专利名称：甲状旁腺素样多肽的制作方法
技术领域：
本发明涉及甲状旁腺素及其片段。更特别地，本发明涉及来自非哺乳动物来源的甲状旁腺素核酸序列及多肽。
背景技术：
骨质疏松症是老年人中一种主要的疾病，其影响男性和女性。骨质疏松症是一种进行性疾病，其导致总骨量(bone mass)的减少及脆性提高。骨中的这些变化可能导致包括髋和椎骨的承重(load-bearing)骨的自发性骨折。这些骨折，与疾病引起的脆性提高，可以明显地导致患者的体质和精神恶化。闭经后骨质疏松通常是由于绝经特征雌激素水平降低而引起的。雌激素水平降低导致骨更新加速及加大了旧骨再吸收和新骨形成之间的不平衡。这导致承重骨的变薄、孔率提高及小梁缺乏(trabecular depletion)。骨质疏松症还与其它疾病状态相关，包括应用类固醇、甲状腺功能亢进、甲状旁腺功能亢进和库兴氏综合症。
甲状旁腺素(PTH)通过甲状旁腺产生，是一种主要的钙稳态调节物。PTH的主要靶细胞在骨和肾中。当血清钙降低至低于正常水平时，甲状旁腺释放PTH并通过骨钙的再吸收、通过在肾小管中钙的肾再吸收及通过PTH对肠的间接作用提高钙的吸收来提高钙的水平。尽管以低水平连续输入PTH可以从骨中移除钙，当间断注射同样低的剂量也可以促进骨的生长，因此提示其在治疗骨质疏松症中的潜在作用。
人PTH(hPTH)在甲状旁腺细胞中合成为一个115个氨基酸的前甲状旁腺素原的形式，其25氨基酸被切除产生一个甲状旁腺素原，然后6个氨基酸被切除产生hPTH的84个氨基酸的成熟形式。大多数hPTH的活性存在于N末端的1-34个氨基酸。
参与调节PTH作用的细胞内通路已被阐明。在肾和成骨细胞系中，PTH引发了几种平行的胞内信号反应，包括激活腺苷酸环化酶(AC)、蛋白激酶A(PKA)、磷脂酶(PLC)和蛋白激酶C(PKC)并且产生第二信使如环AMP(cAMP)、肌醇三磷酸(IP3)、二酰甘油和升高的胞质游离钙(Ca2+)。PLC的激活刺激了膜结合PKC的活性。已经考虑了多种基团，激活AC/PKA信号的结构决定簇与激活PLC/PKC的那些不同，这些分别存在于PTH(1-34)的N-和C-末端结构域中。特别地，区域hPTH(29-32)已被特异鉴定为关键的PKC激活结构域。已知骨生长的提高(即用于治疗骨质疏松症的效果)与肽序列升高AC活性的能力相关。天然hPTH(1-34)序列已经示出具有所有这些活性。
目前，已经克隆了三个结构相关但不同种类的PTH受体，PTH-1R和PTH-2R和来自斑马鱼(zebrafish)第三个PTH受体，PTH3R(Juppner等，Receptors for Parathyroid Hormone and Parathyroid Hormone-relatedPeptideExploration of Their Biological Importance.In Bone，Vol 25 No.1，July 199987-90)。其中第一个受体，哺乳动物PTH-1R分离自骨和肾细胞，并且当在缺少内源性PTH-1R的细胞中异源表达时，其示出转导多种对PTH(1-34)或甲状旁腺素相关的蛋白质(PTHrP)(1-36)的信号反应。哺乳动物PTH-2R的作用尚未指明。这个受体特异地被PTH而不是PTHrP激活。阐明PTH分子的特异区域对其结合和信号传递性质的努力已经主要通过使用通常对啮齿动物的复杂体内生物分析、器官培养、分离的细胞膜或细胞系而进行。编码不同的PTH-PTHrP受体的3个cDNA已从斑马鱼中鉴定。这些推定受体的两个看来是PTH1R和PTH2R的鱼类同源物，而第三个编码新的受体蛋白，PTH3R(Rubin等，J Biol Chem，27428185-28190(1999)，Rubin and Juppner，Isolation and characterization of a novelparathyroid hormone-related peptide(PTHrPrp)-selective receptor and thehomolog of the mammalian Parathyroid Hormone(PTH/PTHrP)Receptor(PTH1R)from zebrafish.In Danks，J.，Dacke，C.，and Gay.C，CalciumMetabolismComparative Endocrinology.BristolBioScientifica.19991-6)。
已知hPTH和某些hPTH的类似物是用于治疗骨质疏松症的骨生长刺激物。尽管hPTH(1-84)和hPTH(1-34)是治疗骨质疏松症和其它人类疾病的有希望的一个候选物，还是有一些相关问题，如高钙血症。因此，需要鉴定或生产hPTH的变体，其提供了hPTH的生物学活性但具有最小的或降低的临床副作用。
发明简述尽管甲状旁腺素(PTH)是哺乳动物主要的高血钙激素，至今还未认为其存在于在进化树上早于两栖类动物的任何动物中，因为两栖类是最早的具有明显的甲状旁腺的动物。本发明人从红鳍东方鲀(Fugu rubripes)中分离了一种具有在哺乳动物的钙代谢和稳态中可以起重要的治疗作用的潜力的多肽。
因此，本发明第一方面提供了一种基本上纯化的多肽或其生物学活性片段，其中所述多肽包含与SEQ ID NO1所示的氨基酸序列具有至少45％序列相同性的氨基酸序列。
第二方面，本发明提供了一种分离的核酸分子，其编码第一方面的多肽或生物学活性片段。
第三方面，本发明提供了一种重组宿主，其中所述重组宿主包括编码第一方面的多肽或生物学活性片段的核酸分子。
第四方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含第一方面的多肽或生物学活性片段或第二方面的核酸分子，任选与一种药物可接受的载体组合。
第五方面，本发明提供了一种治疗与对象中异常钙稳态相关的疾病的方法，所述方法包括给予对象治疗有效量的第一方面的多肽或生物学活性片段，第二方面的核酸分子，或第四方面的药物组合物。
第六方面，本发明提供了一种治疗由改变的或过度的PTH受体作用导致的疾病的方法，所述方法包括给予对象治疗有效量的第一方面的多肽或生物学活性片段，第二方面的核酸分子，或第四方面的药物组合物。
第七方面，本发明提供了一种确定骨形成、骨再吸收和/或骨再建的速度的方法，包括给予对象治疗有效量的用适当可检测标记标记的第一方面的多肽或生物学活性片段，并确定所述对象的骨对所述多肽或生物学活性片段的摄取。
第八方面，本发明提供了一种抗体，其中所述抗体特异结合第一方面的多肽或生物学活性片段。
附图简述
图1示出了突出显示(黑体加框)的正向和反向引物得到的244bp的Fugu PTH DNA的核苷酸序列(SEQ ID NO3)。
图2示出了Fugu PTH(1-80)的氨基酸序列(SEQ ID NO1)。
图3示出了Fugu PTH基因的核苷酸序列(SEQ ID NO2)。
图4提供了Fugu PTH(1-80)和人PTH(1-84)、鸡PTH(1-88)、FuguPTHrP、sparus PTHrP(AF197094)和人PTHrP(p12272)的多序列对比。PTH和PTHrP的相同参见分别是黑色或灰色阴影表示。
