专利名称：一种抑制血管渗漏和组织水肿的方法
技术领域：
目前的发现是关于通过各种因子，尤其是生长因子，比如VEGF家族或亚型来控制血管渗透性和血管发生。
背景技术：
VEGF(特别是VEGF-A)是影响血管通透性和血管发生的同种肽家族的一员，正被讨论的这个家族至少包括十种结构相关的蛋白，如VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E；胎盘生长因子(PIGF)；EG-VEGF和各种血小板衍生生长因子(PDGF)，如PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C、PDGF-D。至少有三种生物学功能，如血管发生、血管生成、血管通透性，是通过VEGF家族不同的同种型介导。不管是生理还是病理状态下VEGF家族成员是引发血管发生的重要因子，它们负责女性生殖周期、创伤愈合以及各种病理状况下(如肿瘤生长和转移、糖尿病视网膜病变和类风湿性关节炎)血管的发生。
VEGF家族的三种结构相关的高亲和受体已被鉴定，它们分别是VEGFR-1(Flt-1)、VEGFR-2(KDR/Flk-1)和VEGFR-3(Flt-4)，其中VEGFR-3在淋巴内皮细胞特异性表达，而VEGFR-1和VEGFR-2则在血管内皮细胞表达，VEGF-C和VEGF-D与VEGFR-2和VEGFR-3结合都能诱导血管和淋巴管生成反应，而VEGF-B和PIGF只与VEGFR-1结合。这些相互作用的生物学功能仍然有待进一步鉴定。VEGF诱导的生血管反应是通过VEGFR-1和VEGFR-2介导，并且VEGF同种型与这两种受体作用所引起的生物学反应看起来是不同的，比如激活VEGFR-2可引起内皮细胞的增殖和迁移，然而激活VEGFR-1则不能。PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C、和PDGF-D对血管发生过程中内皮细胞的反应可能很重要，它们普遍被认为是细胞存活的因素和管壁细胞如平滑肌细胞、周细胞和系膜细胞的有丝分裂原。VEGF家族成员彼此二聚化形成各种组合，这可能提示它们的受体之间存在相互作用和活动。
VEGF(尤其是VEGF-A)最初是作为肿瘤细胞分泌的一种血管渗透因子被认识的，鉴于肿瘤维管结构是具有膜孔的、易扩张的、不规则的、不稳定的和易出血的这些事实，因此认为VEGF是诱导肿瘤血管渗漏的原因。除了肿瘤以外，在一些具有膜孔内皮的器官和组织，如脉络丛和肾小球，VEGF、VEGFR-1和VEGFR-2都持续表达，而且，相信内皮间连接也与VEGF介导的内皮渗漏有关，因此推测VEGF家族成员的持续产生与诱导和维持内皮膜孔有关。确实，VEGF在体内的短暂供给能诱导平滑肌、眼和皮肤内皮膜孔的产生，在体外，培养肾上腺皮质和脑来源的内皮细胞可以得到同样的结果。
VEGF使血管通透性增加不仅对肿瘤细胞播散而且对组织中液体的积聚同样重要，从毛细血管运输液体主要依靠各种动力，比如毛细血管内流体静压、间质压力、胞浆和间质液的胶体渗透压以及毛细血管通透性，还有毛细血管滤过系数，这些压力共同作用的结果使动脉末端的毛细血管液体往外迁移(滤过)，有时在静脉部位的毛细血管滤过大于重吸收，这将引起组织当中的液体积聚，在大部分组织中，积聚的液体通过淋巴系统排出，而在大脑则通过脑脊液排出。当毛细血管通透性增加，如内皮细胞间产生间隙或孔，引起液体积聚从而导致组织水肿。
VEGF，又称为血管渗透因子(VPF)，对血管有两个主要的功能，然而作为体内一个强有力的特异性的生血管因子，它同样会增加血管的渗漏。事实上VEGF是乞今为止发现的最强的血管渗透因子，它对血管的作用比组胺强50,000倍。VEGF家族成员的一个独特的生物学特性是在低氧条件下它们的表达能得到戏剧性地上调，这样在心脏缺血性疾病、动脉粥样硬化、循环功能不全、中风、糖尿病、慢性炎症、呼吸功能不全和高山病等情况下引起VEGF产生增加，从而使血管通透性增加(随后可能引起水肿)和引发新血管发生。VEGF水平的增高对许多器官产生严重的后果。毛细血管通透性增加导致水肿形成，随后组织肿胀，运输氧气能力下降，这反过来引起低氧进一步加重。在大脑，血脑屏障(BBB)通透性增加，从而发展成水肿尤为严重。因为容纳大脑的脑室是不能扩张的。因此，大脑肿胀使颅内压升高，于是大脑血供受损或者引起脑嵌顿/脑疝，随这而来的是大脑坏死。与水肿相伴而行的常常是许多中枢神经系统的疾病，比如癌症、肿瘤、感染、出血和梗塞引起的中风，这些都被认为与VEGF产量相关。目前治疗脑水肿的方法很有限，包括渗透疗法以及使用糖皮质激素(地塞米松)治疗，渗透疗法的潜在疗效常常不能凑效，因为渗透疗法把大脑中健康的区域和坏死的区域一起缩小了。Criscuolo和Fischer曾经指出糖皮质激素的疗效与它能抑制VEGF表达之间的关系。在脑膜炎中，血脑屏障(BBB)的破坏以及脑水肿的产生被认为与VEGF产量相关，并且发现在人体VEGF的表达、FLK-1的表达和神经胶质瘤的恶性程度、肿瘤内的多血管状态、肿瘤外周脑水肿之间有明显的相关性，这也表明VEGF的表达与水肿的发展之间存在联系。在人体，缺血引起中风时，大脑中异戊巴比妥区域VEGF表达上调已得到证实。在实验性的脑缺血病灶中，VEGF在1-3小时后开始表达，24-48小时达到高峰，中风后马上系统供给VEGF将明显增加BBB渗漏、出血转移、缺血损害，脑缺血病灶中其它生长因子的表达也会上调，但是VEGF对于疾病的转归至关重要。