专利名称：提高肿瘤组织内氧浓度的卟啉输氧剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及提高肿瘤组织内氧浓度的卟啉输氧剂，将其给药于长有肿瘤组织的哺乳动物可提高肿瘤组织含氧量低的部位内的氧分压。
背景技术：
活体内，红细胞内的血红蛋白负责氧运输。已报导了许多使用各种合成化合物来恢复氧-运输机能方面的研究，类似铁(II)原卟啉络合物的功能，其为用于血红蛋白的氧-结合袋。例如，早期的报道包括J.P.Collman，Acc.Chem.Res.，10，265(1977)，和F.Basolo，B.M.Hoffman，J.A.Ibers，同上，8，384(1975)。特别地，室温下可形成稳定氧络合物的已知的铁(II)卟啉络合物为5，10，15，20-四(α，α，α，α-o-特戊酰茚二酮-酰胺基苯基)卟啉铁(II)络合物(下文称作“FeTpivPP络合物”)(J.P.Collman等，J.Am.Chem.Soc.，97，1427(1975)。室温下，在轴向碱(如，1-烷基咪唑、1-烷基-2-甲基咪唑，或吡啶衍生物)存在下，在有机溶剂，如苯、甲苯、二氯甲烷、N，N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃等中，FeTpivPP络合物可以可逆地结合或释放氧分子。但是，如果意图将FeTpivPP络合物用于活体中，作为代替血红蛋白的、可显示出氧运输机能的人工载氧体(输氧剂)，则FeTpivPP络合物在生理条件下(即，在生理盐水中，pH7.4，温度＜40℃)必须具有结合或释放氧的能力。本发明者成功地发现了输氧剂，其通过有效利用氧配位点附近的微小的疏水环境，和FeTpivPP络合物在水中的溶解，即使在生理状态下也可以可逆地结合和释放氧，FeTpivPP络合物在水中的溶解可通过各种方法完成例如，将FeTpivPP络合物或其类似物嵌入到包括磷脂的双层膜内质网中(Dalton Trans.，1984，1147，JP S58-21371(A))；用包括滴状油珠的微球包封或覆盖FeTpivPP络合物(E.Tsuchida等，Biochem.Biophs，Acta.，1108，253-256(1992)，JP H06-264641(A))；通过诱导而与两性取代基形成共价键从而进行自组装(JP H06-92966(A))；和将血清白蛋白包围在疏水区内(JP H08-301873(A))。而且，发明者已证实，即使给药于活体时，这些输氧剂也能充分运输氧(E.Tsuchida等，Artif.Organs Today，5，207-215(1996))。
如上面所提及的，为了使FeTpivPP络合物发挥可逆的氧结合和释放性质，必须从外部向液体加入过量摩尔数的碱性轴向配体。本发明者已发现不添加任何碱性轴向配体就可制造稳定的氧络合物的体系，只要将，例如烷基咪唑衍生物或烷基组氨酸衍生物作为取代基结合到铁(II)卟啉络合物分子中，与其形成共价键即可(JP H05-85141(A))。一些已广泛用作轴向碱的咪唑衍生物具有医药性质，但其大部分对身体组织来说都是高毒性的。而且，如果所用载体为磷脂内质网、ripido微球或白蛋白，过量共存的咪唑衍生物可成为导致形态特征不稳定的因素。作为使轴向碱加入量最小化的途径，本发明者没有选择只有将咪唑衍生物结合到铁(II)卟啉络合物中。当然，已不断通过试验方法证明所得的改性铁(II)卟啉络合物作为载氧体可给药于活体(E.Tsuchida等，Bioconjugate Chem.，11，46-50(2000))。
