专利名称：降低身体脂肪百分比的药剂或身体脂肪百分比增加抑制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种含有大豆7S蛋白作为降低身体脂肪百分比的药剂或身体脂肪百分比增加抑制剂，以及使用它们的食品。
背景技术：
在植物蛋白之中，大豆蛋白作为营养物是极佳的，近年来发现它是食品原料中的生理功能性物质，这是因为在大豆蛋白中已经发现了多种生理学作用。例如，Iritani等人指出大豆蛋白可通过抑制肝脏中脂肪酸合成酶的活性而降低中性脂肪(J.Nutr.，126，380，1996)。已经研究过总大豆球蛋白，7S球蛋白和11S球蛋白中的每一个对血液和肝脏中脂类的作用，且该蛋白已经显示出与动物蛋白酪蛋白相比，它降低血液中胆固醇和中性脂肪浓度的能力总体极佳(Okita等人，J.Nutr.，27，379，1981)。
另一方面，来源于大豆的某些蛋白与构成膜如质膜、蛋白体和油体膜的极性脂类有亲和性。这种蛋白被Samoto等人称作“油体缔合蛋白”。“油体缔合蛋白”是含有膜蛋白作为主要成分的一组蛋白的总称。特别是，所述蛋白是这样一个部分它含有估计分子量为34kDa、24kDa和18kDa的蛋白，这是通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测量的，且含有约10重量％的极性脂类，其是用氯仿和乙醇2∶1混合物的极性溶剂提取的。Samoto等人报道了这种蛋白占大豆蛋白分离物约35％，其是工业化生产的(Biosci.Biotechnol.Biochem.，62(5)，935-940 1998)。油体缔合蛋白的味道较差且变应原性较高。
然而，估计油体缔合蛋白的含量远远低于实际的含量或当在常规SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中测定时没有被考虑进去，这是因为油体缔合蛋白很难被染色，其中所述SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳是测定大豆蛋白的蛋白组成时通常使用的。
如上所述，已经评价了大豆7S球蛋白对降低血液中胆固醇和中性脂肪水平的作用，还没有关于通过使用大豆7S球蛋白而降低身体脂肪百分比和抑制身体脂肪增加的报道。
本发明的发明人发现在从大豆蛋白中分级分离出7S蛋白后，通过摄取含有大量大豆7S球蛋白的大豆7S蛋白可降低身体脂肪百分比或抑制它的增加，并因此完成了本发明。
因此，本发明的问题是提供一种含有大豆7S蛋白作为活性成分的降低身体脂肪百分比的药剂或身体脂肪百分比增加抑制剂，以及含有它们的食品，它们是由含有大量来源于大豆蛋白的大豆7S球蛋白的7S蛋白获得的。
发明内容
本发明提供一种含有大豆7S蛋白作为活性成分的降低身体脂肪百分比的药剂或身体脂肪百分比增加抑制剂。本发明的作用是有效抑制具有30％或更高的身体脂肪百分比的超重人群的身体脂肪增加并降低身体脂肪。本发明还提供含有降低身体脂肪百分比的药剂或身体脂肪百分比增加抑制剂的食品。
本发明提供(1)含有大豆7S蛋白作为活性成分的降低身体脂肪百分比的药剂或身体脂肪百分比增加抑制剂；(2)根据(1)的降低身体脂肪百分比的药剂，其用于具有30％或更高的身体脂肪百分比的超重人群；(3)根据(1)和(2)任何一项的降低身体脂肪百分比的药剂或身体脂肪百分比增加抑制剂，大豆7S蛋白的固体内含物中含有2.5％或更少的极性脂类；(4)根据(1)和(2)任何一项的降低身体脂肪百分比的药剂或身体脂肪百分比增加抑制剂，大豆7S蛋白的固体内含物中含有1.2％或更少的肌醇六磷酸；(5)含有(1)的降低身体脂肪百分比的药剂或身体脂肪百分比增加抑制剂的食品。