在小鼠，用可溶性VEGF受体嵌合蛋白可以使内源性的VEGF失活，从而缓解水肿，防止脑损伤进一步扩展。然而，在缺血情况下VEGF可以通过刺激新血管发生(血管发生和血管发生)从而产生显著疗效，这样异戊巴比妥区或其它区域的大脑组织可以建立一个血供，因而可以提高神经系统恢复的范围和速度。在其它器官，提高VEGF表达同样重要。新血管的生长虽然能有效地改善心肌缺血的状况，但是VEGF所引起的水肿将给心脏带来更加沉重的负担。同样的情况也出现在糖尿病视网膜病变治疗中，事实上VEGF引起的水肿是失明的根源(湿型斑疹)。另外，慢性炎症同样会伴随出现VEGF引起的血管渗漏和组织增厚。为了缓解缺血状况，通过以VEGF为基础的生血管治疗诱导新血管发生的同时也带来了严重的副作用，这是由于形成了高度渗漏的血管。另一方面，如果VEGF引起的血管渗漏增加可以选择性地被封闭，那将有可能大大地改善以VEGF为基础的生血管治疗。
尽管人们在了解VEGF受体介导的信号通路方面作了大量的努力，但仍没有人能将VEGF和其它生长因子介导的生血管和血管渗漏两条通路分开。从受体介导的细胞骨架信号中得到提示的一个蛋白家族是Rho家族的小GTPases，这个家族的多肽包括Rho、Rac和Cdc42，它们影响粘连、肌动蛋白的聚合作用、片状伪足和线状伪足的形成，所有这些对内皮细胞的功能都很重要。
目前研究者发现Rho GTPases拮抗剂有治疗潜能，比如发现了Rac拮抗剂代表N17Rac可选择性地封闭VEGF引起的血管穿孔，令人感到惊讶的是它并没有封闭VEGF引起的生血管作用，这就为将VEGF引起的生血管效应与血管通透效应分开提供了依据。目前正在讨论的Rho家族拮抗剂类型对于治疗许多疾病似乎极具潜能，因为它们极大地抵抗了VEGF引起的血管渗漏的增加，同时没有影响VEGF的生血管效应，比如中风，VEGF引起的大脑水肿是危险期主要的致死并发症。至此，它将能很好地封闭VEGF引起的水肿，同时允许新血管生长的进行从而改善缺血状况。这在缺血性心脏病中也得到证实，虽然VEGF表达增加而引起新血管的生长对于改善心肌缺血的状况大有裨益，但是与之相伴随产生的水肿将增加心脏的负担。结果，以VEGF为基础的生血管治疗所带来的弊大于利。很显然，在使用VEGF达到生血管治疗目的的临床实验中，VEGF引起的血管通透性增加必须被封闭，但是到目前为止还没有能将这两种生物学功能分开的试剂可供利用。Soga等在另一同样研究I型胶原的趋触性和VEGF刺激的I型胶原的趋化性显示，Rac足以刺激人体皮肤(包皮)微血管内皮细胞产生游动性，Rac抑制物，N17Rac能抑制细胞在I型胶原上的游动性，且能完全阻止VEGF引起的趋化性刺激，在Soga等研究结果的基础上，人们预料已被利用过的Rac抑制物将同样能抑制生血管作用，但是没有有关VEGF诱导生血管效应的数据显示。
近来有研究者惊讶地发现不仅正被讨论的Rac抑制物能抑制血管通透性增加(这通常是由一种因子或VEGF其它亚型诱导)，并且这种抑制作用不会同时抑制新血管发生，这通常是由正被讨论的因子诱导。近来的发现来自VEGF通过不同胞内通路介导生血管(血管细胞增殖)和血管通透性增加的认识，尽管这两种作用通过相同的细胞膜受体介导。
发明摘要这项研究是关于利用Rho家族成员拮抗剂或抑制剂达到治疗、诊断和研究目的。目前研究的第一个方面是，通过提高能增加血管通透性的生长因子水平在血管中的暴露，从而在实验对象(动物和人)体内实现抑制和降低血管通透性增加，这方法包括给予Rho家族成员拮抗剂。正如以上所讨论的，增加血管通透性是引起组织水肿的主要原因，未来的研究方向是对实验对象的治疗，通过提高能增加血管通透性的生长因子水平在血管中的暴露，以防止和减轻含有血管的组织水肿，这方法也包括给予Rho家族成员拮抗剂，比如，多肽或Rho家族的GTPases的拮抗剂或抑制剂，或Rho调控通路的拮抗剂或抑制剂。
正如上面也讨论过，文章的后面方法提到的血管通透性诱导因子，是典型的能通过Rho家族成员介导的引起血管通透性增加的因子，比如Rho、Rac和Cdc42和同种型。
前面已不同程度提到，在未来的研究中，文章中的方法所使用的因子能刺激含血管的组织生血管，同时这种方法不会抑制和降低因子诱导的生血管作用。
未来的研究方向药物组成成分，作为功能组分，包括Rho家族成员拮抗剂和药物学上可接受的载体或稀释液；使用Rho家族成员拮抗剂作治疗用药物制剂，或作为在血管透性诱导因子在血管中暴露增加的情况下，对引起的血管通透性增加的预防方法。
发明的详细描述目前的研究是基于这样的事实Rho家族成员中的小GTPases，包括Rho、Rac和Cdc42亚家族，是在VEGF和其它相关生长因子介导下调节血管透性增加的关键分子。然而，VEGF和其它相关生长因子诱导的生血管反应涉及其它的通路，这样就有可能通过VEGF和相关因子干挠Rho GTPases的功能，从而选择性地抵抗血管透性增加。