该输氧剂在医疗领域具有极其广泛的应用。预期的应用不仅包括作为再生液(代替红细胞)用于出血性休克，而且用作载氧体运输氧至心肌梗塞的局部缺血部位，用作可移植器官的灌注液或贮备液，用作体外循环回路如人工心脏和肺的补偿溶液、作为载氧体运输氧以培养再生组织的细胞。此外，最近对输氧剂应用于癌症治疗增强剂(即，其在肿瘤组织中对抗含氧量低的部位的治疗性质)的兴趣不断增大。
通常，癌细胞为乏氧细胞，且乏氧细胞的存在也是恶性肿瘤耐放射疗法或化学疗法的原因之一。乏氧细胞包括(i)急性乏氧细胞，其这样产生肿瘤位置的血流量暂时改变，其反过来导致停止将氧运输到受某些血管控制的部位，和(ii)慢性乏氧细胞，其这样产生新血管的形成不能跟上肿瘤的异常生长，导致远离血细胞的细胞供氧不足。实际上，氧存在下，肿瘤组织对放射的灵敏度比无氧条件下观察到的结果增加达3倍，且肿瘤组织的存活率也下降。氧浓度由0托-40托时，可明显观察到放射敏化效应，浓度超出该范围时却几乎不改变。
氧效应的作用机理中还有许多不清楚之处。例如，分子氧为强氧化剂，其具有高电子亲合性。但是，在简单的水溶液中，由氧产生的放射敏化效应却不增加，即使在水溶液中将认为是目标物质的DNA分子暴露于放射线下也根本不能诱发氧效应。目前，人们认为细胞内的氧效应是由氧和谷胱甘肽(GSH)之间的拮抗作用引起的。且认为细胞被杀死是因为胞内目标分子(DNA)由于放射线的直接或间接作用在细胞内形成自由基。通过减少细胞内含有的GSH的反应来减少自由基，并修复放射线对细胞的破坏。但这种情况下，如果氧大量存在，则氧阻碍GSH作用产生氧效应。
迄今为止，还有一些报道试图通过施用输氧剂提高低氧状态下肿瘤组织的氧浓度来改进抗癌性质和放射灵敏度。人们已注意到全氟化合物(PFC)乳剂作为输氧剂的效用。1982年，Kokuuchi等人第一次报道了PFC乳剂和化学疗法的结合疗法。他们使用皮下移植脑肿瘤的大鼠模型研究了给药PFC乳剂引起的脑肿瘤组织内的氧浓度的变化(Kokuuchi等，Cancer and chemical therapy，11，2207-2211(1984))。给药PFC乳剂就伴随有乏氧组织内氧分压的升高。基于该结果，其揭示了在外周氧分压保持在300mmHg和之上的状态下，结合使用PFC乳剂和化学疗法治疗乏氧组织的可用性。但是，由于PFC的低氧亲和力，仍存在这样一个问题PFC乳剂必须用在高压氧氛下，例如，在高压探子下。
另一方面，Shorr等证明了含氧量低的肿瘤组织的氧合作用和给药改性血红蛋白(聚乙二醇(PEG)-改性的血红蛋白(PEG-Hb)，分子量为128kDa)对放射疗法的促进效果(R.Linberg，C.D.Conover，K.L.Shum，R.G.S.Shorr，体内，12，167-174(1998))。四种肿瘤，即，骨癌、前列腺癌、肺癌和神经胶质瘤用作研究的对象，给药各种血红蛋白制剂来确定肿瘤内氧浓度的变化。其显示，给药2小时后，PEG-Hb使含氧量低的肿瘤组织的氧浓度增加值达到最大(4-7托)。基于此事实，将PEG-Hb给药于移植了不同放射敏感的癌瘤的大鼠，然后使其接受γ-射线的放射，依次测量癌瘤的大小。结果，其显示所有肿瘤的大小都减小了。从这些结果可证明，PEG-Hb对含氧量低的肿瘤组织的氧合作用和放射治疗都有效。但是，通常已知，血红蛋白产品易于从血管内皮渗漏出去，并捕获平滑肌周围最接近处的血管放松因子，因此其诱发血管收缩，并导致血压迅速升高。
显而易见，输氧剂适于将分子氧运输至血管直径小的肿瘤组织，则其应包括粒度尽可能小的分子。换句话说，人们认为，可通过人工载氧体更有效地改善肿瘤组织内含氧量低的部位，该人工载氧体分子很小，但其具有一定的物理化学特征和分子大小，从而使其不易从血管内皮或肾脏渗漏出去。但是，设计和合成出应用和使用中达到这些需求、技术改进的输氧剂一直只是人们的期望。
