β－L－2′－脱氧核苷用于治疗抗性HBV株以及联合治疗的制作方法

专利名称：β－L－2′－脱氧核苷用于治疗抗性HBV株以及联合治疗的制作方法
技术领域：
本发明包括用于治疗具有对已知抗HBV药物抗药性的乙型肝炎病毒株的2’-脱氧-β-L-核苷，以及2’-脱氧-β-L-核苷与免疫调节剂的联合治疗。
背景技术：
乙型肝炎病毒(“HBV”)是仅次于烟草的人类癌症起因。虽然人们假设HBV可能直接触发肿瘤发育，或通过慢性炎症、肝硬化以及与感染有关的细胞再生间接触发肿瘤发育，但HBV引起癌症的机制仍然未知。
乙型肝炎病毒已经在世界范围内流行。HBV感染宿主，在宿主未知的情况下潜伏期二到六个月后，引起急性肝炎和肝损害，随之导致腹痛、黄疽以及某些酶的血液水平提高。HBV可能引起暴发性肝炎，即一种快速进行性、常常是致死形式的疾病，在该疾病中大量肝组织受到破坏。患者通常能够从急性病毒性肝炎康复。然而，在某些患者体内，血液中高水平的病毒抗原持续更长或不确定时间，从而引起慢性感染。慢性感染可能引起慢性持续性肝炎。感染慢性持续性HBV的患者在发展中国家最常见。慢性持续性肝炎能够导致疲劳、肝硬化和肝细胞癌(即一种原发性肝癌)。在西方发达国家，HBV的高危群体包括那些接触HBV携带者或其血液样品的群体。HBV的流行病学实际上非常类似于获得性免疫缺陷综合征的流行病学，这项事实解释了为什么HBV感染在患有AIDS或HIV相关感染的患者中普遍存在的原因。然而，HBV比HIV更具传染性。
迄今为止，FDA仅批准了三种用于治疗慢性HBV感染的药物干扰素α，3TC(Epivir，拉米夫定)和阿德福韦二匹伏酯(HepseraGileadSciences)。
FDA批准用于HBV的药物
干扰素α人造形式的干扰素已被用于治疗乙型肝炎。该治疗涉及通过注射施用约4个月的干扰素。
并非所有患者均对干扰素产生响应，有时需要复治。在临床研究中，采用注射用A(干扰素α-2b，重组的，Schering Corporation)来治疗乙型肝炎的患者中，仅45％的人的血中随时间不再显示乙型肝炎病毒。此外，大多数患者很难耐受干扰素治疗，该治疗会导致严重的流行性感冒样症状，体重减轻，和能量和精力不足。
3TCBCH-189(2’，3’-二脱氧-3’-硫胞苷)的(-)-对映异构体(也被称为3TC(Epivir，拉米夫定))是一种同时抗HIV和HBV的抗病毒药。其属于称为核苷类似物反转录酶抑制剂(NRTI)的药物类别，其通过阻断HIV和HBV复制所需反转录酶的产生而发挥作用。3TC最初被发展用于治疗HIV，然而，研究人员发现3TC还具有抗乙型肝炎病毒的作用。美国食品与药物管理局(FDA)于1998年12月批准了用于治疗乙型肝炎病毒感染的Epivir HBV。
虽然3TC能有效抑制HBV复制，但在3TC治疗期间，病毒消除的动力学缓慢(Nowak，M.，S.Bonhoeffer等1996.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 934398-4402)且自发病毒基因组变异性会导致出现药物抗性突变体，该突变体带有影响反转录酶(RT)区域的突变(Mason，W.S.，J.Cullen等1998.Virology 24518-32.Nafa，S.，S.Ahmed等2000.Hepatology 321078-1088；Melegari，M.，P.P.Scaglioni，和J.R.Wands.1998 Hepatology 27628-633.；Seigneres，B.，C.Pichoud等2000.J.Infect.Dis.1811221-1233)。约50％经过治疗的患者在用3TC治疗3年后出现病毒抵抗性(Leung，N.W.，C.L.Lai等2001.Hepatology331527-1532)。对核苷类似物的抗性与聚合酶基因的核酸序列中的置换相关，所述置换导致HBV RT的氨基酸序列改变，尤其是在催化位点内YMDD模体中。最常见的聚合酶变型是rtL180M-plus-M204V改变(根据近来对HBV药物抗性变体不依赖基因型的命名方式)(Stuyver，L.J.，S.A.Locarnini等2001.Hepatology 33751-757)，其将催化位点中突变(rtM204V)与为催化位点变体提供更高复制能力的RT的B结构域中的代偿突变(rtL180M)相关联(Allen，M.I.，M.Deslauriers等1998.Hepatology 271670-1677.Chayama，K.，Y.Suzuki等1998.Hepatology 271711-1716.Melegari，M.，P.P.Scaglioni，和J.R.Wands.1998.Hepatology 27628-633.Ono，S.K.，N.Kato等2001.J.Clin.Investig.107449-455.Seigneres，B.，S.Aguesse-Germon等2001.J.Hepatol.34114-122)。
阿德福韦二匹伏酯(Hepsera)美国食品与药品管理局于2000年9月20日批准阿德福韦二匹伏酯用于肿瘤慢性慢性乙型肝炎.HEPSERATM是阿德福韦二匹伏酯(阿德福韦的二酯前药)的商品名。阿德福韦是一磷酸腺苷的无环核苷酸类似物，其可通过与天然底物三磷酸脱氧腺苷和通过在其掺入病毒DNA后导致DNA链终止从而抑制乙型肝炎病毒(HBV)DNA聚合酶。阿德福韦二匹伏酯的化学名是9-[2-[双[(三甲基乙酰氧)甲氧基]氧磷基]甲氧基]乙基]腺嘌呤。阿德福韦被细胞激酶磷酸化而成为活性代谢物，二磷酸阿德福韦。例如，参见美国专利序号5,641,763和5,142,051，其名称为嘧啶和嘌呤碱基的N-膦酰甲氧烷基衍生物及来自其的具有抗病毒效能的治疗性组合物。
抗性HBV株拉米夫定是用于HBV治疗的L-核苷，所述治疗通常会导致能区分非天然L-核苷和D-核苷(天然底物)的病毒抗性株的选择，所述抗性株尤其是单突变体，YMDD突变体(M552I或M552V)和L528M，以及双突变体(L528M/M552V)。参见美国专利序号6,242,187和6,265,181；和国际公开序号WO 01/04358。还可参见Ahmed等“通过在用拉米夫定治疗慢性乙型肝炎的患者中确定乙型肝炎病毒聚合酶突变对病毒抗性早期检测”，Hepatology，2000，32(5)，1078-1088；Ono等，“聚合酶L528M突变与核苷酸结合位点突变协作，增加乙型肝炎病毒复制核药物抗性”，Journal of Clinical Investigation，February2001，107(4)，449-455；Allen“拉米夫定抗性的乙型肝炎病毒中突变的鉴定和特征描述”，Hepatology，1998，7(6)，1670-1677；Das等“揭示乙型肝炎病毒聚合酶对拉米夫定(3TC)和恩曲他滨(FTC)抗性的机制的分子模型和生物化学特征描述”，Journal of Virology，May 2001，75(10)，4771-4779；Delaney“阿德福韦，恩替卡韦和β-L-胸苷(L-DT)抗HBV药物抗性株的体外交叉抗性试验”，Antimicrobial Agents and Chemotherapy，June 2001，45(6)，1705-1713；Bu“乙型肝炎病毒聚合酶的YMDD模体外其它突变在L(-)SddC(3TC)抗性症的作用”，Biochemical Pharmacology，1998，55(10)，1567-1572；Fu，“Sensitivity of L-(-)-2’，3’-二脱氧硫代胞苷抗性乙型肝炎病毒对其它抗病毒核苷类似物的敏感性”BiochemicalPharmacology，1999，57(12)，1351-1359；Gauthier“用拉米夫定专利的慢性乙型肝炎患者症乙型肝炎病毒血症的定量和YMDD变体的出现”The Journal of Infection Diseases，December1999，180，1757-1762；Kioko“乙型肝炎病毒聚合酶中YMDD模体对复制和拉米夫定抗性的影响体外全长病毒DNA转染的研究”Hepatology，March1999，29(3)，939-945；Kioko“拉米夫定抗性乙型肝炎病毒对其它逆转录酶抑制剂的易感性”The Journal of Clinical Investigation，June1999，3(12)，1635-1640；Zoulim“对慢性乙型肝炎的治疗抗病毒功效和乙型肝炎病毒聚合酶突变对治疗结果的影响”Journal ofHepatology，1998，29，151-168；和Ying等J.Viral Hepat.，March2000，7(2)，161-165。
在将拉米夫定施用于HBV感染的患者(100mg qd)的控制临床试验中，在治疗一年后，YMDD-突变体HBV的发生率是14-32％，而在治疗2-3年后为58％。突变体病毒与相对于不具有YMDD突变的拉米夫定治疗的患者的减少的治疗响应的迹象相关。Ono等The Journalof Clinical Investigation，2001，107(4)，449-455。
对获自患者的病毒分离物的基因型分析(所述患者在接受拉米夫定时存在更新的HBV复制)显示出HBV对拉米夫定敏感性的降低与如下突变相关，该突变导致HBV聚合酶催化区的YMDD模体中蛋氨酸至缬氨酸或异亮氨酸的置换(552位)和515或528位的亮氨酸至蛋氨酸的置换(依据HBV的基因型/亚型)。
目前，尚没有可用于评估抗病毒剂对来自患者的拉米夫定抗性HBV分离物所感染细胞的抵抗活性的基于细胞的HBV感染系统。鸭HBV(DHBV)体外模型尚未证实可用于选择抗药性突变，因为该模型中使用的原代鸭肝细胞在细胞培养中无法保持超过数周。旱獭体外模型中抗药性突变体的选择的关联性是不确定的，因为旱獭中拉米夫定抗性突变体的谱与HBV感染患者中鉴定的不符。
干扰素干扰素是一种机体天然产生的蛋白质，其可调节免疫系统并调节其它细胞功能。干扰素的主要类型是干扰素α，干扰素β，干扰素γ，干扰素ω和干扰素τ。
可对干扰素进行修饰以增强其在体内的稳定性，所长修饰包括聚乙二醇化，或其它能够增强分子稳定性的方法。
干扰素α类干扰素的实例包括干扰素α-2a，干扰素α-2b，聚乙二醇化干扰素α-2a，聚乙二醇化干扰素α-2b ROFERON-A(干扰素α-2a，Roche)，PEGASYS(聚乙二醇化干扰素α-2a)，INTRONA(干扰素α-2b)，PEG-INTRON(聚乙二醇化干扰素α-2b)，复合干扰素，InterMune提供的INFERGEN(干扰素alphacon-1)，Viragen提供的OMNIFERON(天然干扰素)，Human Genome Sciences提供的ALBUFERON，Amarillo Biosciences提供的口服干扰素α，SuperFeron(天然人多亚型IFN-α，Genetrol，Inc.)。
其它类型的干扰素包括Ares-Serono提供的干扰素β，干扰素γ，干扰素τ，干扰素ω，REBIF(干扰素β-la)，BioMedicine提供的ω干扰素，InterMune，和HuFeron(人IFN-β，Genetrol，Inc.)提供的干扰素γ-lb。
使用一种遗传工程化蛋白α-干扰素进行的每日治疗很有希望。也已经开发出一种源于人类血清的疫苗，用于免疫接种患者，使其抵抗HBV。人们已经通过遗传工程生产疫苗。虽然已经证实所述疫苗有效，但由于来自慢性携带者的人类血清供应有限，并且纯化程序长而昂贵，使得生产所述疫苗非常麻烦。此外，从不同血清制备的每一批疫苗必须在黑猩猩体内测试以保证安全性。另外，所述疫苗无法帮助已经感染病毒的患者。
在嘌呤核苷和嘧啶核苷对病毒性疾病(尤其是HBV和HIV)的作用模式中，主要步骤是它们受到细胞激酶和病毒激酶的代谢激活，产生一磷酸、二磷酸和三磷酸衍生物。许多核苷的生物活性种类是三磷酸形式，该形式抑制DNA聚合酶或反转录酶，或导致链终止。
已经鉴定出显示对抗HBV活性的多种合成核苷。在Liotta等的美国专利5,539,116中要求保护称为3TC的BCH-189(2’，3’-二脱氧-3’-硫代胞苷)的(-)-对映异构体，该物质目前正在进行治疗乙型肝炎的临床试验。还可见BioChem Pharma，Inc.提交的EPA0494119A1。
阿德福韦(9-{2-(膦酰基甲氧基)乙基}腺嘌呤也称为PEMA或“2-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)乙氧基}甲基膦酸}在美国也已被批准用于治疗乙型肝炎病毒感染的患者。例如参见，美国专利序号5,641,763和序号5,142,051。已经报道了携带HBV的患者中存在对阿德福韦治疗的抗性。
在Liotta等的美国专利序号5,814,639和序号5,914,331中所要求保护的β-2-羟甲基-5-(5-氟胞嘧啶-1-基)-1，3-氧硫杂环戊(己)烷(oxathiolane)(“FTC”)显示对抗HBV活性。见Furman等，“顺式-5-氟-1-{2-(羟甲刹-1，3-氧硫杂环戊(己)烷-5-基}-胞嘧啶的(-)和(+)对映异构体的抗乙型肝炎病毒活性、细胞毒性和合成代谢剖析”Antimicrobial Agents和Chemotherapy，1992年12月，第2686-2692页；和Cheng等，Journal of Biological Chemistry第267卷(20)，13938-13942(1992)。
美国专利序号5,565,438、序号5,567,688和序号5,587,362(Chu等)公开应用2’-氟-5-甲基-β-L-呋喃阿拉伯糖尿苷(arabinofuranolyluridine)(L-FMAU)治疗乙型肝炎和EB病毒。
喷昔洛韦(Penciclovir)(PCV，2-氨基-1，9-二氢-9-{4-羟基-3-(羟甲刹丁基}-6H-嘌呤-6-酮)具有对抗乙型肝炎的确定活性。见美国专利序号5,075,445和5,684,153。
耶鲁大学和The University Of Georgia Research Foundation，Inc.在WO92/18517中公开应用L-FDDC(5-氟-3’-硫代-2’，3’-二脱氧胞苷)治疗乙型肝炎病毒。
其它研究用于治疗HBV的药物包括腺苷阿拉伯糖苷、胸腺素、无环鸟苷、膦酰基甲酸、齐多夫定、(+)-cyanidanol、奎吖因和2’-氟阿拉伯糖基-5-碘尿嘧啶。
归属于Emory University的美国专利序号5,444,063和序号5,684,010公开了应用β-D-1，3-二氧戊烷嘌呤核苷的纯对映异构体治疗乙型肝炎。
Emory University、UAB Research Foundation和the CentreNational de la Recherche Scientifique(CNRS)提交的WO96/40164公开用于治疗乙型肝炎的多种β-L-2’，3’-二脱氧核苷。
Emory University、UAB Research Foundation和the CentreNational de la Recherche Scientifique(CNRS)提交的WO95/07287公开用于治疗HIV感染的2’或3’脱氧和2’，3’-二脱氧-β-L-呋喃戊糖基核苷。
Genencor International，Inc.和Lipitek，Inc.提交的WO96/13512公开制备用作抗肿瘤剂和杀病毒剂的L-呋喃核糖基核苷。
WO95/32984公开用作免疫抑制药物的核苷一磷酸的脂类酯。
DE4224737公开胞嘧啶核苷和它们的药物应用。
Tsai等在Biochem.Pharmacol.1994，48(7)，1477-81中公开抗HIV剂2’-β-D-F-2’，3’-二脱氧核苷类似物对于线粒体DNA的细胞含量和乳酸产生的效应。
Galvez，J.Chem.Inf.Comput.Sci.1994，35(5)，1198-203描述β-D-3’-叠氮基-2’，3’-二脱氧-5-氟胞苷的分子计算。
Mahmoudian，Pharm.Research 1991，8(1)，43-6公开HIV剂如β-D-3’-叠氮基-2’，3’-二脱氧-5-氟胞苷的结构-反应性关系的定量分析。
美国专利序号5,703,058公开用于治疗HIV或HBV的(5-甲酰亚氨基(carboximido)或5-氟)-(2’，3’-不饱和或3’-修饰)嘧啶核苷。
Lin等在J.Med.Chem.31(2)，336-340(1988)公开β-D-核苷的各种3’-叠氮基类似物的合成和抗病毒活性。
NoVirio Pharmaceuticals，Ltd.提交的WO00/3998公开制备取代6-苄基-4-氧代嘧啶的方法，以及所述嘧啶用于治疗HIV的应用。
Idenix Pharmaceuticals，Ltd.在美国专利序号6,395,716；6,444,652；6,566,344和6,539,837中公开了2’-脱氧-β-L-赤呋喃五并核苷(erythropentofuranonucleoside)以及它们在治疗HBV中的应用。同样参见WO 00/09531。公开了治疗人类和其它宿主动物乙型肝炎感染的一种方法，包括给予有效量的(可任选地在药学可接受的载体中)具有生物活性的下列物质2’-脱氧-β-L-赤-呋喃五并核苷(也称为β-L-dN或β-L-2’-dN)或其药学上可接受的盐或前药，包括β-L-脱氧核糖胸苷(β-L-dT)、β-L-脱氧核糖胞苷伊-L-dC)、β-L-脱氧核糖尿苷(β-L-Du)、β-L-脱氧核糖鸟苷(β-L-dG)、β-L-脱氧核糖腺苷(β-L-dA)和β-L-脱氧核糖肌苷(β-L-dI)，所述物质或者单独给予，或者联合给予。还公开了所述活性化合物的5’和N4(胞苷)或N6(腺苷)酰化或烷基化衍生物或5’-磷脂或5’-醚酯。
von Janta-Lipinski等J.Med.Chem.，1998，41(12)，2040-2046公开了3’-氟-修饰的β-2’-脱氧核糖核甙5’-三磷酸酯的L-对映异构体用于抑制乙型肝炎聚合酶的用途。具体而言，3’-脱氧-3’-氟-β-L-胸腺嘧啶(β-L-FTTP)，2’，3’-双脱氧-3’-氟-β-L-胞嘧啶(β-L-FdCTP)，和2’，3’-双脱氧-3’-氟-β-L-5-甲基胞嘧啶(β-L-FMethGTP)的5’-三磷酸酯被公开为HBV DNA聚合酶的有效抑制剂。此外，von Janta-Lipinski等公开了β-L-胸腺嘧啶(而非β-L-2’-dC)的三磷酸酯作为HBV和DHBV的内源性DNA聚合酶的核苷抑制剂的生物活性。但是，仅评价了三磷酸化的β-L-胸腺嘧啶，而非本发明要求的非磷酸化形式，现有技术中没有记载这些β-L-核苷是否在细胞内或体内被磷酸化，或，更重要地，没有记载胸腺嘧啶在体内的磷酸化的效能。由此，现有技术没有教导β-L-胸腺嘧啶在细胞内或体内具有任何乙型肝炎活性。同样参见WO96/1204。
归于Johansson等的欧洲专利申请序号0352248A1公开了L--核呋喃糖基化合物用于治疗乙型肝炎的用途。
Lin等在″Synthesis of Several Pyrimidine L-Nucleoside Analoguesas Potential AntiviralAgents″Tetrahedron，1995，51(4)，1055-1068中公开了β-L-5-碘-2’-脱氧尿苷(β-L-IUdR，化合物7)具有对抗疱疹感染和多种其它DNA病毒的活性，BVdU和β-L-BV-氮杂-U也具有对抗疱疹的活性，β-L-BV-氮杂-U具有对抗水痘-带状疱疹病毒的活性；而2’，3’-双脱氧-β-L-氮杂胞苷被发现具有对抗HBV的活性。
归于Idenix Pharmaceuticals，Ltd.的US专利公开序号20030083306公开了用于治疗HBV的2’-脱氧-β-L-核苷的3’-前药。也见于WO01/96353。
Beauchamp的美国专利序号4,957,924公开了无环鸟苷的各种治疗用酯。
2002年4月17-21日，在西班牙马德里召开的欧洲协会肝脏研究会议，上，Gilead Sciences，Inc.的Siihnel等提出了显示阿德福韦与β-L-2’脱氧胸苷的联合在体外产生了对抗HBV的累加抗病毒效果的报告。
在同一会议中，Gilead Sciences，Inc.的Delaney等提出了口头包括，其表明选择拉米夫定抗性HBV的株系，即，具有L528M(rtL180M)或M552I(rtM204I)单突变，或具有L528M(rtL528M)和M552V(rN204V)双突变的的HBV，在体外对L-dT和L-dC具有交叉抗性。
Lok和McMahon，AASLD Practice Guidelines，pp.1225-1241(2001)中也也描述了对乙型肝炎感染的治疗，包括用干扰素的治疗。将旱獭乙型肝炎病毒(WHV)慢性感染的东方旱獭用作HBV感染的模型以便研究1-(2-氟-5-甲基-β)3-L-阿糖呋喃糖基)-尿嘧啶(L-FMAU)和WHV表面抗原疫苗的抗病毒效果。L-FMAU和疫苗联合相关联的体液和细胞免疫与在自限性WHV感染中观察到的相似。Menne等，J.Virology，76(11)5305-5314(2002)。
WO 98/23285公开了在人或动物患者中治疗或预防乙型肝炎病毒感染的方法，其包括对患者施用有效量或预防量的喷西洛维(或其生物前提例如泛昔洛韦)和α-干扰素.