在研究实践中，VEGF或其它因素如局部或系统低氧引起的血管透性增加和组织水肿，可以给予至少一种有效剂量的Rho家族成员拮抗剂得到阻抗，而不会使随着发生的生血管受到损害。在一些情况下这种治疗方法已被报道，如中风、创伤性脑损伤或其它中枢神经系统损伤、心脏缺血、低氧性肺水肿或其它器官水肿(这些地方血供不足)、视网膜病变、慢性炎症、肿瘤(癌)、或一些经过与VEGF活性有关生血管治疗。研究的一个方面是关于利用Rho调控通路作为Rho拮抗剂的靶标，这条通路涉及GDP/GTP交换蛋白(GEP’s)。Rho蛋白有两种形式，GDP结合的非活化型和GTP结合的活化型，这两种形式是可以相互转换的。GEP’s有利于GDP/GTP的转换，这样就构成了一个Rho活性的调控靶标。另一方面是，GDP解离抑制剂(GDI’s)，可以抑制GDP从Rho上解离，这样经GTP结合的活化就成为了介质调控Rho活性的靶标。活化的GTP-Rho可以通过GTPases催化转变成非活化的GDP-Rho，这一反应可以用特异性GTPases激活蛋白(GAP’s)易化。另一方面是关于利用GAP’s作为靶标调控Rho活性。事实上Rho存在于胞浆并且与GDI复合，当Rho转位到细胞膜上时与GTP结合从而成为活化型Rho，利用介质促使Rho与GDI结合从而封闭了Rho与细胞膜的结合。另一个事实是，C3转移酶，一种细菌的核糖基转移酶，核糖基化的Rho使蛋白失活，提供了利用C3转移酶使Rho失活的依据，这是研究的另一方面。另外，利用其它的细菌毒素，如毒素A和B，同样可以抑制Rho的活性，这又是研究的另一方面。许多Rho蛋白的突变型有显性失活的功能，这样就有了使血管细胞内源性Rho生物学功能失活的功能；利用它们抑制Rho活性构成了研究的另一方面。抑制剂或拮抗剂的混合物，与Rho蛋白合成或稳定性的抑制剂/拮抗剂一样可被利用，Rho蛋白的抑制剂/拮抗剂包括任何RhoA、Rac1或Cdc42，还有Rho-GTP家族的其它成员。
文章中提到的“血管通透性”是指液体或溶液容易从血管腔进入组织，或者从组织进入血管腔。
文章中提到的“血管发生”是指产生新的血供，比如从已经存在的血管组织中产生新的血管(毛细血管，静脉和/或动脉)，血管发生的过程可以涉及许多组织细胞类型，包括内皮细胞，在血管管腔内排列成单层状，同时还涉及调控血流和周围组织的液体、溶液、细胞、血气等的交换。新血管的发育(血管发生)可以通过内皮细胞的旁生长从而代替小血管壁。血管发生不仅在健康个体正常生理过程中很重要，同时在许多病理情况下也非常重要。比如，血管发生过程可以保证低氧组织有足够的血液和营养供给。另一方面，在肿瘤组织中，血管发生对于向肿瘤组织提供血供，使肿瘤细胞存活和增殖(生长，代谢)显得尤为重要。关于这一点，研究方法的另一方面是供给抗血管发生药和/或抗癌药(如细胞生长抑制剂)同时加上Rho家族成员拮抗剂。
文章中提到的“Rho家族成员”是指所谓的Rho家族的小GTPases(Rho GTPases)，包括RhoA、RhoB、RhoC、RhoD、RhoE、RhoG和RhoH；Rac1、Rac2、Rac3；Cdc42；TC10；Rnd1、Rnd2。有报道称这些成员调控着肌动蛋白纤丝通过聚合作用形成应力纤维、片状伪足和丝状伪足，另外，Rho结合蛋白激酶也包括在这一范围之内。
文章中所提到的Rho家族成员拮抗剂，是指具有抑制和拮抗文中所定义的有关的Rho家族成员功能的任何物质。这些拮抗剂不仅指多肽或蛋白质(包括能与受体结合的Rho家族成员的类似物，抗Rho家族成员蛋白或片段的抗体)，还指非多肽类物质(典型的小分子有机物)，包括已命名的小分子Y-27632，它能抑制Rho结合蛋白激酶；肉毒梭菌胞外酶C3，它能抑制RhoA GTPases；艰难梭菌毒素B，它能非特异性地抑制大多数RhoGTPases，比如Rho、Rac、Cdc42的同种型。
研究中尤其感兴趣的有关血管，包括心肌组织、脑组织、肺组织、骨胳肌组织、肾组织、肝组织或皮肤中的血管。研究中尤其重要的血管通性诱导或增加的因子，包括前面已经提到的VEGF家族生长因子；VEGF家族的某些成员又被称为“血管渗透因子”(VPF)。
根据目前的研究，该方法更进一步的探讨是，为了诱导或增强血管发生作用，有可能将一种能刺激血管发生的因子与正在讨论的Rho家族成员一起使用，比如，就起因因子而言(如血管通性诱导或增加的因子)它本身就能刺激血管发生，象VEGF/VPF家族或亚型，附加供给的血管发生刺激因子可能与这些因子是相同或不同家族与亚型。
研究中，诱导实验对象或病人体内血管透性发生或增加的因子水平的提高，通常是在慢性或急性病情况下。相关的慢性或急性病包括缺血性心脏病(动脉粥样硬化)；缺血性中风；出血性中风；I型和II型糖尿病；炎症(包括风湿性关节炎)；低氧引起的疾病，比如所谓的“高山病”。
上面已经提到，研究中使用的Rho家族成员拮抗剂可能是蛋白(肽类)或非肽类物质，就肽/蛋白拮抗剂而言，一组有用的拮抗剂由显性失活的Rho家族成员组成。一个肽/蛋白的例子是N17Rac(有时也称RacN17)，肽类/蛋白类包括它们的氨基酸序列，比如组成Rac的氨基酸序列，在这个序列中，天然Rac第17位的苏氨酸残基(T)被天冬酰胺残基(N)代替。有关的Rho家族成员拮抗剂组包括Cdc42拮抗剂和GDP结合抑制剂(GDI’s)。