因此，本发明就是用于克服上述问题，并意图通过在肿瘤组织附近的部位给药来提供高安全性输氧剂，用于有效提高瘤内含氧量低的部位的氧压。
发明内容
本发明者对直径小于传统载氧体，且不易从血管内皮或肾脏渗漏出去的人工载氧体化合物进行了研究，并对含有高浓度所述化合物的输氧剂的检查、使用和给药进行了研究。结果，本发明者发现，卟啉金属络合物为氧配位的活性中心，其可与血清白蛋白结合使用，以形成笼形物或包合配合物，其中卟啉金属络合物被围绕在血清白蛋白的晶体结构中，所得卟啉金属络合物-白蛋白笼形化合物可用作能将氧高效供至肿瘤组织内含氧量低的部位的制剂。本发明即是通过这些发现得以实现的。
根据本发明，提供了提高活体内肿瘤组织内氧浓度的输氧剂，所述输氧剂包括围绕卟啉金属络合物的白蛋白笼形化合物分散体，所述白蛋白笼形化合物分散在生理允许的含水介质中。
下文将对本发明进行详细说明。
本发明提供一种输氧剂，其包括围绕卟啉金属络合物的白蛋白化合物。输氧剂可包括围绕卟啉金属络合物的白蛋白笼形化合物，其可分散在生理允许的含水介质中，优选分散在生理盐水溶液，如磷酸盐缓冲的盐水中。
本发明中使用的卟啉金属络合物优选为通式(I)所代表的卟啉金属络合物[Chem.1]
通式(I) [其中，R1为链烃基或脂环烃基，其可具有一个或多个取代基，R2为式(A)所示的碱性轴向配体[Chem.2]式(A) (其中，R3为亚烃基，R4为不阻碍所述碱性轴向配体与中心过渡金属离子M配位的基团)，或式(B)所代表的碱性轴向配体[Chem.3]
式(B) (其中，R5为亚烃基，R6为烷基)；和M为元素周期表第4或第5族的过渡金属离子]，和/或通式(II)所代表的卟啉金属络合物[Chem.4]通式(II) (其中，R7为氢或可具有一个或多个取代基的链烃基，R8为烷氧基、烷基氨基，或氨基酸或氨基酸衍生物残基，R9为式(C)所代表的碱性轴向配体[Chem.5]式(C)
(其中，R10为亚烃基，R11为不阻碍所述碱性轴向配体与中心过渡金属离子M配位的基团)，或式(D)所代表的碱性轴向配体[Chem.6]式(D) (其中R12为烷基)，和M为元素周期表第4或第5族的过渡金属离子]。
这些卟啉金属络合物构成氧配位的活性中心。
通式(I)的卟啉金属络合物中，优选R1为第1位上具有二甲基的C1-C19链烃基，或第1位上具有取代基的C3-C19脂环烃基。后面的脂环烃基的例子包括1-取代环丙基、1-取代环戊基、1-取代环己基、1-甲基-2-环己烯基、2-取代冰片基和1-取代环金刚烷基。此处，上述基团的各个取代基可为甲基、C1-C18烷基酰胺基、C1-C18烷酰基氧基，或C1-C18烷氧基。
优选R3为C1-C10亚烃基。
优选R4为氢、甲基、乙基或丙基。
优选R5为C1-C10亚烃基。
优选R6为C1-C18烷基。
通式(II)的卟啉金属络合物中，优选R7为氢、乙烯基、乙基或甲氧基。
优选，R8为C1-C18烷氧基、C1-C18烷基氨基，或氨基酸或其衍生物的残基。优选，氨基酸衍生物为氨基酸-O-C1-C18烷基酯。
优选，R10为C1-C10亚烃基。
优选，R11为氢、甲基、乙基或丙基。
优选，R12为C1-C18烷基。
通式(I)和(II)中M均优选为Fe或Co。
通式(I)的卟啉金属络合物在，例如，JP H06-271577(A)，和T.Komatsu等，Chem.Lett.，2001，668-669(2001)中公开。