已经鉴定具有对抗乙型肝炎病毒活性的抗病毒剂的实例包括当前处于临床发展中的药剂，包括
**日达仙美国批准罕用药暴露后和/或肝移植后治疗
Mark Nelson，MD.Selected Highlights from Drug Development forAntiretroviral Thera pies 2001(Hep DART 2001)December 16-20，2001，Maui，Hawaii；Selected Highlights from American Association forthe Study of Liver Diseases 52nd Annual Meeting(52nd AASLD).November 9-13，2001.Dallas，Texas；Report on Hepatitis B fromDigestive Disease Week 2001；May 20-23，2001，Atlanta，Georgia.
2002年7月25日公布的美国申请序号20020098199公开了治疗HBV和HCV的免疫刺激性序列。
归属于The Regents of the University of California和DynavaxTechnologies Corp.，的美国专利序号6,225,292公开了抑制ISS-ODN(免疫刺激性序列寡聚脱氧核苷酸)的免疫刺激性活性的寡核苷酸及其鉴别方法和用途。所公开的寡核苷酸可用于控制治疗上预期的ISS-ODN佐剂活性以及由重组表达载体(诸如用于基因治疗和基因免疫接种的那些载体)显现出的不需要的ISS-ODN活性。该寡核苷酸还具有抗炎活性，可用于降低响应包含微生物的ISS-ODN的宿主感染的炎症，可用于控制自身免疫病和增高宿主针对抗原的Th2型免疫反应。该专利还包括本发明的寡核苷酸的药学上有用的缀合物(包括诸如抗原和抗体的缀合物配偶体)。
归属于Dynavax Technologies Corp.的美国专利序号6,589,940公开了免疫刺激性寡核苷酸组合物。这些寡核苷酸包括免疫刺激性八核苷酸序列。这些寡核苷酸可与免疫刺激性肽或抗原联合施用。其中还公开了通过施用该寡核苷酸而调节免疫反应的方法。此外，提供了鉴定具有免疫刺激性活性的寡核苷酸的体外筛选方法。
归属于Dynavax Technologies Corp.的美国专利序号6,562,798公开了免疫调节性寡核苷酸组合物，其包括含有修饰的胞嘧啶的免疫刺激性六核苷酸序列。这些寡核苷酸可与免疫调节性肽或抗原联合施用。其中还公开了通过施用包含修饰的免疫刺激性序列的寡核苷酸而调节免疫反应的方法。
归属于Dynavax Technologies Corp.的PCT WO 03/014316A2公开了用于个体免疫调节的组合物和方法。通过施用包含3-6mer免疫调节性寡核苷酸的免疫调节性多核苷酸/微载体(IMO/MC)复合物来实现免疫调节。IMO/MC复合物可以是共价或非共价结合的。其中还公开了包含封装于MC的3-6mer IMO的免疫调节性组合物。
归属于Dynavax Technologies Corp.的PCT WO 03/000922A2公开了免疫调节性化合物和采用免疫调节性化合物对个体进行免疫调节的方法。
归属于Dynavax Technologies Corp.的PCT WO 02/052002A2公开了免疫调节性多核苷酸和采用免疫调节性多核苷酸对个体进行免疫调节的方法。
归属于Dynavax Technologies Corp.的PCT WO01/68144A2和PCTW00168143A2公开了用于个体免疫调节的组合物和方法。通过施用包含3-6mer免疫调节性寡核苷酸的免疫调节性多核苷酸/微载体(IMO/MC)复合物来实现免疫调节。IMO/MC复合物可以是共价或非共价结合的，且描述了一种多核苷酸的特征，该多核苷酸包含至少一种与可生物降解的微载体或纳米载体结合的免疫刺激性序列。
PCT WO01/68117A2，归属于Dynavax Technologies Corp.，公开了治疗乳头瘤病毒感染的方法。对已经暴露于或感染了乳头瘤病毒的个体施用包含免疫刺激性序列的多核苷酸。该多核苷酸不与乳头瘤病毒抗原一同施用。施用该多核苷酸导致乳头瘤病毒感染症状的改善。
归属于Dynavax Technologies Corp.的PCT WO01/68078A2公开了治疗乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)感染的方法。对已经暴露于或感染了HBV和/或HCV的个体施用包含免疫刺激性序列的多核苷酸。该多核苷酸不与HCV或HBV抗原一同施用。施用该多核苷酸导致HCV或HBV感染症状的改善。
归属于Dynavax Technologies Corp.的PCT WO01/68077A3公开了抑制、防止，和/或治疗病毒感染的方法。对具有暴露于病毒的危险、已经暴露于病毒或感染了病毒的个体施用包含免疫刺激性序列(“ISS”)的多核苷酸。包含ISS的多核苷酸不与任何病毒抗原一同施用。施用包含ISS的多核苷酸导致一种或多种病毒感染症状的发生率和/或严重度降低。
归属于Dynavax Technologies Corp.的PCT WO01/12223A2公开了调节针对第二抗原的免疫反应的方法，其使得必须施用第一抗原和免疫刺激性多核苷酸。免疫反应的调节通常随Th1反应的刺激而放大。
归属于Dynavax Technologies Corp.PCT WO 00/21556A1公开了抗病毒免疫调节性组合物，其包含免疫刺激性多核苷酸和HIV抗原，诸如gpl20。其中还公开了通过施用寡核苷酸和抗原组合物来调节免疫反应的方法。
归属于Dynavax Technologies Corp.的PCT WO 00/16804A1公开了治疗IgE相关性病症的方法及其中使用的组合物。该方法特别适用于治疗变态反应和变态反应相关性病症。该方法通常包括施用IgE抑制剂(诸如抗IgE抗体)和抗原和/或免疫刺激性多核苷酸序列(ISS)。这些联合方法具有显著优势，诸如允许更具攻击性的治疗，同时降低不需要的副作用，诸如过敏反应。
归属于DynavaxTeclmologies Corp.的PCT WO 99/62923A2公开了包括含有修饰的胞嘧啶的免疫刺激性六核苷酸序列的寡核苷酸。这些寡核苷酸可与免疫调节性肽或抗原联合施用。其中还公开了通过施用包含修饰的免疫刺激性序列的寡核苷酸而调节免疫反应的方法。
归属于Dynavax Technologies Corp.的PCT WO98/55495A2公开了包含免疫刺激性八核苷酸序列的免疫刺激性寡核苷酸组合物。这些寡核苷酸可与免疫刺激性肽或抗原联合施用。其中还公开了通过施用该寡核苷酸而调节免疫反应的方法。此外，提供了鉴定具有免疫刺激性活性的寡核苷酸的体外筛选方法。
归属于Coley Pharmaceutical Group，Inc.的PCT WO03/015711A2公开了一类具有至少两个功能上和结构上确定的结构域的的免疫刺激性核酸。该类组合模体免疫刺激性核酸可刺激免疫反应并可用于治疗多种免疫相关性病症，诸如癌症，感染性疾病，和变态反应性疾病。该核酸还可刺激天然杀伤细胞的活化以及1型干扰素的生成。
归属于Coley Pharmaceutical Group，Inc.的美国专利序号6,406,705公开了采用免疫刺激性寡核苷酸协同组合的方法和产品，所述免疫刺激性寡核苷酸具有至少一个未甲基化CpG二核苷酸(CpGODN)和非核酸佐剂。佐剂的所述组合可与抗原一同或单独使用。其中还公开了采用免疫刺激性寡核苷酸的方法和产品，所述免疫刺激性寡核苷酸具有至少一个未甲基化CpG二核苷酸(CpG ODN)以便在胎儿中诱导细胞免疫。
归属于Coley Pharmaceutical Group，Inc.的美国专利序号6,339,068公开了DNA疫苗载体，其可通过除去CpG-N模体和任选地添加CpG-S模体而被改进。此外，对于高和长期水平的表达来说，优化的载体应包括不被细胞因子下调的启动子/增强子，所述细胞因子由免疫刺激性CpG模体诱导。其中还提供了用于免疫刺激的载体和方法。本发明还提供了提供如下方法改进的基因治疗载体，即通过确定CpG-N和CpG-S模体存在于构建体中，除去刺激性CpG(CpG-S)模体和/或插入中和性CpG(CpG-N)模体，由此产生可增强治疗性多肽表达的核酸构建体。
归属于Coley Pharmaceutical Group，Inc.的美国专利序号6,239,116公开了包含未甲基化的CpG二核苷酸的核酸序列，其可调节包括刺激Th1型免疫激活，细胞因子生成，NK溶解活性和B细胞增殖的免疫反应。该序列还可用于合成佐剂。
归属于Coley Pharmaceutical Group，Inc.的美国专利序号6,207,646公开了包含未甲基化的CpG二核苷酸的核酸序列和基于其在个体中刺激免疫反应以及将Th2反应变为Th1反应的能力的治疗性用途。
归属于Coley Pharmaceutical Group，Inc.的美国专利序号6,194,388公开了包含未甲基化的CpG二核苷酸的寡核苷酸和和基于其在个体中刺激免疫反应的能力的治疗性用途。其中还公开了治疗免疫系统活化相关性疾病的方法，所述免疫系统活化由个体中未甲基化CpG二核苷酸启动，所述方法包括对个体施用不包含未甲基化CpG序列(即，甲基化CpG序列或非CpG序列)的寡核苷酸以便在与未甲基化CpG核酸的结合竞争中取胜。其中还公开了包含二核苷酸的甲基化CpG，其可用于反义治疗或作为体内杂交探针，和可用于抗病毒治疗的免疫抑制性寡核苷酸。
归属于Coley Pharmaceutical Group，Inc.的美国公开序号20030091599A1公开了采用免疫刺激性寡核苷酸协同组合的方法和产品，所述免疫刺激性寡核苷酸具有至少一个未甲基化CpG二核苷酸(CpG ODN)和非核酸佐剂。剂的所述组合可与抗原一同或单独使用。该公开还涉及采用免疫刺激性寡核苷酸的方法和产品，所述免疫刺激性寡核苷酸具有至少一个未甲基化CpG二核苷酸(CpG ODN)以便在胎儿中诱导细胞免疫。
归属于Coley Pharmaceutical Group，Inc.的PCT WO 03/031573A2公开了可用于鉴别、定性和优化免疫刺激性化合物，其激动剂和拮抗剂的组合物和方法，其通过TLR3发挥作用。
归属于Coley Pharmaceutical Group，Inc.的PCT WO 03/012061A2公开了关于树突状细胞病毒数据库的方法和组合物。
归属于Coley Pharmaceutical Group，Inc.的PCT WO02/069369A2公开了被描述为CpG样核酸的免疫刺激性组合物，其包括具有CpG核酸的免疫刺激特性的核酸，尽管CpG二核苷酸的C、G或C和G的特定置换。置换可包括甲基化C与C，肌苷与G和ZpY与CpG的交换，其中Z是胞嘧啶而dSpacer和Y是肌苷，2-氨基嘌呤、水粉伞素或dSpacer。还公开了采用CpG样核酸在个体中诱导免疫反应的方法。该方法可用于治疗具有或处于发展感染性疾病、变态反应、哮喘、癌症、贫血、血小板减少症或中性粒细胞减少症的个体的方法。
归属于Coley Pharmaceutical Group，Inc.的PCT WO01/95935A1公开了采用免疫刺激性核酸诱导免疫反应的方法和产品。具体而言，免疫刺激性核酸优先诱导Th2免疫反应。本发明可用于治疗和预防与Th1免疫反应相关的病症或可用于构建用于治疗对Th2免疫反应敏感的病症的Th2环境。
归属于Coley Pharmaceutical Group，Inc.的PCT WO01/22990A2公开了用于拓展IFN-’α’在治疗多种病毒性和增殖性疾病上的临床用途的方法和组合物。还公开了增加IFN-’α’治疗功效和降低IFN-’α’治疗相关副作用的方法。此外，提供了无外源IL-3或GM-CSF的，体外维持生存和激活产生天然干扰素的细胞(IPCs)的方法。
归属于Coley Pha rmaceutical Group，Inc.的PCT WO01/22972A2公开了免疫刺激性核酸组合物及该组合物的使用方法。富含T的核酸包含T序列和/或具有超过25％的T核苷酸残基。TG核酸含有TG二核苷酸。富含C的核酸具有至少一个聚C区和/或超过50％的C核苷酸。这些免疫刺激性核酸起作用的方式与包含CpG模体的核酸相似。本发明还包括优选的CpG核酸。
考虑到乙型肝炎病毒已经在世界范围内流行，并且其对受感染患者有严重并且常常是悲惨的影响，因此，有极大必要为感染药物抗性病毒，(即，拉米夫定抗性HBV)的人提供对宿主低毒的新型有效药剂。
因此，本发明的一个目的在于提供用于治疗和/或预防宿主，诸如人类患者中拉米夫定抗性HBV感染的化合物，组合物和方法。
本发明的另一目的在于提供防止原初宿主，诸如人类患者中抗性HBV突变体，例如YMDD HBV(M552V)感染的化合物，组合物和方法。
而本发明的另一目的在于提供治疗抗药性型HBV感染患者的化合物，组合物和方法。
而本发明的另一目的在于提供用于治疗患者中HBV和/或抑制或防止患者中抗性HBV株表达的有效联合治疗组合物。
发明概述已经发现β-L-2’-脱氧核苷，尤其是β-L-2’-脱氧胞苷和β-L-2’-脱氧胸苷，具有抵抗存在552位密码子(M-V)突变，即病毒的逆转录酶区的204(M-V)位密码子突变的抗药性乙型肝炎病毒活性。基于该发现，公开了治疗宿主，诸如哺乳动物，尤其是人类中拉米夫定抗性HBV(M552V)的方法，该方法包括施用β-L-2’-脱氧核苷或其药学上可接受的盐、酯或前药。此外，还公开了防止原初宿主，诸如哺乳动物，尤其是人类中发生拉米夫定抗性HBV(M552V)突变的方法，该方法包括施用β-L-2’-脱氧核苷或其药学上可接受的盐、酯或前药。还公开了防止和/或抑制原初宿主，诸如哺乳动物，尤其是人类中发生HBV双突变体(L528M/M552V)的方法，该方法包括施用β-L-2’-脱氧核苷或其药学上可接受的盐、酯或前药。
在一个实施方案中，本发明提供了式(I)的β-L-2’-脱氧核苷或其药学上可接受的盐、酯或前药的用途 其中R1是氢、直链烷基、支链烷基或环状烷基、酰基、乙酰基、丁酰基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、CO-芳氧基烷基、CO-取代的芳基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳烷基磺酰基、氨基酸残基、一磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯或磷酸酯衍生物；R2是氢、直链烷基、支链烷基或环状烷基、酰基、乙酰基、丁酰基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、CO-芳氧基烷基、CO-取代的芳基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳烷基磺酰基、氨基酸残基、一磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯或磷酸酯衍生物；X是O、S、SO2或CH2；且BASE为可任选被取代的嘌呤碱基或嘧啶碱基，和其所有互变异构体和立体异构体。
在优选的实施方案中，X为O。
在一个实施方案中，所述氨基酸残基是式C(O)C(R8)(R9)(NR10R11)，其中R8是氨基酸侧链，其中如在脯氨酸中，R8可任选地与R10连接形成环状结构；或者，R8是烷基、芳基、杂芳基或杂环部分；R9是氢、烷基(包括低级烷基)或芳基；和R10和R11独立地是氢、酰基(包括连接于R8的酰基衍生物)或烷基(包括但不限于甲基、乙基、丙基和环丙基)；和其所有互变异构体和立体异构体。
在本发明另一个实施方案中，所述β-L 2’-脱氧核苷是下式的β-L-2’-脱氧嘌呤或其药学上可接受的盐、酯或前药 其中R1是氢、直链烷基、支链烷基或环状烷基、酰基、乙酰基、丁酰基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、CO-芳氧基烷基、CO-取代的芳基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳烷基磺酰基、氨基酸残基、一磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯或磷酸酯衍生物；R2是氢、直链烷基、支链烷基或环状烷基、酰基、乙酰基、丁酰基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、CO-芳氧基烷基、CO-取代的芳基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳烷基磺酰基、氨基酸残基、一磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯或磷酸酯衍生物；Y是OR3、NR3R4或SR3；且X1和X2独立地选自氢、直链烷基、支链烷基或环状烷基、酰基、乙酰基、丁酰基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、卤素、OR5、NR5R6或SR5；且R3、R4、R5和R6独立地是氢、直链烷基、支链烷基或环状烷基(尤其是环丙基)、二烷基氨基亚烷基(特别是二甲氨基亚甲基)、酰基、乙酰基、丁酰基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、CO-芳氧基烷基、CO-取代的芳基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳烷基磺酰基、氨基酸残基、一磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯或磷酸酯衍生物；和其所有互变异构体和立体异构体。
在一个实施方案中，所述氨基酸残基是式C(O)C(R8)(R9)(NR10R11)，其中R8是氨基酸侧链，其中如在脯氨酸中，R8可任选地与R10连接形成环状结构；或者，R8是烷基、芳基、杂芳基或杂环部分；R9是氢、烷基(包括低级烷基)或芳基；和R10和R11独立地是氢、酰基(包括连接于R8的酰基衍生物)或烷基(包括但不限于甲基、乙基、丙基和环丙基)；和其所有互变异构体和立体异构体。
在本发明另一个实施方案中，所述β-L 2’-脱氧核苷是下式的β-L-2’-脱氧嘧啶或其药学上可接受的盐、酯或前药 其中R1是氢、直链烷基、支链烷基或环状烷基、酰基、乙酰基、丁酰基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、CO-芳氧基烷基、CO-取代的芳基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳烷基磺酰基、氨基酸残基、一磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯或磷酸酯衍生物；R2是氢、直链烷基、支链烷基或环状烷基、酰基、乙酰基、丁酰基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、CO-芳氧基烷基、CO-取代的芳基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳烷基磺酰基、氨基酸残基、一磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯或磷酸酯衍生物；Y是OR3、NR3R4或SR3；X1选自H、直链烷基、支链烷基或环状烷基、酰基、乙酰基、丁酰基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、卤素、OR5、NR5R6或SR5；且
R3、R4、R5和R6独立地是H、直链烷基、支链烷基或环状烷基(尤其是环丙基)、二烷基氨基亚烷基(尤其是二甲氨基亚甲基)、酰基、乙酰基、丁酰基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、CO-芳氧基烷基、CO-取代的芳基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳烷基磺酰基、氨基酸残基、一磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯或磷酸酯衍生物；和其所有互变异构体和立体异构体。
在一个实施方案中，所述氨基酸残基是式C(O)C(R8)(R9)(NR10R11)，其中R8是氨基酸侧链，其中如在脯氨酸中，R8可任选地与R10连接形成环状结构；或者，R8是烷基、芳基、杂芳基或杂环部分；R9是氢、烷基(包括低级烷基)或芳基；和R10和R11独立地是氢、酰基(包括连接于R8的酰基衍生物)或烷基(包括但不限于甲基、乙基、丙基和环丙基)；和其所有互变异构体和立体异构体。
在一个具体的实施方案中，所述β-L 2’-脱氧核苷是下式的β-L-2’-脱氧胞苷或其药学上可接受的盐、酯或前药 其中R1是氢、直链烷基、支链烷基或环状烷基、酰基、乙酰基、丁酰基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、CO-芳氧基烷基、CO-取代的芳基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳烷基磺酰基、氨基酸残基、一磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯或磷酸酯衍生物；R2是氢、直链烷基、支链烷基或环状烷基、酰基、乙酰基、丁酰基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、CO-芳氧基烷基、CO-取代的芳基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳烷基磺酰基、氨基酸残基、一磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯或磷酸酯衍生物；和