很显然，据研究显示，本发明所述的Rho家族成员拮抗剂通常能够使靶细胞产生理想的通透性(进入或转运的适当能力)，这些能力与被因子(如生长因子VEGF/VPF)的诱导而增加的血管通透性有关。增加某种潜在拮抗剂，例如效果并不理想的Priori，的细胞通透性能力的一种方法是融合一个附加物(例如一个基团、亚基、氨基酸序列等等)，这些附加物能够协同提高转运入细胞的能力，因此可以预期Rho家族成员采用这种方法来提高细胞通透性。关于具备这些能力的肽的氨基酸序列(如Gariepy和Kavamura提供的，2001)，作为相关的一系列候选物被考虑采用，如下K-FGF(卡波西成纤维生长因子)N-端疏水区1-16残基(Ala-Ala-Val-Ala-Leu-Leu-Pro-Ala-Val-Leu-Leu-Ala-Leu-Leu-Ala-Pro)；Src同源物2(SH2)的Grb2区域1-12号残基(Ala-Ala-Val-Leu-Leu-Pro-Val-Leu-Leu-Ala-Ala-Pro)；整合蛋白β3(Val-Thr-Val-Leu-Ala-Leu-Gly-Ala-Leu-Ala-Gly-Val-Gly-Val-Gly)；HIV-1 gp41(1-23)(Gly-Ala-Leu-Phe-Leu-Gly-Phe-Leu-Gly-Ala-Ala-Gly-Ser-Thr-Met-Gly-Ala)；Caiiman crocodylus免疫球蛋白(V)轻链(Met-Gly-Leu-Gly-Leu-His-Leu-Leu-Val-Leu-Ala-Ala-Ala-Leu-Gln-Gly-Ala-Met-Gly-Leu-Gly-Leu-His-Leu-Leu-Leu-Ala-Ala-Ala-Leu-Gln-Gly-Ala)；流感血凝素融合肽合成类似物，如KALATrp-Glu-Ala-Lys-Leu-Ala-Lys-Ala-Leu-Ala-Lys-Ala-Leu-Ala-Lys-His-Leu-Ala-Lys-Ala-Leu-Ala-Lys-Ala-Leu-Lys-Ala-Cys-Glu-Ala；GALATrp-Glu-Ala-Ala-Leu-Ala-Glu-Ala-Ala-Leu-Glu-Ala-Leu-Ala-Glu-His-Leu-Ala-Glu-Ala-Leu-Ala-Glu-Ala-Leu-Glu-Ala-Leu-Ala-Ala；46Leu-Ala-Arg-Leu-Leu-Ala-Arg-Leu-Leu-Ala-Arg-Leu-Leu-Arg-Ala-Leu-Leu-Arg-Ala-Leu-Leu-Arg-Ala-Leu；Hel 11-7Lys-Leu-Leu-Lys-Leu-Leu-Leu-Lys-Leu-Trp-Lys-Leu Leu-Leu-Lys-Leu-Leu-Lys；来自三螺旋触角虫的穿透素(43-58)Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Arg-Arg-Met-Lys-Lys-Trp-Lys；将融合的促生长激素神经肽转化到乳头状病毒中Gly-Trp-Thr-Leu-Asn-Ser-Ala-Gly-Tyr-Leu-Leu-Gly-Lys-Ile-Asn-Leu-Lys-Ala-Leu-Ala-Ala-Leu-Ala-Lys-Lys-Ile-Leu；来自HIV-1 Tat蛋白的基础残基(47-57)Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg；来自HSV录因子VP22(267-300)Asp-Ala-Ala-yr-Ala-Tyr-Arg-Gly-Arg-Ser-Ala-Ala-Ser-Arg-Ser-Arg-Pro-Tyr-Gly-Arg-Pro-Tyr-Glu-Arg-Pro-Arg-Ala-Pro-Ala-Arg-Ser-Ala-Ser-Arg-Pro-Arg-Pro-Val-Glu。
成功/增强将Rho家族成员拮抗剂转运进入细胞的其它方法有，将它们包裹在能透过细胞膜的载体中，例如脂质体或脂质或与抗体吸附，病毒蛋白载体或其它寻靶载体靶向相关的血管。可以伴随注射重组的 病毒表达的拮抗剂，这里有一个有效的例子表明，使用一种所谓的TAT蛋白序列作用载体蛋白与N17Rac融合可以增强N17Rac转运进入细胞。
研究中，Rho家族成员拮抗剂(和其它的有药物功效的物质，有关的辅助物质，载体、赋形剂或类似物)的给药方式可被任何其它给药路线所代替。包括局部的、胃肠外的、口服的、直肠的给药路线。由于慢性或急性病情况下，常常结合血管通透性增加，通透性增加则抵抗(抑制或降低)本研究的给药方式，这时胃肠外给药路线常常是很合适的，胃肠外给药路线常常有下列一些可供选择动脉内、静脉内、颅内、皮内、皮下、肌肉内、肺部、鼻腔、阴道内给药，在某些情况下，如外科手术过程中，药物通过注射、灌入或其它方式直接供给受侵袭的组织可能是一种有效的胃肠外给药路线。
上面已经提到，目前更进一步的研究是关于药物的组成成分，作为有作用的成分，Rho家族成员拮抗剂与药物学上可接受的载体或稀释液一起，这种类型的组分将可以用于治疗和预防由于暴露在血管中的因子水平的提高所引起的血管通透性增加(比如前述的其中一种因子，VEGF、PDGF、PIGF)；含有血管的组织水肿——尤其是上面已经讨论过的一些组织——是这种情况下非常严重的例子。
本研究另一方面是关于Rho家族成员拮抗剂作为治疗和预防的药物制剂，在血管透性诱导因子在血管中暴露增加的情况下使用。
总之，目前的研究可用于体内和体外抑制血管通透性增加。本方法可用于治疗动物或人体内各种疾病，尤其是生长因子(如VEGF)引起的血管通透性增加，这些疾病包括中风、心脏和大脑创伤、各种癌症、糖尿病视网膜病变、慢性炎症和自身免疫性疾病，如类风湿性关节炎、高海拔和组织低氧引起的疾病，并且当生长因子如VEGF用于生血管治疗以矫正器官(心脏或肢体)血供不足时，利用这一研究发现将有可能防止不期望出现的血管通透性增加。
