的贫血、早产儿贫血、与(慢性)肾衰有关的贫血、地中海贫血、自身免疫性溶血性贫血、再生障碍性贫血、与手术、疲劳、疼痛、慢性心衰、节律障碍或痴呆的治疗有关的贫血、用来降低非血管和非心脏手术同种异体输血需要的手术前应用。
全文摘要
本发明提供了一种用泊洛沙姆多元醇和多羟基醇的组合稳定的新型的稳定红细胞生成素(EPO)药物组合物。
文档编号A61K47/02GK1668333SQ03817007
公开日2005年9月14日 申请日期2003年7月14日 优先权日2002年7月17日
发明者A·武克米罗维奇, T·罗兹曼, J·斯韦泰克, A·帕里斯 申请人:力奇制药公司