R3和R4独立地是氢、直链烷基、支链烷基或环状烷基(尤其是环丙基)、二烷基氨基亚烷基(尤其是二甲氨基亚甲基)、酰基、乙酰基、丁酰基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、CO-芳氧基烷基、CO-取代的芳基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳烷基磺酰基、氨基酸残基、一磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯或磷酸酯衍生物。
在优选实施方案中，R1和/或R2是H。
在一个实施方案中，所述氨基酸残基是式C(O)C(R8)(R9)(NR10R11)，其中R8是氨基酸侧链，其中如在脯氨酸中，R8可任选地与R10连接形成环状结构；或者，R8是烷基、芳基、杂芳基或杂环部分；R9是氢、烷基(包括低级烷基)或芳基；和R10和R11独立地是氢、酰基(包括连接于R8的酰基衍生物)或烷基(包括但不限于甲基、乙基、丙基和环丙基)。
在另一优选实施方案中，R1和/或R2是一种氨基酸残基，尤其是L-缬氨酰基。
在一个实施方案中，R3是氢，R4是二甲氨基亚甲基。
在另一实施方案中，R3是氢，R4是乙酰基。
在另一实施方案中，R3是氢，R4是L-缬氨酰基。
在一个具体的实施方案中，所述β-L-2’-脱氧胞苷是下式或其药学上可接受的盐、酯或前药 在另一具体的实施方案中，所述β-L-2’-脱氧胞苷是下式或其药学上可接受的盐
在另一具体的实施方案中，所述β-L-2’-脱氧胞苷是下式或其药学上可接受的盐、酯或前药 其中R2是氢、直链烷基、支链烷基或环状烷基、酰基、乙酰基、丁酰基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、CO-芳氧基烷基、CO-取代的芳基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳烷基磺酰基、氨基酸残基、一磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯或磷酸酯前药；和R3和R4独立地是H、直链烷基、支链烷基或环状烷基、二烷基氨基亚烷基、酰基、乙酰基、丁酰基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、CO-芳氧基烷基、CO-取代的芳基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳烷基磺酰基、氨基酸残基、一磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯或磷酸酯前药。
在另一具体的实施方案中，所述β-L-2’-脱氧胞苷是下式或其药学上可接受的盐
在另一具体的实施方案中，所述β-L-2’-脱氧胞苷是下式或其药学上可接受的盐 在另一个实施方案中，所述β-L 2’-脱氧核苷是下式的β-L-2’-脱氧胸苷或其药学上可接受的盐、酯或前药 其中R1是氢、直链烷基、支链烷基或环状烷基、酰基、乙酰基、丁酰基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、CO-芳氧基烷基、CO-取代的芳基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳烷基磺酰基、氨基酸残基、一磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯或磷酸酯衍生物；且R2是氢、直链烷基、支链烷基或环状烷基、酰基、乙酰基、丁酰基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、CO-芳氧基烷基、CO-取代的芳基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳烷基磺酰基、氨基酸残基、一磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯或磷酸酯衍生物；且R3是氢、直链烷基、支链烷基或环状烷基(尤其是环丙基)、二烷基氨基亚烷基(尤其是二甲氨基亚甲基)、酰基、乙酰基、丁酰基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、CO-芳氧基烷基、CO-取代的芳基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳烷基磺酰基、氨基酸残基、一磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯或磷酸酯衍生物；和其所有互变异构体和立体异构体。
在优选实施方案中，R1和/或R2是H。
在一个实施方案中，所述氨基酸残基是式C(O)C(R8)(R9)(NR10R11)，其中R8是氨基酸侧链，其中如在脯氨酸中，R8可任选地与R10连接形成环状结构；或者，R8是烷基、芳基、杂芳基或杂环部分；R9是氢、烷基(包括低级烷基)或芳基；和R10和R11独立地是氢、酰基(包括连接于R8的酰基衍生物)或烷基(包括但不限于甲基、乙基、丙基和环丙基)；和其所有互变异构体和立体异构体。
在另一优选实施方案中，R1和/或R2是一种氨基酸残基，尤其是L-缬氨酰基。
在一个具体的实施方案中，所述β-L-2’-脱氧胸苷是下式或其药学上可接受的盐、酯或前药 在另一具体的实施方案中，所述β-L-2’-脱氧胸苷是下式或其药学上可接受的盐 在另一具体的实施方案中，所述β-L-2’-脱氧胸苷是下式或其药学上可接受的盐、酯或前药
其中R2是氢、直链烷基、支链烷基或环状烷基、酰基、乙酰基、丁酰基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、CO-芳氧基烷基、CO-取代的芳基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳烷基磺酰基、氨基酸残基、一磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯或磷酸酯前药；且R3是氢、直链烷基、支链烷基或环状烷基、二烷基氨基亚烷基、酰基、乙酰基、丁酰基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、CO-芳氧基烷基、CO-取代的芳基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳烷基磺酰基、氨基酸残基、一磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯或磷酸酯前药。
在另一具体的实施方案中，所述β-L-2’-脱氧胸苷是下式或其药学上可接受的盐 在另一具体的实施方案中，所述β-L-2’-脱氧胸苷是下式或其药学上可接受的盐
在优选的实施方案中，β-L-2’-脱氧核苷至少90％不含其反向的β-D-对映异构体。
在另一个实施方案中，本发明包括治疗HBV感染的人类的方法，其包括施用HBV治疗量的所述2’-脱氧-β-L-赤-呋喃五并核苷衍生物的前药。本文所使用的前药是指体内施用的可转化为核苷的化合物或其代谢物。非限制性的实例包括药学上可接受的盐(或者指“生理学上可接受的盐”)，活性化合物的5’和/或N4(胞苷)和/或N6(腺苷)酰化的(包括采用氨基酸残基诸如L-缬氨酰基)或烷基化衍生物，或活性化合物的5’-磷脂或5’-醚脂质。
在另一个实施方案中，2’-脱氧-β-L-呋喃五并核苷可与一种或多种其它2’-脱氧-β-L-赤-呋喃五并核苷或表现出抗乙型肝炎病毒活性的一种或多种其它化合物交替或联合施用。
本文所提供的β-L-2’-脱氧核苷，尤其是β-L-2’-dC或β-L-2’-dT，或其药学上可接受的盐、酯或前药的抗乙型肝炎病毒活性可通过将两种或多种这些核苷联合或交替施用而得以增强。
或者，例如，一种或多种本文所述的β-L-2’-脱氧核苷，尤其是β-L-2’dC或β-L-2’-dT可以与一种或多种表现出抗乙型肝炎病毒活性的其它化合物联合和/或交替施用。非限制性实例包括FTC、L-FMAU、DAPD、DXG、泛昔洛韦、喷昔洛韦、BMS-200475，bis pom PMEA(阿德福韦二匹伏酯)、洛布卡韦、更昔洛韦、替诺福韦、Lfd4C、磷卡萘替(磷酸三钠甲酸盐)、异丙肌苷、左旋咪唑、N-乙酰胞苷(NAC)、干扰素、聚乙二醇化干扰素或利巴韦林。在一个实施方案中，本文所提供的β-L-2’-脱氧核苷，尤其是β-L-2’dC或β-L-2’-dT可以与3TC联合和/或交替施用。
在一个实施方案中，2’-脱氧-β-L-赤-呋喃五并核苷与一种或多种免疫调节剂，例如TH1细胞因子，尤其是干扰素，优选干扰素γ联合或交替施用以治疗抗性或野生型HBV感染。
在本发明的一个实施方案中，免疫调节剂以蛋白质的形式进行递送。在可选的实施方案中，免疫调节剂以表达免疫调节性蛋白质的基因或基因片段的形式进行递送。在本发明的一个具体的实施方案中，免疫调节剂以其基因或基因片段的形式进行递送，且该递送通过腺病毒介导。在本发明的一个具体的实施方案中，免疫调节剂是干扰素(诸如干扰素γ)，且其递送采用由腺病毒介导的基因或基因片段的形式。
与干扰素，诸如干扰素α或干扰素γ联合和/或交替施用的β-L-2’-脱氧核苷在人类中提供抵抗乙型肝炎病毒的优良治疗。在一个实施方案中，以蛋白质的形式施用干扰素，典型地直接进入静脉或动脉。在本发明可选的实施方案中，干扰素以其在被宿主表达的核酸、基因或基因片段的形式进行施用。干扰素核酸可被递送至“裸”宿主(即无载体)，或可选地，可借助载体(包括但不限于病毒载体诸如腺病毒载体)而被递送。
在一个实施方案中，干扰素是干扰素α，任选地是，聚乙二醇化干扰素α。在另一个实施方案中，干扰素选自(包括但不限于)干扰素α-2a，干扰素α-2b，聚乙二醇化干扰素α-2a，聚乙二醇化干扰素α-2bROFERON(干扰素α-2a)，PEGASYS(聚乙二醇化干扰素α-2a)，INTRONA(干扰素α-2b，Schering Corporation)，PEG-INTRON(聚乙二醇化干扰素α-2b，Schering Corporation)，复合干扰素，InterMune产INFERGEN(干扰素alphacon-1)，Viragen产OMNIFERON(天然干扰素)，Human Genome Sciences产ALBUFERON，Amarillo Biosciences产口服干扰素α，和SuperFeron(天然人多亚型IFN-α，Genetrol，Inc.)。在可选的实施方案中，干扰素是干扰素γ。而在另一实施方案中，干扰素是干扰素β、干扰素ω或干扰素τ。在另一个实施方案中，干扰素选自(包括不限于)Ares-Serono产REBIF(干扰素β-la)，BioMedicine产ω干扰素，InterMune产干扰素γ-lb和HuFeron(人IFN-β，Genetrol，Inc.)。
通常，在交替治疗期间，有效量的各药剂被次序地施用，而在联合治疗中，有效量的两种或多种药剂的被一起施用。剂量要依赖于药物的吸收、失活、生物分布、代谢和排泄率以及其它本领域技术人员已知的其它因素。应当注意的是剂量值还会随着要缓解的病症的严重度而变化。还应理解，对于任何特定个体而言，具体的剂量方案和计划应根据个体需要和实施或指导实施组合物的人员的专业判断而随时间进行调整。适用剂量范围的实例可见于可科学文献和临床医师手册中。本文所描述的其它化合物的适用剂量范围的多种实例还可见于公开的文献或可通过已知的方法进行鉴别。这些剂量范围可按照需要进行改变以获得所需结果。
附图简述

图1a描述了采用L-核糖或L-木糖作为原料获得β-L-赤呋喃五并-核苷(β-L-dN)的一般方法。图1b和1c是依照本发明非限制性的说明性实施例，分别说明从2’-脱氧-β-L-胞苷合成2’-脱氧-β-L-胞苷(β-L-dC)的3’-和5’-缬氨酰酯。
图2是依照本发明的非限制性说明性实施例，说明从2’-脱氧-β-L-胞苷合成N4-乙酰基-2’-脱氧-β-L-胞苷。
图3是依照本发明的非限制性说明性实施例，说明从2’-脱氧-β-L-胞苷合成N4-[(二甲氨基)亚甲基)-2’-脱氧-β-L-胞苷。
图4是依照本发明的非限制性说明性实施例，说明从2’-脱氧-β-L-胞苷合成3’，5’-二-O-乙酰基-2’-脱氧-β-L-胞苷。
图5是依照本发明的非限制性说明性实施例，说明从2’-脱氧-β-L-胞苷合成2’-脱氧-β-L-胞苷的3’，5’-二-O-缬氨酰酯。
图6是依照本发明的非限制性说明性实施例，说明从2’-脱氧-β-L-胞苷合成2’-脱氧-β-L-胞苷的N4-(Boc-缬氨酰基)酯。
图7是依照本发明的非限制性说明性实施例，说明从3’，5’，N4-三-(Boc-L-缬氨酰基)-2’-脱氧-β-L-胞苷合成3’，5’，N4-三-(L-缬氨酰基)-2’-脱氧-β-L-胞苷。
图8是线形图，描述用于确定各种核苷溶解度的标准校准技术。图8a是根据天然β-D-脱氧核糖胞苷确定的校准曲线。图8b是根据β-L-脱氧核糖胞苷的3’，5’-二缬氨酰酯确定的校准曲线。
图9a是非限制性实施例，描述用于在pH7.42时评估β-L-脱氧核糖胞苷的3’，5’-二缬氨酰酯的稳定性的HPLC图谱。所述HPLC图谱表明β-L-脱氧核糖胞苷的3’，5’-二缬氨酰酯和三种活性代谢物的存在，所述三种活性代谢物是β-L-脱氧核糖胞苷的3’-缬氨酰酯、β-L-脱氧核糖胞苷的5’-缬氨酰酯和L-dC。图9b是线形图，描述β-L-脱氧核糖胞苷的3’，5’-二缬氨酰酯和其代谢物以时间为坐标的相对浓度。
相似地，图10a和图11a是非限制性实施例，分别描述用于在pH7.20和pH4.51时评估β-L-脱氧核糖胞苷的3’，5’-二缬氨酰酯的稳定性的HPLC图谱。在这些pH下，所述HPLC图谱表明β-L-脱氧核糖胞苷的3’，5’-二缬氨酰酯和三种活性代谢物的存在，所述三种活性代谢物是β-L-脱氧核糖胞苷的3’-缬氨酰酯，β-L-脱氧核糖胞苷的5’-缬氨酰酯和L-dC。图10b和图11b是线形图，描述β-L-脱氧核糖胞苷的3’，5’-二缬氨酰酯和其代谢物以时间为坐标的相对浓度。
图12是非限制性实施例，描述用于在pH1.23时评估β-L-脱氧核糖胞苷的3’，5’-二-缬氨酰酯的稳定性的HPLC图谱。在该pH下，所述HPLC图谱表明仅存在β-L-脱氧核糖胞苷的3’，5’-二缬氨酰酯，而没有分解成其三种活性代谢物中的任何一种。
图13是线形图，描述β-L-脱氧核糖胞苷的3’，5’-二缬氨酰酯在人血浆中的体外代谢。
图14是线形图，描述β-L-脱氧核糖胞苷(L-dC)在HepG2细胞中的细胞内代谢。
图15是线形图，描述L-dC在初级人肝细胞中的细胞内代谢。
图16描述了L-dA，L-dC，和L-dT在人HepG2细胞中蓄积和衰变形式的代谢。细胞用10pM化合物进行培养。
发明详述已经发现，β-L-2’-脱氧核苷，尤其是β-L-2’-脱氧胞苷和β-L-2’-脱氧胸苷具有抵抗药物抗性乙型肝炎病毒的活性，所述病毒具有突变，尤其是位于552(M至V)密码子，即病毒的逆转录区的204(M至V)密码子的突变。基因该发现，提供治疗宿主诸如哺乳动物，尤其是人类中拉米夫定抗性HBV(M552V)的方法，其包括施用β-L-2’-脱氧核苷或其药学上可接受的盐、酯或前药。此外，通过了防止原初宿主诸如哺乳动物，尤其是人类中出现拉米夫定抗性HBV(M552V)突变的方法，其包括施用β-L-2’-脱氧核苷或其药学上可接受的盐、酯或前药。还提供了防止和/或预防原初宿主诸如哺乳动物，尤其是人类中出现HBV双突变体(L528M/M552V)的方法，其包括施用β-L-2’-脱氧核苷或其药学上可接受的盐、酯或前药。
在另一个实施方案中，2’-脱氧-β-L-呋喃五并核苷可与一种或多种其它2’-脱氧-β-L-赤-呋喃五并核苷或表现出抗乙型肝炎病毒活性的一种或多种其它化合物交替或联合施用。通常，在交替治疗期间，有效量的各药剂被次序地施用，而在联合治疗中，有效量的两种或多种药剂的被一起施用。剂量要依赖于药物的吸收、失活和排泄率以及其它本领域技术人员已知的其它因素。应当注意的是剂量值还会随着要缓解的病症的严重度而变化。还应理解，对于任何特定个体而言，具体的剂量方案和计划应根据个体需要和实施或指导实施组合物的人员的专业判断而随时间进行调整。
在另一个实施方案中，本发明包括治疗HBV感染的人类的方法，其包括施用HBV治疗量的所述2’-脱氧-β-L-赤-呋喃五并核苷衍生物的前药。本文所使用的前药是指体内施用的可转化为核苷的化合物或其代谢物。非限制性的实例包括药学上可接受的盐(或者指“生理学上可接受的盐”)，活性化合物的5’和/或N4(胞苷)和/或N6(腺苷)酰化的(包括采用氨基酸残基诸如L-缬氨酰基)或烷基化衍生物，或活性化合物的5’-磷脂或5’-醚脂质。
本发明一个优选的实施方案是治疗人类或其它宿主动物指HBV感染的方法，其包括施用有效量的一种或多种2’-脱氧-β-L-赤-呋喃五并核苷衍生物，其选自β-L-2’-脱氧腺苷、β-L-2’-脱氧胞苷、β-L-2’-脱氧尿苷、β-L-2’-尿苷、β-L-2’-脱氧肌苷和β-L-2’-脱氧胸苷，或其药学上可接受的前药，包括磷酸酯、5’和或N6烷基化或乙酰化衍生物，或其药学上可接受的盐，任选地在药学上可接受的载体中。本发明的化合物或者具有抗HBV活性，或者被代谢为表现抗HBV活性的单个化合物或多个化合物。在本发明优选的实施方案中，2’-脱氧-β-L-赤呋喃五并-核苷衍生物基本上以单异构体的形式进行施用，即，至少大约95％具有指定的立体构型。
I.本发明定义的化合物在一个实施方案中，本发明提供了式(I)的β-L-2’-脱氧核苷或其药学上可接受的盐、酯或前药的用途
其中R1是氢、直链烷基、支链烷基或环状烷基、酰基、乙酰基、丁酰基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、CO-芳氧基烷基、CO-取代的芳基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳烷基磺酰基、氨基酸残基、一磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯或磷酸酯衍生物；R2是氢、直链烷基、支链烷基或环状烷基、酰基、乙酰基、丁酰基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、CO-芳氧基烷基、CO-取代的芳基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳烷基磺酰基、氨基酸残基、一磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯或磷酸酯衍生物；X是O、S、SO2或CH2；和BASE为可任选被取代的嘌呤碱基或嘧啶碱基，和其所有互变异构体和立体异构体。
在优选的实施方案中，X为O。
在一个实施方案中，所述氨基酸残基是式C(O)C(R8)(R9)(NR10R11)，其中R8是氨基酸侧链，其中如在脯氨酸中，R8可任选地与R10连接形成环状结构；或者，R8是烷基、芳基、杂芳基或杂环部分；R9是氢、烷基(包括低级烷基)或芳基；和R10和R11独立地是氢、酰基(包括连接于R8的酰基衍生物)或烷基(包括但不限于甲基、乙基、丙基和环丙基)；和其所有互变异构体和立体异构体。
在第一个子实施方案中，R1和/或R2是C(O)-烷基(包括低级烷基)或芳基，BASE是胞嘧啶、保护的胞嘧啶或胸腺嘧啶。
在第二个子实施方案中，R1和/或R2是C(O)-低级烷基，BASE是胞嘧啶、保护的胞嘧啶或胸腺嘧啶。
在第三个子实施方案中，R1和/或R2是C(O)-甲基，BASE是胞嘧啶、保护的胞嘧啶或胸腺嘧啶。
在第四个子实施方案中，R1和/或R2是C(O)C(R8)(H)(NR10R11)，BASE是胞嘧啶、保护的胞嘧啶或胸腺嘧啶。
在第五个子实施方案中，R1和/或R2是C(O)C(R8)(H)(NR10R11)，R8是异丙基，R10和R11中至少一个是氢，BASE是胞嘧啶、保护的胞嘧啶或胸腺嘧啶。
在第六个子实施方案中，R1和/或R2是C(O)C(R8)(H)(NR10R11)，R8是氨基酸侧链，BASE是胞嘧啶、保护的胞嘧啶或胸腺嘧啶。
在第七个子实施方案中，R1和/或R2是C(O)C(R8)(H)(NR10R11)，R8是非极性氨基酸侧链，BASE是胞嘧啶、保护的胞嘧啶或胸腺嘧啶。
可以通过式(I)定义子实施方案的非限制性实施例，其中(1)R1和/或R2是C(O)-甲基，BASE是胞嘧啶。
(2)R1和/或R2是C(O)-甲基，BASE是保护的胞嘧啶。
(3)R1和/或R2是C(O)-甲基，BASE是胸腺嘧啶。
(4)R1和/或R2是C(O)C(R8)(H)(NH2)；R8是异丙基，BASE是胞嘧啶。
(5)R1和/或R2是C(O)C(R8)(H)(NH2)；R8是异丙基，BASE是保护的胞嘧啶。
(6)R1和/或R2是C(O)C(R8)(H)(NH2)；R8是异丙基，BASE是胸腺嘧啶。
在第八个子实施方案中，X是O，R1和/或R2是C(O)-烷基(包括低级烷基)或芳基，BASE是胞嘧啶、保护的胞嘧啶或胸腺嘧啶。
在第九个子实施方案中，X是O，R1和/或R2是C(O)-低级烷基，BASE是胞嘧啶、保护的胞嘧啶或胸腺嘧啶。
在第十个子实施方案中，X是O，R1和/或R2是C(O)-甲基，BASE是胞嘧啶、保护的胞嘧啶或胸腺嘧啶。
在第十一个子实施方案中，X是O，R1和/或R2是C(O)C(R8)(H)(NR10R11)，BASE是胞嘧啶、保护的胞嘧啶或胸腺嘧啶。
在第十二个子实施方案中，X是O，R1和/或R2是C(O)C(R8)(H)(NR10R11)，R8是异丙基，R10和R11中至少一个是氢，BASE是胞嘧啶、保护的胞嘧啶或胸腺嘧啶。