图形简述
图1显示VEGF可以诱导转染了VEGFR-2(而不是VEGFR-1)的PAE内皮细胞肌动蛋白重组织，同时细胞形态发生改变。
(a)转染VEGFR-2，无VEGF；(b)转染VEGFR-2，有VEGF；(e)表达VEGFR-1，无VEGF；(f)表达VEGFR-1，有VEGF；(b)无VEGF+Rac1；(c)有VEGF但无Rac1；(g)有VEGF+Rac1，用FITC结合的羊抗兔抗体染色；(h)有VEGF+Rac1，用TRITC—毒伞素染色结果(a)和(b)显示，加入100ng/mlVEGF165到PAE/VEGFR-2作用6-12小时，结果经过固定和用TRITC标记的毒伞素检测，发现肌动蛋白纤丝重组织同时细胞形态伸长；
(e)和(f)显示，在相同条件下，VEGF不能诱导表达VEGFR-1的细胞形态发生改变；(g)和(h)显示，通过显微注射将显性失活突变的Rac1注射入PAE/VEGFR-2细胞；过度表达的突变Rac1蛋白完全阻断了VEGF刺激细胞形态改变的作用，两者都可以看见相同的形状。
图2显示TAT-N17Rac对VEGF诱导的血管发生模型的作用。当植块植入C57BL6/J小鼠角膜5天后检测和计数角膜血管发生，a、b、c组中大箭头所指是植块植入部位。
(a)单独植入VEGF，结果发现高密度的毛细血管芽，血管渗漏并且趋于形成毛细血管斑[毛细血管生长的边缘发生融合，(小前头所指)](b)VEGF与TAT-N17Rac包裹在缓释多聚物中一起植入，结果引起新血管的发生，但这样不会形成毛细血管芽/斑，小前头所指是发育良好的微血管。
(c)单独植入包裹TAT-N17Rac缓释多聚物，结果不能诱导新血管发生。
(d)计数角膜新生血管的面积，数据代表10-12个眼睛的平均值。
图3利用免疫组织化学法证明TAT-N17Rac被微血管吸收。
(e、h)将VEGF/TAT-N17Rac植入5天后，取角膜组织切片，与anti-CD31一起孵育，再用Cy3-结合二抗染色，显示在原始图片上红色部分(f、i)同样的切片用anti-HA标记抗体染色，看见绿色的原始影像(g、j)利用数码成像技术将CD31阳性信号(红色)与HA信号重叠，产生双重染色信号，重叠的信号表示TAT-N17Rac被微血管吸收。
图4显示TAT-N17Rac阻断了VEGF诱导的血管穿孔。通过电镜观察到微血管壁薄的部分长成小鼠的角膜。
(i)VEGF诱导产生的血管由一薄层具有很多膜孔的内皮组成。
(i)由VEGF/TAT-N17Rac诱导产生的血管完全没有膜孔这说明TAT-N17Rac能有效地减少VEGF诱导的血管产生膜孔。箭头所指内皮膜孔，L表示毛细血管腔，M表示角膜胶原基质。
(k)定量分析显示由VEGF/TAT-N17Rac诱导产生的血管几乎不能检测到膜孔。
(l)TAT-N17Rac并没有减少内皮小凹，相反，VEGF/TAT-N17Rac诱导产生的血管与VEGF相比，内皮小凹明示增加。
(m)与这一发现相一致的，由VEGF/TAT-N17Rac诱导产生的内皮与VEGF相比明显要厚。
这些数据至少代表15个区域的平均值。
图5显示为了检测VEGF/VPF对血管通透性影响而进行的改良Mile’s实验的结果。Evansblue从静脉穿出进入皮肤组织是监测VEGF诱导生成的血管通透性的指示，将Evans blue从Balb/c小鼠尾部静脉注入，5分钟后，20ul含有2ug的TAT-N17Rac经皮内注射，30分钟后，再将20ul含有50ngVEGF的PBS液经相同部位注射入皮内，相同剂量的TAT-N17Rac和BSA单独作为阴性对照，使用数码相机系统间隔记录Evans blue的外渗，结果显示，单独注入VEGF，通过检测Evans blue染料外渗可知VEGF能快速诱导血管通透性反应，VEGF诱导的血管通透性在注射3分钟后就能检测到，最大影响在大约135分钟后右以检测到。
图6证明Rac能够启动VEGF诱导的生血管作用，但不是严格必须的。不过Rac是介导刺激VEGF诱导生成内皮膜孔和血管通透性这一信号系统中的必要组成部分。早期研究已经证实VEGF是最早通过VEGFR-2诱导血管发生和血管通透性的。为了深入地详细研究VEGF-Rac信号通路和了解潜在的机制，将PAE/VEGFR-2细胞中VEGFR-2转导的信号通路与目前的研究联系起来。在VEGF(10ng/ml)刺激下，VEGFR-2发生磷酸化，从而以时间依赖方式引起PLCγ、Akt、eNOS、Erk1/2磷酸化，PLCγ、Akt和eNOS最大磷酸化作用在10-15分钟后可以观察到，而Erk1/2最大磷酸化作用则在30-60分钟后才能观察到，为了确定磷酯酰肌醇激酶(PI3K)在激活Rac和胞内信号级联反应的作用有多大，我们在实验中使用一种叫渥曼青霉素的PI3K的特异性抑制剂，这种试剂可先后在30分钟内特异性地阻断Akt和eNOS磷酸化，这与内皮细胞中Akt是eNOS重要激活子是相符合，渥曼青霉素减少Erk1/2磷酸化的程度很小。为了阐明VEGFR-2与Rac之间的功能关系，我们用GST-PAK与谷胱甘肽-琼脂糖珠结合进行免疫沉淀实验，随后又用Rac抗体进行blotting.，这个实验使我们能特异性地检测到Rac的活化片段。在VEGF刺激10分钟后，可观察到GTP-Rac至少增加了10倍，且渥曼青霉素能阻断这一作用，这个实验结果显示Rac的激活要依赖PI3K，而PI3K也能引起Akt和eNOS的活化。这样，在VEGF刺激的信号通路中PI3K同样是一个重要的激活因子。