图5(A)示出了Fugu PTH(1-34)、Fugu PTHrP(1-34)、人PTH(1-34)和人PTHrP(1-34)在UMR106.01细胞中的腺苷酸环化酶的反应；(B)示出了Fugu PTH(1-34)、Fugu PTHrP(1-34)、Fugu PTH(1-26)、Fugu PTH(1-29)、Fugu PTH(2-34)、Fugu PTH(1-32)和Fugu PTH(7-34)的腺苷酸环化酶的反应。结果以三组数的平均数±SE表示。Fugu PTH(1-34)的ID50是15nM，Fugu PTHrP(1-34)的是1.5nM，Fugu PTH(1-32)的是9nM。Fugu PTH(1-34)和Fugu PTH(1-32)都比Fugu PTHrP(1-34)获得了更高程度的最大化cAMP反应。Fugu PTH(2-34)当使用100nM或更高时有效刺激了cAMP反应；(C)示出了当分别在存在和不存在5nM和100nM的Fugu PTH(1-34)共孵育5nM和500nM的Fugu PTH(1-29)时的腺苷酸环化酶反应。未检测到拮抗剂作用。观测到的cAMP反应与FuguPTH(1-34)的具有同样的程度，因为Fugu PTH(1-29)本身似乎未有效地刺激腺苷酸环化酶反应；(D)示出了当分别在存在和不存在5nM和100nM的Fugu PTH(1-34)共孵育5nM和500nM的Fugu PTH(2-34)时的腺苷酸环化酶反应。未检测到拮抗剂作用，而且当100nM Fugu PTH(1-34)和500nM Fugu PTH(2-34)共孵育时，观察到的cAMP反应要大于分别测试时两个肽作用的总和；(E)示出了当分别在存在和不存在5nM和100nM的Fugu PTH(1-34)共孵育5nM和500nM的Fugu PTH(7-34)时的腺苷酸环化酶反应。未检测到拮抗剂作用。当100nM Fugu PTH(1-34)和500nMFugu PTH(7-34)共孵育时，观察到的cAMP反应要大于分别测试时两个肽作用的总和。
图6示出了未处理的大鼠和用Fugu PTH(1-34)处理的大鼠的近端胫骨(由左至右)的染色切片，示出Fugu PTH(1-34)在年轻大鼠中提高了骨量。特别地，该图示出了未处理对照大鼠和处理大鼠的近端胫骨的甲苯胺蓝色染色切片，所述处理的大鼠用3微克/100克体重/天Fugu PTH(1-34)(“低剂量fPTH”)、10微克/100克体重/天Fugu PTH(1-34)(“高剂量fPTH”)、3微克/100克体重/天人PTH(“低剂量hPTH”)和10微克/100克体重/天人PTH(“高剂量hPTH”)处理，并且用Fugu PTH(1-34)处理的大鼠中小梁密度明显提高。
图7示出了近端次级松质(secondary spongiosa)的组织形态学分析，揭示用高剂量Fugu PTH(1-34)(10微克/100克体重/天)处理的大鼠中松质骨量(％总骨量)、小梁厚度(μm)及小梁数目(每mm)的显著增加，而小梁距离(μm)没有减少。每组的数值为平均数±SEM，每组n＝5-8只大鼠。*，p＜0.05；**，p＜0.01；***，p＜0.001，通过单因素ANOVA继以Tuke’s post hoc test与未处理的对照相比。
图8示出了近端胫骨的切片，选自不同的处理组以表示通过组织形态学确定的平均松质骨量。切片用修饰的von Kossa染液染色，其将钙化基质染黑，并用丽春红/橘黄G复染骨髓。图中左侧的切片框表示选作组织形态学分析的区域。表示的处理组是(从左至右)未处理大鼠和处理的大鼠，分别用3微克/100克体重/天Fugu PTH(1-34)、10微克/100克体重/天Fugu PTH(1-34)、3微克/100克体重/天人PTH和10微克/100克体重/天人PTH处理。
图9图示出骨形成的组织形态学标记被人PTH(hPTH)显著提高，并且在较低的程度上，通过高剂量的Fugu PTH(1-34)(10微克/100克体重/天)处理而提高。成骨细胞数量和表面的增加提示响应Fugu PTH(1-34)的成骨细胞增殖的增加，如用人PTH(hPTH)所观察到的；低剂量的FuguPTH(1-34)(3微克/100克体重/天)导致成骨细胞增殖增加的倾向性。每组的数值为平均数±SEM，每组n＝5-8只大鼠。*，p＜0.05；**，p＜0.01；**，p＜0.001，通过单因素ANOVA继以Tuke’s post hoc test与未处理的对照相比。
图10图示出每单位类骨质表面的成骨细胞数目被低剂量(3微克/100克体重/天)和高剂量(10微克/100克体重/天)的Fugu PTH(1-34)，以及最高剂量(10微克/100体重/天)的人PTH(hPTH)显著增加。每组的数值为平均数±SEM，每组n＝5-8只大鼠。*，p＜0.05；**，p＜0.01；***，p＜0.001，通过单因素ANOVA继以Tuke’s post hoc test与未处理的对照相比。
图11图示出骨再吸收的组织形态学标记被高剂量的人PTH(hPTH)(10微克/100克体重/天)显著减少，但是Fugu PTH未显著将其改变，尽管存在在给予了高剂量(10微克/100克体重/天)的Fugu PTH(1-34)的动物中有成骨细胞数目减少的倾向。每组的数值为平均数±SEM，每组n＝5-8只大鼠。*，p＜0.05；**，p＜0.01；***，p＜0.001，通过单因素ANOVA继以Tuke’s post hoc test与未处理的对照相比。
图12示出了星鲨(gummy shark)PTH基因的核苷酸序列(SEQ ID NO4)。
图13示出了星鲨PTH基因的三种可能的翻译与Fugu PTH和人PTH的氨基酸序列的对比。
发明详述本申请人分离并测序了来自红鳍东方鲀的PTH样基因。
因此，本发明的第一方面提高了一种基本上纯化的多肽或其生物学活性片段，其中所述多肽包含与SEQ ID NO1所示的氨基酸序列具有至少45％序列相同性的氨基酸序列。
本文所用术语“多肽”指任何肽，多肽或蛋白质，其包含通过肽键或修饰的肽键相互连接的两个或多个氨基酸，即肽等排物(peptideisosteres)。这种“多肽”可以含有除了20个基因编码氨基酸以外的氨基酸并包含通过天然过程修饰的氨基酸序列，如翻译后加工，或通过本领域技术人员熟知的化学修饰技术修饰的氨基酸序列。在这种多肽中，修饰可以发生在任何位置，包括肽主链，氨基酸侧链和/或氨基或羧基末端。应意识到在这种多肽中同一类型的修饰可以相同或不同程度在几个位点存在。而且，这种多肽可以含有许多类型的修饰(见，例如Proteins-Structureand Molecular-Properties，2nd Ed.，TE Creighton，WH Freeman andCompany，New York，1993；和Wold，F，Posttranslational ProteinModificationsPerspectives and Prospects，pgs 1-12 in PosttranslationalCovalent Modification of Proteins，BC Johnson，Ed，Academic Press，NewYork，1983；Seifter等，“Analysis for protein modifications and nonproteincofactors”，Methods in Enzymology 182626-646(1990)；和Rattan等，“Protein SynthesisPosttranslational Modifications and Aging”，Ann NYAcad Sci，66348-62(1992))。肽、多肽和蛋白质包括在本文所用术语“多肽”的范围内，其可以分离自适当的来源，使用本领域技术人员熟知的技术合成，通过本领域技术人员熟知的重组技术产生，或得自适当的商业来源。