实施本发明的最佳方式在本发明中，大豆7S蛋白是指含有大量大豆7S球蛋白的蛋白。通常，大豆7S球蛋白是指球蛋白中，由超离心沉降系数代表的分子量相当于7S的蛋白，其是可溶性球蛋白的总称。根据分子量分布的不同，球蛋白包括2S、7S、11S和15S，且已知7S和11S蛋白大量包含在豆科植物，如大豆的贮藏蛋白中。顺便提及的是，大豆7S球蛋白基本上与免疫学名词中的β-伴大豆球蛋白相对应。
用于除去11S球蛋白的下列已知方法可用于获得本发明的大豆7S蛋白。可用方法的例子包括Thahn-Shibasaki方法(Thahn，V.H.和Shibasaki，K.，J.Agric.Food Chem.，24，117，1976)、通过冷-沉淀方法分离冷不溶性部分(Briggs，D.R.和Mann，R.L.，CerealChem.，27，243，1950)、以及通过加入0.1N氯化钙进行分级分离的方法(Wolf，W.J.和Sly，D.A.，Cereal Chem.，44，653，1967)的任何一种。如USP No.6171640所公开的，还可使用缺少11S球蛋白部分的培育大豆。
通过上述任何一种方法除去11S球蛋白后，可通过等电沉淀、随后中和并灭菌来制备7S蛋白。在这种情况下，可在不使用任何还原剂的条件下，分级分离出纯度足以用于各种用途的7S蛋白，且所述不含还原剂的蛋白可被预期广泛用作降低身体脂肪百分比的药剂或身体脂肪百分比增加抑制剂。
作为7S蛋白纯净物(以下述SPE标准为基础)的7S球蛋白含量为40％或更高、优选60％或更高、更优选80％或更高、且最优选90％或更高。预期的作用可通过摄取少量纯度更高的蛋白而获得。
增加自11S球蛋白的分离效率可产生高纯度的7S蛋白。所述方法的实施例包括在弱酸性条件下加热含大豆蛋白的溶液，并在pH5.6-6.6将蛋白分级分离成富含7S蛋白的可溶性部分及富含11S蛋白的不溶性部分。该方法可提供在固体内含物中含1％或更少极性脂类的高纯度7S蛋白，极性脂类是油体缔合蛋白的指数。在11S球蛋白分离前，还可通过用酶如肌醇六磷酸酶分解而有效除去肌醇六磷酸。该方法可提供具有低肌醇六磷酸百分比的高纯度7S蛋白，其中固体内含物具有1.2％或更低、通常0.2％或更低的肌醇六磷酸含量。分离效率可通过联合使用这两种方法而进一步提高。
作为肥胖指标的身体脂肪百分比根据性别和年龄的不同而有所不同。具有30％和35％身体脂肪百分比的男性分别被认为是肥胖和过度肥胖，而具有30％、35％和40％身体脂肪百分比的女性分别被认为是轻度肥胖、肥胖和过度肥胖。本发明降低身体脂肪百分比的药剂适于具有30％或更高身体脂肪百分比的超重人群，优选可有效降低具有35％或更高身体脂肪百分比的超重人群中的身体脂肪百分比。本发明的身体脂肪百分比增加抑制剂是有效的，另一方面，与身体脂肪百分比无关。
通过每天摄取3g或更大、优选5g或更大量的大豆7S蛋白，本发明降低身体脂肪百分比的药剂或身体脂肪百分比增加抑制剂是有效的，但考虑到效果和避免营养失衡，每天15g或更小的量就已足够。
可将本发明的药剂配制成用于口服给药的组合物，其中含有所得的大豆7S蛋白作为活性成分。例如，根据本领域抑制的方法，可将它配制成粉剂、片剂、或颗粒剂等形式，且可将它用于各种食品中。适当地，可一起加入用于各种食品的原料和添加剂。
用作本发明活性成分的大豆7S蛋白是十分安全的，所述蛋白可用于食用组合物中。对食品中混合物的量以及摄取量没有特别的限制，且所述蛋白可直接服用或可作为饮食疗法而被加入到食品中。
本发明的药剂可以任何形式提供而没有任何限制，如片剂、饮料、酸乳、米饼、面包和果冻的形式。含1-10％7S蛋白的饮料可通过将大豆7S蛋白与糖、水、稳定剂和果汁等混合，调节pH至3.5，匀化，加入调味香料等，加热，并冷却而制备。果冻-样食品可通过将大豆7S蛋白与胶凝剂混合而制备。含1-15％7S蛋白的酸乳-样食品可通过将大豆7S蛋白与乳样酸乳、水、糖和胶凝剂等混合，调节pH至3.5-4.5，并加热灭菌而制备。米饼可通过将水缓慢加入到30％或更多大豆7S蛋白、淀粉物质、佐料等的混合物中得到生面团，然后揉合并将生面团分开，通过夹在两个平板之间而在120℃-300℃下烘焙，接着干燥而制备。面包是通过将占小麦面粉2-18％的大豆7S蛋白与伴随使用的、含45％或更多磷脂酰胆碱的磷脂混合而生产的。