图7显示在大鼠中右部脑动脉瞬时闭塞2小时后，用TAT-N17Rac治疗，24小时大鼠脑部梗塞体积将减少。只有载体到达的对照组，梗塞体积是20.1±2.7％，而给予TAT-N17Rac治疗的梗塞体积是12.3±2.7％，两者在统计学上有明显差异。
例子例1下面描述的这个实验提供了一个依据，即N17Rac能够大大地抑制VEGF介导的血管通透性，但不影响VEGF介导的生血管反应。
体外实验显示，在表达VEGFR-2内皮细胞中VEGF诱导肌动蛋白重组织，引起细胞伸长呈纺缍形状改变，但却不能使表达VEGFR-1的细胞改变。当N17Rac经cDNA转染或显微注射突变蛋白的方法进入表达VEGFR-2细胞中，VEGF就不能诱导肌动蛋白重组织和细胞形状呈纺缍样改变。并且，可透过细胞膜的Rac拮抗剂(Rho拮抗剂)TAT-N17Rac改变了渗漏生血管模型，它对于完全阻断VEGF诱导形成血管膜孔是必须的，但是对于生血管却是非必须。最后，VEGF诱导的血管通透性增加也可以被Rac拮抗剂阻断。
体内实验，在小鼠角膜生血管模型中，VEGF诱导的新毛细血管形成膜孔，而FGF-2诱导的新细血管则不形成膜孔。VEGF进一步使小凹增加可能介导内皮细胞的胞吞作用。VEGF诱导的血管形成的膜孔与新形成的微血管通透性增加有关。
例2下面描述的是，在组织低氧如中风情况下上调VEGF将带来严重的后果。血脑屏障通透性增加引起水肿，从而使组织压力升高、血供受损。严重情况下，这不仅可能引起嵌顿/疝，还可能减少受损区域及周围的局部血供，这样梗塞体积随时间而扩大。在大鼠中风模型中，我们观察到当中脑动脉闭塞2小时后给予N17Rac治疗，梗塞体积将比只给予载体的大鼠小。
例1的材料与方法试剂、细胞、动物重组人VEGF165准备如前所述。重组人FGF-2从Scios Novainc，Mountainview California获得。质粒构建包括显性失活的Rac cDNA(pGEX N17Rac和pEXV myc tag V12N17Rac1)，由Dr.Alan Hall惠赠。表达VEGFR-1和VEGFR-2的稳定猪主动脉内皮(PAE)细胞株的建立如前所述，保存在附加青毒素/链毒素和10％胎牛血清(FCS)的Ham’s F12培养基中。将4只或更少5-6周龄的C57BI6/J雄小鼠关在笼子里以使其适应新环境。在进行所有实验前将动物麻醉在甲氧氟烷箱中，随后用致死剂量的甲氧氟烷将动物杀死。实验中所使用的动物是经动物保护和使用委员会的同意。
小鼠角膜血管发生实验小鼠角膜实验按前面描述的方法进行。角膜微囊是用改良的瓦哥尔非型白内障小刀在5-6周龄的C57BI6/J雄小鼠两只眼睛上建立，一个覆盖了亲水多聚物NCC的蔗糖和硫化铝微小植块(0.35*0.35mm)，包裹了160ngVEGF或GFG-2带有或不带有可透过细胞膜的Rac拮抗剂(TAT-N17Rac)，被植入到每一个微囊植块的位置离角膜边缘0.6-0.8mm.，植入后用红霉素搽每一个眼睛。植入后5-6天用狭缝灯生物显微镜检测眼睛，这样血管的长度和血管发生轮廓就可以测到了。
电子显微镜当VEGF或GFG-2植入6天后，将动物杀死，取出眼睛，用3％戊二醛，0.1M二甲胂酸钠-HCL缓冲液(pH7.3)，0.5M蔗糖浸泡和固定几小时后，对有血管正在生长的角膜部分进行解剖，切下一小片，放到新鲜的固定液中，用缓冲液冲洗后，标本在1.5％锇酸，0.1M二甲胂酸缓冲液(pH7.3)，0.7％亚铁氰化钠溶液中4℃再固定2小时。用乙醇(70％、95％、100％)脱水，用2％乙酸双氧铀乙醇溶液染色，用低粘度的环氧树脂包埋。薄片用钻石刀在角膜表面垂直切下，放到碳覆盖的透明塑料胶片上，用alkaline lead citrate染色，用飞利浦CM120Twin电子显微镜在80kv下检测。
渗透性实验将6周龄的Balb/c雌白鼠刮毛，4天后，用碳酸锂和咪锉安定以1∶1混合的含氧溶液麻醉小鼠，将150ul 1％的偶氮蓝染液从尾部静脉注入每只小鼠，5分钟后，将含有50ngVEGF加上和不加2ug TAT-N17Rac的20ulPBS注入同一只小鼠背部中间的相邻位置，偶氮蓝染液外渗用数码相机连续记录4小时，2ugBSA或TAT-N17Rac作为对照，注入另一组动物的相同位置，每一处理和对照组都由5只动物组成。
显微注射PAE/VEGFR-2用含10％胎牛血清(FCS)的Ham’s F12培养基培养，在盖玻片上生长到汇合率达70％，显微注射前换成无血清Ham’s F12培养基，用Zeiss自动注射系统和Eppendorf的玻璃毛细管，将重组的显性失活Rac蛋白(用GST标签纯化方法从E.coli中纯化)注入正在生长的细胞胞浆中，注射Rac蛋白的浓度是0.5ug/ul，显微注射缓冲液由50mMTris，50mMNaCL，5mMgCL2，0.1mMDTT组成，含有0.5ug/ul兔IgG的显微注射缓冲液作为对照，注射后不久，给细胞加入含100ng/mlVEGF，2％FCS Ham’s F12培养基孵育12小时后，用3％甲醛PBS(pH7.5)溶液固定30分钟后，用PBS冲洗3次。接着用0.5％TritonX-100 PBS溶液透化30分钟后，再用PBS洗3次。最后用1ug/mlTRITC-毒伞素PBS液染色30分钟，用PBS洗5次后，盖玻片用含有0.1％对苯二胺的甘油和PBS(90∶10)混合物固定制成标本，最后用荧光显微镜观察细胞。