通式(II)的卟啉金属络合物在，例如，T.G.Traylor等，J.Am.Chem.Soc.，101，6716-6731(1979)，JP S58-10388(A)和JP S60-17326(A)中公开，只是其中R8为烷基氨基的物质未公开。通式(II)中R8为烷基氨基的卟啉金属络合物的合成在下面提及的实施例中进行了公开。
作为围绕卟啉金属络合物的白蛋白化合物，可使用血清白蛋白，如人血清白蛋白、基因修饰的人血清白蛋白、牛血清白蛋白等。作为白蛋白化合物，还可使用多体形式的白蛋白。特别优选使用二聚形式的白蛋白。使用二聚白蛋白可防止笼形化合物渗出循环系统。
包括围绕着卟啉金属络合物的白蛋白笼形化合物的输氧剂的制备，可使用JP S08-301873(A)；E.Tsuchida等，Bioconjugate Chem.，10，797-802(1999)；或Bioconjugate Chem.，11，46-50(2000)中公开的方法。通常希望本发明的输氧剂所含的白蛋白化合物浓度为1-30wt％，优选，5-25wt％。每个白蛋白化合物中，卟啉金属化合物的结合数为1-8(mol/mol)，从而使卟啉金属络合物浓度为0.15-36mM。本发明输氧剂的适当剂量为40mL/kg体重或此量以下。
本发明的输氧剂具有下列优异性质，其为肿瘤组织进行氧化作用所必须的(i)由于在血浆蛋白质中约占60％的血清白蛋白是作为氧配位活性中心的卟啉金属络合物的载体，因此本发明的输氧剂在血管内给药时非常安全且生物适应性非常高；(ii)由于分子尺寸可小至8×3nm，因此输氧剂可穿过肿瘤组织内的小毛细血管，而红细胞(8μm)却不能到达；和(iii)输氧剂具有低等电位点(pI)，因此其不会从肾或血管内皮渗漏出来。
而且，通过调节卟啉金属络合物的三维结构还可调节氧亲和力，因此根据受影响部分的氧分压还可高效运输氧。
通过将本发明的输氧剂给药至生长了肿瘤组织的哺乳动物活体可提高肿瘤组织内含氧量低的部位的氧分压。
可通过动脉内注射、静脉内注射、局部给药、系统给药或任何其它给药方式将本发明的输氧剂给药于活体。当然，给药前位于卟啉金属络合物中心的金属应被氧合。
下面是使肿瘤组织含氧量低的部位内，氧分压得到提高的方法的实施例后续说明，该方法通过将本发明的输氧剂给药于具有肿瘤组织的哺乳动物而实现。
通过将肿瘤细胞移植到实验室动物，如大鼠、仓鼠、兔或比格尔犬的希望部位处而制备患有癌症的动物。下面对肿瘤细胞移植入大鼠右腿中进行解释。
饲养大鼠若干天直至肿瘤生长，然后在麻醉下(如，使用戊巴比妥钠、乙醚或氟烷麻醉气)进行试验。把管子插过大鼠的颈部气管并在正压下通过呼吸罩使其吸入氧。将聚乙烯导管插入左颈总动脉中，远侧导管端定位于未达到髂总动脉分叉点的位置处，然后进行向后的套管插入术，以提供下行主动脉中的试样给药途径。
可通过静脉注射磷光探针(粪卟啉钯(PdPor))，用光照射，并用氧分压监测器监测磷光淬灭时间来确定肿瘤组织内的氧分压。在试样给药前的5-20分钟，通过尾静脉静脉注射PdPor。将大腿切开20mm，使正常肌肉和肿瘤暴露出来，探针就放置在肿瘤上面。持续测量过程中，用37℃的温和生理盐水溶液润湿肿瘤表面以防止肿瘤表面干燥。使用氧分压测量装置(如，Medical System Corp.制造的OxySpot(商标))，于空气或含99％氧的大气下，在右腿肿瘤位置处测定5-30个点的氧分压，并作为对照。然后在恒压下用注射泵进行动脉内注射，从而给药氧饱和试样(1-20mL/kg)1-20分钟。开始动脉内注射的同时，还对右腿肿瘤部位和正常部位的氧分压的连续变化进行测定。测量结束后，在腹部切开一个切口，以确定用于动脉内注射试样的导管正好位于髂总动脉分支处的前面，然后测量肿瘤的大小。
