专利名称：人的抗人mcp－1抗体和该抗体的片段的制作方法
技术领域：
本发明涉及与人单核细胞趋化蛋白-1(以下称之为人MCP-1)结合由此抑制其生物活性的人的抗人MCP-1抗体或该抗体片段。期待该抗体和抗体片段可用作由MCP-1引起的炎症和免疫异常性疾病的治疗药。
背景技术：
趋化因子是8-10kDa的肽蛋白质，在白血球的迁移和活化中起重要作用。根据存在于趋化因子的N-端的四个半胱氨酸中头两个半胱氨酸的位置，趋化因子分成4小组，即“C趋化因子”、“CC趋化因子”、“CXC趋化因子”和“CX3C趋化因子”。MCP-1，属于CC趋化因子亚族的一种趋化因子，是具有76个氨基酸残基的单核细胞趋化活性因子，由人神经胶质瘤细胞系和单核细胞性白血病细胞系于1989年克隆(例如参见Yoshimura等人“FEBS Letter”，1989年第244卷第487-493页)。MCP-1是由单核细胞、血管内皮细胞和成纤维细胞等产生并作用于单核细胞、T细胞和嗜碱细胞，由此强化其迁移活性，产生并释放活性氧和溶酶体酶，产生并诱导细胞因子、嗜碱细胞脱粒，诱导粘连分子表达，促进产生并释放组氨酸和白细胞三烯等的多功能分子。
随着使用疾病模型动物分析的进展，特别是对慢性炎症而言，已指出MCP-1与某些炎症性疾病有关(例如参见，Schrier，D.J.等，“Journal of LeukocyteBiology”，1998年第63卷第359-363页)。另外，已报道抑制这些疾病模型动物中MCP-1活性使得症状受到抑制。例如，已报道向大鼠的胶原诱导性关节炎(以下也简称为“CIA”)或佐剂诱导性关节炎模型施用抗MCP-1抗体，使得关节炎症状减轻，提供了关节炎的预防效果和治疗效果(例如参见Youssef，S.等，“Journal of Clinical Investigation”，2000年第106卷第361-371页；和Ogata，H.等，“Journal of Pathology”，1997年第182卷第106-114页)。还报道了，在关节炎自发产生并且持续整个生命周期的MRL-lpr小鼠，当施用MCP-1时关节炎加重，而当施用MCP-1的拮抗物时关节炎减轻(例如参见，Gong，J.H.等，“Journalof Experimental Medicine”，1997年第186卷第131-137页)。
而且，随着使用MCP-1及其受体CCR2的基因缺失的小鼠分析的进展，已显示在一些炎症性疾病中，MCP-1/CCR2对疾病形成时涉及的巨嗜细胞侵入是必不可少的。例如已报道，在自身免疫小鼠中缺乏MCP-1将抑制巨嗜细胞和T细胞迁移，从而保护肾、肺、皮肤等各个脏器，从而延长生命，并且针对在CCR2基因被破坏的敲除小鼠腹部试验性诱导的炎症中的巨嗜细胞侵入受到抑制(例如参见，Kurihara，T.等，“Journal of Experimental Medicine”，1997年第186卷第1757-1762页)。还报道了，动脉硬化模型小鼠中缺乏MCP-1或CCR2将抑制巨嗜细胞在动脉壁上迁移和硬化灶(sclerotic focus)的形成(例如参见，Gosling，J.等，“Journal of Clinical Investigation”，1999年第103卷第773-778页；和Boring L.等，“Nature”，1998年第394卷第894-897页)。
在与人疾病的关系中，与变形性关节炎相比，类风湿性关节炎(下面还简称为“RA”)中滑膜液中MCP-1浓度较高，这暗示MCP-1可能在炎症性细胞侵入和炎症的诱导/强化中起着重要作用(例如参见，Akahoshi，T.等，“Arthritisand Rheumatism”1993年第36卷第762-771页；和Koch，AE.等，“Journal ofClinical Investigation”1992年第90卷第772-779页)。而且，流行病学调查证实MCP-1可能与心肌梗塞和动脉硬化的发生有关，MCP-1的细胞迁移活性可能是其危险因子，因此希望可以将MCP-1抗体用于抑制细胞迁移活性，由此预防和治疗心肌梗塞和动脉硬化。
如上所述，已证实在慢性炎症性疾病和动脉硬化中的炎症性细胞侵入和炎症诱导中涉及MCP-1。因此期望开发中和MCP-1的生物活性的特定单克隆抗体，从而提供有效地治疗以巨嗜细胞侵入作为主要因素的疾病的手段。已从小鼠和大鼠中获得几个与MCP-1结合的的单克隆抗体，并报道实际上抗MCP-1单克隆抗体抑制大鼠马杉(Masugi)型肾炎中的巨嗜细胞侵入，并在大鼠肺高血压模型中抑制巨嗜细胞侵入、抑制右心室压上升、抑制肺细动脉内膜肥大(例如参见，Wada，T.等，“FASEB Journal”，1996年第10卷第1418-1425页；和Kimura，H.等，“Lab.Invest.”，1998年第78卷第571-581页)。
发明内容