在第十三个子实施方案中，X是O，R1和/或R2是C(O)C(R8)(H)(NR10R11)，R8是氨基酸侧链，BASE是胞嘧啶、保护的胞嘧啶或胸腺嘧啶。
在第十四个子实施方案中，X是O，R1和/或R2是C(O)C(R8)(H)(NR10R11)；R8是非极性氨基酸侧链；R5和R6中至少一个是氢，BASE是胞嘧啶、保护的胞嘧啶或胸腺嘧啶。
可以通过式(I)定义子实施方案的非限制性实施例，其中(1)X是O，R1和/或R2是C(O)-甲基，BASE是胞嘧啶。
(2)X是O，R1和/或R2是C(O)-甲基，BASE是保护的胞嘧啶。
(3)X是O，R1和/或R2是C(O)-甲基，BASE是胸腺嘧啶。
(4)X是O，R1和/或R2是C(O)C(R8)(H)(NH2)；R8是异丙基，BASE是胞嘧啶。
(5)X是O，R1和/或R2是C(O)C(R8)(H)(NH2)；R8是异丙基，BASE是保护的胞嘧啶。
(6)X是O，R1和/或R2是C(O)C(R8)(H)(NH2)；R8是异丙基，BASE是胸腺嘧啶。
在第十五个子实施方案中，X是O，R1是氢，R2是C(O)-烷基(包括低级烷基)或芳基，BASE是胞嘧啶、保护的胞嘧啶或胸腺嘧啶。
在第十六个子实施方案中，X是O，R1是氢，R2是C(O)-低级烷基，BASE是胞嘧啶、保护的胞嘧啶或胸腺嘧啶。
在第十七个子实施方案中，X是O，R1是氢，R2是C(O)-甲基，BASE是胞嘧啶、保护的胞嘧啶或胸腺嘧啶。
在第十八个子实施方案中，X是O，R1是氢，R2是C(O)C(R8)(H)(NR10R11)，BASE是胞嘧啶、保护的胞嘧啶或胸腺嘧啶。
在第十九个子实施方案中，X是O，R1是氢，R2是C(O)C(R8)(H)(NR10R11)，R8是异丙基，R10和R11中至少一个是氢，BASE是胞嘧啶、保护的胞嘧啶或胸腺嘧啶。
在第二十个子实施方案中，X是O，R1是氢，R2是C(O)C(R8)(H)(NR10R11)，R8是氨基酸侧链，BASE是胞嘧啶、保护的胞嘧啶或胸腺嘧啶。
在第二十一个子实施方案中，X是O，R1是氢，R2是C(O)C(R8)(H)(NR10R11)；R8是非极性氨基酸侧链；R5和R6中至少一个是氢，BASE是胞嘧啶、保护的胞嘧啶或胸腺嘧啶。
可以通过式(I)定义子实施方案的非限制性实施例，其中(1)X是O，R1是氢，R2是C(O)-甲基，BASE是胞嘧啶。
(2)X是O，R1是氢，R2是C(O)-甲基，BASE是保护的胞嘧啶。
(3)X是O，R1是氢，R2是C(O)-甲基，BASE是胸腺嘧啶。
(4)X是O，R1是氢，R2是C(O)C(R8)(H)(NH2)；R8是异丙基，BASE是胞嘧啶。
(5)X是O，R1是氢，R2是C(O)C(R8)(H)(NH2)；R8是异丙基，BASE是保护的胞嘧啶。
(6)X是O，R1是氢，R2是C(O)C(R8)(H)(NH2)；R8是异丙基，BASE是胸腺嘧啶。
在第二十二个子实施方案中，X是O，R1和R2独立地是C(O)-烷基(包括低级烷基)或芳基，BASE是胞嘧啶、保护的胞嘧啶或胸腺嘧啶。
在第二十三个子实施方案中，X是O，R1和R2独立地是C(O)-低级烷基，BASE是胞嘧啶、保护的胞嘧啶或胸腺嘧啶。
在第二十四个子实施方案中，X是O，R1和R2独立地是C(O)-甲基，BASE是胞嘧啶、保护的胞嘧啶或胸腺嘧啶。
在第二十五个子实施方案中，X是O，R1和R2独立地是C(O)C(R8)(H)(NR10R11)，BASE是胞嘧啶、保护的胞嘧啶或胸腺嘧啶。
在第二十六个子实施方案中，X是O，R1和R2独立地是C(O)C(R8)(H)(NR10R11)，R8是异丙基，R10和R11中至少一个是氢，BASE是胞嘧啶、保护的胞嘧啶或胸腺嘧啶。
在第二十七个子实施方案中，X是O，R1和R2独立地是C(O)C(R8)(H)(NR10R11)，R8是氨基酸侧链，BASE是胞嘧啶、保护的胞嘧啶或胸腺嘧啶。
在第二十八个子实施方案中，X是O，R1和R2独立地是C(O)C(R8)(H)(NR10R11)；R8是非极性氨基酸侧链；R5和R6中至少一个是氢，BASE是胞嘧啶、保护的胞嘧啶或胸腺嘧啶。
可以通过式(I)定义子实施方案的非限制性实施例，其中(1)X是O，R1和R2独立地是C(O)-甲基，BASE是胞嘧啶。
(2)X是O，R1和R2独立地是C(O)-甲基，BASE是保护的胞嘧啶。
(3)X是O，R1和R2独立地是C(O)-甲基，BASE是胸腺嘧啶。
(4)X是O，R1和R2独立地是C(O)C(R8)(H)(NH2)；R8是异丙基，BASE是胞嘧啶。
(5)X是O，R1和R2独立地是C(O)C(R8)(H)(NH2)；R8是异丙基，BASE是保护的胞嘧啶。
(6)X是O，R1和R2独立地是C(O)C(R8)(H)(NH2)；R8是异丙基，BASE是胸腺嘧啶。
在另一实施方案中，本发明提供了式(I)的β-L-2’-脱氧嘌呤或其药学上可接受的盐、酯或前药的用途 其中R1是氢、直链烷基、支链烷基或环状烷基、酰基、乙酰基、丁酰基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、CO-芳氧基烷基、CO-取代的芳基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳烷基磺酰基、氨基酸残基、一磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯或磷酸酯衍生物；R2是氢、直链烷基、支链烷基或环状烷基、酰基、乙酰基、丁酰基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、CO-芳氧基烷基、CO-取代的芳基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳烷基磺酰基、氨基酸残基、一磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯或磷酸酯衍生物；Y是OR3、NR3R4或SR3；和X1和X2独立地选自H、直链烷基、支链烷基或环状烷基、酰基、乙酰基、丁酰基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、卤素、OR5、NR5R6或SR5；和R3、R4、R5和R6独立地是H、直链烷基、支链烷基或环状烷基(尤其是环丙基)、二烷基氨基亚烷基(尤其是二甲氨基亚甲基)、酰基、乙酰基、丁酰基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、CO-芳氧基烷基、CO-取代的芳基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳烷基磺酰基、氨基酸残基、一磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯或磷酸酯衍生物；和其所有互变异构体和立体异构体。
在一个实施方案中，所述氨基酸残基是式C(O)C(R8)(R9)(NR10R11)，其中R8是氨基酸侧链，其中如在脯氨酸中，R8可任选地与R10连接形成环状结构；或者，R8是烷基、芳基、杂芳基或杂环部分；R9是氢、烷基(包括低级烷基)或芳基；和R10和R11独立地是氢、酰基(包括连接于R8的酰基衍生物)或烷基(包括但不限于甲基、乙基、丙基和环丙基)；和其所有互变异构体和立体异构体。
在另一优选实施方案中，R1和/或R2是一种氨基酸残基，尤其是L-缬氨酰基。
在一个实施方案中，R3是氢，R4是二甲氨基亚甲基。
在另一实施方案中，R3是氢，R4是乙酰基。
在另一实施方案中，R3是氢，R4是L-缬氨酰基。
在另一实施方案中，本发明提供了式(I)的β-L-2’-脱氧嘧啶或其药学上可接受的盐、酯或前药的用途 其中R1是氢、直链烷基、支链烷基或环状烷基、酰基、乙酰基、丁酰基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、CO-芳氧基烷基、CO-取代的芳基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳烷基磺酰基、氨基酸残基、一磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯或磷酸酯衍生物；R2是氢、直链烷基、支链烷基或环状烷基、酰基、乙酰基、丁酰基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、CO-芳氧基烷基、CO-取代的芳基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳烷基磺酰基、氨基酸残基、一磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯或磷酸酯衍生物；Y是OR3、NR3R4或SR3；且X1选自H、直链烷基、支链烷基或环状烷基、酰基、乙酰基、丁酰基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、卤素、OR5、NR5R6或SR5；和R3、R4、R5和R6独立地是H、直链烷基、支链烷基或环状烷基(尤其是环丙基)、二烷基氨基亚烷基(尤其是二甲氨基亚甲基)、酰基、乙酰基、丁酰基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、CO-芳氧基烷基、CO-取代的芳基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳烷基磺酰基、氨基酸残基、一磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯或磷酸酯衍生物；和其所有互变异构体和立体异构体。
在一个实施方案中，所述氨基酸残基是式C(O)C(R8)(R9)(NR10R11)，其中R8是氨基酸侧链，其中如在脯氨酸中，R8可任选地与R10连接形成环状结构；或者，R8是烷基、芳基、杂芳基或杂环部分；R9是氢、烷基(包括低级烷基)或芳基；和R10和R11独立地是氢、酰基(包括连接于R8的酰基衍生物)或烷基(包括但不限于甲基、乙基、丙基和环丙基)；和其所有互变异构体和立体异构体。
在一个具体的实施方案中，β-L-2’-脱氧嘧啶是下式的β-L-2’-脱氧胞苷或其药学上可接受的盐、酯或前药
其中R1是氢、直链烷基、支链烷基或环状烷基、酰基、乙酰基、丁酰基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、CO-芳氧基烷基、CO-取代的芳基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳烷基磺酰基、氨基酸残基、一磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯或磷酸酯衍生物；R2是氢、直链烷基、支链烷基或环状烷基、酰基、乙酰基、丁酰基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、CO-芳氧基烷基、CO-取代的芳基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳烷基磺酰基、氨基酸残基、一磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯或磷酸酯衍生物；R3和R4独立地是H、直链烷基、支链烷基或环状烷基(尤其是环丙基)、二烷基氨基亚烷基(尤其是二甲氨基亚甲基)、酰基、乙酰基、丁酰基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、CO-芳氧基烷基、CO-取代的芳基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳烷基磺酰基、氨基酸残基、一磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯或磷酸酯衍生物；和其所有互变异构体和立体异构体。
在优选的实施方案中，R1和/或R2是H。
在一个实施方案中，所述氨基酸残基是式C(O)C(R8)(R9)(NR10R11)，其中R8是氨基酸侧链，其中如在脯氨酸中，R8可任选地与R10连接形成环状结构；或者，R8是烷基、芳基、杂芳基或杂环部分；R9是氢、烷基(包括低级烷基)或芳基；和R10和R11独立地是氢、酰基(包括连接于R8的酰基衍生物)或烷基(包括但不限于甲基、乙基、丙基和环丙基)；和其所有互变异构体和立体异构体。
在另一优选实施方案中，R1和/或R2是一种氨基酸残基，尤其是L-缬氨酰基。
在一个实施方案中，R3是氢，R4是二甲氨基亚甲基。
在另一实施方案中，R3是氢，R4是乙酰基。
在另一实施方案中，R3是氢，R4是L-缬氨酰基。
在一个具体的实施方案中，所述β-L-2’-脱氧胞苷是下式或其药学上可接受的盐、酯或前药
在另一具体的实施方案中，所述β-L-2’-脱氧胞苷是下式或其药学上可接受的盐 在另一具体的实施方案中，所述β-L-2’-脱氧胞苷是下式或其药学上可接受的盐、酯或前药 其中R2是氢、直链烷基、支链烷基或环状烷基、酰基、乙酰基、丁酰基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、CO-芳氧基烷基、CO-取代的芳基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳烷基磺酰基、氨基酸残基、一磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯或磷酸酯前药；且R3和R4独立地是H、直链烷基、支链烷基或环状烷基、二烷基氨基亚烷基、酰基、乙酰基、丁酰基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、CO-芳氧基烷基、CO-取代的芳基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳烷基磺酰基、氨基酸残基、一磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯或磷酸酯前药。
在另一具体的实施方案中，所述β-L-2’-脱氧胞苷是下式或其药学上可接受的盐 在另一具体的实施方案中，所述β-L-2’-脱氧胞苷是下式或其药学上可接受的盐 在另一个实施方案中，所述β-L2’-脱氧核苷是下式的β-L-2’-脱氧胸苷或其药学上可接受的盐、酯或前药 其中R1是氢、直链烷基、支链烷基或环状烷基、酰基、乙酰基、丁酰基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、CO-芳氧基烷基、CO-取代的芳基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳烷基磺酰基、氨基酸残基、一磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯或磷酸酯衍生物；和R2是氢、直链烷基、支链烷基或环状烷基、酰基、乙酰基、丁酰基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、CO-芳氧基烷基、CO-取代的芳基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳烷基磺酰基、氨基酸残基、一磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯或磷酸酯衍生物；且R3是氢、直链烷基、支链烷基或环状烷基(尤其是环丙基)、二烷基氨基亚烷基(尤其是二甲氨基亚甲基)、酰基、乙酰基、丁酰基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、CO-芳氧基烷基、CO-取代的芳基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳烷基磺酰基、氨基酸残基、一磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯或磷酸酯衍生物；和其所有互变异构体和立体异构体。
在优选实施方案中，R1和/或R2是H。
在一个实施方案中，所述氨基酸残基是式C(O)C(R8)(R9)(NR10R11)，其中R8是氨基酸侧链，其中如在脯氨酸中，R8可任选地与R10连接形成环状结构；或者，R8是烷基、芳基、杂芳基或杂环部分；R9是氢、烷基(包括低级烷基)或芳基；和R10和R11独立地是氢、酰基(包括连接于R8的酰基衍生物)或烷基(包括但不限于甲基、乙基、丙基和环丙基)；和其所有互变异构体和立体异构体。
在另一优选实施方案中，R1和/或R2是一种氨基酸残基，尤其是L-缬氨酰基。
在一个具体的实施方案中，所述β-L-2’-脱氧胸苷是下式或其药学上可接受的盐、酯或前药；和其所有互变异构体
在另一具体的实施方案中，所述β-L-2’-脱氧胸苷是下式或其药学上可接受的盐 在另一具体的实施方案中，所述β-L-2’-脱氧胸苷是下式或其药学上可接受的盐、酯或前药 其中R2是氢、直链烷基、支链烷基或环状烷基、酰基、乙酰基、丁酰基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、CO-芳氧基烷基、CO-取代的芳基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳烷基磺酰基、氨基酸残基、一磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯或磷酸酯前药；且R3是氢、直链烷基、支链烷基或环状烷基、二烷基氨基亚烷基、酰基、乙酰基、丁酰基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、CO-芳氧基烷基、CO-取代的芳基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳烷基磺酰基、氨基酸残基、一磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯或磷酸酯前药；和其所有互变异构体和立体异构体。
在另一具体的实施方案中，所述β-L-2’-脱氧胸苷是下式或其药学上可接受的盐
在另一具体的实施方案中，所述β-L-2’-脱氧胸苷是下式或其药学上可接受的盐 II.定义本文所使用的术语“抗性病毒”是指与天然病毒相比，在恒定细胞系(包括但不限于外周血单核细胞(PBMCs)，或MT2或MT4细胞)中，表现出EC50增加三倍，更典型地五倍或更高倍的病毒。
本文所使用的术语乙型肝炎和相关病症是指诸如抗HBV抗体阳性和HBV阳性病症、HBV导致的慢性肝炎、肝硬变、急性肝炎、爆发性肝炎、慢性持久性肝炎，和疲劳的乙型肝炎和相关病症。本发明的方法包括预防性地使用2’-脱氧-β-L-赤-呋喃戊糖核苷衍生物来预防或延缓抗HBV抗体或HBV抗原阳性或已暴露于HBV的个体中临床疾病的进展。
本文所使用的术语生物学活性核苷是指当在肝炎病毒体感染的2.2.15细胞中检测时，表现出15微摩尔或更低的EC50的核苷。
本文中术语“基本上纯”或“基本上以一种旋光异构体的形式”指这样的核苷组合物所述核苷组合物包括至少95％到98％，或更优选99％到100％该核苷的单一对映异构体。在优选实施方案中，对于所公开的任何适应症施用基本上纯形式的β-L-2’-脱氧核苷。
相似地，术语“分离的”指这样的核苷组合物所述核苷组合物包含至少85％或90％(重量比)、优选95％到98％(重量比)、甚至更优选99％到100％(重量比)所述核苷，其余部分包含其它化学物质或对映异构体。
本说明书通篇使用的术语“基本上纯的形式”是描述这样的化合物，其大约包括90％或更多，可选地至少95％、96％、97％、98％或99％或更多的该化合物的单对映异构体。当在本说明书中涉及特定构型(D或L)的核苷时，即假定该核苷以基本上纯的形式进行施用。
本文使用术语“独立地”指独立应用的可变基团随不同应用而独立变化。因此，在化合物如R”XYR”中，其中R”“独立地是碳或氮”，则两个R”可以都是碳，两个R”可以都是氮，或者一个R”是碳，另一个R”是氮。
本文所用术语“烷基”除特别指出外，指C1到C18，诸如C1到C10，优选C1到C6的饱和链状、分支或环状伯、仲、叔烃，并且具体包括甲基、三氟甲基、乙基、丙基、异丙基、环丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、环戊基、异戊基、新戊基、已基、异己基、环己基、环己基甲基、3-甲基戊基、2，2-二甲基丁基和2，3-二甲基丁基。该术语包括被取代或未被取代的烷基。可以取代上述烷基基团的部分选自卤素(氟、氯、溴或碘)、羟基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、烷氧基、芳氧基、硝基、氰基、磺酸、硫酸酯、膦酸、磷酸酯或膦酸酯，所述部分根据需要或者不保护，或者受到保护，这是本领域内技术人员已知的，例如在Greene等，Protective Groups in Organic Synthesis，JohnWiley和Sons，第二版，1991中教导，该文献特此通过引用结合到本文中。
本文所用术语“低级烷基”除特别指出外，指C1到C4饱和直链烷基基团、支链烷基基团，或者如果合适的话，指环状烷基基团(例如环丙基)，其中包括被取代和未被取代的形式。在本说明书中，除特别指出外，当烷基是合适部分时，优选低级烷基。相似地，当烷基或低级烷基是合适部分时，优选未取代的烷基或低级烷基。