本发明涵盖的生物学活性片段包括缺少至少一个SEQ ID NO1所示的氨基酸序列的氨基酸而保留了包含SEQ ID NO1所示氨基酸序列的多肽的至少一种生物学活性的片段。例如，所述片段当用于分析腺苷酸环化酶活性时可以激活腺苷酸环化酶并导致cAMP积累(例如实施例1所述的分析)。
在一个优选的实施方案中，本发明提供了一种基本上纯化的多肽，或其生物学活性片段，其中所述多肽包含与SEQ ID NO1所示的氨基酸序列具有至少55％序列相同性的氨基酸序列。更优选地，所述多肽包含与SEQ ID NO1所示的氨基酸序列具有至少65％序列相同性的氨基酸序列。更优选地，所述多肽包含与SEQ ID NO1所示的氨基酸序列具有至少75％序列相同性的氨基酸序列。更优选地，所述多肽包含与SEQ ID NO1所示的氨基酸序列具有至少90％序列相同性的氨基酸序列。最优选地，所述多肽包含与SEQ ID NO1所示的氨基酸序列具有至少95％序列相同性的氨基酸序列。
在另一个优选的实施方案中，本发明的生物学活性片段包含与SEQID NO1的1-34位氨基酸的序列具有至少65％序列相同性的氨基酸序列。更优选地，所述生物学活性片段包含与SEQ ID NO1的1-34位氨基酸的序列具有至少75％，更优选至少90％，及最优选95％序列相同性的氨基酸序列。
在另一个优选的实施方案中，本发明的生物学活性片段包含与SEQID NO1的7-34位氨基酸的序列具有至少65％序列相同性的氨基酸序列。更优选地，所述生物学活性片段包含与SEQ ID NO1的7-34位氨基酸的序列具有至少75％，更优选至少90％，及最优选95％序列相同性的氨基酸序列。
本文所用术语“序列相同性”指氨基酸序列相同性的一种度量，其中序列被排列对比以便获得最高的匹配，并且其可以使用计算机程序编码的已知技术或方法计算，例如BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschul等，J Molec Biol，215403(1990))。
在本发明生物学活性片段的一个最优选的实施方案中，所述生物学活性片段由基本上相应于SEQ ID NO1的1-34或7-34位氨基酸序列的氨基酸序列组成。
而且，本发明的多肽或生物学活性片段包含在1位是苏氨酸(即Thr 1)的氨基酸序列。
优选地，所述在N末端包含苏氨酸的多肽或生物学活性片段来自于硬骨鱼或软骨鱼类。
本发明还涵盖了包含来自于不同种类的甲状旁腺素或甲状旁腺素样激素(parathyroid-like hormone)多肽的杂种氨基酸序列的多肽或其生物学活性片段。例如，包含来自于硬骨或软骨鱼类的甲状旁腺素样激素多肽(例如Fugu PTH)和人和/或其它哺乳动物和/或鸟类甲状旁腺素多肽的杂种氨基酸序列的多肽或其生物学活性片段。这种杂种多肽或其生物学活性片段优选包含N某端苏氨酸。
本文所用与本发明的多肽或生物学活性片段的氨基酸序列相关的术语“基本上相应于”意图涵盖精确的氨基酸序列以及最小化的变体，其不导致氨基酸序列的生物学活性的显著降低(例如变体当用于分析腺苷酸环化酶活性时，其不减少多肽或生物学活性片段激活腺苷酸环化酶并导致cAMP积累的能力)。这些变体可以包括一或多个保守氨基酸取代。保守氨基酸取代如G、A、V、I、L、M；D、E、N、Q；S、C、T；K、R、H；和P、Nα-烷基氨基酸。
在第二方面中，本发明提供了一种编码本发明第一方面的多肽或生物学活性片段的分离的核酸分子。
在一个优选的实施方案中，所述核酸分子包含基本上相应于SEQ IDNO2所示的核苷酸序列或其片段的核苷酸序列。
在一个优选的实施方案中，所述第二方面的核酸分子插入到一个克隆或表达载体中。
本发明所用的克隆载体包括质粒或噬菌体DNA或其它DNA载体，其能够在宿主细胞中自主复制。所述克隆载体可以进一步包含适用于鉴定(即选择)用所述克隆载体转化的细胞的选择性标记。适当的标记包括例如提供了四环素抗性或氨苄青霉素抗性的那些标记。
本发明所用的表达载体包括与克隆载体相似的载体，但其在转化进入宿主后能够增强克隆进入其中的基因的表达。克隆的基因通常置于(即可操纵地连接到)某些控制序列如启动子序列的控制下。适当的启动子序列包括组成型和可诱导启动子序列。
本文所用术语“核酸分子”包括任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸，且其可以是单链或双链的，因此包括单链和双链DNA，单链和双链区域混合的DNA，单链和双链RNA，和单链和双链区域混合的RNA，及包含可以是单链，或典型地为双链或单链和双链区域混合的DNA和RNA的杂种分子。另外，术语“核酸分子”还包括含有一或多个修饰碱基的DNA和RNA及为了稳定性或其它原因而主链被修饰的DNA和RNA。“修饰”碱基包括例如三苯甲基化的碱基和稀有碱基，如肌苷。术语“核酸分子”还包括相对短的多核苷酸，常称为寡核苷酸。
在第三方面，本发明提供了一种重组宿主，其中所述重组宿主包括编码第一方面的多肽或生物学活性片段的核酸分子。
适当的重组宿主包括任何原核或真核宿主细胞，其在例如克隆载体或表达载体中含有核酸分子，以及包括任何原核或真核宿主细胞，其被遗传工程化以在宿主染色体或基因组中包括所需的核酸分子。合适的宿主细胞的代表性例子包括细菌细胞，如链球菌(streptococci)、葡萄球菌(staphylococci)，大肠杆菌(E.coli)、链霉菌(Streptomyces)和枯草芽孢杆菌细胞(B.subtilis)；真菌细胞，如酵母细胞和曲霉(Aspergillus)细胞；昆虫细胞，如果蝇(Drosophila)S2和夜蛾(spodoptera)Sf9细胞；动物细胞，如CHO、COS、Hela、C127、3T3、BHK、293和黑色素瘤(bowesmelanoma)细胞，和植物细胞(见Sambrook等，Molecular CloningALaboratory Manual，Second Edition，Cold Spring Harbor Laboratory，NewYork(1989))。
优选的重组宿主是转化了包括本发明核酸分子的克隆或表达载体的真核细胞。更特别地，优选转化了包括本发明核酸分子的克隆或表达载体的重组哺乳动物细胞。
适当的重组宿主细胞还包括转基因动物，其所有生殖细胞和体细胞都包括本发明的核酸分子。这种转基因动物典型地是脊椎动物，特别是哺乳动物，如非人的灵长类、小鼠、绵羊、猪、牛、山羊、豚鼠、啮齿类(例如小鼠和大鼠)等。