(本发明解决的技术问题)然而，由于上述抗MCP-1单克隆抗体是得自异种动物的单克隆抗体，当将它们施用到人时它们被识别为外来物质而排除，因此不适合用作药剂。尤其是在治疗诸如RA的慢性自身免疫异常性疾病时，由于需要长时间连续施用，因此出现针对施用抗体的抗体的问题。作为解决该问题的方案，已知一种获得得自人的抗人MCP-1单克隆抗体的方法(例如参照，特开平9-67399号公报)。即，用Epstein-Barr病毒(后面也简称为“EBV”)转化产生抗人MCP-1抗体的人淋巴细胞，并将所得转化细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合产生杂交瘤，由此获得人的抗人MCP-1单克隆抗体。然而，其中获得的抗体是IgM类抗体，与IgG类抗体相比，难以提供高的亲和力，并且不易操作。此外，从实用角度，EBV转化细胞仅能产生少量抗体，因此也是一个问题。另外，特开平9-67399号公报中记载的抗人MCP-1的IgM抗体证实具有与人MCP-1结合的活性，但是没有证实中和活性。
除了上述方法之外，也可以使用基因工程技术将抗MCP-1的小鼠单克隆抗体人源化。但是，即使人源化的抗体，不能避免在接受重复施用或长期施用的慢性疾病患者中可能产生抑制抗人MCP-1抗体的活性的抗体(抑制抗体)。
(解决这些问题的方法)鉴于这种状况，本发明人们，经过深入研究，结果提供了由健康成人的末梢血B淋巴细胞制备的免疫球蛋白的VH链和VL链基因为材料，所构建的噬菌体展示文库中的一种完全的人的抗人MCP-1抗体单链Fv(scFv)分子，并阐明了所述抗体的VH和VL链。使用所述人抗体的序列信息制备的完整的人的抗人MCP-1抗体以及所述抗体的片段可以与人MCP-1结合并抑制其生物活性，由此预防/治疗炎症性疾病。
(与现有技术相比的有益效果)如上所述，本发明的得自人的抗人MCP-1的scFv，特异性地与人MCP-1结合，由此抑制人MCP-1的细胞迁移活性。因此期望所述scFv以及所述scFv的VH链和VL链与人抗体恒定区或其一部分结合的人的抗人MCP-1抗体或者所述人的抗人MCP-1抗体的片段用于治疗涉及人MCP-1的疾病，例如慢性炎症性疾病和动脉硬化等。使用这些抗体，包括与人MCP-1结合但是不呈现人MCP-1的抑制活性的抗体，也可以测定人MCP-1的血中浓度，由此监控病症的进展。
附图简述
图1是显示评价分离克隆的scFv与人MCP-1的特异性的ELISA结果图。
图2是显示测定得自人的纯化scFv与人MCP-1的结合性的ELISA结果图。
图3是显示scFv抑制人MCP-1介导的人单核细胞细胞系THP-1的细胞迁移的图。
图4显示纯化的完整分子型MC32的HPLC图(流速0.5mL/分钟；起始缓冲液100mM PB，pH7.2+0.5M NaCl)。
图5是显示纯化的完整分子型MC32与MCP-1的结合的图。
实施本发明的最佳方式本发明的结合人MCP-1的人抗体和所述抗体的片段例如可以通过下面所述的步骤制备。
从健康成人的末梢血B淋巴细胞提取mRNA，并用定义于VH链和VL链基因的两端的引物对通过RT-PCR法扩增免疫球蛋白VH链和VL链基因，从而获得具有不同序列的各组H链和L链的V区域。然后，再用编码肽接头的DNA和定义所述DNA的两端的引物对进行扩增，以便所述DNA的末端分别与H链基因和L链基因相连，从而制备H链和L链的V区域随机组合的scFvDNA群。将所得scFv DNA整合到嗜菌粒载体pCANTAB5E中，制备scFv噬菌体展示文库。然后将该文库与固定在塑料管上的人MCP-1反应，通过洗涤除去未反应的scFv噬菌体之后，用酸洗脱与人MCP-1结合的scFv噬菌体克隆。用分离的噬菌体克隆制备scFv DNA并将其整合到表达载体中，并通过常规方法培养用所述表达载体转化的宿主细胞，从而仅得到所需的scFv蛋白质。
作为scFv DNA的表达方法，例如可以在大肠杆菌内进行表达。在大肠杆菌中表达的情况下，可以用常用且有用的启动子，将抗体分泌信号序列与待表达的scFv功能地相连，从而进行表达。作为启动子，例如可以举出的有lacZ启动子、araB启动子等。作为分泌scFv的信号序列，在大肠杆菌的周质中表达的情况下，可以使用pelB信号序列(Lei，SP.等，J.Bacteriol.，1987，1694379-4383)。为了分泌到培养上清液中，也可以使用M13噬菌体的g3蛋白的信号序列。
如上所述表达的scFv可以在细胞内或细胞外与宿主分离并纯化至均质。由于本发明表达的scFv在其C-末端具有E tag序列，因此可以用抗E tag抗体通过亲和层析法短时间内容易地将其纯化。也可以通过常规的蛋白质分离、纯化法进行组合纯化。例如，可以通过超滤、盐析、凝胶过滤/离子交换/疏水层析法等柱层析法的组合分离并纯化该抗体。
根据本发明获得的scFv蛋白具有与人MCP-1的结合活性。作为本发明使用的抗人MCP-1抗体的抗原结合活性的测定方法，有ELISA、BIAcore等方法。例如，在使用ELISA的情况下，含所需抗人MCP-1抗体或所述抗体的片段的样品，例如大肠杆菌的培养上清液或纯化抗体，可以加入到固定人MCP-1的96-孔板中。然后可以向该板中加入用过氧化物酶等酶标记的第二抗体。将该板孵育、洗涤并加入发色基质TMBZ，测定吸光度，由此评价抗原结合活性。