该情况下，即使分别将氧饱和生理盐水、人血清白蛋白、基因修饰的人血清白蛋白、牛血清白蛋白和白蛋白二聚体进行动脉内注射，也未观察到肿瘤组织内的氧分压(PO2)有变化。与之相比，给药本发明的含有卟啉金属络合物-白蛋白笼形化合物的输氧剂使肿瘤组织内的氧分压显著升高。人们认为，正如上面所述，本发明的卟啉金属络合物-白蛋白笼形化合物具有小粒径，因此与红细胞相比，其可更容易地穿过肿瘤组织内的不规则血管，反过来又可有效提高肿瘤组织内的氧分压。
附图简述
图1说明了给药本发明的输氧剂所导致的肿瘤组织内的氧分压变化。
本发明的最佳实施方式下面将通过实施例对本发明进行解释，但并不对发明进行限定。
合成实施例A合成8，13-二乙烯基-2-甲氨基羰基乙基-18-(3-(1-咪唑基)丙氨基)羰基乙基-3，7，12，17-四甲基卟啉铁络合物(I)合成8，13-二乙烯基-2-甲氨基羰基乙基-18-(3-(1-咪唑基)丙氨基)羰基乙基-3，7，12，17-四甲基卟啉将原卟啉IX(0.1g，0.18mmol)、蒸馏吡啶(10mL)和三乙胺(51μL，0.45mmol)加料至100mL的三颈回收烧瓶中，并搅拌10分钟。在光屏蔽条件下，向所得混合物中加入(苯并三唑氧基)三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐(124mg，0.45mmol)，搅拌10分钟，加入1-(3-氨基丙基)咪唑(15μL，0.14mmol)，之后再搅拌4小时。向所得反应混合物中加入5mL甲胺的四氢呋喃溶液，并搅拌4小时。用真空泵减压除去吡啶，之后分馏反应产物，并用硅胶柱(氯仿/甲醇/三乙胺＝8/1/1)纯化。真空干燥所得馏分。得到红色固体物质，为24mg(产率19％)8，13-二乙烯基-2-甲氨基羰基乙基-18-(3-(1-咪唑基)丙氨基)羰基乙基-3，7，12，17-四甲基卟啉。
Rf0.6(氯仿/甲醇＝3/1)IR(cm-1)νC＝0(酰胺基)1631UV-vis/λmax(nm)(CHCl3)631；579；542；508；4091H-NMR(δ(ppm))(CDCl3)-4.0(s，2H，内)；1.8-2.4(m，4H，-C2H4-Im)；2.7(m，4H，-CH2-COO-，-CH2-NH-)；3.5-3.7(m，15H，Por-CH3，CONHCH3)；4.2(s，4H，Por-CH2-)；5.8(s，1H，Im)；6.1-6.4(q，4H，CH2＝CH-)；6.6(d，1H，Im)；8.2(m，2H，CH2＝CH-)；9.5-10.0(q，4H，meso)FAB-MAS[m/z]683。
(II)铁络合物的合成将5mL上述方法(I)中得到的卟啉化合物(23.9mg，34.6μmol)的二甲基甲酰胺溶液加料至50mL三颈回收烧瓶中，然后用20分钟时间以氮气除去其中的氧。向溶液中迅速加入四水合氯化铁(68.8mg，346μmol)，在70℃的氮气氛下搅拌所得混合物3小时。向氯仿稀释的反应混合物溶液中加入一滴盐酸，在UV-可见光谱内未观察到衍生自二价阳离子的峰(约450nm处)，则确定反应完成。用真空泵减压除去溶剂，分馏反应产物并用硅胶柱(氯仿/甲醇/三乙胺＝8/1/1)纯化。经真空干燥，得到7.6mg(收率29％)棕色固体物质。
Rf0.1(氯仿/甲醇/三乙胺＝8/1/1)IR(cm-1)νC＝0(酰胺基)1649UV-vis/λmax(nm)(CHCl3)583；531；406FAB-MAS[m/z]736。