将本发明的核酸分子导入宿主细胞中可以通过本领域技术人员熟知的技术进行(例如在许多标准实验室手册中所述，如Davis等，BasicMethods in Molecular Biology(1986)和Sambrook等，1989如前，包括磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、转位、微注射、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、转导、scrape loading、ballistic导入和感染)。
本发明的重组宿主可以用于第一方面的多肽或生物学活性片段的重组生产。
在第四方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含第一方面的多肽或生物学活性片段或第二方面的核酸分子，任选与一种药物可接受的载体组合。
在第五方面，本发明提供了一种治疗与对象中异常钙稳态相关的疾病的方法，所述方法包含给予对象治疗有效量的第一方面的多肽或生物学活性片段，第二方面的核酸分子，或第四方面的药物组合物。
优选地，所述疾病选自骨折、骨质疏松症、Paget’s病、骨癌(包括由其它部位的原发性肿瘤导致的骨中的继发性癌症)、甲状旁腺功能亢进、甲状旁腺功能减退、牛皮癣及其它皮肤相关疾病。
包含本发明的多肽或生物学活性片段的药物组合物可以用于预防及治疗多种由钙稳态的改变导致的哺乳动物疾病，且包括具有骨量丢失表现的那些疾病。因此，特别地，本发明的药物组合物用于预防性和治疗性治疗人的骨质疏松症和骨量减少。
而且，本发明的药物组合物用于预防性和治疗性治疗其它骨病，包括预防性和治疗性治疗甲状旁腺功能减退。
而且，本发明的药物组合物用作为骨折修复的激动剂和高血钙的拮抗剂。
一些形式的高钙血症和低钙血症涉及PTH和PTHrP及PTH-1R、PTH-2R和/或PTH3R受体之间的相互作用。高钙血症是一种血清钙水平异常升高的疾病，通常与其它疾病相关，包括甲状旁腺功能亢进、骨质疏松症、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、头和颈部和食道的表皮样癌、多发性骨髓瘤和肾上腺样瘤。另一方面，低钙血症是一种血清钙水平异常低的疾病，这可能是由于缺乏有效的PTH导致的(例如甲状腺手术后)。
典型地，本发明的药物组合物将以大约0.01和100微克/千克体重每天的活性(即本发明的多肽或生物学活性片段)，更优选以0.05和25微克/千克体重每天的活性，及最优选以大约0.07和1.0微克/千克体重每天的活性给予对象。对于一个50千克女性对象而言，每天的活性剂量因此是大约0.5至大约500微克，更优选大约2.5至大约125微克，最优选大约3.5至大约50微克。在其它哺乳动物中，如马、狗和牛中，需要更高的剂量。这个剂量可以每天单次给药、每天多次给药或控释或缓释的药物组合物输送，以获得最有效的结果，或者优选通过每天一或多次注射(通过皮下、经皮、肌内和静脉内途径中的任何一种)输送。最优选地，这个剂量可以鼻吸收的药物组合物输送。
精确剂量和最合适的输送方案的选择受如下影响所选的活性(即本发明的多肽或生物学活性片段)的药物性质、治疗的疾病或病症的性质和严重性及对象的身体健康状况和精神敏度，等等。
活性(即本发明的多肽或生物学活性片段)可以存在于药物可接受的盐的形式的本发明的药物组合物中，所述盐的形式保留了所需的生物学活性而没有毒性副作用。这种盐的例子是(a)无机酸形成的酸加成盐，无机酸例如是盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、硝酸等；和有机酸形成的盐，有机酸例如是乙酸、草酸、酒石酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、葡糖酸、柠檬酸、苹果酸、抗坏血酸、苯甲酸、单宁酸、双羟萘酸(pamoicacid)、藻酸、聚谷氨酸、萘磺酸、萘二磺酸、聚半乳糖醛酸等；(b)多价金属阳离子形成的碱加成盐，所述阳离子例如是锌、钙、铋、钡、镁、铝、铜、钴、镍、镉等；或N，N’-二苄基乙二胺或乙二胺形成的有机阳离子形成的碱加成盐；和(c)(a)和(b)的组合，例如，单宁酸锌盐等。
如上述，给予所述药物组合物的一个优选途径是通过鼻吸收。这样给予的药物组合物可以包含表面活性剂酸(surfactant acid)以提高通过鼻粘膜的活性吸收。适当的表面活性剂酸包括，例如，甘氨胆酸、胆酸、牛磺胆酸、ethocholic acid、脱氧胆酸、鹅脱氧胆酸、脱氢胆酸、甘脱氧胆酸(glycodeoxycholic acid)、环糊精。这种表面活性剂酸可以重量百分比为大约0.2％和大约15％之间、优选大约0.5％和大约4％之间、最优选大约2％的量包括在所述药物组合物中。
如PTH，本发明的多肽或生物学活性片段可以与其它用于治疗一定临床病症的试剂联合给药。例如，为治疗骨质疏松症和其它骨相关疾病，所述多肽或生物学活性片段可以与饮食性钙补充物或维生素D类似物联合给药(见US Patent No 4698328)。或者，所述多肽或生物学活性片段可以与二膦酸盐(bisphosphonate)联合给药，如US Patent No 4761406所述，或与一或多种骨治疗剂联合给药，所述骨治疗剂如降钙素和雌激素，或与Raloxifene和其它相关的选择性雌激素受体调节物(SERM)药物联合给药，优选使用周期治疗方案(cyclic therapeutic regimen)。
在第六方面，本发明提供了一种治疗由改变的或过度的PTH受体的作用导致的疾病的方法，所述包含给予对象治疗有效量的第一方面的多肽或生物学活性片段，第二方面的核酸分子，或第四方面的药物组合物。
在第七方面，本发明提供了一种确定骨形成、骨再吸收和/或骨再建的速度的方法，包含给予对象治疗有效量的用适当可检测标记标记的第一方面的多肽或生物学活性片段，并确定所述对象的骨对所述多肽或生物学活性片段的摄取。
在一个优选的实施方案中，所述多肽或生物学活性片段用选自如下一组的标记标记发射性标记、荧光标记、生物发光标记。更优选地，所述多肽或生物学活性片段用99锝标记。
在第八方面，本发明提供了一种抗体，其中所述抗体特异结合第一方面的多肽或生物学活性片段。
本发明的多肽或生物学活性片段可以通过本领域技术人员熟知的技术用于生产单克隆和多克隆抗体试剂。例如，抗体试剂可以通过用本发明的多肽或生物学活性片段单独或在佐剂和/或载体蛋白存在的情况下免疫适当的宿主动物而制备。适当的宿主的例子包括小鼠、大鼠、兔、绵羊、马、山羊和牛。为生产单克隆抗体试剂，可以应用的技术包括Kohler等，Eur J Immunol，611-19(1976)所示的技术。
为了使本发明可以被清楚地理解，参考以下非限定实施例描述本发明的优选实施方式。