而且，根据本发明获得的scFv蛋白，抑制人MCP-1介导的细胞迁移活性。用本领域常用的趋化性测定，例如Grob等的方法(Grob.PM.等，J.Biol.Chem.，1990，2658311-8316)可以研究人MCP-1对敏感细胞的迁移(趋化性)。具体地说，使用可商购获得的趋化性室，用培养液，例如RPMI 1640分别稀释抗人MCP-1抗体和人MCP-1，并混合在一起，将该混合物在室温下孵育一定时间，然后加入到用过滤器分隔的该室的下层。然后，将人MCP-1敏感性细胞，例如单核细胞细胞系THP-1或人末梢血单核细胞(后面也简称为“PBMC”)的悬液加入到该室的上层，并在37℃下静置一定时间。迁移细胞将通过其上安装的过滤器移动到室下层，因此粘附在过滤器上的细胞可以用Giemsa染色液等染色，对细胞数进行计数。或者，可以用Coulter计数器等对移动到室下层的细胞数计数。而且，代替上述室，也可以使用可商购获得的趋化性测定用的一次性测定元件，该趋化性测定系统证实本发明的scFv蛋白抑制人MCP-1的细胞迁移活性。
如上所述，由于根据本发明获得的scFv蛋白可以浓度依赖性方式抑制人MCP-1的细胞迁移活性，因此期望能够有效地预防或治疗因所述细胞迁移引起的疾病。
具有上述抑制活性的scFv克隆的VH链和VL链的氨基酸序列及其编码碱基序列，分别用序列号1和2(VH链)和序列号6和7(LV链)表示。
此外，下面显示了上述序列中包括的VH链和VL链的互补决定区(CDR 1-3)的氨基酸序列。
CDR1Ser Tyr Ala Ile Ser<序列号3>
CDR2Gly Phe Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly<序列号4>
CDR3Asp Leu Gly Gly Gly Asp Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val<序列号5> CDRlArg Ser Ser Gln Ser Ile Asn Thr Tyr Leu His<序列号8>
CDR2Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser<序列号9>
CDR3Gln Gln Ser Phe Thr Thr Pro Leu Thr<序列号10>
而且，本发明的VH链和VL链包括上述氨基酸序列中一个或几个氨基酸残基发生缺失、取代和添加后所得的那些氨基酸序列。
尽管本文公开的人的抗人MCP-1抗体的VH链和/或VL链是通过噬菌体抗体法以scFv形式获得的，但是本发明还包括公开的VH链和/或VL链与人免疫球蛋白的恒定区结合的完整分子型人的抗人MCP-1抗体、以及公开的VH链和/或VL链与人免疫球蛋白的一部分恒定区结合的Fab、Fab’或F(ab’)2等人的抗人MCP-1抗体片段、和scFv与人免疫球蛋白的恒定区结合的人的抗人MCP-1单链抗体(scAb)等其它人的抗人MCP-1抗体片段，以及编码这些抗体和抗体片段的基因片段。而且，本发明还包括聚乙二醇等高分子量修饰剂与这些抗体和抗体片段蛋白分子结合的经修饰蛋白质分子。为了制备H链和L链的每个Fv都由合适接头连接在一起的scFv，例如可以使用由10-25个氨基酸残基构成的任意单链肽作为肽接头。
工业实用性如上所述，本发明的人的抗人MCP-1抗体和所述抗体片段分子，含有得自人的抗人MCP-1抗体的可变区域，可以有效地与人MCP-1相互作用，由此抑制人MCP-1和人MCP-1受体之间的结合。此外，本发明的人的抗人MCP-1抗体和所述抗体片段分子可以抑制人MCP-1诱导的各种免疫应答，因此可用作预防和治疗所述免疫应答诱导的炎症和免疫异常性疾病的药物，例如作为消炎药或者治疗和预防自身免疫异常性疾病的药剂。此外，本发明的抗体及其片段有望用于预防和治疗心肌梗塞和动脉硬化。
下面基于实施例更详细地解释本发明，然而本发明并不限于此。
《实施例1由健康人构建噬菌体文库》参考J.D.Marks等(J.Mol.Biol.，222581-597，1991)报告的方法，以得自20名健康人的末梢血的淋巴细胞为原料构建噬菌体文库。
即，通过Ficol沉降离心法从20名健康人的末梢血中分离淋巴细胞，用PBS充分洗涤之后，用ISOGEN(日本基因株式会社)处理，制备总RNA。将该总RNA分成4个样品，并由各个样品用第一链cDNA合成试剂盒(Pharmacia biotech)利用对人IgG、IgM、K链和λ链的恒定区特异的引物制备cDNA。使用所得的每一cDNA作模板，如Marks等报告所述，使用VH(γ或μ)和JH、Vκ和Jκ、或者Vλ和Jλ的任一组合特异的引物，经聚合酶链式反应(PCR)扩增每一抗体V区域基因。