转染单层的PAE/VEGFR-2细胞生长在六孔板中的盖玻片上，用含10％FCS的Ham’s F12培养基培养，当细胞汇合率达70％时，培养基换成1ml Opti-MEM，根据厂商推荐的方法，用10ug含c-myc标签的V12N17Rac DNA和20ug脂质体进行转染，8小时后加入含100ng/mlVEGF、10％FCS的Ham’s F12培养基，孵育12小时。用3％甲醛PBS(pH7.5)溶液固定30分钟后，用PBS冲洗3次，再用0.5％Triton X-100 PBS溶液透化30分钟，最后用PBS洗。接着与抗myc标签的单克隆抗体(9E10)一起孵育1小时，用PBS冲洗几次后，用FITC结合的兔抗鼠IgG染色1小时，再用PBS洗。最后用TRITC-毒伞素染色，荧光显微镜观察结果。
免疫组织化学法生长因子植块植入5天后摘出小鼠眼睛，立即置于干冰上，使用前放在-80℃保存。10um冰冻切片用冷冻切片机切，切片在空气中干燥10分钟，用丙酮固定，再用30％未免疫的羊血清封闭。内源性的生物素用抗生物素蛋白—生物素试剂封闭。加入一抗混合物(一抗混合物包括大鼠抗小鼠CD31和小鼠抗人结蛋白)，室温下孵育1小时，反复冲洗后，向组织切片中加入二抗(二抗是兔抗大鼠-FITC和生物素化的羊抗小鼠IgG)，孵育30分钟。接着严格冲洗，向标本中加入链毒素抗生物素结合Cy3，孵育30分钟，用PBS洗，片子用90％甘油封闭制成标本，在荧光显微镜下放大20倍观察，成像用数码相机储存，用Adobe photoshop6.0软件进一步分析。
细胞形态实验和肌动蛋白染色PAE/VEGFR-1和PAE/VEGFR-2细胞生长在12孔板中的盖玻片上，用含10％FCS的Ham’s F12培养基培养，当细胞汇合率达40-60％时，弃去旧培养液，换成新鲜的含2％FCS的Ham’s F12培养基，加上或不加上VEGF、PLGF、PLGF/VEGF或25％的条件培养基。16小时后，细胞用3％的低聚甲醛PBS(pH7.5)溶液固定30分钟，然后用PBS冲洗3次，再用0.5％Triton X-100 PBS溶液透化15分钟，用PBS冲洗3次，用1ug/mlTRITC-毒伞素PBS液染色30分钟。PBS洗3次后，盖玻片用含有甘油和PBS(9∶1)混合物固定制成标本，最后用复合光和荧光显微镜观察细胞。
检测GTP-RacPAE/VEGFR-2细胞(5×106)用无血清Ham’s F12培养基饥饿19小时，加上或不加上渥曼青霉素作预处理，用50ng/mlVEGF刺激10分钟。细胞用GST-Fish缓冲液裂解(50mmol/l Tris pH7.2，1％Triton X-100，0.5％脱氧胆酸钠，0.1％SDS，500mmol/lNaCL，10mmol/lMgCL2，10ug/ml抑蛋白酶肽/亮抑蛋白酶肽，1mmol/LPMSF)。当细胞裂解液离心后，上清与GST-PAK-CD-sepharose结合。简而言之，含GST-PAK的细菌裂解液(1.2ml)上清与300ul 50％GSH-sepharose的PBS溶液4℃孵育1小时，形成首尾相连。结合后的sepharose珠用细菌裂解液缓冲液洗3次后，用0.5mlGST-Fish缓冲液重悬，100ulGST-PAK sepharos与细胞裂解液孵育1小时，经广泛冲洗后，用LDS终止液处理后的结合材料被释放，Western blotting(ECL)进一步分析，用小鼠抗人Rac1单克隆抗体。
信号转导实验PAE/VEGFR-2细胞在60mm板上生长到汇合率达90％时，清洗，用无血清培养基(RPMI)孵育30分钟。加入500ul含有1.2ug/ml的抑蛋白酶肽、抑胃酶肽和亮抑蛋白酶肽，1.25mmol/lNaF，PMSF，正钒酸钠的LDS裂解缓冲液使细胞活性被终止。样品混匀30秒后14,000rpm离心10分钟。等量的蛋白样品用SDS-PAGE(10％BAS-Tris)分开.蛋白转到硝酸纤维素膜上，用含0.1％吐温的5％小牛血清白蛋白PBS溶液封闭非特异性位点。抗体溶解在含5％BSA和0.1％吐温的PBS溶液，在4℃下对膜进行探测过夜，以检测P-Akt(ser473)、P-eNOS(ser1177)、P-Erk1/2(Tyr204)、P-KDR。这些检测须在含有1％BSA和0.1％吐温的PBS溶液中孵育1小时后才能进行。过氧化物结合的兔免疫球蛋白在检测P-Akt、P-eNOS和P-PLCγ时以1∶1000稀释，在检测P-Erk1/2时以1∶5000稀释，在检测P-VEGFR-2时以1∶40000稀释，蛋白条带用增强的化学发光屏显示观察。
在VEGFR-2/PAE细胞中，VEGF诱导的(10ng/ml)VEGFR-2、PLCγ、Erk1/2、Akt和e-NOS的磷酸化以及Rac的活化用Western blotting检测，每一个样品用相同量的细胞裂解液。细胞与10ng/mlVEGF和其它磷酸化酶共孵育10分钟后测定与VEGF起反应的VEGFR-2的自动磷酸化情况，孵育10分钟后测定GTR-Rac，细胞与渥曼青霉素预孵育10分钟是为了封闭PI3K的活性。