实施例1在鱼类红鳍东方鲀(Fugu rubripes)中鉴定甲状旁腺素材料和方法编码Fugu PTH(1-80)的DNA克隆的聚合酶链反应和自动测序根据得自Joint Genome Institute(http//www.jgi.doe.gov/programs/fugu.htm)的初步数据用已知的PTH氨基酸序列设计用于聚合酶链反应(PCR)的引物。得自数据库的初步核酸序列通过PCR检查并确定了一些错误。针对修正的核酸序列设计新的PCR引物；正向引物-[5’-CAGTGAGTGAAGTCCAGCTCA-3’](SEQ ID NO5)，和反向引物-[5’-CTTCACTCCTGTGATTTGAGCA-3’](SEQ ID NO6)。对分离自红鳍东方鲀的大约100ng基因组DNA进行PCR扩增。使用可商购的试剂盒(UltraClean PCR Clean-Up DNA Purification Kit，Geneworks，Adelaide，Australia)纯化PCR产物并使用ABI Prism BigDye TerminatorCycle Sequencing Ready Reaction试剂盒(Perkin Elmer，Boston，USA)进行DNA测序。
使用ClustralW(Thompson等，Nucleic Acid Res，224673-4680(1994))进行多序列对比并在PrettyBox(Rick Westerman，Purdue University)中显示。使用缺口(gap)计算百分比相同性和相似性(Henikoff and Henikoff，Proc Natl Acad Sci USA，9810915-10919(1992))。
合成肽使用Applied Biosystems 433A肽合成仪(Foster City，USA)使用Rink树脂和Fmoc化学法和Fastmoc 0.1 Dry Conditions监控器合成蛋白FuguPTH(1-34)和不同的片段(即Fugu PTH(1-26)、Fugu PTH(1-29)、FuguPTH(1-34)、Fugu PTH(2-34)、Fugu PTH(1-32)和Fugu PTH(7-34))的N-末端区域以及Fugu PTHrP(1-34)的N-末端。完成的肽同时去保护并从树脂上切割下来(切割在具有试剂K的82.5％三氟乙酸中进行，所述试剂K(Auspep，Parkville，Australia)由5％苯酚，5％水，5％苯硫基甲烷和2.5％ethandithiol)。在20％(v/v)乙腈和0.1％(v/v)三氟乙酸中从树脂中提取肽，干燥。用20％(v/v)乙腈(Mallinkrodt HPLC级，St Louis，USA)和0.1％(v/v)三氟乙酸以0-1M的盐酸胍梯度通过连续(sequential)离子交换色谱法(MacS)纯化该肽。然后通过质谱法检查级份并合并。合并的样品在存在0.1％(v/v)三氟乙酸的情况下用乙腈梯度通过制备低压反相色谱法(25X 400柱，C18，250埃，35-70微米Amicon树脂)纯化。质谱法证实了合成肽的纯度(PerSephive Biosystems Voyager DE，(Foster City，USA)和Data Explorer Software Version 4.0)。合成的Fugu PTH(1-34)和Fugu PTHrP(1-34)通过纳喷雾(Nanospray)质谱法(Applied SystemsQSTAR pulsar，Foster City，USA)分析。
生物学活性肽的PTH样生物学活性通过测量在生长至90％铺满的UMR106.01细胞(Forrest等，CalcifTissue Int，3752-56(1985))中生成的环腺苷酸3’，5’-单磷酸(cAMP)来分析。分析前，细胞用磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)洗一次并在含有0.1％BSA和1mM异丁基甲基黄嘌呤(Sigma，St Louis，USA)的培养基中平衡20分钟。然后在存在和不存在升高的激素浓度的情况下在37℃刺激细胞10分钟。然后细胞用PBS洗一次并用1.5ml的酸化的乙醇提取cAMP。将样品蒸发干燥，在分析缓冲液中再生(reconstituted)并通过特异的cAMP发射免疫分析(Houssami等，Endocrine J，2127-134(1994))进行分析。
免疫印迹产生抗人PTHrP(1-14)的抗血清(R88、R1904、R1942、R87、R1348、R196、R212)和抗人PTHrP(1-141)的抗血清(R190)。产生抗hPTH(1-34)的抗PTH多克隆抗体(BioGenex，San Ramon，USA)。抗人PTHrP抗血清被成功用于取自硬骨和软骨鱼类的组织的免疫组织化学和Western印迹中(Danks等，Gen Comp Endocrinol，92201-212(1993)；Ingleton等，GenComp Endocrinol 98211-218(1995))。抗PTH抗血清已被用于人甲状旁腺材料的免疫组织化学和Western印迹中(Danks等，J Pathol，16127-33(1993))。在硝酸纤维素膜上(Schleicher & Schuell，Dassel，Germany)在正对照(即人PTHrP(1-34))旁有10、25、50μg的Fugu PTH印迹。在与Tris缓冲盐溶液、0.2％Tween、5％脱脂奶粉起始孵育以封闭非特异结合位点后，将硝酸纤维素膜与初级多克隆抗体孵育，然后与二抗(偶联了辣根过氧化物酶的抗兔血清(Dako，Carpenteria，USA))孵育。在每次孵育之间将膜在摇床上洗三次。使用BM化学发光印迹系统(RocheApplied Sciences，Mannheim，Germany)检测特异的印迹点。
结果使用正向和反向引物通过PCR扩增产生了一个244bp的产物，其核酸序列示于图1(也见图3)。这个序列的翻译产生了一个80个氨基酸的序列(图2)并示出Fugu PTH基因的编码区与鸡的PTH或人PTH具有非常低的总体序列同源性。Fugu PTH和鸡PTH之间的序列相同性为36％，相似性为49％，而Fugu PTH和人PTH之间的序列相同性为32％，相似性为44％(图4)。
Fugu PTHrP和人PTHrP之间的氨基酸序列相同性为53％，相似性为64％。如果只考虑N-末端的34个氨基酸区域，Fugu PTH(1-34)与鸡PTH具有53％的相同性，与人PTH具有53％的相同性，但是与鸡PTH的相似性是68％，与人PTH的相似性是65％。Fugu PTHrP和人PTHrP的N-末端区域的序列相同性是59％，相似性是77％。这些结果总结于表1(也见图4)。表1.Fugu PTH和Fugu PTHrP的N末端34个氨基酸或全部蛋白质编码序列的氨基酸序列比较
百分比相似性/百分比相同性纯化的Fugu PTH(1-34)质量为4,154.75Da，纯化的Fugu PTHrP的质量为4,126.4529Da。Fugu PTHrP(1-34)的完全自动合成导致通过piperadine的Asp10的定量转酰氨基作用(quantative transamidation)，增加了67Da(http//www.abrf.org/index.cfm/dm.details？DMID＝67&AvgMass＝67&Margin＝0)，但是这可以通过手工加入His9而克服。
合成的肽的纯度用质谱法检查，所得图示出一个单主峰，表明所述肽是所需的长度，纯度在90-95％纯之间。