然后，通过装配PCR(McCatfferty，J等Antibody Engineering-A PracticalApproach，IRL Press，Oxford，1996)将VH(γ或μ)和Vκ以及VH(γ或μ)和Vλ通过DNA接头连在一起，制备单链scFv DNA。使用PCR法向scFv DNA中引入NotI和SfiI限制酶位点，在琼脂糖凝胶上电泳后，纯化。纯化的scFv DNA用限制酶SfiI(Takara)和NotI(Takara)消化之后，克隆到嗜菌粒pCANTAB5E(Pharmacia)中。对每个VH(γ)-Vκ、VH(γ)-Vλ、VH(μ)-Vκ和VH(μ)-Vλ，通过电穿孔将所得的结合有scFv DNA的pCANTAB5E导入到大肠杆菌TG1细胞中。由转化的TG1细胞的数量，评价VH(γ)-Vκ、VH(γ)-Vλ、VH(μ)-Vκ和VH(μ)-Vλ，分别显示1.1×108、2.1×108、8.4×107和5.3×107克隆的多样性。用Ml3KO7辅助噬菌体，在该转化的TG1上表达噬菌体抗体，制备得自健康人的scFv噬菌体展示文库。
《实施例2淘选》将人MCP-1溶解在1mL的0.1M NaHCO3中，将其在35mm碟(Iwaki)中于4℃下培养过夜、固定。用0.5％明胶/PBS于20℃下封闭2小时之后，用0.1％Tween20-PBS洗涤6次。向该盘中加入0.9mL(1×1012tu/mL)得自健康人的抗体噬菌体文库(单链抗体展示噬菌体溶液)，进行反应。
用0.1％ Tween20-PBS洗涤10次之后，加入1.0mL甘油缓冲液(pH2.2)，洗脱出与人MCP-1结合的单链抗体展示噬菌体。加入1M Tris(羟基甲基)-氨基甲烷-HCl将洗脱的噬菌体的pH调整至pH9.1之后，感染在对数生长期的大肠杆菌TG1细胞。将感染的TG1细胞在3000×g下离心分离10分钟，除去上清液，悬浮于200μL 2×YT培养基中，接种于SOBAG板上(SOB板含有2％葡萄糖、100μg/ml氨苄青霉素)，然后于30℃的保温箱中培养过夜。用刮刀(Costar)将所得菌落加入到适量的2×YT培养基中悬浮，回收。
将50μL该TG1溶液接种到30mL的2×YTAG培养基中，用辅助噬菌体补救，筛选之后制备噬菌体文库。就得自健康人的每一噬菌体文库VH(γ)-Vκ、VH(γ)-Vλ、VH(μ)-Vκ和VH(μ)-Vλ而言，用人MCP-1固定化板进行总共4次淘选。第4次淘选之后，从该SOBAG板中提取任意克隆，证实scFv表达，由人MCP-1 ELISA证实特异性并分析碱基序列。
《实施例3对人MCP-1进行ELISA筛选》为了筛选分离的克隆，如下进行ELISA。将人MCP-1和人MIP-lα(巨嗜细胞炎症性蛋白1-α)固定在ELISA板上进行筛选。将各自2μg/mL的人MCP-1或人MIP-1α，或者2.5μg/mL的人血清白蛋白(HSA)置于40μL/孔的ELISA板(Nunc)中，于4℃下静置16小时用于固定。向该固定的板中以400μL/孔加入含有0.5％BSA、0.5％明胶和5％脱脂乳的PBS溶液，在4℃下静置2小时用于封闭。
加入40μL/孔的含有scFv呈现噬菌体的样品溶液进行反应之后，将这些样品溶液倒掉并用洗涤液洗涤5次。使该板与生物素标记的抗-M13单克隆抗体(Pharmacia biotech)反应，然后与用碱性磷酸酯酶(AP)标记的抗小鼠IgG抗体反应。用洗涤液洗涤5次之后，加入50μL/孔的发色基质溶液(含有1g/mL对硝基苯基磷酸盐(Wako)和10％二乙醇胺(Wako)的PBS溶液)，遮光，并在室温至37℃下显影5-10分钟。使用Multiplate Autoreader NJ-2001(Inter Med)测定405nm下的吸光度，结果证实所有评价的克隆对人MCP-1是特异性的(图1)。
《实施例4克隆的序列分析》使用Dye终止子循环测序FS Ready Reaction试剂盒(Applied Biosystems)测定分离的克隆scFv基因VH和VL的DNA碱基序列(序列号1和6)。根据ELISA和序列分析的结果将分离的克隆分成4类。
《实施例5得自人的抗人MCP-1 scFv的表达和纯化》从上述实施例2和3中分离的与人MCP-1反应的4个scFv克隆MC8、MC15、MC32和MC59中回收质粒DNA并根据常规技术用所述质粒DNA转化大肠杆菌HB1251。将这些大肠杆菌在含有2％葡萄糖的2×YT培养基上培养过夜，然后将一部分转移到没有葡萄糖的2×YT培养基上并向其上加入最终浓度为1mM的IPTG用于培养过夜，诱导scFv的表达。培养结束之后离心回收细胞，将其悬浮于含有1mM EDTA的PBS中并在冰上放置30分钟。然后，在8,900×g下离心30分钟，回收上清液并通过0.45μm过滤器过滤之后，将滤液作为从周质部分纯化scFv的原料。
用抗-E tag抗体通过亲和层析法根据常规技术纯化由此制备的纯化原料。用PBS透析之后，根据其上所附的说明用内毒素除去柱Detoxi-gel(PIERCE公司)除去内毒素。用分子量切分点为10000的Centricon(Amicon)浓缩之后，经0.45μm过滤器过滤，得到纯化产品。
《实施例6纯化scFv与人MCP-1的结合性》通过ELISA法测定纯化scFv与人MCP-1的结合性。向固定有以0.5μg/mL用PBS制备的人MCP-1的96孔板(NUNC.MAXISORP)中加入100μL纯化抗体，在37℃下反应1小时。用0.05％ Tween-PBS(后面也简称为“PBST”)洗涤5次，再与标记有过氧化物酶的抗Etag抗体于37℃下反应1小时。用PBST洗涤5次之后，加入发色基质溶液显影，并测定450nm下的吸光度以评价该结合性。结果示于图2。所有这4种抗体均以浓度依赖性方式与人MCP-1结合。