下面参考实施例说明本发明的有效性，且本发明的技术范围不受这些实施例的限制。
本发明主要使用的测定法如下。
*SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳蛋白是通过Laemmli(Nature，227，680(1970))的方法，使用10-12％浓度的梯度凝胶测定的。所用蛋白量为10μg。
*肌醇六磷酸肌醇六磷酸是按照Alii Mohamed(CerealChemistry，63，475-478 1986)的方法测量的。
*用氯仿/甲醇提取的油成分的含量将约为干燥样品50倍的氯仿/甲醇混合溶液(2/1体积比)加入到干燥的样品中，并将160℃下提取的部分称重以测定用氯仿/甲醇提取的油成分的含量。
*纯度(SPE标准)通过上述SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳获得的电泳图案的面积是用光密度计测量的，并根据占该部分总面积的面积比例而测量纯度(SPE标准)。7S球蛋白含量是指α、α’和β亚单位的总量。虽然纯度还可通过将油体-缔合蛋白的量考虑进去而作为校正纯度被测量，但在本发明中，是按照SPE标准测量它的。
*校正纯度除了7S球蛋白外，样品还包含重量多达氯仿/甲醇提取物10倍的油体缔合蛋白。因此，相对于总蛋白的纯度是根据以SPE标准为基础的样品纯度(A％)计算的。
校正纯度(％)＝(100％-用氯仿/甲醇提取的油成分的含量(％)×10)×A(％)/100*身体脂肪百分比身体脂肪百分比是通过测量身体的电阻而计算的。具体而言，身体脂肪百分比是用Tanita Corp制造的“8-电极身体脂肪测量装置BC-118”测量的。
生产实施例1(高纯度-低肌醇六磷酸7S蛋白的制备)将10重量份40℃的提取水加入到1重量份40℃的低变性脱脂大豆中，用盐酸调节溶液至pH5.3。把相当于8个单位/蛋白重量的肌醇六磷酸酶(肌醇六磷酸酶Novo L，由Novo Industries制造)加入到该溶液中，其被加工用于提取蛋白且在40℃下进行30分钟酶反应以得到酶-处理过且提取过的浆液。将酶处理过且提取过的浆液冷却至约25℃，接着用盐酸调节至pH 6.1，并通过用间歇式离心机(1,200G)离心而分离。通过离心可确定地将可溶性部分与不溶性部分分离。离心过程中的溶液温度约为25℃。随后，用盐酸将可溶性部分调至pH4.9，离心获得沉淀的凝乳。用水(4倍重量)稀释沉淀的凝乳，并用多达蛋白重量10倍的水洗涤，接着用氢氧化钠中和。肌醇六磷酸酶处理过的大豆7S蛋白是通过在140℃下灭菌15秒后喷雾干燥获得的。
由此获得的高纯度大豆7S蛋白的纯度(SPE标准)为95％。因为固体内含物中肌醇六磷酸的含量为0.5％，因此证实了肌醇六磷酸几乎被完全分解且除去。另一方面，蛋白中用氯仿/甲醇提取的油成分含量为0.5％。此外，还显示与最初的纯化7S蛋白中的5mg/g含量相比，含极少量杂质的高纯度大豆7S蛋白具有12mg/g蛋白的含硫氨基酸-胱氨酸及甲硫氨酸的联合含量。
生产实施例2(具有高纯度低肌醇六磷酸的7S蛋白的制备，2)以1∶10的重量比将水加入到脱脂大豆中。搅拌混合溶液1小时同时偶尔控制pH为7.0。将混合物离心(4,000rpm，20℃，10分钟)，并将上清液调至pH6.0。以0.2％/蛋白的比例加入肌醇六磷酸酶(肌醇六磷酸酶L由Novo Industries制造)，40℃下反应1小时。将反应溶液的pH再次调节至6.0并离心(4,000rpm，20℃，10分钟)。将上清液调至pH5.0，接着离心(4,000rpm，4℃，10分钟)。收集沉淀物并加水。将溶液中和至pH7.0，喷雾干燥并灭菌得到低肌醇六磷酸大豆7S蛋白。