例2的材料与方法大鼠中风模型成年的雌性Sprague-Dawley大鼠重275-300g，禁水一晚，用70％亚硝酸氧化物和30％的氧组成的混合物麻醉大鼠，用腔内缝合技术使右侧中脑动脉闭锁。从颈中线切口处用3-0缝线将颈总动脉与颈外动脉连接起来，将一根顶端(0.3-0.32mm)用火焰烧圆且覆盖poly-L-lysin的尼龙丝(0.25mm)，从动脉分叉处插入颈内动脉，直到感到阻力增加-—此处是中脑动脉的开端(常常要引入19mm的细丝)，细丝插入后，中止麻醉使大鼠恢复意识。两小时后对待测大鼠进行神经学上的评估(按照Bederson和Pitts等提供的方法，1986 30/id)。只有能够向右转圈行为的大鼠才能在本实验中采用。在麻醉状态下，撤去细丝后中脑动脉循环重新建立。此后将一根导管插入颈总动脉，过10秒钟后供给大鼠0.3ml的肽TAT-N17Rac(15ug)，对照大鼠只得到载体。然后动脉连接，皮肤缝合，大鼠恢复意识。
24小时后再次将大鼠麻醉(戊巴比妥，50mg/kg)，去头后大脑作冠状切片(2mm)，将切片暴露在2％2，3，5-氧化三苯基四氮唑溶液中以标记活的(红色)和梗塞(白色)区域。用成像分析系统检测梗塞的扩展，测得的梗塞体积通过水肿系数的分区调整为水肿体积，比如把每张切片右脑体积与左脑体积分开，梗塞体积表示成整个大脑体积的百分数。
权利要求
1.本课题是关于一种抑制或降低血管渗漏性增加的方法，该方法是通过将血管暴露在较高水平的能增加血管渗漏性的因子中，其中还包括给予该课题所述的Rho家族成员拮抗剂。
2.本课题还是关于一种通过这样的处理以阻止或降低组织水肿的方法，该方法包括将血管暴露在较高水平的能增加血管渗漏性的因子中，还包括给予该课题所述的Rho家族成员拮抗剂。
3.根据权利要求1或2所述的方法，所述的因子还能刺激组织的血管生成，包括所提到的血管，并且这种方法大体上不会抑制或降低血管的生成。
4.根据权利要求1或2或3所述的方法，所述的血管包括下列组织中的血管心肌组织；脑组织；肺组织；骨胳肌组织；肾组织；肝组织和皮肤。
5.根据权利要求1或2或3或4所述的方法，所述的因子是血管内皮生长因子(VEGF)或血管渗透因子(VPF)。
6.根据前面任何一项权利要求所述的方法，该方法将来还包括给予因子以刺激血管生成。
7.根据权利要求6所述的方法，该方法所述的刺激血管生成因子与血管渗漏性增加因子不同。
8.根据权利要求1-7中任何一项权利要求所述的方法，该方法所述的将血管暴露在较高水平的因子中所得到的结果是在慢性或急性疾病的情况下进行的。
9.根据权利要求8所述的方法，该方法所述的慢性或急性病包括下列疾病缺血性心脏病，包括动脉粥样硬化；缺血性中风；出血性中风；糖尿病；炎症，包括类风湿性关结炎；高山病。
10.根据权利要求1-9中任一项权利要求所述的方法，所述的Rho家族成员包括下面一组RhoA，RhoB，RhoC，Rac1，Rac2，Rac3，CDC-42和Rho相关蛋白激酶。
11.根据权利要求1-10中任一项权利要求所述的方法，所述的Rho家族成员拮抗剂是一种多肽或蛋白。
12.根据权利要求1-10中任一项权利要求所述的方法，所述的Rho家族成员拮抗剂是一种非多肽小分子。
13.根据权利要求11所述的方法，该方法所述的Rho家族成员拮抗剂包括N17 Rac的氨基酸序列。
14.根据权利要求11所述的方法，该方法所说的Rho家族成员拮抗剂是Cdc42拮抗剂。
15.根据前面的任何一项权利要求所述的方法，所述的Rho家族成员拮抗剂有一半能增加细胞的渗漏性。
16.根据前面的任何一项权利要求所述的方法，所述的那一半是一种多肽氨基酸序列。
17.根据权利要求16所述的方法，所述的氨基酸序列与下面一组多肽氨基酸序列不同或至少部分不同TAT；卡波西成纤维生长因子(K-FGF)；Grb2(SH2domain)和整合素β3。
18.根据前面的任何一项权利要求所述的方法，所述的给药取代下面一组给药途径胃肠外给药；口服给药；直肠给药。
19.根据前面的任何一项权利要求所述的方法，所述的给药取代下面一组胃肠外给药途径动脉内给药；静脉内给药；颅内给药；皮内给药；皮下给药；肌肉内给药；鼻内给药和肺内给药。
20.药物学成分包括活性成分Rho家族成员拮抗剂和药物学上可接受的载体或稀释度。
21.用于治疗和预防由于将血管暴露在较高水平的能增加血管渗漏性的因子中，引起血管渗漏性增加的药物学成分包括活性成分-Rho家族成员拮抗剂和药物学上可接受的载体或稀释度。
22.根据权利要求20或21，可用该药物成分治疗和预防由于将血管暴露在较高水平的血管内皮生长因子(VEGF)或血管渗透因子(VPF)中，引起血管渗漏性增加。
23.根据权利要求20-23中任何一项，可用该药物成分治疗和预防组织水肿包括所提到的血管的。
24.根据权利要求24，可用该药物治疗和预防下列一组组织的水肿心肌组织；脑组织；肺组织；骨胳肌组织；肾组织；肝组织和皮肤。
25.临床前可使用Rho家族成员拮抗剂治疗和预防由于将血管暴露在较高水平的能增加血管渗漏性的因子中，引起的血管渗漏性增加。
全文摘要
本项目是关于通过将血管暴露在一种较高水平的因子中，从而抑制或降低血管渗漏性增加的方法，例如血管内皮生长因子(VEGF)，它与Rho家族成员拮抗剂一起使用能增加血管通透性。
文档编号A61K38/00GK1681525SQ03821207
公开日2005年10月12日 申请日期2003年7月10日 优先权日2002年7月12日
发明者曹义海 申请人:曹义海