合成实施例B合成8，13-二乙烯基-2-十二烷基氨基羰基乙基-18-(甲基-O-组氨酸)羰基乙基-3，7，12，17-四甲基卟啉铁络合物除使用组氨酸-O-甲基酯代替1-(3-氨基丙基)咪唑，使用十二烷基胺代替甲胺之外，按照与合成实施例A中方法(I)相同的方式制得8，13-二乙烯基-2-十二烷基氨基羰基乙基-18-(甲基-O-组氨酸)羰基乙基-3，7，12，17-四甲基卟啉合铁，收率为25％。
Rf0.4(氯仿/甲醇＝15/1)IR(cm-1)νC＝O(酰胺基)1640UV-vis/λmax(nm)(CHCl3)631；575；540；4091H-NMR(δ(ppm))(CDCl3)-4.0(s，2H，内)；0.8(s，3H，-(CH2)10CH3)；1.2-1.8(m，20H，-CH2-)；1.9(t，4H，-CH2(C＝O)NH-)；3.2(s，2H，-Im-CH2-)；3.3(t，2H，-(C＝O)NHCH2-)；3.5-3.7(m，12H，Por-CH3)；3.7(m，3H，His-OMe)；4.2(s，4H，Por-CH2-)；4.8(s，1H，His-CH2CH-)；6.1-6.4(q，4H，CH2＝CH-)；6.8(s，1H，Im)；7.6(s，1H，Im)；8.2(m，2H，CH2＝CH-)；9.5-10.0(q，4H，meso)FAB-MAS[m/z]881使用所得卟啉，按照与合成实施例A中方法(II)相同的方式制备其铁络合物。
实施例1
制备本发明的输氧剂向可分离的烧瓶(2L)中加料10mL(2.5mg，37.5μmol)人血清白蛋白(25wt％)和1L磷酸盐缓冲盐水(pH8.1)，然后装上500mL滴液漏斗。另外，向回收烧瓶(300mL)中加料250mL 2-8-(2-甲基-1-咪唑基)辛酰氧基甲基-5，10，15，20-四-(α，α，α，α-o-新戊酰基酰氨基苯基)卟啉铁(II)络合物(下文称作“FepivP(Im)”，390mg，300μmol)的乙醇溶液，并通过特氟隆(商标)管与上述可分离的烧瓶连接起来。保持该管不与液体表面接触。向含有FepivP(Im)乙醇溶液的回收烧瓶中鼓入一氧化碳，使排出的气体流入白蛋白溶液中。与此同时，继续进行鼓入以免白蛋白溶液起泡沫。鼓泡和排气流操作约60分钟。在一氧化碳气氛下，向FepivP(Im)乙醇溶液中加入250μL抗坏血酸水溶液(0.6M)，并搅拌5分钟。以此方式，血红素还原形成一氧化碳络合物，溶液颜色变为深红。
将所得一氧化碳FepivP(Im)络合物的乙醇溶液转移至可分离烧瓶上的滴液漏斗内，并缓慢滴加至白蛋白溶液中。滴加结束后，搅拌溶液30分钟。
接下来用铝箔对光进行屏蔽，并在此条件下进行下面的步骤。使用带有超滤膜的闭路型超过滤装置(Pellicon 2 MINI HOLDER(商品名)，Cat.NO.XX42PMINI)，超滤膜的过滤面积为0.1m2，分子量截至10kDa，P2B010A01(MILIPORE的商品名)，对1.25L所得白蛋白-血红素的20％乙醇溶液进行过滤。过滤出50mL滤出液时，加入50mL磷酸盐缓冲液(1mM，pH7.3)。重复此步骤直至过滤出10L(1.25×8L)磷酸盐缓冲溶液。然后，将白蛋白-血红素溶液浓缩至100mL并收集在容器中。
用过滤器(DISMIC(商品名)，0.45μm)过滤所得浓缩溶液(约200mL)，并用超过滤单元(UHP-76K，ADVANTEC(商标))浓缩滤出液，得到约50mL浓缩溶液。
向所得浓缩溶液中加入20wt％的氯化钠溶液，使氯化钠浓度变为140mM。
使用pH测定仪和盐液密度计测定白蛋白-血红素溶液的pH和Na+浓度。通过溴甲酚绿(BCG)试验确定白蛋白浓度，通过ICP(感应耦合等离子体)发射光谱测定法确定FepivP(Im)浓度。