本文所用术语“芳基”除特别指出外，指苯基、联苯基或萘基，优选指苯基。该术语包括被取代和未被取代的部分。芳基基团可以被选自以下的一种或多种部分取代卤素(氟、氯、溴或碘)、羟基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、烷氧基、芳氧基、硝基、氰基、磺酸、硫酸酯、膦酸、磷酸酯或膦酸酯，所述部分根据需要或者不保护，或者受到保护，这是本领域内技术人员已知的，例如在Greene等，Protective Groups in Organic Synthesis，John Wiley和Sons，第二版，1991中教导，该文献特此通过引用结合到本文中。
术语“酰基”指式-C(O)R′羧酸酯，其中所述酯基团(即R′)的非羧基部分选自直链、支链环状烷基或低级烷基、烷氧基烷基(包括甲氧基甲基)、烷芳基、芳烷基或芳基烷基(包括苄基)、芳氧基烷基(例如苯氧基甲基)、芳基(包括可任选地被卤素(例如F、Cl、Br或I)、C1到C4烷基或C1到C4烷氧基取代的苯基)、氨基酸残基或杂芳族化合物。所述酯中的芳基基团最好包括一个苯基基团。术语芳基具体包括(但不限于)乙酰基、丙酰基、丁酰基、戊酰基、3-甲基丁酰基、氢琥珀酰基、3-氯苯甲酰基、苯甲酰基、乙酰基、特戊酰基、甲磺酸基、丙酰基、戊酰基、己酸基、羊脂酸基、月桂酸基、肉豆蔻酸基、棕榈酸基、硬脂酸基和油酸基。可选地，还包括磺酸酯(例如烷基磺酰基或芳烷基磺酰基，包括甲磺酰基)、一磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯、三苯甲基或单甲氧基三苯甲基、三烷基甲硅烷基(如二甲基叔丁基甲硅烷基)或二苯基甲基甲硅烷基。术语“低级酰基”指其中非羧基部分是低级烷基的酰基基团。
术语“嘌呤碱基”或“嘧啶碱基”包括但不限于6-烷基嘌呤和N6-烷基嘌呤、N6-酰基嘌呤、N6-苄基嘌呤、6-卤嘌呤、N6-乙烯基嘌呤、N6-炔属嘌呤、N6-酰基嘌呤、N6-羟基烷基嘌呤、N6-硫代烷基嘌呤、N2-烷基嘌呤、N4-烷基嘧啶、N4-酰基嘧啶、4-苄基嘧啶、N4-卤嘧啶、N4-烷基嘧啶、N4-炔属嘧啶、4-酰基和N4-酰基嘧啶、4-羟基烷基嘧啶、4-硫代烷基嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、6-氮杂嘧啶(包括6-氮杂胞嘧啶)、2-和/或4-巯基嘧啶、尿嘧啶、C5-烷基嘧啶、C5-苄基嘧啶、C5-卤嘧啶、C5-乙烯基嘧啶、C5-炔属嘧啶、C5-酰基嘧啶、C5-羟基烷基嘌呤、C5-酰氨基嘧啶、C5-氰基嘧啶、C5-硝基嘧啶、C5-氨基嘧啶、N2-烷基嘌呤、N2-烷基-6-硫代嘌呤、5-氮杂胞苷基、5-氮杂尿苷基、三唑并吡啶基、咪唑并吡啶基、吡咯并嘧啶基和吡唑并嘧啶基。可以根据需要保护所述碱基中的氧官能团和氮官能团。合适的保护基团是本领域内技术人员众所周知的，包括三甲基甲硅烷基、二甲基己基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基和叔丁基二苯基甲硅烷基、三苯甲基、烷基基团和酰基基团例如乙酰基和丙酰基、甲基磺酰基和对甲苯磺酰基。
优选的碱基包括胞嘧啶、5-氟胞嘧啶、5-溴胞嘧啶、5-碘胞嘧啶、尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤核苷、黄嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、6-氨基嘌呤、6-氯嘌呤和2，6-二氯嘌呤、6-溴嘌呤、2，6-二溴嘌呤、6-碘嘌呤、2，6-二-碘嘌呤、5-溴乙烯基胞嘧啶，5-溴乙烯基尿嘧啶、5-溴次乙基胞嘧啶、5-溴次乙基尿嘧啶、5-三氟甲基胞嘧啶、5-三氟甲基尿嘧啶。
本文所使用的术语“氨基酸残基”包括(但不限于)丙氨酰基、缬氨酰基、亮氨酰基、异亮氨酰基、脯氨酰基、苯丙氨酰基、色氨酰基、甲硫氨酰基、甘氨酰基、丝氨酰基、苏氨酰基、半胱氨酰基、酪氨酰基、天冬酰胺酰基(asparaginyl)、谷氨酰胺酰基、天冬氨酰基、谷氨酰基、赖氨酰基、精氨酰基、组氨酰基的L或D对映异构体或其任何混合物，包括外消旋混合物，所有互变异构核立体化学构型。
优选的氨基酸为L-立体构型，优选的氨基酸部分为L-缬氨酰基。
表1中给出本文所使用的氨基酸缩写。
表1氨基酸密码子丙氨酸AlaAGCA GCC GCG GCU半胱氨酸 CysCUGC UGU天冬氨酸 AspDGAC GAU GAC GAU谷氨酸GluEGAA GAG苯丙氨酸 PheFUUC UUU甘氨酸GlyGGGA GCG GGG GGU组氨酸HisHCAC CAU异亮氨酸 IleIAUA AUC AUU赖氨酸LysKAAA AAG亮氨酸LeuLUUA UUG CUA CUC CUG GUU
蛋氨酸MetMAUG天冬酰胺 AsnNAAC AAU脯氨酸ProPCCA CCC CCG CCU谷氨酰胺 GlnQCAA CAG精氨酸ArgRAGA AGG CGA CGC CGG CGU丝氨酸SerSAGC AGU UCA UCC UCG UCU苏氨酸ThrTACA ACC ACG ACU缬氨酸ValVGUA GUC GUG GUU色氨酸TrpWUGG酪氨酸TyrYUAC UAU本文所使用的术语“免疫调节剂”或“调节免疫反应”是指趋化因子或细胞因子，其能直接或间接调节免疫反应，包括免疫刺激性以及免疫抑制性效应。免疫调节主要是全部免疫反应中的质变，虽然量变也可与免疫调节联合出现。免疫调节可涉及移向“Th1型”免疫反应(与“Th2型”免疫反应相反)的免疫反应。Th1型反应通常被看作细胞性免疫系统(例如，细胞毒性淋巴细胞)反应，而Th2-type型反应通常是“体液的”或基于抗体的。Th1型免疫反应的特征通常在于对抗原的“迟发型超敏性”反应，并可在生化水平上通过Th1相关性细胞因子诸如IFN-γ、IL-2、IL-12和TNF-β，以及IFN-α和IL-6的增加进行检测，虽然IL-6也同样地与Th2型反应相关。Th1型免疫反应通常与细胞毒性淋巴细胞(CTLs)的生成和抗体的低水平或瞬时生成相关。Th2型免疫反应通常与较高水平的抗体生成(包括IgE的生成)，缺少或极小的CTL生成，以及Th2相关性细胞因子诸如IL-4的病毒相关。由此一个实施方案中的免疫调节可通过如下方式进行鉴别，例如，通过根据本发明的方法治疗的个体中相对于无治疗时IFN-γ的增加和/或IgE产生的降低。
免疫调节剂包括(但不限于)诸如直接或间接作用于免疫反应的趋化因子或细胞因子的分子。免疫调节剂的非显著性实例包括TH1细胞因子，尤其是干扰素、干扰素α，纯化的干扰素α，干扰素α-2a，干扰素α-2b，干扰素β，干扰素γ，复合干扰素，聚乙二醇化干扰素、聚乙二醇化干扰素α，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、白细胞介素、白细胞介素-2和白细胞介素-12。在一个实施方案中，免疫调节剂是干扰素，例如，干扰素γ。
本文所使用的缩略语具有如下含义Ad IFN 表达旱獭干扰素γ基因的腺病毒载体Ad RFP 无旱獭干扰素γ基因的腺病毒载体CCC DNA共价闭合环状病毒形式的DNADNA脱氧核糖核酸FTC(-)-β-2’，3’-二脱氧-5-氟-3’-硫代胞嘧啶GFP绿荧光蛋白HBV乙型肝炎病毒IFN干扰素L-FMAU 1-(2-氟-5-甲基-β，L-呋喃阿拉伯糖基)胸腺嘧啶M1，M2 分别是治疗开始后的第1或第2月PCNA 增殖细胞核抗原PCR聚合酶链式反应Pfu空斑形成单位RFP红荧光蛋白RI 复制中间体RT 逆转录TUNEL 末端脱氧核苷酸(基)转移酶(TdT)介导的dUTP切口端标记测定法WHV旱獭乙型肝炎病毒本文所使用的“治疗”是用于获得有益的或需要的结果(包括临床结果)的途径。为了本发明的目的，有益的或需要的结果包括(但不限于)缓解或改善一种或多种症状，减小病变范围，稳定的(即，非恶化的)疾病状态，预防疾病扩散，延缓或减慢疾病的进展，疾病状态的改善或缓解和减轻(无论是局部的还是全部的)，无论是可检测的还是不可检测的。“治疗”还指于生存率比若不接受治疗所预期的延长。
本文所用术语宿主指其中病毒可以复制的单细胞或多细胞生物，包括细胞系和动物，最好是人类。或者，所述宿主可以携带部分乙型肝炎病毒基因组，本发明的化合物可以改变所述乙型肝炎基因组的复制或功能。术语宿主具体地指受感染的细胞、受到全部或部分HBV基因组转染的细胞以及动物(尤其是灵长类动物(包括黑猩猩)和人类)。在本发明的大多数动物应用中，所述宿主是人类患者。然而，本发明清楚地预期在某些适应证下的兽医应用(如黑猩猩)。
III.核苷酸盐或前药制剂术语“药学上可接受的盐、酯或前药”在本说明书中通篇使用，用于描述核苷化合物任何药学上可接受的形式(例如酯、磷酸酯、酯或相关基团的盐)，当将所述形式的核苷化合物给予患者时，为其直接或间接地提供β-L-2’-脱氧核苷，或呈现其自身的活性。药学上可接受的盐包括由药学上可接受的无机或有机碱和酸衍生的盐。药学上可接受的前药指在宿主内代谢(例如水解或氧化)形成本发明化合物的化合物。前药的典型例子包括在活性化合物的官能部分具有生物易分解的保护基团的化合物。前药包括可以氧化、还原、氨化、脱氨、羟化、脱羟基、水解、脱水、烷基化、脱烷基、酰化、脱酰、磷酸化、脱磷酸化而产生活性化合物的化合物。本发明的化合物具有对抗HBV，尤其是拉米夫定抗性HBV(M552V)的抗病毒活性，或者代谢成为表现所述活性的化合物。
所述盐的非限制性实施例是(a)与无机酸(如盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、硝酸等等)形成的酸加成盐和与有机酸(如乙酸、草酸、酒石酸、琥珀酸、苹果酸、抗坏血酸、苯甲酸、丹宁酸、棕榈酸、褐藻酸、聚谷氨酸、萘磺酸、萘二磺酸和聚半乳糖醛酸)本发明所使用的术语“药学上可接受的盐或复合物”是指β-L-2’-脱氧核苷的盐或复合物，其保留了母体化合物的所需生物活性，并呈现最小不希望的毒性效应(如果有的话)。所述盐的非限制性实施例是(a)与无机酸(如盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、硝酸等等)形成的酸加成盐和与有机酸(如乙酸、草酸、酒石酸、琥珀酸、苹果酸、抗坏血酸、苯甲酸、丹宁酸、棕榈酸、褐藻酸、聚谷氨酸、萘磺酸、萘二磺酸和聚半乳糖醛酸)形成的盐；(b)与阳离子形成的碱加成盐，例如与碱金属形成的盐和与碱土金属(钠、钾、锌、钙、铋、钡、镁、铝、铜、钴、镍、镉、钠、钾等)形成的盐，或者与有机阳离子(由N，N-二苄基亚乙基-二胺、铵或乙二胺形成)形成的碱加成盐；或者(c)(a)和(b)的组合；例如丹宁酸锌盐等。
用于联合或交替治疗的本文所述的任何核苷和/或化合物可以作为核苷酸前药给予，以增强活性、生物利用度、稳定性或以其它方式改变所述核苷的特性。已知多种核苷酸前药配体。一般地说，对所述核苷一磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯的烷基化、酰化或其它亲脂性修饰将增加所述核苷酸的稳定性。可以取代磷酸酯部分上一个或多个氢的取代基团的例子有烷基、芳基、类固醇、碳水化合物(包括糖)、1，2-二酰基甘油和醇类。R.Jones和N.Bischofberger，Antiviral Research，27(1995)1-17中描述许多这样的取代基团。所述取代基团的任一种可以与所公开的核苷联合使用，获得所需效应。
在一个实施方案中，β-L-2’-脱氧核苷的5’和/或3’-O位置和/或N4位置被酰化、烷基化或磷酸化(包括一磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯以及稳定化磷酸酯和磷脂)。在一个实施方案中，所述酰基基团是羧酸酯，其中所述酯基团的非羰基部分选自直链、支链环状烷基、烷氧基烷基(包括甲氧基甲基)、芳烷基(包括苄基)、芳氧基烷基(例如苯氧基甲基)、芳基(包括可任选地被卤素、烷基、烷基或烷氧基取代的苯基)、磺酸酯(例如烷基磺酰基或芳烷基磺酰基，包括甲基磺酰基)、三苯甲基或单甲氧基三苯甲基、取代苄基、三烷基甲硅烷基或二苯基甲基甲硅烷基。所述酯中的芳基基团可任选地包括一个苯基基团。烷基基团可以是直链、分支或环状，优选是C1到C18。
β-L-2’-脱氧核苷可通过与适宜的酯化剂(例如酸卤化物或酸酐)反应而被转化为药学上可接受的酯。核苷或其药学上可接受的前药可通过常规方法(例如通过适宜的碱或酸处理)而转化为其药学上可接受的盐。酯或盐可通过，例如水解而被转化为母体核苷。活性化合物的修饰(尤其是在5’和/或3’-O位置和/或N4位置)可影响活性物的生物可利用度和代谢速率，由此对活性物的递送进行全面控制。优选的修饰是3’和/或5’-氨基酸酯，包括L-缬氨酸酯。
也可以以5’磷酸醚脂(5’-phosphoether lipid)或5’-醚脂的形式提供所述活性β-L-3’-前药，如在下面参考文献中公开，所述参考文献通过引用结合到本文中Kucera，L.S.，N.Iyer，E.Leake，A.Raben，Modest E.K.，D.L.W.和C.Piantadosi.1990的“抑制传染性HIV-1产生并诱导缺陷型病毒形成的新型膜相互作用活性醚脂类似物”AIDS Res.Hum.Retro Viruses.6491-501；Piantadosi，C.，J.Marasco C.J.，S.L.Morris-Natschke，K.L.Meyer，F.Gumus，J.R.Surles，K.S Ishaq，L.S.Kucera，N.Iyer，C.A.Wallen，S.Piantadosi和E.J.Modest.1991的“合成新型醚脂核苷偶联物并评估其抗HIV活性”J.Med，Chem.341408.1414；Hosteller，K.Y.，D.D.Richman，D.A.Carson，L.M.Stuhmiller，G.M.T.van Wijk和H.van den Bosch.1992的“通过3’-脱氧胸苷的一种脂类前药3’-脱氧胸苷二磷酸二肉豆蔻酰甘油极大增强在CEM和HT4-6C细胞中对1型人类免疫缺陷病毒复制的抑制”Antimicrob.Agents Chemother.362025.2029；Hosetler，K.Y.，L.M.Stuhmiller，H.B.Lenting，H.van den Bosch和D.D.Richman，1990的“叠氮胸苷和其它抗病毒核苷的磷脂类似物的合成和抗逆转录病毒活性”J.Biol.Chem.26561127。
公开可以共价加入所述核苷(最好在所述核苷或亲脂性制剂的5’-OH位加入)的合适亲脂性取代基的美国专利的非限制性例子包括美国专利序号5,149,794(1992年9月22日，Yatvin等)、5,194,654(1993年3月16日，Hostetler等)、5,223,263(1993年6月29日，Hostetler等)、5,256,641(1993年10月26日，Yatvin等)、5,411,947(1995年5月2日，Hostetler等)、5,463,092(1995年10月31日，Hostetler等)、5,543,389(1996年8月6日，Yatvin等)、5,543,390(1996年8月6日，Yatvin等)、5,543,391(1996年8月6日，Yatvin等)和5,554,728(1996年9月10日；Basava等)，所有这些专利特此通过引用结合到本文中。公开能够连接到本发明的核苷上的亲脂性取代基或亲脂性制剂的外国发明专利申请包括WO 89/02733、WO 90/00555、WO 91/16920、WO 91/18914、WO 93/00910、WO 94/26273、WO96/15132、EP 0350287、EP 93917054.4和WO 91/19721。
下列参考文件中描述了核苷酸前药的非限制性实例Hong，Ho，D.H.W.“1β-D-呋喃阿拉伯糖胞嘧啶的激酶和脱氨基酶在人和小鼠组织中的分布”，Cancer Res1973，33，2816-2820；Holy，A.“同极性磷修饰的核苷酸类似物”，Advances in Antiviral Drug Design，DeClercq(Ed.)，JAI Press1993，Vol.I，179-231；Hong，C.I.，Nechaev，A.，和West，C.R.“皮质醇和可的松的1β-D-呋喃阿拉伯糖胞嘧啶缀合物的合成和抗肿瘤活性”Biochem.Biophys.Rs.Commun.1979a，88，1223-1229；Hong，C.I.，Nechaev，A.，Kirisits，A.J.Buchheit，D.J.和West，C.R.“作为可能的抗肿瘤剂的核苷缀合物.3.皮质类固醇和所选的亲脂性醇的1-(β-D-呋喃阿拉伯糖基)胞嘧啶缀合物的合成和抗肿瘤活性”，J.Med.Chenu.1980，28，171-177；Hosteller，K.Y.，Stuhmiller，L.M.，Lenting，H.B.M.van den Bosch，H.和Riclnnan J.Biol.Chem.265，6112-6117；Hosteller，K.Y.，Carson，D.A.和Richman，D.D.“磷脂酰基叠氮基胸苷在CEM细胞中抗逆转录病毒的机制”，J.Biol.Chem.1991，266，11714-11717；Hosteller，K.Y.，Korba，B.Sridhar，C.，Gardener，M.“磷脂酰基二脱氧胞苷在感染乙肝的细胞中的抗病毒活性以及在小鼠中增强肝脏吸收”，Antiviral Res.1994a，24，59-67；Hosteller，K.Y.，Richman，D.D.，Sridhar.C.N.Felgner，P.L.Felgner，J.，Ricci，J.，Gardener，M.F.Selleseth，D.W.和Ellis，M.N.“磷脂酰基叠氮基胸苷和磷脂酰基-ddC评价在小鼠淋巴组织中的摄取和在感染人免疫缺陷病毒的细胞中以及在感染rauscher白血病病毒的小鼠中的抗病毒活性”，Antimicrobial Agents Chemother.1994b，38，2792-2797；Hunston，R.N.，Jones，A.A.McGuigan，C.，Walker，R.T.，Balzarini，J.，和DeClercq，E.“衍生自2’-脱氧-5-氟尿苷的某些环磷酸三酯的合成和生物性质″”，J.Med.Chem.1984，27，440-444；Ji，Y.H.，Moog，C.，Schmitt，G.，Bischoff，P.和Luu，B.“作为可能的抗肿瘤剂的7β-羟基胆固醇和嘧啶核苷的一磷酸酯合成和初步评价抗肿瘤活性”，J.Med.Chem.1990，33，2264-2270；Jones，A.S.，McGuigan，C.，Walker，R.T.，Balzarini，J.和DeClercq，E.“某些核苷环氨基磷酸酯的合成、性质和生物活性”，J.Chem.Soc.Perkin Trans.I，1984，1471-1474；Juodka，B.A.和Smart，J.“二核糖核苷-一种(P→N)氨基酸衍生物的合成”，Coll.Czech.Chem.Comm.1974，39，363-968；Kataoka，S.，Imai，J.，Yamaji，N.，Kato，M.，Saito，M.，Kawada，T.和Imai，S.“烷基化cAMP衍生物；选择性合成和生物活性”，NucleicAcids Res.Sons.Ser.1989，21，1-2；Kataoka，S.，Uchida，“(cAMP)苄基和甲基三酯”，Heterocycles 32，1351-1356；Kinchington，D.，Harvey，J.J.，O’Connor，T.J.，Jones，B.C.N.M.，Devine，K.G.，Taylor-Robinson D.，Jeffries，D.J.和McGuigan，C.比较zidovudine氨基磷酸酯与二氨基磷酸酯衍生物在体外抗HIV和ULV的抗病毒作用”，Antiviral Chem.Chemother.1992，3，107-112；Kodama，K.，Morozumi，M.，Saithoh，K.I.，Kuninaka，H.，Yosino，H.和Saneyoshi，M.“1-β-D-呋喃阿拉伯糖基胞嘧啶-5’-硬脂基磷酸酯-一种1-β-D-呋喃阿拉伯糖基胞嘧啶的口服活性衍生物的抗肿瘤活性和药理性质”，Jpn.J.Cancer Res.1989，80，679-685；Korty，M.和Engels，J.“腺苷和鸟苷3’，5’-磷酸苄酯对豚鼠心室心肌的作用”，Naunyn-Schmiedeberg’s Arch.Pharmacol.1979，310，103-111；Kumar，A.，Goe，P.L.，Jones，A.S.Walker，R.T.Balzarini，J.和DeClercq，E.“某些环氨基磷酸酯核苷衍生物的合成和生物评价”，J.Med.Chem，1990，33，2368-2375；LeBec，C.，和Huynh-Dinh，T.“作为抗癌前药的5-氟尿苷和阿拉伯胞苷的亲脂性磷酸三酯的合成”，TetrahedronLett.1991，32，6553-6556；Lichtenstein，J.，Barner，H.D.和Cohen，S.S.“大肠杆菌外源性补充的核苷代谢”，J.Biol.Chem.1960，235，457-465；Lucthy，J.，Von Daeniken，A.，Friederich，J.Manthey，B.，Zweifel，J.，Schlatter，C.和Benn，M.H.“三种天然氰基环硫烷烃的合成和毒性特征”，Mitt.Geg.Lebensmittelunters.Hyg.1981，72，131-133(Chem.Abstr.95，127093)；McGigan，C.Tollerfield，S.M.和Riley，P.a.“抗病毒药物Ara的某些磷酸三酯衍生物的合成和生物评价”，Nucleic Acids Res.1989，17，6065-6075；McGuigan，C.，Devine，K.G.，O’Connor，T.J.，Galpin，S.A.，Jeffries，D.J.和Kinchington，D.“作为抗HIV化合物的3’-叠氮基-3’-脱氧胸苷(AZT)的新氨基磷酸酯衍生物的合成和评价”，Antiviral Chem.Chemother.1990a，1，107-113；McGuigan，C.，O’Connor，T.J.，Nicholls，S.R.Nickson，C.和Kinchington，D.“某些新的AZT和ddCyd的取代的二烷基磷酸酯衍生物的合成和抗HIV活性”，Antiviral Chem.Chemother.1990b，1，355-360；McGuigan，C.，Nicholls，S.R.，O’Connor，T.J.，和Kinchington，D.“作为可能的抗AIDS药物的3’-修饰的核苷的某些新的二烷基磷酸酯衍生物的合成”Antiviral Chem.Chemother.1990c，1，25-33；McGuigan，C.，Devin，K.G.，O’Connor，T.J.，和Kinchington，D.“3’-叠氮基-3’-脱氧胸苷(AZT)的某些卤代氨基磷酸酯衍生物的合成和抗HIV活性；三氯乙基甲氧基丙氨酰基化合物的强效活性”，Antiviral Res.1991，15，255-263；McGuigan，C.，Pathirana，R.N.，Mahmood，N.，Devine，K.G.和Hay，A.J.在抗AZT作用的细胞系中AZT的芳基磷酸酯衍生物保留抗HIV-1的活性，Antiviral Res.1992，17，311-321；McGuigan，C.，Pathirana，R.N.，Choi，S.M.，Kinchington，D.和O’Connor，T.J.作为HIV抑制剂的AZT的氨基磷酸酯衍生物；对羧基末端的研究，AntiviralChem.Chemother.1993a，4，97-101；McGuigan，C.，Pathirana，R.N.，Balzarini，J.和DeClercq，E.“通过AZT的芳基磷酸酯衍生物来细胞内递送生物活性AZT核苷酸”，J.Med.Chem.1993b，36，1048-1052。