《实施例7对人MCP-1的细胞迁移活性的影响》通过趋化性测定研究人MCP-1对单核细胞的迁移活性的抑制效果。将孔径为8μm的Transwells(Costar公司)安装在24孔板的每一孔上。向该24孔板中加入540μL的含有1％FCS的RPMI 1640(后面也简称为“1％FCS-RPMI”)培养基。然后，将每一调整浓度的等量scFv和2×10-8M人MCP-1(CHEMICON公司)混合并在室温下培养30分钟。将60μL的该反应液加入到含有540μL培养基的24孔板中。向Transwells中加入100μL的1％FCS-RPMI和200μL的1×106个细胞/mL的人单核细胞细胞系THP-1，并将该板在37℃下静置4小时。这些细胞留在用8μm过滤器分开的Transwell上面部分，24孔板下面部分放置抗体混合物。用Coulter计数器(Coulter公司)对通过过滤器迁移到24孔板的细胞计数。该测定的结果示于图3。在这4种抗体当中，发现MC15和MC32对人MCP-1的细胞迁移活性具有抑制效果。
《实施例8表达抗MCP-1完整分子型人抗体的质粒的构建》由整合了实施例3中分离的scFv克隆MC32的scFv DNA的表达质粒，通过PCR扩增VH链和VL链编码区域。下面显示用于该扩增的PCR引物。
5’-CGT GGC TCC TGG GCC CAC AGC CAG GTA CAG CTG CAG CAGTCA-3’<序列号11> 5’-TGA GGA TAC GGT GAC CGT GG-3’<序列号12> 5’-CGT GGC TCC TGG GCC CAC AGC GAC ATC CAG TTG ACC CAGTCT-3’<序列号13> 5’-ACG TTT GAT CTC CAC CTT GG-3’<序列号14>
将扩增的VH链和VL链的DNA克隆到整合有在动物细胞中分泌表达所需的前导序列的质粒DNA pUC18中的所述前导序列的下游。
由此获得的质粒DNA于37℃下用HindIII(TAKARA BIO株式会社)-BamHI消化2小时，并在2％琼脂糖凝胶(TAKARA BIO株式会社)上电泳，从而回收含有信号序列的VH链和VL链DNA片段。
整合有人抗体H链基因IgG1的恒定区(铰链-CH1-CH2-CH3)基因的表达质粒pCAG-H于37℃下用HindIII-BamHI消化2小时，制备载体DNA片段，向该部位插入预先制备的VH链的HindIII-BamHI片段。转化大肠杆菌HB101细胞，并由耐药(氨苄青霉素)的菌落制备该质粒，用限制酶处理，从而证实VH链插入。
同样，将VL链插入整合有人抗体L链基因κ链的恒定区(Cκ)的该表达质粒pCAG-L中。
《实施例9抗MCP-1细胞完整分子型人抗体MC32的在动物细胞内的瞬时表达及其纯化》将EMT-10用于瞬时表达。
将保持在具有8％FCS(Invitrogen株式会社)的D’MEM(Invitrogen株式会社)上的5mL BMT-10细胞以1.5×105个细胞/mL的细胞浓度分散到灭菌过的小实验盘(直径6cm；Corning株式会社)中并在CO2培养箱中于37℃下培养过夜。用PBS(SIGMA株式会社)将这些细胞洗涤2次之后，用血清浓度较低的5mLOPTI-MEM(Invitrogen株式会社)替换。提供2个由聚苯乙烯制备的一次性离心管(FALCON制造)。在一个管中，将10μL Lipofectamine试剂(Invitrogen株式会社)和90μL OPTI-MEM培养基混合在一起(后面也称之为“Lipofectamine溶液”)。在另一管中，加入3μg预先制备的H链和L链的表达质粒DNA，再向其中加入100μL的OPTI-MEM并混合(后面也称之为“DNA溶液”)。将该DNA溶液滴加到Lipofectamine溶液中混合，在室温下反应30分钟。反应结束之后，向实验盘中滴加总量(200μL)的该溶液，在CO2培养箱中于37℃下培养6小时。6小时之后，抽吸除去该培养基，慢慢加入具有8％FCS的D’MEM并在37℃下静置培养4天。4天之后，回收上清液并经0.22μm过滤器过滤，将该滤液用作纯化用的原料。
根据常规技术用Biologic Duo Flow的纯化系统(BIO RAD株式会社)和Protein G柱(Pharmacia株式会社)进行纯化。
具体地说，用PBS平衡Protein G柱之后，然后将50mL上述培养上清液以1mL/min的流速上柱。用凝胶床体积50倍的PBS洗涤之后，用0.1M甘油-HCl于pH2.7进行洗脱。将1mL洗脱液回收到预先向其中加入50μl用于中和的1M Tris-HCl，pH9.0的无ET的一次性管(FALCON 2063等)中。立即用分光光度计测定每一馏分在280nm下的吸光度并将主要馏分汇集(通常2mL)，在4℃下相对PBS透析过夜。用G3000SW柱(Toso株式会社)经HPLC并经SDS-PAGE进行纯化抗体的纯度测定。HPLC的一个结果示于图4(流速0.5mL/min.；起始缓冲液100mM PB，pH7.2+0.5M NaCl)。