Fugu PTH(1-34)以剂量依赖性的方式刺激了cAMP形成(ID50＝17±3.6nM，n＝4)，但其效力始终小于Fugu PTHrP(1-34)(ID50＝1.4±0.48nM，n＝4)(图5)。Fugu PTH(1-34)效力小于人PTH(1-34)、人PTHrP(1-34)和Fugu PTHrP(1-34)、Fugu PTH(1-34)(图5A)，但是对Fugu PTH(1-34)的最大程度的反应明显高于用最高浓度的人PTH、人PTHrP或Fugu PTHrP达到的反应。Fugu PTH(1-32)也刺激了cAMP形成，而单独应用Fugu PTH(1-26)、Fugu PTH(1-29)、Fugu PTH(2-34)和Fugu PTH(7-34)时没有观察到或极少的cAMP形成(图5B)。
当UMR106.01细胞与100nM的Fugu PTH(1-34)和最大剂量为10nM的Fugu PTHrP(1-34)共同孵育时，观察到腺苷酸环化酶活性没有进一步升高，这与两个肽通过相同的受体起作用的假定一致(数据未示出)。
当与10nM Fugu PTH(1-34)、1nM人PTH(1-34)、0.5nMFugu PTHrP(1-34)或0.5nM人PTHrP(1-34)共同孵育的人PTHrP(7-34)浓度升高时，明显地所有测试的肽都对cAMP反应具有部分抑制(数据未示出)(McKee等，Endocrinol，1223008-3010(1988))，这提供了Fugu PTH(1-34)通过PTH-1R起作用的进一步证据。
在一个共同孵育分析中，其结果示于图5C-E，应用Fugu PTH(1-34)(5nM和100nM量)和Fugu PTH(1-29)(5nM和500nM量)观察到腺苷酸环化酶活性没有变化，而应用Fugu PTH(1-34)(100nM)和Fugu PTH(2-34)(500nM)，以及Fugu PTH(1-34)(100nM)和Fugu PTH(7-34)(500nM)时观察到活性升高(大于其和)。
免疫印迹示出Fugu PTH(1-34)与抗人PTHrP(1-14)的兔多克隆抗血清或抗人PTH(1-34)的兔多克隆抗血清的任一种都不交叉反应(数据未示出)。
讨论在这个实施例中鉴定的Fugu PTH多肽的N-末端区域与四足动物PTH的N-末端和哺乳动物和鱼类的PTHrP同源。Fugu PTH的头34个氨基酸中的18个与人PTH中的相同，而Fugu PTH的头34个氨基酸中的14个与FuguPTHrP中的相同。而Fugu PTHrP和人PTHrP的头34个氨基酸中的20个相同，Fugu PTH和Fugu PTHrP之间在这个区域中只有13个相同。这提示分离的鱼类的序列更类似PTH，而不是PTHrP。在Fugu PTH的氨基酸序列中，在头34个氨基酸之后，其与人PTH或鸡PTH没有明显的同源性。
生物学分析数据与Fugu PTH通过PTH1R的作用相一致，如人PTH和人PTHrP的情况。使用核磁共振和X-射线晶体学的结构分析以及PTH和PTHrP类似物与PTH1R的交联的广泛研究与通过残基15和31之间的序列中的残基参与的PTH和PTHrP结合的模型相符。Fugu PTH分子的N-末端部分的许多结构方面与已知的PTH1R的相互作用非常吻合。光亲和性交联(photoaffinity cross-linking)研究已经鉴定了对于PTH和PTHrP与PTH1R的结合至关紧要的的某些残基。残基Phe23、Leu24和Ile28接近受体，Leu24的光标记导致结合降低10倍(Gensure等，J Biol Chem，27628650-28658(2001))。当这与残基Phe23、Leu24和Ile28对极性残基取代不耐受的事实一起考虑时(Gardella等，Endocrinol，1322024-2030(1993)；Gardella等，J Biol Chem，27119888-19893(1996))，Fugu PTH与其它的PTH和PTHrP同源物一致。而且，Fugu PTH的Arg20和Leu24也与这些残基在所有已知的PTH和PTHrP序列中严格保守相一致。另一方面，残基Lys26、Gln29和Asp30可以被突变而不影响受体的结合(Gardella等，1993如前)。
在这个实施例中示出的Fugu PTH(1-34)的效力是人PTH或PTHrP的五分之一到十分之一。这可能是由于由Fugu PTH(1-34)的C-末端部分的不同序列产生的细微构象变化导致的，例如残基26、27、29和30都与其它PTH/PTHrP同源物中的残基不同。而在哺乳动物靶细胞中FuguPTH对腺苷酸环化酶激活的效力降低是令人感兴趣的，这仍需研究在鱼类中谁是真正的靶和所述肽的效力。然而，要注意的是在斑马鱼中发现的PTH3R中(Rubin等，1993如前)，有人PTH的激活总是比人PTHrP或FuguPTHrP的效力低20倍。
Fugu PTH(2-34)的效力明显低于Fugu PTH(1-34)表明Fugu PTH(1-34)肽的N-末端(即第1位)的苏氨酸在产生生物学活性中是重要的。当100nM Fugu PTH(1-34)和500nM Fugu PTH(2-34)共同孵育时观察到的cAMP反应比分别测试两种肽时的效果总和要大，表明Fugu PTH(1-34)的第1位的苏氨酸具有协同作用。相反，缺失Fugu PTH(1-34)两个C-末端氨基酸对cAMP活性的刺激具有最小的影响。
免疫学上，即使在高浓度的肽和抗血清的情况下，Fugu PTH(1-34)也不被任何人PTH或人PTHrP抗血清识别。不太可能针对任PTHrP、人PTH和牛PTH的抗血清可以在鱼类组织中定位鱼PTH，因为Fugu PTH的N-末端是多肽中最高度保守的部分。发现Fugu PTH的N-末端只有34个氨基酸中的18个与人PTH的一致，其在第1位具有苏氨酸而不是丝氨酸，这可以确定其与人PTH或PTHrP的多克隆抗血清缺乏交叉反应性。
不受理论所限制，本实施例中提供的结果表明Fugu PTH具有与人PTH不同的药物动力学。这些不同的药物动力学可能意味着Fugu PTH当给予人体或其它动物时引起高钙血症或导致其它副作用的可能性较低。而且，Fugu PTH和人PTH之间的不同可能导致与例如人PTH相比时，针对给予的Fugu PTH多肽的免疫反应降低，如过敏反应。
实施例2Fugu PTH对大鼠骨的合成作用物质和材料Fugu PTH的合成作用在50-60g雄性Sprague-Dawley大鼠(3-4周龄)的骨中评估。
大鼠经皮下每天每100g体重给予低或高剂量(3或10μg)的Fugu PTH(1-34)30天。将合成的PTH肽溶解于0.01M乙酸中，然后在具有2％大鼠血清(得自雄性Sprague-Dawley大鼠)的生理盐水中制备每日的注射液。大鼠每周称重两次，针对每只动物体重增加调节PTH剂量。
在以下处理组中每组具有12只大鼠对照、人PTH(低或高剂量)和Fugu PTH(低或高剂量)。通过窒息对大鼠进行安乐死，然后取出胫骨，在骨上留下大部分肌肉。将样品置于新鲜制备的4％多聚甲醛中。固定24小时然后转移至70％乙醇中以准备进行组织形态测量(histomorphometry)。