将白蛋白-血红素(一氧化碳络合物)溶液(20mL)加料至100mL回收烧瓶中，并与旋转蒸发仪连接。用冰水浴冷却回收烧瓶，同时旋转回收烧瓶，并用20分钟时间使氧流过冷却管的上部活塞。然后，将卤素灯(500w)固定在旋转回收烧瓶上面15-20cm处的位置上，并照射白蛋白-血红素溶液10分钟。通过白蛋白-血红素溶液的紫外可见光谱吸收和λmax可确定氧络合物的形成。所得氧络合物的摩尔消光系数(ε426)约1.16×105M-1cm-1。
健康细胞和肿瘤细胞内氧分压的测定使用Donryu大鼠(Crj-Donryu；Nippon Charles River，雄性，重量约200g，6周大)作为试验动物，通过生物清洁体系，在自由进食药丸和水的条件下对其进行饲养。通过腹内传代移植，使移植的肿瘤细胞，腹水肝细胞癌LY80生长。为了获得患有癌症的大鼠，移植后使肿瘤细胞生长7天。移植前的8天，在大鼠右腿进行切开，并用27G和1mL的注射器将5×106个细胞恰好移植在大腿肌肉下面。静脉注射粪卟啉钯(PdPor)，然后进行光辐射，之后使用氧分压测定系统(Oxyspot Photomeric氧测量系统(OxySpot，Medical SystemCorp.)监测，从而通过磷光淬灭时间确定肿瘤组织内的氧分压。试样给药15分钟前，使用24G留置针由尾静脉静脉注射PdPor。在大腿上切开20mm的小切口，使正常肌肉和肿瘤都暴露出来，将测量探针就放置在肿瘤上面5mm距离处。测量过程中用37℃的温和生理盐水漂洗肿瘤表面以防止肿瘤表面干燥。
用乙醚吸入剂麻醉大鼠，经颈部气管将14G-Angiocath(商标)插管，通过人工呼吸机(人工呼吸机型号SN 480-7，Shinano MFG.，CO.Ltd制造)在正压下(80次/分钟)使其吸收氧，同时通过小型动物麻醉器供给与空气或氧混合的1％氟烷麻醉气(FiO2，1％三氟溴氯乙烷Fluothane)。将聚乙烯导管(SP10，单腔，内径0.28mm，外径0.61mm)插入左颈总动脉中，并固定在距髂总动脉分叉点(约9.5cm)1cm的位置处，然后进行向后的套管插入术，以提供下行主动脉中的试样给药途径。
剥离右腿肿瘤细胞皮肤之后，由大鼠尾部的尾静脉注射PdPor(0.24cc(10mg/mL，0.9mL/kg))。使用OxySpot(商标)，于空气或含99％氧的大气下，在右腿肿瘤位置处测定20个点的氧分压，并作为对照。然后在恒压下用注射泵(FP-W-100，Matys，ToyoSangyo Ltd.)持续动脉内注射4分钟(2.5mL/kg/分钟)，从而给药氧饱和的试样(10mL/kg)。开始动脉内注射的同时，还测量肿瘤部位和正常部位(5个点，持续15分钟)的氧分压，以确定氧分压的连续变化。测量结束后，在腹部切开一个切口，以确定试样的动脉内注射导管位于未达到髂总动脉分叉处的位置，并测量肿瘤的大小。
在99％的氧氛下，右腿正常部位和肿瘤部位氧分压(PO2)分别为14-16托和1.4-1.7托，如表1所示。与正常部位的分压相比，肿瘤部位的分压显著降低。因此，可确信只通过大鼠呼吸的氧浓度的增加，肿瘤部位的氧分压不会增加。
r人血清白蛋白-血红素处理(rHSA-Heme)小组(4只大鼠)和r人血清白蛋白(rHSA)处理小组(4只大鼠)的各种参数的初始值如表1所示。
表1
接下来，通过动脉内注射给药氧饱和的、基因修饰的人血清白蛋白(rHSA)，但氧分压(PO2)并未发生变化。相比较而言，将上面制备的本发明的输氧剂产物给药时，肿瘤组织内的氧分压上升至高达3.5托。结果如图1所示。给药本发明的输氧剂产物后，氧分压为给药前的2.5倍。可认为本发明的卟啉金属络合物-笼形白蛋白化合物可有效升高肿瘤组织内的氧分压，其原因在于由于其与红细胞相比分子尺寸更小，因此该化合物可容易地穿过肿瘤组织内的不规则血管。