《实施例10纯化完整分子型MC32抗体与MCP-1的结合性》通过ELISA法评价纯化完整分子型MC32抗体与MCP-1的结合性。用1％BSA/PBS将固定有以0.5μg/mL用PBS制备的人MCP-1(Chemicon株式会社)的96井板(Maxisorp；Nunc株式会社)封闭之后，使用以从5μg/mL开始用1％BSA-0.05％Tween/PBS以2倍连续稀释的纯化抗MCP-1完整分子型MC32。在37℃下反应1小时之后，用0.05％Tween-PBS洗涤5次，再与标记有过氧化物酶的抗人IgG抗体于37℃下反应1小时。用PBST洗涤5次之后，向板中加入发色基质TMBZ显影，并测定450nm下的吸光度以评价该结合性。结果示于图5。纯化完整分子型MC32抗体与scFv的情形相同地以浓度依赖性方式与MCP-1结合。
序列表<110>The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute<120>人的抗人MCP-1抗体和该抗体的片段<130>663985<150>JP 2002-267184<151>2002-09-12<160>14<210>1<211>366<212>DNA<213>人类<400>1cag gta cag ctg cag cag tca ggg gct gag gtg aag aag cct ggg tcc 48Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser1 5 10 15tcg gtg aag gtc tcc tgc aag gct tct gga ggc acc ttc age agc tat 96Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30gct atc agc tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggg ctt gag tgg atg144Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met35 40 45gga ggt ttt gat cct gaa gat ggt gaa aca atc tac gca cag aag ttc192Gly Gly Phe Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Gln Lys Phe50 55 60cag ggc aga gtc acc atg acc gag gac aca tct aca gac aca gcc tac240Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr65 70 75 80atg gag ctg agc age ctg aga tct gag gac acg gcc gtg tat tac tgt288Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95gca aca gat ctt ggc gga ggt gac tac tac tac ggt atg gac gtc tgg336Ala Thr Asp Leu Gly Gly Gly Asp Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp100 105 110ggc cca ggg acc acg gtc acc gta tcc tca366Gly Pro Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser115 120<210>2<211>122<212>PRT<213>人类<400>2
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser1 5 10 15Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met35 40 45Gly Gly Phe Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Gln Lys Phe50 55 60Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Thr Asp Leu Gly Gly Gly Asp Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp100 105 110Gly Pro Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser115 120<210>3<211>5<212>PRT<213>人类<220>