显示由此获得的高纯度-低肌醇六磷酸7S蛋白的纯度(SPE标准)为88％。固体内含物中肌醇六磷酸的含量为0.05％，由此证实肌醇六磷酸几乎被完全分解和除去。另一方面，用氯仿/甲醇提取的油成分的含量为1.0％。此外，还显示与最初的纯化7S蛋白中的5mg/g含量相比，含极少量杂质的高纯度大豆7S蛋白具有16mg/g蛋白的含硫氨基酸-胱氨酸及甲硫氨酸的联合含量。
生产实施例3(低肌醇六磷酸7S蛋白的制备)以1∶10的重量比将水加入到脱脂大豆中。搅拌混合溶液1小时同时偶尔控制pH在7.0。将混合物离心(4,000rpm，20℃，10分钟)，并将上清液调至pH6.4。将上清液维持在4℃过夜，离心(4,000rpm，4℃，10分钟)并弃去沉淀物。将上清液调至pH4.5，离心(4,000rpm，4℃，10分钟)，收集7S蛋白凝乳沉淀。
加入多达7S蛋白凝乳重量4倍的水，调节pH至6.0。以0.2％/蛋白的比例加入肌醇六磷酸酶(肌醇六磷酸酶L由Novo Industries制造)，40℃下反应1小时。将反应溶液的pH调至5.0，然后通过离心(4,000rpm，20℃，10分钟)除去乳清部分，得到低肌醇六磷酸7S蛋白凝乳。将水加入到低肌醇六磷酸7S蛋白凝乳中，中和至pH7.0，灭菌，并喷雾干燥得到低肌醇六磷酸7S蛋白。由此获得的高纯度-低肌醇六磷酸7S蛋白的纯度(SPE标准)为80％。固体内含物中肌醇六磷酸的含量为0.05％，由此证实通过肌醇六磷酸酶处理，肌醇六磷酸几乎被完全分解和除去。用氯仿/甲醇提取的油成分的含量为2.8％。另一方面，因为与最初的纯化7S蛋白中的5mg/g含量相比，含硫氨基酸-胱氨酸及甲硫氨酸的联合含量为25mg/g蛋白，因此显示它含有许多杂质。
试验实施例1[降低身体脂肪百分比的作用]将32份在生产实施例1中制备的高纯度低肌醇六磷酸7S蛋白、和68份麦芽糖粉(Finetose由Haya shibara shoji，Inc.制造)混合，加入6份水和14份乙醇，并揉合。在干燥器中，60℃下干燥该混合物10小时，并过1mm筛孔。处理后，将3份糖酯(商品名DK-酯，由Dai-Ichi Kogyo Seiyaku Co.，Ltd.制造)、2份果汁粉(由Ogawa & Co.，Ltd.制造)和1份柠檬酸加入到94份上述混合物中，使用压片机得到含0.5g高纯度低肌醇六磷酸7S蛋白的片剂(1.7g/片)。
每天早餐和晚餐前服6片，持续4周(每天12片，相当于约5g的7S球蛋白)，并使用阻抗身体组成测量装置(装置名称BC-118，由Tanita Corp.制造)在开始服用前以及服用后2周和4周测量身体脂肪百分比。
结果在表1中表示。说明通过每天服用约5g大豆7S球蛋白，可显著降低身体脂肪百分比。这种趋势对于具有较高的最初身体脂肪百分比的人群特别显著。此结果说明7S球蛋白不仅显示出除脂肪的作用，而且与身体中的内环境稳定相一致，具有极佳的降低身体脂肪的作用。
图1表示每一类(从服用前到服用4周)身体脂肪百分比中的人数分布。图2表示最初的身体脂肪百分比与服用4周后身体脂肪百分比之间的差异。
表1身体脂肪百分比/身体脂肪量/试验食品摄入重量的改变
数值平均值±标准偏差*与摄取前的值相比具有显著性差异(成对t-检验，p＜0.05)用生产实施例3中获得的、含有较高百分比的氯仿/甲醇提取部分的7S蛋白进行类似的试验。结果显示与上述试验相似的降低身体脂肪百分比的趋势。然而，所述蛋白比生产实施例1中得到的蛋白味道要差，且试验对象抱怨很难长时间服用它。