实施例2除使用2-8-(1-咪唑基)辛酰氧基甲基-5，10，15，20-四-(α，α，α，α-o-(1-甲基环己酰基)氨基苯基)卟啉铁(II)络合物代替实施例1中的FepivP(Im)之外，按照与实施例1相同的方式测定氧供给对肿瘤组织内含氧量低的部位的作用。肿瘤组织内的氧分压升高至高达约7.0托。因此，其表明通过给药白蛋白-血红素(其为人造载氧体)而向低氧肿瘤组织供氧所产生的效果。
实施例3除使用8，13-二乙烯基-2-甲氧基羰基乙基-18-(3-(1-咪唑基)丙基氨基)羰基乙基-3，7，12，17-四甲基卟啉铁(II)络合物代替实施例1中的FepivP(Im)之外，按照与实施例1相同的方式测定供氧对肿瘤组织内含氧量低的部位的作用。肿瘤组织内的氧分压升高至约1.6托。因此，其表明通过给药白蛋白-血红素(其为人造载氧体)而向低氧肿瘤组织供氧所产生的效果。
工业实用性如上所述，根据本发明，其提供了一种非常安全的输氧剂产物，将其给药于肿瘤组织附近的部位时，可有效升高肿瘤组织内含氧量低的部位的氧分压。
权利要求
1.提高活体内肿瘤组织氧浓度的输氧剂，所述输氧剂包括白蛋白笼形化合物分散体，该分散体包括卟啉金属络合物，其分散在生理允许的含水介质中。
2.根据权利要求1的输氧剂，其中所述卟啉金属络合物为通式(I)所代表的卟啉金属络合物[Chem.7]通式(I) [其中，R1为链烃基或脂环烃基，其可具有一个或多个取代基，R2为式(A)所示的碱性轴向配体[Chem.8]式(A) (其中，R3为亚烃基，R4为不阻碍所述碱性轴向配体与中心过渡金属离子M配位的基团)，或式(B)所代表的碱性轴向配体[Chem.9]式(B) (其中，R5为亚烃基，R6为烷基)；和M为元素周期表第4或第5族的过渡金属离子]，和/或通式(II)所代表的卟啉金属络合物[Chem.10]通式(II) (其中，R7为可具有一个或多个取代基的链烃基或脂环烃基，R8为烷氧基、烷基氨基，氨基或氨基酸衍生物残基，R9为式(C)所代表的碱性轴向配体[Chem.11]式(C) (其中，R10为亚烃基，R11为不阻碍所述碱性轴向配体与中心过渡金属离子M配位的基团)，或式(D)所代表的碱性轴向配体[Chem.12]式(D) (其中R12为烷基)，和M为元素周期表第4或第5族的过渡金属离子]。
3.根据权利要求2的输氧剂，其中所述卟啉金属络合物为通式(I)的卟啉金属络合物，其中R1为第1位上具有二甲基的C1-C19链烃基，或第1位上具有取代基的C3-C19脂环烃基，R3为C1-C10亚烃基，R4为氢、甲基、乙基或丙基，R5为C1-C10亚烃基，R6为C1-C18烷基，M为Fe或Co。
4.根据权利要求2的输氧剂，其中所述卟啉金属络合物为通式(II)的卟啉金属络合物，其中R7为氢、乙烯基、乙基或甲氧基；R8为C1-C18烷氧基、C1-C18烷基氨基、氨基酸或其衍生物的残基；R10为C1-C10亚烃基；R11为氢、甲基、乙基或丙基；R12为C1-C18烷基；且M为Fe或Co。
全文摘要
一种非常安全的输氧剂，其可有效提高肿瘤组织内含氧量低的部位的氧分压，其包括围绕卟啉金属络合物的白蛋白笼形化合物分散体，其分散在生理允许的含水介质中。
文档编号A61K31/409GK1674891SQ0381861
公开日2005年9月28日 申请日期2003年6月3日 优先权日2002年6月3日
发明者土田英俊, 小林纮一, 小松晃之, 堀之内宏久, 渡边真纯 申请人:尼普洛株式会社