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IV.联合治疗和交替治疗人们已经认识到在用一种抗病毒剂长期治疗后会出现HBV抗药性变体。抗药性最典型地是由于编码病毒生存周期中所使用酶(在HBV中最典型地是DNA聚合酶)的基因的突变而发生。近来，已经证实通过将化合物与第二、第三、第四等抗病毒化合物(其诱导的突变与主药(principle drug)所导致的不同)联合或交替可以延长、增强或恢复药物抵抗HBV感染的功效。或者，药物的药动学、生物分布或其它参数可通过所述联合或交替治疗而改变。剂量要依赖于各药物的诸如吸收、生物分布、代谢或排泄率等因素以及其它本领域技术人员已知的其它因素。应当注意剂量值还会随着要缓解的病症的严重度而变化。还应认识到对于任何特定个体，特定剂量方案和剂量计划应当根据个体需要和实施及指导施用组合物的人员的专业判断而随时间进行调整。抗HBV化合物适用剂量范围的实例可见于可科学文献和临床医师手册中。本文所描述的其它化合物的适用剂量范围的多种实例还可见于公开的文献或可通过已知的方法进行鉴别。这些剂量范围可按照需要进行改变以获得所需结果。
通常，在联合治疗中，同时给予两种或多种药物的有效剂量，而在交替治疗中，每种药物的有效剂量连续给予。例如，在交替治疗中，可以将一种或多种第一药物以有效量施用有效时间期限以治疗病毒感染，然后用一种或多种第二药物在疗程中替代第一药物并同样以有效量给药有效的时间期限。一般而言，联合治疗通常优先于交替治疗，因为其诱导对病毒的多重同时应力。
在本文所述任一实施方案中，假如本发明β-L-2’-脱氧核苷与第二种核苷或磷酸化后成为活性形式的非核苷反转录酶抑制剂联合或交替给予，则优选第二种化合物是一种能够由酶磷酸化的化合物，所述酶不同于在体内磷酸化本发明选定β-L-2’-核苷的酶。激酶的例子有胸苷激酶、胞嘧啶激酶、鸟苷激酶、腺苷激酶、脱氧胞苷激酶，5’-核苷酸酶和脱氧鸟苷激酶。
因此，在一个实施方案中，本发明提供本发明两种或多种核苷前药的组合，所述核苷最好由不同酶磷酸化、或通过不同生物途径起作用。在另一实施方案中，本发明提供至少一种前药与表现抗乙型肝炎活性的核苷联合应用或交替应用，所述核苷包括但不限于本文所定义任一种前药的母体药物，即2’-脱氧-β-L-核苷，包括2’-脱氧-β-L-胞苷、2’-脱氧-β-L-胸腺嘧啶、2’-脱氧-β-L-腺苷、2’-脱氧-β-L-鸟嘌呤、2’-脱氧-β-L-5-氟胞苷、2’，3’-二脱氧-3’-硫代胞苷、2’，3’-二脱氧-3’-硫代-5-氟胞苷。本文所提供的β-L-2’-脱氧核苷，尤其是β-L-2’-dC或β-L-2’dT，或这些化合物的药学上可接受的盐、酯、磷酸酯或前药的抗乙型肝炎病毒活性(抵抗HBV的野生型或抗性株)，可通过联合或交替施用两种或多种这些核苷而被增强。或者，例如，一种或多种本文所述的β-L-2’-脱氧核苷，尤其是β-L-2’dC或β-L-2’-dT可以与一种或多种已知具有抗乙型肝炎病毒活性的其它化合物联合和/或交替给予。非限制性实例包括FTC、L-FMAU、DAPD、DXG、泛昔洛韦、喷昔洛韦、BMS-200475，bis pom PMEA(阿德福韦二匹伏酯)、洛布卡韦、更昔洛韦、替诺福韦、Lfd4C、磷卡萘替(磷酸三钠甲酸盐)、异丙肌苷、左旋咪唑、N-乙酰胞苷(NAC)、干扰素、聚乙二醇化干扰素、利巴韦林、PC1323或聚腺环状聚尿苷酸。在一个实施方案中，本文所提供的β-L-2’-脱氧核苷，尤其是β-L-2’-dC或β-L-2’-dT，可与3TC联合和/或交替施用。
已被鉴定为具有抗乙型肝炎病毒活性，并由此可与本发明的组合物联合和/或交替使用的药物的实例包括
**日达仙美国批准罕用药暴露后和/或肝移植后治疗
来源Hepatitis B Foundation Drug Watch.Compounds in Developmentfor Hepatitis B.www.hepb.org，Pharmaceutical Research andManufacturers of America.Mark Nelson，MD.Selected Highlights fromDrug Development for Antiretroviral Therapies 2001(Hep DART2001)December 16-20，2001，Maui，Hawaii；Selected Highlights fromAmerican Association for the Study of Liver Diseases 52nd AnnualMeeting(52nd AASLD).November 9-13，2001.Dallas，Texas；Reporton Hepatitis B from Digestive Disease Week 2001；May 20-23，2001，Atlanta，Georgia.
在一个实施方案中，所述2’-β-L-赤-呋喃五并核苷与一种或多种诸如免疫刺激剂和/或免疫调节剂，例如TH1细胞因子，尤其是干扰素，优选干扰素γ联合或交替施用以治疗HBV野生型或抗性株，和/或抑制或防止HBV抗性株的表达。例如，可使用上述已经如下文件中所述的那些免疫刺激性序列Krieg等，(1989)J Immunol.14324482451；Tokunaga等，(1992)Microbiol.Immunol.3655-66；Kataoka等，(1992)Jpn′.J Cancer Res.83244-247；Yamamoto等，(1992)J Immunol.1484072-4076；Mojcik等，(1993)Clin.Immuno.and Immnunopathol.67130-136；Branda，等，(1993)Biochem.Pharmacol.452037-2043；Pisetsky等，(1994)Life Sci.54(2)101-107；Yamamoto等，(1994a)Antisense Research and Development.4119-122；Yamamoto等，(1994b)Jpn.J Cancer Res.85775-779；Raz等，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 919519-9523；Kimura等，(1994)J Biochem.(Tokyo)116991-994；Krieg等，(1995)Nature 374546549；Pisetsky等，(1995)Ann.N.Y Acad.Sci.772152-163；Piesetsky(1996a)J Immunol.156421-423；Pisetsky(1996b)Immunity 5303-310；Zhao等，(1996)Biochem.Pharmacol.51173-182；Yi等，(1996)J.Immunol.156558-564；Krieg(1996)Trends Microbiol.4(2)73-76；Krieg等，(1996)Antisense Nucleic AcidDrugDev.6133-139；Klimnan等，(1996)Proc.Nad.Acad.Sci.USA.932879-2883；Raz等，(1996)；Sato等，(1996)Science 273352-354；Stacey等，(1996)J Immunol.1572116-2122；Ballas等，(1996)J Immunoo.1571840-1845；Branda等，(1996)JLab.Clin.Med 128329338；Sonehara等，(1996)JInterferon and Cytokine Res.16799-803；Klimnan等，(1997)J Immunol.1583635-3639；Sparwasser等，(1997)Eur.J Immunol.2716711679；Roman等，(1997)；Carson等，(1997)J Exp.Med 1861621-1622；Chace等，(1997)Clin.Immunol.and Immunopathol，84185-193；Chu等，(1997)J Exp.Med 1861623-1631；Lipford等，(1997a)Eur.J Immunol.272340-2344；Lipford等，(1997b)Eur.J Immunol.273420-3426；Weiner等，(1997)Proc.Natl.Acad Sci.USA9410833-10837；Macfarlane等，(1997)Immunology 91586-593；Schwartz等，(1997)J Clin.Invest.10068-73；Stein等，(1997)，Antisense Technology，Ch.11pp.241-264，C.Lichtenstein和W.Nellen，Eds.，IRL Press；Wooldridge等，(1997)Blood 8929942998；Leclerc等，(1997)Cell.Immunol.17997-106；Kline等，(1997)JInvest.Med 45(3)282A；Yi等，(1998a)J Immunol.1601240-1245；Yi等，(1998b)Immunol.1604755-4761；Yi等，(1998c)Immunol.1605898-5906；Yi等，(1998d)J.Immunol.1614493-4497；Krieg(1998)Applied Ayatisense Oligonucleotide Technology Ch.24，pp.431-448，C.A.Stein和A.M.Krieg，Eds.，Wiley-Liss，Inc.；Krieg等，(1998a)Trends Microbiol.623-27；Krieg等，(1998b)J Immunol.1612428-2434；Krieg等，(1998c)Proc.Nad.Acad.Sci.USA 9512631-12636；Spiegelberg等，(1998)Allergy 53(45S)9397；Homer等，(1998)Cell Immunol.19077-82；Jakob等，(1998)J lmmunol.1613042-3049；Redford等，(1998)J Immunol.1613930-3935；Weeratna等，(1998)Antisense & Nucleic AcidDrug Development 8351-356；McCluskie等，(1998)J Immunol.161(9)4463-4466；Grarnzinski等，(1998)Mol.Med 4109-118；Liu等，(1998)Blood 923730-3736；Moldoveanu等，(1998)Vaccine 161216-1224；Brazolot Milan等，(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9515553-15558；Briode等，(1998)Immunol.1617054-7062；Briode等，(1999)Int.Arch.Allergy Immunol.118453-456；Kovarik等，(1999)J Immunol.1621611-1617；Spiegelberg等，(1999)Pediatr.Pulmonol.Suppl.18118-121；Martin-Orozco等，(1999)Int.Immunol.111111-1118；EP 468,520；WO96/02555；WO 97/28259；WO 98/16247；WO 98/18810；WO 98/37919；WO01/68116PCT/US01/07839；WO99/33488；WO 99/51259和WO 99/62923。还可参见Zimmermann等，(1998)J.Immunol 1603627-3630；Krieg(1999)Trends Microbiol 764-65；美国专利序号5,663,153；5,723,335；5,849,719和6,174,872。还可参见WO 99/56755，WO00/06588，WO 00/16804；WO 00/21556；WO 00/67023和WO01/12223。
在旱獭模型和转基因小鼠中已经显示TH1细胞因子包括IFNγ，TNFα和白细胞介素12的肝内表达可经由非细胞溶解性途径诱导病毒复制的抑制(Guidotti，L.G.，P.Borrow，A.Brown，H.McClary，R.Koch，和F.V.Chisari“淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒从肝细胞中的非细胞损伤性清除”J Exp Med.1999，189，1555-1564；Guo，J.T.，H.Zhou，C.Liu，C.Aldrich，J.Saputelli，T.Whitaker，M.1.Barrasa，W.S.Mason，和C.Seeger“瞬时肝DNA病毒感染恢复期间肝细胞的调亡和再生”J Virol.2000，74，1495-1505。
在另一个实施方案中，本文所提供的β-L-2’-脱氧核苷，尤其是β-L-2’-dC或β-L-2’dT，可与干扰素，诸如干扰素α或干扰素γ联合和/或交替施用以在人中提供抵抗乙型肝炎病毒，野生型或抗性株的优良治疗，和/或防止或抑制HBV抗性株的表达。在一个实施方案中，以蛋白质的形式施用干扰素，例如直接进入静脉或动脉。在本发明可选的实施方案中，干扰素以其在被宿主表达的核酸、基因或基因片段的形式进行施用。干扰素核酸可被递送至“裸”宿主(即无载体)，或可选地，可借助载体(包括但不限于病毒载体诸如腺病毒载体)而被递送。在本发明的一个具体实施方案中，免疫调节剂以其基因或基因片段的形式进行递送，且该递送通过腺病毒介导。在本发明的一个具体的实施方案中，免疫调节剂是干扰素(诸如干扰素γ)，且其递送采用由腺病毒介导的基因或基因片段的形式。
在一个实施方案中，干扰素是干扰素α，任选地是，聚乙二醇化干扰素α。在另一个实施方案中，干扰素选自(包括但不限于)干扰素α-2a，干扰素α-2b，聚乙二醇化干扰素α-2a，聚乙二醇化干扰素α-2bROFERON(干扰素α-2a)，PEGASYS(聚乙二醇化干扰素α-2a)，INTRONA(干扰素α-2b，Schering Corporation)，PEG-INTRON(聚乙二醇化干扰素α-2b，Schering Corporation)，复合干扰素，InterMune产INFERGEN(干扰素alphacon-1)，Viragen产OMNIFERON(天然干扰素)，Human Genome Sciences产ALBUFERON，Amarillo Biosciences产口服干扰素α，和SuperFeron(天然人多亚型IFN-α，Genetrol，Inc.)。在可选的实施方案中，干扰素是干扰素γ。而在另一实施方案中，干扰素是干扰素β、干扰素ω或干扰素τ。在另一个实施方案中，干扰素选自(包括不限于)Ares-Serono产REBIF(干扰素β-la)，BioMedicine产ω干扰素，InterMune产干扰素γ-lb和HuFeron(人IFN-β，Genetrol，Inc.)。
免疫刺激性序列本文所使用的术语“ISS”或“免疫刺激性序列”是指多核苷酸序列，其单独和/或与MC复合而能在体外、体内和/或离体检测时影响可检测的免疫反应。可检测的免疫反应的实例包括(但不限于)抗原特异性抗体生成，细胞因子分泌，淋巴细胞群诸如NK细胞，CD4+T淋巴细胞，CD8+T淋巴细胞，B淋巴细胞等的活化或扩增。
优选地，ISS序列优先活化Thl型反应。用于本发明的多核苷酸包含至少一个ISS。本文所使用的“ISS”还是包含ISS的多核苷酸速记术语。
包含ISS的多核苷酸(或包含所述多核苷酸的组合物)可用于本文所描述的方法和组合物中。免疫调节性多核苷酸可包括至少一个ISS或多个ISSs。ISSs可在多核苷酸内邻接，或它们可在多核苷酸内被其它核苷酸碱基分开。或者，多个ISSs可以以个体多核苷酸而被递送。
现有技术中已经描述了ISS且可采用能够指示免疫反应多个方面诸如细胞因子分泌，抗体生成，NK细胞活化和T细胞增殖的标准检测法对其进行方便地鉴别。例如参见WO 97/28259；WO 98/16247；WO99/11275；Krieg等，(1995)；Yamamoto等，(1992)；Ballas等，(1996)；Klinman等，(1997)；Sato等，(1996)；Pisetsky(1996a)；Shimada等，(1986)；Jpn.Cancer Res.77808-816；Cowdery等，(1996)J Innnunol.1564570-4575；Roman等，(1997)；和Lipford等，(1997a)。
ISS可以是大于6个碱基或碱基对的任何长度，通常包含序列5′-胞嘧啶，鸟嘌呤-3′，优选长度大于15个碱基或碱基对，更优选大于20碱基或碱基对。如本领域众所周知的，5′-胞嘧啶，鸟嘌呤-3′序列的胞嘧啶是未甲基化的。ISS还可包含序列5′-嘌呤，嘌呤，C，G，嘧啶，嘧啶，C，G-3′。ISS还可包含序列5′-嘌呤，嘌呤，C，G，嘧啶，嘧啶，C，C3′。如下面多核苷酸序列所示，ISS可包含(即包含一个或多个)序列5′-T，C，G-3′。在某些实施方案中，ISS可包含序列5′-C，G，嘧啶，嘧啶，C，G-3′(诸如5′-CGTTCG-3′)。在某些实施方案中，ISS可包含序列5′-C，G，嘧啶，嘧啶，C，G，嘌呤，嘌呤-3′。在某些实施方案中，ISS包含序列5′-嘌呤，嘌呤C，G，嘧啶，嘧啶-3′(诸如5′-AACGTT-3′)。
在某些实施方案中，ISS可包含序列5′-嘌呤，T，C，G，嘧啶，嘧啶-3′。
在某些实施方案中，包含ISS的多核苷酸约小于以下任何长度(以碱基或碱基对计)10,000；5,000；2500；2000；1500；1250；1000；750；500；300；250；200；175；150；125；100；75；50；25；10。在某些实施方案中，包含ISS的多核苷酸约大于以下任何长度(以碱基或碱基对计)8；10；15；20；25；30；40；50；60；75；100；125；150；175；200；250；300；350；400；500；750；1000；2000；5000；7500；10000；20000；50000。或者，ISS可以是上限是10,000；5,000；2500；2000；1500；1250；1000；750；500；300；250；200；175；150；125；100；75；50；25；或10且独立地选取下限8；10；15；20；25；30；40；50；60；75；100；125；150；175；200；250；300；350；400；500；750；1000；2000；5000；7500的任何长度范围，其中下限小于上限。
在某些实施方案中，ISS包括以下任何序列
GACGCTCC；GACGTCCC；GACGTTCC；GACGCCCC；AGCGTTCC；AGCGCTCC；AGCGTCCC；AGCGCCCC；AACGTCCC；AACGCCCC；AACGTTCC；AACGCTCC；GGCGTTCC；GGCGCTCC；GGCGTCCC；GGCGCCCC；GACGCTCG；GACGTCCG；GACGCCCG；GACGTTCG；AGCGCTCG；AGCGTTCG；AGCGTCCG；GCGCCCG；AACGTCCG；AACGCCCG；AACGTTCG；AACGCTCG；GGCGTTCG；GGCGCTCG；GGCGTCCG；GGCGCCCG.