固定的胫骨用X-射线照射并如下包埋于甲基丙烯酸甲酯树脂中清除胫骨上的肌肉，然后横向切开并用水冷却的低速实验台(water cooledslow speed bench)在每一侧修整大约2mm以提供用于包埋的平面，与正中矢状面(sagittal midline)平行。固定的胫骨在丙酮中脱水，每小时更换70％丙酮、90％丙酮和100％丙酮(×2)。脱水后，样品用甲基丙烯酸甲酯树脂(85％甲基丙烯酸甲酯、15％二丁基邻苯二甲酸盐、0.05％苯甲酰过氧化物)浸润两次，至少3天(最低总共6天)。在浸润程序的至少一天中，样品置于真空下浸润；所有其它步骤在4℃下进行。浸润后，在37℃孵箱的水浴中将胫骨包埋在玻璃闪烁管中甲基丙烯酸甲酯树脂(85％甲基丙烯酸甲酯、15％二丁基邻苯二甲酸盐、3％苯甲酰过氧化物)的聚合的甲基丙烯酸甲酯碱基中。聚合后，再包括第三层丙烯酸甲酯(与上述成分相同，再加上丙烯酸树脂珠)并再聚合48小时。样品完全聚合后，在-20℃冷却以使聚合物收缩，然后包埋的胫骨通过用锤子将其打碎而从玻璃管中取出。然后在电磨/磨光器上研磨聚合的胫骨以暴露骨表面，并提供能稳定置于切片机中的四方块。在Leica 2165切片机上切出5μm的切片，用95％乙醇覆盖并通过在37℃箝位过夜粘附到玻璃显微镜载玻片上，被包装塑料(bagging plastic)分隔。完全粘附的切片在纤维素溶剂中去塑化(deplasticised)2×25分钟，在分级乙醇(graded ethanol)中脱水，用甲苯胺蓝染色进行标准的组织形态测量。进行Von Kossa染色以提供合成图象。
使用Osteomeasure图像分析系统(Osteometrics，Decatur，GA)按照标准程序，在次级松质中，在3mm宽、1.1mm高的生长面下3mm开始进行组织形态测量。通过one-way ANOVA用Turkey’s post-hoc test分析数据以定位显著差异。
结果和讨论本实施例中所得结果示于图6-11。结果示出在年轻的成长大鼠中100微克/100克Fugu PTH(1-34)是合成代谢的，导致松质骨体积、厚度和小梁数目的明显增加。骨量的这种增加与增加的成骨细胞生成相关，提示增加的骨形成是主要机制。也存在破骨细胞数目减少的倾向，但是这没有达到统计学上的显著性，提示在体内破骨细胞生成的适度减少(在10微克/100克人PTH组中观察到的)可能在Fugu PTH(1-34)的作用中也起作用。
这个发现的临床意义在于Fugu PTH及其生物学活性片段，以及相关肽(例如包含与SEQ ID NO1至少45％序列相同性的肽)，可以用于治疗人骨质疏松症和预防骨质疏松症。在大鼠中观察到的作用与用人PTH观察到的相似，只是程度较低。因此预期在人类中人PTH对骨具有相似的作用。可获得具有相似活性但不同氨基酸序列的新的多肽以产生新的PTH类似物，其可以具有所需的性质，如改良的药物动力学、更少的副作用、不同的给药模式或其它未鉴别的益处。
实施例3在其它鱼类中检测fPTH同源物本实施例的目的是在不同种类的鱼中鉴定前述的编码甲状旁腺素样多肽的基因。
方法和材料按照标准技术从表2所列的鱼类的肌肉样品中提取基因组DNA。按照标准技术提取的总RNA使用随机六聚体进行逆转录以产生cDNA。
基于Fugu和斑马鱼PTH的N-末端(高度保守)和C-末端(不是非常保守)区域的氨基酸和核苷酸序列设计简并PCR引物(表3)。这个策略不能设计用来可能含有大的内含子的基因组DNA中扩增PCR产物。因此也合成cDNA以检测可能含有大的内含子序列的PTH基因。
为了检测与Fugu和斑马鱼PTH基因具有低同源性的序列，还因为使用了简并引物，选择45℃为退火温度。条件如下95℃，5分钟-起始变性95℃，1分钟-变性)45℃，1分钟-退火)40个循环72℃，1分钟-延伸)72℃，1分钟-最后延伸在PCR反应中使用简并引物时使用了100ng基因组DNA。在含有溴化乙锭(EtBr)的1.5％-2％琼脂糖凝胶中通过凝胶电泳在紫外光下观察DNA来检测PCR产物。电泳后，通过Southern转移方法将PCR产物转移至Hybond-N+膜(Amersham)上。Southern转移膜在DIG Easy Hybe(Roche)中杂交并用地高辛标记的Fugu PTH DNA克隆探测。使用的探测条件是杂交温度37℃和洗涤温度68℃或杂交温度30℃和洗涤温度37℃。使用DIGHigh Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II(Roche)生成和检测地高辛标记的探针。
表2
表3
其中，W＝A/T，R＝A/G，I＝肌苷(通用碱基)，Y＝C/T和N＝A/C/G/T。
结果和讨论鱼类的范围是选自硬骨和软骨鱼。而且所述种类来自热带和温带水域并涵盖了大部分的世界地区，包括非洲、亚洲、南美洲和澳大拉西亚。澳大利亚肺鱼，一种叶鳍型鱼在起源自至少3亿年前的泥盆纪的鱼类和四足动物之间建立了联系。星鲨是软骨鱼的代表，其在进化中早于硬骨鱼。
结果示于表4。在丝足鱼、丽鱼、金鱼、四间鱼、鲶鱼、红魔鬼丽鱼、星鲨、肺鱼和斑马鱼中检测到了与Fugu PTH DNA同源的核苷酸序列，代表PTH可能的同源物。星鲨的PTH可能的同源物、一个236bp的部分基因组DNA随后被分离并测序(见图12和13)。本实施例的结果示出在鱼类中Fugu PTH同源物的广泛分布。在软骨鱼中检测到PTH同源物令人惊讶。
观察到彩虹鲨DNA的斑点(smear)和地高辛标记的Fugu PTH DNA探针的杂交呈阳性。这个结果提示在反应中合成了与Fugu PTH DNA同源的不同长度的PCR产物，并且进一步优化PCR条件应该能够产生代表彩虹鲨PTH同源物的分离条带。
表1.人和大鼠的Nogo受体1多肽的序列
表2
a)(脯氨酸酯体或者依那普利)/(依那普利拉)的浓度比实施例8贴剂的制造使苯乙烯-异戊二烯-苯乙烯嵌段共聚物(商品名クインタツク3421日本ゼオン制)30g和粘合附加树脂(脂环族饱和烃树脂，商品名クイントン M100日本ゼオン制)60g溶解于甲苯110g，再加入流动石蜡10g，均匀混合，调制粘合剂溶液。这样进行混合，以便使该粘合剂溶液涂布干燥后的质量为65质量％、本发明化合物1为20质量％、十四烷酸异丙酯为10质量％、月桂聚乙二醇为5质量％，再加入甲苯调整粘度，然后直到均匀混合。将含有该药物的粘合剂溶液使用薄膜给料器按照厚200μm涂布在厚75μm的聚对苯二甲酸乙二醇酯制剥离片的硅涂层表面上。使其在约65℃下干燥10分钟，然后在涂布面上粘合12μm的聚对苯二甲酸乙二醇酯制支撑体，裁剪为规定大小，制造贴剂1。
使用本发明化合物2～5，同样地制造各贴剂2～5。