<223>对应于序列号2中的氨基酸号31-35的CDR1<400>3Ser Tyr Ala Ile Ser1 5<210>4<211>17<212>PRT<213>人类<220>
<223>对应于序列号2中的氨基酸号50-66的CDR2<400>4Gly Phe Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Gln Lys Phe Gln1 5 10 15Gly<210>5<211>13<212>PRT<213>人类<220>
<223>CDR3 corresponding to amino acids No.99 to No.111 in SEQ ID NO2
<400>5Asp Leu Gly Gly Gly Asp Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val1 5 10<210>6<211>324<212>DNA<213>人类<400>6gac atc cag ttg acc cag tct cct tcc acc ctg tct gct tct gtc ggg 48Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15gac aga gcc acc atc tct tgc cgg tct agt cag agc att aac acc tat 96Asp Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Asn Thr Tyr20 25 30tta cat tgg tat cag cag aaa cea ggg gaa gcc cct aaa ctc ctg ate144Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Glu Ala Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45tat gct gct tcc acc ttg caa agt ggg gtc cca tca aga ttc agt ggc192Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc atc acc act ctc caa cct240Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Thr Leu Gln Pro65 70 75 80gaa gat ttt gca act tat tac tgc caa cag agt ttc act acc cca ctc288Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Phe Thr Thr Pro Leu85 90 95act ttc ggc gga ggg acc aag gtg gag atc aaa cgt324Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105<210>7<211>108<212>PRT<213>人类<400>7Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Asn Thr Tyr20 25 30Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Glu Ala Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Thr Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Phe Thr Thr Pro Leu85 90 95Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105<210>8<211>11<212>PRT<213>人类<220>
<223>对应于序列号7中的氨基酸号24-34的CDR1<400>8Arg Ser Ser Gln Ser Ile Asn Thr Tyr Leu Hisl 5 10<210>9<211>7<212>PRT<213>人类<220>
<223>对应于序列号7中的氨基酸号50-56的CDR2<400>9Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser1 5<210>10<211>9<212>PRT<213>人类<220>
<223>对应于序列号7中的氨基酸号89-97的CDR3<400>10Gln Gln Ser Phe Thr Thr Pro Leu Thr1 5<210>11<211>42<212>DNA<213>人工<220>
<223>VH链有义引物<400>11