在某些实施方案中，免疫调节性多核苷酸包括序列5′-TGACTGTGAACGTTCGAGATGA-Y(SEQ ID NO1).
在某些实施方案中，ISS包括以下任何序列GACGCU；GACGUC；GACGUU；GACGUT；GACGTU；AGCGUU；AGCGCU；AGCGUC；AGCGUT；AGCGTU；AACGUC；AACGUU；AACGCU；AACGUT；AACGTU；GGCGUU；GGCGCU；GGCGUC；GGCGUT；GGCGTU.
在某些实施方案中，ISS包括以下任何序列。
GABGCTCC；GABGTCCC；GABGTTCC；GABGCCCC；AGBGTTCC；AGBGCTCC；AGBGTCCC；AGBGCCCC；AABGTCCC；AABGCCCC；AABGTTCC；AABGCTCC；GGBGTTCC；GGBGCTCC；GGBGTCCC；GGBGCCCC；GABGCTCG；GABGTCCG；GABGCCCG；GABGTTCG；AGBGCTCG；AGBGTTCG；AGBGTCCG；GBGCCCG；AABGTCCG；AABGCCCG；AABGTTCG；AABGCTCG；GGBGTTCG；GBGCTCG；GGBGTCCG；GGBGCCCG；GABGCTBG；GABGTCBG；GABGCCBG；GABGTTBG；AGBGCTBG；AGBGTTBG；AGBGTCBG；AGBGCCBG；AABGTCBG；AABGCCBG；AABGTTBG；AABGCTBG；GGBGTTBG；GGBGCTBG；GGBGTCBG；GGBGCCBG，其中B是5-溴胞嘧啶。
在某些实施方案中，ISS包括以下任何序列
GABGCUCC；GABGUCCC；GABGUTCC；GABGTUCC；GABGUUCC；GBGUUCC；AGBGTUCC；AGBGUTCC；AGBGCUCC；AGBGUCCC；AABGUCCC；ABGUUCC；AABGUTCC；AABGTUCC；AABGCUCC；GGBGUUCC；GGBGUTCC；GBGTUCC；GGBGCUCC；GGBGUCCC；GABGCUCG；GABGUCCG；GABGUUCG；ABGUTCG；GABGTUCG；AGBGCUCG；AGBGUUCG；AGBGUTCG；AGBGTUCG；AGBGUCCG；AABGUCCG；AABGUUCG；AABGUTCG；AABGTUCG；AABGCUCG；GGBGUUCG；GGBGUTCG；GGBGTUCG；GGBGCUCG；GGBGUCCG；GABGCUBG；GABGUCBG；GABGUUBG；GABGUTBG；GABGTUBG；AGBGCUBG；AGBGUUBG；AGBGUCBG；AGBGUTBG；AGBGTUBG；AABGUCBG；AABGUUBG；AABGUTBG；AABGTUBG；AABGCUBG；GGBGUUBG；GGBGUTBG；GGBGTUBG；GGBGCUBG；GGBGUCBG，其中B是5-溴胞嘧啶。
在其它实施方案中，ISS包括以下任何序列5′-TGACCGTGAACGTTCGAGATGA-3′；5′-TCATCTCGAACGTTCCACAGTCA-3’；5′-TGACTGTGAACGTTCCAGATGA-3′；5’-TCCATAACGTTCGCCTAACGTTCGTC-3’；5’-TGACTGTGAABGTTCCAGATGA-3′，其中B是5-溴胞嘧啶；5’-TGACTGTGAABGTTCGAGATGA-3′，其中B是5-溴胞嘧啶，和5’-TGACTGTGAABGTTBGAGATGA-3′，其中B是5-溴胞嘧啶。
ISS和/或包含ISS的多核苷酸可包含修饰。ISS的修饰包括本领域已知的任何(但不限于)3′-OH或5′-OH基团的修饰，核苷酸碱基的修饰，糖部分的修饰，和磷酸基团的修饰。所述修饰的实例描述如下。
ISS可以是单链或双链DNA，以及单链或双链RNA或其它修饰的多核苷酸。ISS可以或可以不包括一个或多个回文区，其可存在于上上述模体中或可沿模体衍伸。ISS可包括另外的等级序列(Rankingsequence)，其中某些为本文所描述。ISS可包含天然存在的或修饰的、天然不存在的碱基，且可包含修饰的糖，磷酸酯和/或末端。例如，磷酸酯修饰包括(但不限于)甲基磷酸酯，硫代磷酸酰(桥接或非桥接)，磷酸三酯和二硫代磷酸酯并可以任何组合进行使用。还可使用其它非磷酸酯键。寡核苷酸可包括硫代磷酸酰主链。还可进行本领域已知的糖修饰，诸如2′-烷氧基-RNA类似物，2′-氨基-RNA类似物和2′-烷氧基-或氨基-RNA/DNA嵌合体和本文所述的其它形式并可与任何磷酸酯修饰组合。碱基修饰的实例包括(但不限于)将吸电子部分加至ISS的胞嘧啶的C-5和/或C-6(例如，5-溴胞嘧啶，5-氯胞嘧啶，5-氟胞嘧啶，5-碘胞嘧啶)。
可采用本领域众所周知的技术和核酸合成装置(包括但不限于酶法，化学法和较大寡核苷酸序列的降解)来合成ISS。例如参见，Ausubel等，(1987)；和Sambrook等，(1989)。当以酶法装配时，可例如用连接酶诸如T4DNA或RNA连接酶连接个体单位。美国专利序号5,124,246。寡核苷酸降级可通过将寡核苷酸暴露于核酸酶来实施，如美国专利序号4,650,675所例举说明的。
ISS还可采用常规多核苷酸分离方法进行分离。所述方法包括(但不限于)探针与基因组或cDNA文库杂交以检测共有的核苷酸序列，抗体筛选表达文库以检测共有的结构特性和通过聚合酶链式反应合成特定的天然序列。
环状ISS可通过重组方法或化学合成方法进行分离，合成。当环状ISS通过分离或通过重组方法获得时，ISS应优选为质粒。较小环状寡核苷酸的化学合成可采用本领域描述的任何方法进行实施。例如参见，Gao等，(1995)Nucleic Acids Res.232025-2029；和Wang等，(1994)Nucleic Acids Res.222326-2333。
制备寡核苷酸和修饰寡核苷酸的技术是本领域已知的。天然存在的DNA或RNA(包含磷酸二酯键)一般通过如下方法合成，将适宜的核苷亚磷酰胺连续地结合至与3′端附着于固体支持物的增长的寡核苷酸的5′-羟基，然后将中间体亚磷酸三酯氧化为磷酸三酯。所需寡核苷酸序列一经合成，寡核苷酸与支持物分离，将磷酸三酯脱保护为磷酸二酯并采用氨水核其它碱将核苷碱基脱保护。例如参见，Beaucage(1993)，“寡脱氧核糖核酸合成”，Protocols for Oligonucleotides andAnalogs，Synthesis and Properties(Agrawal，ed.)Humana Press，Totowa，NJ；Warner等，(1984)DNA 3401和美国专利序号4,458,066.
ISS还可包含磷酸酯修饰的寡核苷酸。包含修饰的磷酸酯键或非磷酸酯键的多核苷酸的合成也是本领域已知的。综述参见Matteucci(1997)“寡核苷酸类似物综述”，Oligonueleotides asTlaerapeuticAgents，(D.J.Chadwick和G.Cardew，ed.)John Wiley和Sons，New York，NY。可与本发明的寡核苷酸的糖或糖类似物部分结合的磷衍生物(或修饰的磷酸基团)可以是一磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、烷基磷酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等。上述磷酸酯类似物的制备及其掺入核苷酸、修饰的核苷酸和寡核苷酸(本质上)也是已知，本文无须详述。Peyrottes等，(1996)Nucleic Acids Res.241841-1848；Chaturvedi等，(1996)Nucleic Acids Res.242318-2323；和Schultz等，(1996)Nucleic Acids Res.242966-2973。例如，除用硫化步骤代替氧化步骤外，硫代磷酸酯的合成与上述天然存在的寡核苷酸的合成相似(Zon(1993)“寡核苷酸硫代磷酸酯”，Protocols forOligonucleotides and Analogs，Synthesis and Properties(Agrawal，ed.)Humana Press，pp.165-190)。同样地，其它磷酸酯类似物诸如磷酸三酯(Miller等，(1971)JACS 936657-6665)，非桥接氨基磷酸酯(Jager等，(1988)Biochem.277247-7246)，N3′至P5′氨基磷酸酯(Nelson等，(1997)JOC 627278-7287)和二硫代磷酸酯(美国专利序号5,453,496)的合成也已被公开。也可使用其它基于非磷酸的修饰的寡核苷酸(Stirchak等，(1989)Nucleic Acids Res.176129-6141)。具有硫代磷酸酯主链的寡核苷酸的免疫原性高于具有磷酸二酯主链的寡核苷酸，并在注入宿主后表现出对降解更高的抗性。Braun等，(1988)J Immunol.1412084-2089；和Latimer等，(1995)Mol.Immuol.321057-1064。
用于本发明的包含ISS的多核苷酸可包括核糖核苷酸(包括独立或部分作为糖部分的核糖)，脱氧核糖核苷酸(包括主要作为糖部分的脱氧核糖)，或如本领域已知的，修饰的糖或糖类似物也可被掺入ISS中。因此，除核糖和脱氧核糖外，糖部分可以是戊糖、脱氧戊糖、己糖、脱氧己糖、葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、来苏糖和糖“类似物”环戊基基团。糖可以吡喃或呋喃形式。在ISS中，糖部分优选是核糖、脱氧核糖、阿拉伯糖或2′-O-烷基核糖的呋喃糖苷，且糖可以以α和β异构体构型而结合至各杂环碱基。糖修饰包括(但不限于)2′-烷氧基-RNA类似物，2′-氨基-RNA类似物和2′-烷氧基-或氨基-RNA/DNA嵌合体。这些糖或糖类似物以及各“核苷”(其中所述糖或类似物与杂环碱基(核酸碱基)结合)的制备实质上是已知的，此处无须详述，所述制备可以包括任何具体实例。还可实施糖修饰并将其在ISS制备中与任何磷酸酯修饰联合。
掺入ISS的杂环碱基，或核酸碱基可以是天然存在的基本嘌呤和嘧啶碱基(名为尿嘧啶或胸腺嘧啶，胞嘧啶，腺嘌呤和鸟嘌呤，如上述)，以及所述基本碱基的天然存在的和合成的修饰。
本领域技术人员应认识到本领域中可获得包含多种杂环碱基和多种糖部分(和糖类似物)的大量“合成”非天然核苷，且只要本发明的其它条件得到满足，ISS可包括除天然存在的核酸的五种基本碱基成分之外的一个或几个杂环碱基。
但是，优选地，ISS中的杂环碱基包括(但不限于)尿嘧啶-5-基，胞嘧啶-5-基，腺嘌呤-7-基，腺嘌呤-8-基，鸟嘌呤-7-基，鸟嘌呤-8-基，4-氨基吡咯并[2.3-d]嘧啶-5-基，2-氨基-4-吡咯并[2，3-d]嘧啶-5-基，2-氨基-4-氧吡咯并[2.3-d]嘧啶-3-基基团，其中嘌呤经由9-位，嘧啶经由1-位，吡咯并嘧啶经由7-位而吡唑并嘧啶经由1-位与ISS的糖部分结合。
ISS和/或IMP可包括至少一个所述修饰的碱基，例如，在共有的国际申请WO 99/62923中的。本文所使用的术语“修饰的碱基”与“碱基类似物”同义，例如“修饰的胞嘧啶”与“胞嘧啶类似物”同义。同样地，“修饰的”核苷或核苷酸被定义为具有与核苷或核苷酸“类似物”同样的含义。碱基修饰的实例包括(但不限于)将吸电子部分加至ISS的胞嘧啶的C-5和/或C-6。优选地，吸电子部分是卤素。修饰的胞嘧啶可包括(但不限于)氮胞嘧啶、5-溴胞嘧啶、5-氯胞嘧啶、氯化胞嘧啶、环胞嘧啶、阿糖胞苷、5-氟胞嘧啶、氟嘧啶、5，6-二氢胞嘧啶、5-碘胞嘧啶、5-硝基胞嘧啶、5-羟基-胞嘧啶，和任何其它嘧啶类似物或修饰的嘧啶。优选的修饰尿嘧啶是在C-5和/或C-6，优选用卤素进行修饰，包括(但不限于)溴尿嘧啶诸如5-溴尿嘧啶，氯尿嘧啶诸如5-氯尿嘧啶、氟尿嘧啶诸如5-氟尿嘧啶、碘尿嘧啶诸如5-碘尿嘧啶和羟尿嘧啶。
还可参见，Kandimalla等，2001，Bioorg.Med.Chem.9807-813。例如参见，国际专利申请序号WO 99/62923。碱基修饰的其它实例包括将巯基添加至碱基，包括但不限于6-硫-鸟嘌呤、4-硫-胸腺嘧啶和4-硫尿嘧啶。此外，某些IMPs可包括修饰的碱基诸如7-脱氮鸟苷代替任何鸟苷残基，或选自N4-甲基胞嘧啶或N4-甲基胞嘧啶的修饰的胞嘧啶代替任何胞嘧啶残基，包括5′-CG-3′的胞嘧啶。
制备碱基修饰的核苷和采用所述碱基修饰的核苷作为前体合成修饰的寡核苷酸已被描述于，例如美国专利序号4,910,300；4,948,882和5,093,232中。这些碱基修饰的核苷已经过设计以便使其能通过化学合成而被掺入寡核苷酸的末端或中间位置中。所述碱基修饰的核苷(存在于寡核苷酸的末端或中间位置)可作为肽或其它抗原结合的位点。在糖部分修饰的核苷也已被公开(包括但不限于，例如，美国专利序号4,849,513；5,015,733；5,118,800；5,118,802)且可被同样使用。
本发明的方法所使用的ISS可被制备为ISS-微载体复合物。ISS-微载体复合物包括于微载体(MC)结合的包含ISS的多核苷酸。ISS-MC复合物包括与微载体的表面结合的ISS(即，ISS未被包裹在MC内)，被吸附在微载体内的ISS(例如，被吸附至PLGA珠)，或被包裹在MC内的ISS(例如，掺合至脂质体中)。
与微颗粒(SEPHAROSE珠)结合的包含ISS的寡核苷酸先前已经显示出具有体外免疫刺激性活性(Liang等，(1996)，J Clin.Invest.981119-1129)。但是，近来的结果显示出与金、乳胶或磁性颗粒结合的包含ISS的寡核苷酸不具有激活7TD1细胞增殖的活性，所述细胞响应包含ISS的寡核苷酸而增殖(Manzel等，(1999).Antisense Nucl.AcidDrug Dev.9459-464)。
微载体不能溶于纯水，且大小小于约50-60μm，大小优选小于约10μm，大小更优选为约10μm至约10μm，25nm至约5μm，50nm至约4.5μm或1.0μm至约2.0μm。微载体可以是任何形状，诸如球形、椭圆形，杆状等，虽然球形微载体正常情况下是优选的。优选微载体的大小为50mn，200nm，1μm，1.2μm，1.4μm，1.5μm，1.6μm，1.8μm，2.0μm，2.5μm或4.5μm。微载体的“大小”通常是制造者所描述颗粒的“设计大小”或预期大小。大小可以是可直接测量的尺寸，诸如平均或最大直径，或可通过间接的测定法诸如过滤筛选测定法进行确定。微载体大小的直接检测典型地通过显微镜术，一般是光学显微镜术或扫描电子显微镜术(SEM)，与已知大小的颗粒比较或参照测微仪来实施。由于在制备过程中大小会发生较小变化，如果检测显示微载体为声明尺寸的±5-10％，则微载体被认为具有声明大小。大小特征还可通过动态光散射进行确定。或者，微载体大小可通过过滤筛选测定法进行确定。如果至少97％的微载体通过声明大小的“筛选型”滤器(即，在表面滞留颗粒的滤器，诸如聚碳酸酯或聚醚砜滤器，其与“厚度过滤器”相反，后者中被滞留的颗粒位于滤器内部)，则微载体小于声明大小。如果至少约97％的微载体被声明大小的筛选型滤器滞留，则微载体大于声明大小。因此，大小约为10tim至约10nm的微载体的至少约97％通过10μm孔径的筛选滤器而被10nm筛选滤器滞留。
如上所述，关于微载体的大小或大小范围，其隐含地包括所声明大小和/或大小范围的大约变化形式和近似值。这通过当涉及大小和/或大小范围时使用术语“约”而得以反映未使用“约”大小或大小范围并非意指10大小和/或大小范围是精确的。
微载体可以是固相的(例如，聚苯乙烯珠)或液相(例如，油合水乳液中的脂质体、微粒或油珠)。液相微载体包括脂质体、微粒、油珠合其它基于脂质或油的颗粒。一种优选的液相微载体是水包油乳液中的油珠。优选地，用作微载体的水包油乳液包括生物可相容性取代基诸如鲨烯。液相微载体通常被认为是非生物可降解的，但通过将一种或多种生物可降解的聚合物掺入液体微载体制剂中而制备的液相微载体可以是生物可降解的。在一个优选的实施方案中，微载体是通过鲨烯、三油酸山梨坦、TWEEN 80在水性pH缓冲液中乳化制备的水包油乳液中的油珠。