试验实施例2[对身体脂肪百分比增加的抑制作用]向100份在生产实施例2中制备的高纯度低肌醇六磷酸7S蛋白中加入14份水、6份柠檬酸和80份乙醇并揉合。在干燥器中，50℃下干燥该混合物10小时后，使所得粉末过1mm的筛孔。将56.2份的已加工粉末与33.2份的麦芽糖粉(Finetose由Hayashibara Shoji，Inc.制造)混合，并加入10.6份的糖粉、40份80％乙醇揉合。在干燥器中，50℃下干燥10小时后，使该混合物过1mm的筛孔。处理后，将3份糖酯(商品名DK-酯，由Dai-Ichi Kogyo Seiyaku Co.，Ltd.制造)、2份果汁粉(由Ogawa & Co.，Ltd.制造)和0.5份香料加入到94份上述混合物中，使用压片机得到含0.75g高纯度低肌醇六磷酸7S蛋白的片剂(1.5g/片)。制备作为对照食品的、主要由碳水化合物组成的片剂(1.5g/片)。在该片剂中，用糖、糊精和淀粉替代高纯度低肌醇六磷酸7S蛋白，并通过降低柠檬酸量而控制酸味。试验食品和对照食品的组成在表2中给出。
表2试验食品和对照食品的组成
试验对象为28人，且试验周期为16周。使用双盲试验和交叉方法，使所述对象服用含7S球蛋白的试验食品达8周，再服用主要由碳水化合物组成的对照食品8周。正常地，每天早餐和晚餐前(或忽略早餐时，可在午餐和晚餐前服用)每次服4片，共8片(约5g的7S球蛋白)。用阻抗身体组成测量装置(BC-118/由Tanita Corp.制造)在开始服用前以及服用第4、8、12和16周结束时测量身体脂肪百分比。身体脂肪百分比是在午餐休息或晚间测量的。试验是在排尿之后进食之前进行的，以便排除水在身体中的作用。试验方法在图3中举例说明。
结果在表3(A组)和表4(B组)中给出。在结合了A组及B组的试验结果(图4)中，在摄取对照食品期间，身体脂肪百分比增加(p＜0.01)，且平均增加±标准偏差为0.8±1.4％。另一方面，在摄取试验食品期间，身体脂肪百分比的增加被抑制，且平均降低±标准偏差为0.1±1.1％。与摄取对照食品期间的增加相比，这种降低是显著的(p＜0.05)。说明身体脂肪百分比的增加可通过每天服用约5g大豆7S蛋白而被显著抑制。
表3身体脂肪百分比的改变(A组)
表4身体脂肪百分比的改变(B组)
本发明说明低肌醇六磷酸7S蛋白降低身体脂肪百分比的能力或抑制身体脂肪百分比增加的能力的有效性。它还说明每天摄取约5g大豆7S蛋白可有效降低身体脂肪百分比或抑制身体脂肪的增加。
工业实用性如上所述，本发明说明降低身体脂肪百分比或抑制身体脂肪增加的效果可通过摄取含有大豆7S蛋白作为活性成分的药剂或食品而显现。
权利要求
1.一种含有大豆7S蛋白作为活性成分的降低身体脂肪百分比的药剂或身体脂肪百分比增加抑制剂。
2.根据权利要求1所述的降低身体脂肪百分比的药剂，其用于具有30％或更高的身体脂肪百分比的超重人群。
3.根据权利要求1和2任何一项所述的降低身体脂肪百分比的药剂或身体脂肪百分比增加抑制剂，其中大豆7S蛋白的固体内含物中含有2.5％或更少的极性脂类。
4.根据权利要求1和2任何一项所述的降低身体脂肪百分比的药剂或身体脂肪百分比增加抑制剂，其中大豆7S蛋白的固体内含物中含有1.2％或更少的肌醇六磷酸。
5.含有权利要求1的降低身体脂肪百分比的药剂或身体脂肪百分比增加抑制剂的食品。
全文摘要
一种含有大豆7S蛋白作为活性成分的降低身体脂肪百分比的药剂或身体脂肪百分比增加抑制剂以及含有它们的食品。作为大豆蛋白7S蛋白，它由蛋白制成，其纯度是通过与11S球蛋白，优选极性脂类和肌醇六磷酸含量较低的蛋白充分分离而提高的。
文档编号A61K38/16GK1681524SQ0382245
公开日2005年10月12日 申请日期2003年4月24日 优先权日2002年7月19日
发明者马场俊充, 广塚元彦, 宫崎千晶, 冈岛哲彦, 神原启文, 鬼头诚 申请人:不二制油株式会社