无毛小鼠皮肤渗透性试验摘出5周大小的雄性无毛小鼠(体重约20g)的皮肤，装入保<p>序列表<110>迪尔奥斯汀有限公司<120>甲状旁腺素样多肽<130>03 1347 9531<160>14<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>80<212>PRT<213>Fugu rubripes<400>1Thr Val Ser Glu Val Gln Leu Met His Asn Leu Gly Glu His Lys Gln1 5 10 15Val Gln Glu Arg Arg Glu Trp Leu Gln Arg Arg Leu His Gly Ile His20 25 30Pro Ile Gly Leu Asn Asn Asp Asp Glu Pro Gly Trp Gly Arg Lys Gly35 40 45Ile Ala Ser Arg Glu Leu Pro Asn Leu Arg Asp Leu Thr Pro Glu Glu50 55 60Ile Gln Asn Ala Leu Asn Val Leu Glu Glu Leu Leu Lys Ser Gln Glu65 70 75 80<210>2<211>240<212>DNA<213>Fugu rubripes<400>2acagtgagtg aagtccagct catgcacaac cttggggagc ataagcaggt gcaggagcgc 60cgtgagtggt tacagcgaag actccatggt attcacccta taggtctcaa caacgacgat120gaaccaggat ggggcagaaa ggggatagct tcccgagagc tgcctaacct cagagacctg180accccagaag agatccagaa tgcattaaat gtcttagagg aactgctcaa atcacaggag240<210>3<211>276<212>DNA
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权利要求
1.一种基本上纯化的多肽或其生物学活性片段，其中所述多肽包含与SEQ ID NO1所示的氨基酸序列具有至少45％序列相同性的氨基酸序列。
2.权利要求1的多肽或其生物学活性片段，其中所述多肽包含与SEQID NO1所示的氨基酸序列具有至少55％序列相同性的氨基酸序列。
3.权利要求1的多肽或其生物学活性片段，其中所述多肽包含与SEQID NO1所示的氨基酸序列具有至少65％序列相同性的氨基酸序列。
4.权利要求1的多肽或其生物学活性片段，其中所述多肽包含与SEQID NO1所示的氨基酸序列具有至少75％序列相同性的氨基酸序列。
5.权利要求1的多肽或其生物学活性片段，其中所述多肽包含与SEQID NO1所示的氨基酸序列具有至少90％序列相同性的氨基酸序列。
6.权利要求1的多肽或其生物学活性片段，其中所述多肽包含与SEQID NO1所示的氨基酸序列具有至少95％序列相同性的氨基酸序列。
7.权利要求1的生物学活性片段，其中所述片段包含与SEQ ID NO1的1-34位氨基酸的序列具有至少65％序列相同性的氨基酸序列。
8.权利要求1的生物学活性片段，其中所述片段包含与SEQ ID NO1的1-34位氨基酸的序列具有至少75％序列相同性的氨基酸序列。
9.权利要求1的生物学活性片段，其中所述片段包含与SEQ ID NO1的1-34位氨基酸的序列具有至少90％序列相同性的氨基酸序列。
10.权利要求1的生物学活性片段，其中所述片段包含与SEQ ID NO1的1-34位氨基酸的序列具有至少95％序列相同性的氨基酸序列。
11.权利要求1的生物学活性片段，其中所述片段包含与SEQ ID NO1的7-34位氨基酸的序列具有至少65％序列相同性的氨基酸序列。
12.权利要求1的生物学活性片段，其中所述片段包含与SEQ ID NO1的7-34位氨基酸的序列具有至少75％序列相同性的氨基酸序列。
13.权利要求1的生物学活性片段，其中所述片段包含与SEQ ID NO1的7-34位氨基酸的序列具有至少90％序列相同性的氨基酸序列。
14.权利要求1的生物学活性片段，其中所述片段包含与SEQ ID NO1的7-34位氨基酸的序列具有至少95％序列相同性的氨基酸序列。
15.权利要求1的生物学活性片段，其中所述片段由基本上相应于SEQ ID NO1的1-34位或7-34位氨基酸的序列的氨基酸序列组成。
16.权利要求1-6任一项的多肽或生物学活性片段，其中所述多肽或片段包含一种在N末端具有苏氨酸的氨基酸序列。
17.权利要求7-15任一项的生物学活性片段，其中所述片段包含一种在N末端具有苏氨酸的氨基酸序列。
18.一种具有甲状旁腺素活性的多肽或生物学活性片段，其中所述多肽或片段包含一种在N末端具有苏氨酸的氨基酸序列。
19.权利要求18的多肽或生物学活性片段，其中所述多肽或片段来自硬骨鱼或软骨鱼类。
20.一种分离的核酸分子，其编码权利要求1-6、16、18或19任一项的多肽或生物学活性片段。
21.一种分离的核酸分子，其编码权利要求7-15或17任一项的生物学活性片段。
22.权利要求20或21的核酸分子，其中所述分子包含一种基本上相应于SEQ ID NO2所示的核苷酸序列的核苷酸序列或其片段。
23.一种分离的编码具有甲状旁腺素活性的多肽或生物学活性片段的核酸分子，其中所述分子包含一种基本上相应于SEQ ID NO4所示的核苷酸序列的核苷酸序列或其片段。
24.一种重组宿主，其中所述重组宿主包括权利要求20-23任一项的核酸分子。
25.一种药物组合物，其包含权利要求1-6、16、18或19任一项的多肽或生物学活性片段、或者权利要求7-15或17任一项的生物学活性片段、或者权利要求20-23任一项的核酸分子，任选与一种药物可接受的载体组合。
26.在对象中治疗与异常钙稳态相关的疾病的方法，所述方法包括给予对象治疗有效量的权利要求1-6、16、18或19任一项的多肽或生物学活性片段、或者权利要求7-15或17任一项的生物学活性片段、或者权利要求20-23任一项的核酸分子、或者权利要求25的药物组合物。
27.权利要求26的方法，其中所述疾病选自骨质疏松症、骨量减少、Paget’s病、骨癌、甲状旁腺功能亢进、甲状旁腺功能减退、高钙血症、牛皮癣及其它皮肤相关疾病。
28.一种治疗由PTH受体作用改变或过度导致的疾病的方法，所述方法包括给予对象治疗有效量的权利要求1-6、16、18或19任一项的多肽或生物学活性片段、或者权利要求7-15或17任一项的生物学活性片段、或者权利要求20-23任一项的核酸分子、或者权利要求25的药物组合物。
29.一种确定骨形成、骨吸收和/或骨再建速度的方法，包括给予对象用适当的可检测标记物标记的治疗有效量的权利要求1-6、16、18或19任一项的多肽或生物学活性片段或权利要求7-15或17任一项的生物学活性片段，并确定所述对象的骨对所述多肽或生物学活性片段的摄取。
30.一种抗体，其中所述抗体特异性结合权利要求1-6、16、18或19任一项的多肽或生物学活性片段或权利要求7-15或17任一项的生物学活性片段。
全文摘要
本发明提供了新的甲状旁腺素多肽及其生物学活性片段，以及编码其的核酸分子。特别地，本发明提供了来自鱼类(例如日本河豚(红鳍东方鲀)(Fugu rubripes))的甲状旁腺素多肽及生物学活性片段(及编码核酸分子)。这种多肽和片段可以用于治疗与异常钙稳态相关的疾病(例如骨质疏松症、骨量减少、Paget’s病、骨癌、甲状旁腺功能亢进、甲状旁腺功能减退、高钙血症、牛皮癣及其它皮肤相关疾病)。
文档编号A61K38/00GK1681843SQ03821809
公开日2005年10月12日 申请日期2003年9月15日 优先权日2002年9月13日
发明者杰弗里·戴维·扎亚克, 雅尼娜·阿塔利亚·丹克斯 申请人:迪尔奥斯汀有限公司