cgtggctcct gggcccacag ccaggtacag ctgcagcagt ca 42<210>12<211>20<212>DNA<213>人工<220>
<223>VH链反义引物<400>12tgaggatacg gtgaccgtgg 20<210>13<211>42<212>DNA<213>人工<220>
<223>VL链有义引物<400>13cgtggctcct gggcccacag cgacatccag ttgacccagt ct 42<210>14<211>20<212>DNA<213>人工<220>
<223>VL链反义引物<400>14acgtttgatc tccaccttgg 20
权利要求
1.一种编码与人单核细胞趋化蛋白-1(以下称之为“人MCP-1”)结合并抑制其生物活性的人的抗人MCP-1抗体的VH链或其部分的基因片段。
2.如权利要求1所述的基因片段，其中所述VH链的互补决定区域(CDR1-3)具有下述氨基酸序列CDR1Ser Tyr Ala Ile Ser<序列号3>CDR2Gly Phe Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly<序列号4>CDR3Asp Leu Gly Gly Gly Asp Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val<序列号5>
3.如权利要求1或2所述的基因片段，其中所述VH链具有序列号2所述的氨基酸序列，或者该氨基酸序列中有一个或几个氨基酸被缺失、取代或添加的氨基酸序列。
4.如权利要求3所述的基因片段，其中所述VH链具有序列号2所述的氨基酸序列。
5.一种编码与人MCP-1结合并抑制其生物活性的人的抗人MCP-1抗体的VL链或其部分的基因片段。
6.如权利要求5所述的基因片段，其中所述VL链的互补决定区域(CDR1-3)具有下述氨基酸序列CDR1Arg Ser Ser Gln Ser Ile Asn Thr Tyr Leu His<序列号8>CDR2Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser<序列号9>CDR3Gln Gln Ser Phe Thr Thr Pro Leu Thr<序列号10>
7.如权利要求5或6所述的基因片段，其中所述VL链具有序列号7所述的氨基酸序列，或者该氨基酸序列中有一个或几个氨基酸被缺失、取代或添加的氨基酸序列。
8.如权利要求7所述的基因片段，其中所述VL链具有序列号7所述的氨基酸序列。
9.一种编码与人MCP-1结合并抑制其生物活性的人的抗人MCP-1抗体的单链Fv(下面简称为“scFv”)的基因片段，所述基因片段由编码权利要求1-4任一项所述的VH链的基因片段和编码权利要求5-8任一项所述的VL链的基因片段结合构成。
10.一种编码与人MCP-1结合并抑制其生物活性的人的抗人MCP-1抗体的基因片段，所述基因片段由与人抗体CH链基因结合的编码权利要求1-4任一项所述的VH链的基因片段和与人抗体CL基因结合的编码权利要求5-8任一项所述的VL链的基因片段结合构成。
11.一种编码与人MCP-1结合并抑制其生物活性的人的抗人MCP-1抗体片段的基因片段，所述基因片段由结合有一部分人抗体CH链基因的编码权利要求1-4任一项所述的VH链的基因片段和结合有一部分人抗体CL基因的编码权利要求5-8任一项所述的VL链的基因片段结合构成。
12.如权利要求11所述的基因片段，其中所述抗体片段选自Fab、Fab’或F(ab’)2。
13.一种编码与人MCP-1结合并抑制其生物活性的人的抗人MCP-1抗体片段的基因片段，所述基因片段由权利要求9的scFv基因片段与一部分人抗体CH链基因或一部分人抗体CL基因结合构成。
14.一种与人MCP-1结合并抑制其生物活性的人的抗人MCP-1抗体或所述抗体片段，它是通过基因重组技术由整合有权利要求1-13任一项所述的基因片段的表达载体表达的。
15.一种修饰蛋白分子，它是由结合高分子量修饰剂的权利要求14所述的人的抗人MCP-1抗体或所述抗体片段构成的。
16.一种抑制人MCP-1活性的试剂，它包括权利要求14所述的人的抗人MCP-1抗体或所述抗体片段或者权利要求15所述的修饰蛋白分子作为有效成分。
17.一种用于预防或治疗因MCP-1引起的炎症和免疫异常性疾病的药物，所述药物利用权利要求16所述的人MCP-1活性的抑制试剂。
全文摘要
提供了有效地治疗涉及MCP－1的免疫性疾病的物质。使用噬菌体抗体法，获得对人MCP－1具有高亲合力的scFv。以由该scFv获得的VH链和VL链的数据为基础，获得人的抗人MCP－1抗体和人的抗人MCP－1抗体片段。期待该抗体和抗体片段可用作因MCP－1引起的炎症和免疫性疾病的治疗药。
文档编号A61P37/06GK1681926SQ0382155
公开日2005年10月12日 申请日期2003年9月10日 优先权日2002年9月12日
发明者杉村和久, 中岛敏博, 西原司 申请人:财团法人化学及血清疗法研究所