用于ISS微载体复合物的固相微载体可从生物可降解材料或非生物可降解材料制备，可包括或排除琼脂糖或修饰的琼脂糖微载体。可用的固相微载体包括(但不限于)生物可降解的聚酯，诸如聚(乳酸)、聚(羟乙酸)和其共聚物(包括嵌段共聚物)，以及聚(乳酸)和聚(乙二醇)的嵌段共聚物；聚正酯诸如基于3，9-二亚乙基-2，4，8，10-四氧杂螺[5.5]十一烷(DETOSU)的聚合物；聚酐诸如基于癸二酸的聚(酸酐)聚合物，p-(羧基苯氧基)丙烷，或p-(羧基-苯氧基)己烷；聚酸酐亚胺，诸如基于掺入了氨基酸(即，通过二酰亚胺键经氨基末端氮而与癸二酸连接)诸如甘氨酸或丙氨酸的源于癸二酸的单体的聚合物聚酐聚合物；聚酸酐酯；聚偶磷氮，尤其是聚(偶磷氮)，其包含水解敏感酯基团，其能通过生成羧酸基团催化聚合物骨架的降解(Schacht等，(1996)BiotechnoL Bioeng.1996102)和聚酰胺诸如聚(乳酸-co-赖氨酸)。适用于制备微载体的多种非生物可降解材料也是已知的，其包括(但不限于)聚苯乙烯、聚乙烯、胶乳、金和铁磁性或顺磁性材料。固相微载体可以是共价修饰的以便掺入一个或多个用于连接ISS的部分，例如通过添加胺基团以便采用胺反应性交联剂进行共价连接。
ISS-微载体复合物可以是共价或非共价连接的。共价连接的ISS-MC复合物可以是直接连接的或通过一个或多个原子的交联部分(通常是交联剂的残基)连接。ISS可被修饰以便允许或增加与MC结合(例如，对于共价交联通过掺入游离巯基或对于疏水性结合通过添加疏水部分诸如脂质，类固醇，醇诸如胆固醇和萜烯)，虽然未修饰的ISS可用于通过静电作用或通过碱基配对(例如通过至少一个部分的ISS与结合于微载体的互补寡核苷酸的碱基配对)而形成非共价的ISS-MC复合物构型。
包含ISS的多核苷酸可被连接于固相微载体或其它化学材料从而易于采用本领域已知的常规技术形成ISS-MC复合物，所述常规技术诸如使用有效的异双功能交联剂(例如，琥伯酰亚胺4-(N-马来亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯或其硫代-衍生物，其用于将胺衍生的微载体和修饰的以便包含游离巯基的ISS连接)或通过加入化合物诸如胆固醇(例如，通过Godard等的方法，(1995)Eur.J Biochem.232404-410)以便易于与疏水性微载体诸如水包油乳液中的油珠结合。或者修饰的核苷或核苷酸，诸如本领域所已知的，可被掺入ISS的末端，或位于中间位置。这些可包括阻断的功能基团，其在被阻断时可与微载体或易于结合于微载体的部分上存在的或与之结合的多种功能基团发生反应。非共价连接的ISS-MC复合物的特定实施方案采用了结合对(binding pair)(例如，抗体和其同源抗原或生物素和抗生物素蛋白链菌素或抗生物素蛋白)，当结合对的一个组分与ISS结合时，且微载体由结合对的另一组分衍生(例如，生物素化ISS和抗生物素蛋白链菌素衍生的微载体可被联合以形成非共价连接的ISS-MC复合物)。
通过静电结合的非共价ISS-MC复合物通常利用了多核苷酸主链的高负电。由此，用于非共价结合的ISS-MC复合物的微载体通常在生理pH(例如，约pH6.8-7.4)下带正电。微载体可本质上带正电，但由正常不带正电的化合物制备的微载体可被衍生或被修饰而带正电。例如，用于制备微载体的聚合物可被衍生以便加入带正电的基团，诸如伯胺。或者，带正电的化合物可在制备期间被掺入微载体的制剂中(例如，在制备聚(乳糖)/聚(羧乙酸)共聚物期间使用带正电的表面活性剂使得所得微载体颗粒带正电)。
固相微球可通过本领域已知的技术进行制备。例如，其可通过乳剂-溶剂提取/蒸发技术进行制备。通常，在该技术中，将生物可降解的聚合物诸如聚酐、聚(烷基-α-氰丙烯酸酯)和聚(α-羟基酯)，例如，聚(乳酸)，聚(羧乙酸)，聚(D，L-乳酸-共-羧乙酸)和聚(己内酯)溶于适宜的有机溶剂中，诸如二氯甲烷以构成乳液的分散相(DP)。通过高速均质化为包含溶解的表面活性剂例如，聚乙烯醇(PVA)或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的过量水连续相(CP)而将DP乳化。CP中的表面活性剂是确保形成分散的和稳定大小乳滴。有机溶剂随后被萃取至CP中，然后通过升高系统温度进行蒸发干燥。然后通过离心或过滤分离固体微颗粒，然后干燥例如通过冻干或实施真空，然后保存于4℃。
一般地，为了制备阳离子微球，将阳离子脂质和聚合物，例如，1，2-二油酰氧丙基-1，2，3-三甲基溴化铵(DOTAP)、溴化十六烷基三甲基铵(CTAB)或聚赖氨酸加至DP或CP，根据其在这些相中溶解度。
可确定干燥微球的物理化学特性诸如平均大小、大小分布和表面电荷。例如通过动态光散射技术确定大小特性，通过检测ζ电位确定表面电荷。
一般地，包含ISS的多核苷酸通过ISS和颗粒的4℃水性孵育过夜而被吸附在阳离子微球上。在结合ISS前，可确定微球的大小和表面电荷特定。然后按本文所述评估所选批次的活性。
可在暴露于病毒之前、期间和/或之后施用包含ISS的多核苷酸。还可在感染病毒之前、期间和/或之后施用ISS多核苷酸。还可在病毒感染症状开始之前或之后施用ISS多核苷酸。由此，可根据暴露于病毒、病毒感染和/或病毒感染症状开始而在不同的时间施用包含ISS的多核苷酸。而且，可以由一个或多个施用。如果包含ISS的多核苷酸在多个时期进行施用，ISS可按临床医师选自的任何计划进行施用，诸如每日，每隔一日，每三日，每四日，每五日，每六日，每周，每两周，每月或以更长的时间间隔(其在治疗期间可以或不保持不变)。当实施多重施用时，包含ISS的多核苷酸可以以2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多分开的施用方式进行给药。一般地，但不是必须的，包含ISS的多核苷酸发挥作用需要至少约三日的间隔。
当包含ISS的多核苷酸被施用于具有暴露于病毒的危险(即，感染前)的个体时，包含ISS的多核苷酸优选在小于暴露于病毒前约14日，优选在小于暴露于病毒前约10日，更优选在小于暴露于病毒前约7日，更优选在小于暴露于病毒前约5日进行施用。在某些实施方案中，包含ISS的多核苷酸优选在暴露于病毒前约14日进行施用。
在另一实施方案中，包含ISS的多核苷酸在暴露于病毒后，而在出现症状前进行施用。如果暴露时间未知或可疑，则优选地，包含ISS的多核苷酸在小于暴露于病毒后约3，更优选在小于暴露于病毒后约1日、12小时、6小时或两小时进行施用。
在另一个实施方案中，包含ISS的多核苷酸在出现至少一种病毒感染症状后进行施用。例如，包含ISS的多核苷酸在出现病毒感染症状后约28、21、14、7、5或3日内进行施用。然而，某些表现出症状的感染的10名个体已经接受了一种或多种其它治疗的处理过程。在所述个体中，或在不能识别其症状出现的个体中，包含ISS的多核苷酸可在感染后的任何时间点进行施用。
此外，采用包含ISS的多核苷酸的治疗还可与其它治疗联合施用或作为“一线”治疗失败后的“二线”治疗。
ISS多核苷酸可被制成本领域已知的任何形式，诸如干粉、半固体或液体制剂。对于胃肠外施用，ISS多核苷酸优选以液体制剂进行施用(虽然固体或半固体制剂也是可接受的)，尤其是在ISS多核苷酸被制备成缓释depot形式时。ISS多核苷酸通常被制成液体或干粉形式用于局部施用，虽然有时也可用半固体制剂。
ISS多核苷酸制剂可包含其它组分诸如盐、缓冲液、填充剂、渗透剂、抗氧化剂、去污剂、表面活性剂和其它本领域已知的药学上可接受的赋形剂。一般地，液体ISS多核苷酸制剂在USP水中进行制备用于注射并且是无菌、等渗的且pH被缓冲至生理学上可接受的pH，诸如约pH6.8-7.5。
包含ISS的多核苷酸可被制成递送载体诸如脂质体、油/水乳剂或缓释depot制剂。所述形式的多核苷酸的制备方法是本领域众所周知的。
包含ISS的多核苷酸制剂还可包括或不包括免疫调节剂诸如佐剂和免疫刺激性细胞因子，其为本领域所众所周知。
适宜的剂量范围或有效量要能够提供症状的所需减少和/或病毒复制的抑制，且依赖于多种因素，包括特定呼吸病毒、多核苷酸的ISS序列，多核苷酸的分子量和施用途径。剂量通常由医师或其它保健专业人员根据多种本领域已知的参数，诸如症状的严重度，患者病史等来进行选择。一般地，对于约20个碱基的包含ISS的多核苷酸而言，剂量范围可选自，例如，独立选择的下限诸如约0.1、0.25、0.5、1、2、5、10、20、30、40、50、60、80、100、200、300、400或500g/mk直至独立选择的上限(大于下限)约60、80、100、200、300、400、500、750、1000、1500、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000或10,000μm/kg。例如，剂量可以大约是如下任何一种0.1-100μ/kg、0.1-50μm/kg、0.1-25μm/kg、0.1-10μm/kg、1-500μm/kg、100-400μm/kg、200-300μm/kg、1-100μm/kg、100-200μm/kg、300-400μm/kg、400-500μm/kg、500-1000μm/kg、500-5000μm/kg或500-10,000μm/kg。一般地，胃肠外的施用途径需要比直接应用于感染组织更高剂量的ISS，如同长度增加的包含ISS的多核苷酸一样。
包含ISS的多核苷酸可全身施用(例如，胃肠外)或局限的施用(例如，局部的)。
在一个实施方案中，包含ISS的多核苷酸经局部施用，诸如呼吸粘膜(诸如鼻道或肺)。鼻咽和肺的施用途径包括(但不限于)鼻内的、吸入的、经支气管的和经肺泡的途径。由此，包含ISS的多核苷酸可通过气雾剂、雾化液或粉末的吸入进行施用。适用于通过吸入包含ISS的组合物而进行施用的装置包括(但不限于)雾化器、喷雾器、蒸发器和压力定量气雾器。多种适用于吸入递送包含ISS的多核苷酸的装置中包括充以或采用包含制剂的容器的雾化器、喷雾器、蒸发器和压力定量气雾器，所述制剂含有包含ISS的多核苷酸。递送至呼吸粘膜的其它方法包括递送液体制剂，诸如通过滴鼻剂。
在其它实施方案中，包含ISS的多核苷酸经胃肠外进行施用。胃肠外施用途径包括(但不限于)经皮、经粘膜和直接注射。通过注射的胃肠外施用可以通过任何胃肠外的注射途径，包括(但不限于)静脉内(IV)、腹膜内(IP)、肌内(IM)、皮下(SC)和皮内(ID)途径。
经皮和经粘膜的施用可如下方法实施，例如通过载体(例如，二甲基亚砜，DMSO)的包裹，通过使用电脉冲(例如，离子电渗疗法)或其组合。可根据本发明可以采用用于经皮施用的多种装置。因为呼吸病毒感染呼吸道的细胞，故此将ISS多核苷酸递送至呼吸道(诸如吸入和鼻内递送(如上述))的途径被认为是非全身施用途径的局部施用途径，尽管通过所述途径的递送通常被认为是胃肠外的、全身的施用途径。
IV，IP，IM和ID施用可以是推注或输注施用。对于SC给药，施用可以通过推注、输注或可植入的装置，诸如可植入的微泵(例如，渗透或机械微泵)或缓释植入物进行。ISS多核苷酸缓可通过适于IV，IP，IM，ID或SC施用的缓释制剂进行递送。虽然与输注相似的递送可通过使用喷雾器实施，但通过吸入的施用优选以分散剂量(例如，经由压力定量吸入剂)实施。经由经皮和经粘膜途径的施用可以是连续的或脉冲的。
其它药物可用于本文所述方法和组合物的其它治疗剂包括利巴韦林(Ribapharm，Inc.)、乙型肝炎免疫球蛋白(静脉内Nabi-HB，NabiPharmaceuticals)、ZADAXINTM(胸腺素α1，SCV-07(SciClonePharmaceuticals)、Theradigm(Epimmune)、抗乙型肝炎超免疫产物(Cangene Corp)、RC-529(Corixa/RheinBiochem)、HYB2055(Hybridon)、ViroKine(人类抗病毒蛋白质，Genetrol，Inc.)、Levovirin(Ribapharm，Inc.)，白细胞介素-2(IL-2)、肿瘤坏死因子-α、白细胞介素1-β、白细胞介素-12(IL-12)、粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，多聚腺苷酸-多聚尿苷酸、胸腺素α、Ampligen(Hemispherx BioPharma)、PolyadenurTM(Poly APoly U RNA，Hemispherx BioPharms)、OragenTM(Hemispherx BioPharms)、乙型肝炎病毒(HBV)特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)(CellExSys，Inc.)、治疗性乙型肝炎疫苗(Epimmune)、PJ Hep B DNA预防性疫苗(Powderject Pharmaceuticals)、白细胞介素4、白细胞介素6、白细胞介素7、粒细胞集落刺激因子。
乙型肝炎表面抗原疫苗也可用于本文所述方法和组合物中。在一个实施方案中，将治疗或预防乙型肝炎病毒感染有效量的FTC和乙型肝炎抗原疫苗诸如表面抗原疫苗，联合或交替施用于宿主，任选地与其它治疗剂诸如干扰素联合。
可施用的其它疫苗包括Engerix-B(GlaxoSmithKline)、Recombivax HB(Merck)、乙型肝炎疫苗(Recombinant)、PJ HepB DNA治疗性疫苗(Powderject Pharmaceuticals)、Hepavax-Gene(DNA重组乙型肝炎疫苗，Berna Biotech group)、Gen H-B VaxTM(Chiron Corporation)、Hepatavax-B(Merck&Co.)、Hevac B(Pasteur)、KGC(Korea Green Cross)、TGP943TM(Takeda Chem，Japan)、GenHevacB(Pasteur，France)、Bio-Hep-BTM/Sci-B-VacTM(Bio-Technology General，Israel)、AG-3TM、HepageneTM、HepacareTM，(Medeva，UK，Evans UK)。
V.基因治疗本发明的另一发明是使用体内基因治疗方法将免疫调节剂与本发明的β-L-2’-脱氧核苷联合和/或交替递送，以不同的作用方式和/或协同作用来治疗HBV。基因治疗方法涉及将核酸(DNA，RNA和反义DNA和RNA)序列导入宿主诸如动物尤其是人中，以便增加免疫调节剂的表达，所述免疫调节剂操作性连于其由靶组织表达所需的启动子和/或任何其它遗传元件。所述基因治疗和递送技术和方法是本领域已知的，例如参见，WO90/11092，WO98/11779，美国专利序号5,693,622，5,705,151，5,580,859；Tabata H.等(1997)Cardiovasc.Res.35(3)470-479，Chao J等，(1997)Pharmacol.Res.35(6)517-522，Wolff J.A.(1997)Neuromuscul.Disord.7(5)314-318，Schwartz B.等，(1996)GeneTher.3(5)405-411，Tsurumi Y.等，(1996)Circulation94(12)3281-3290。
用于基因治疗方法中的多肽载体构建体优选是不整合至宿主基因组中也不包含能使其复制的序列的载体。本领域技术人员已知的任何强启动子均可被用于驱动DNA的表达。
多肽构建体可通过将可注射的物质递送至动物细胞(诸如注射至组织(心、肌肉、皮肤、肺、肝、肠等)的间隙中)的任何方法进行递送。多肽构建体可在药学上可接受的液体或水性载体中进行递送。
多肽构建体可被递送至动物内组织的间隙中，所述组织包括肌肉、皮肤、脑、肺、肝、脾、骨髓、胸腺、心、淋巴、血液、骨、软骨、胰腺、肾、胆囊、胃、肠、睾丸、卵巢、子宫直肠、神经系统、眼、腺体和结缔组织。组织的间隙包括细胞间液、器官组织的网状纤维周围的粘多糖基质、脉管或腔壁中的弹性纤维、纤维组织的胶原纤维或包被肌肉细胞的或在骨陷窝中的结缔组织中的相同基质。相似地，该间隙被循环血浆和淋巴隙的淋巴液占据。它们可方便地通过注射而被递送至包含这些细胞的组织中。虽然递送和表达可在未分化或较不完全分化的细胞诸如血液的干细胞或成纤维细胞中实现，但它们优选被递送至分化的、稳定表达的、不分裂的细胞中。
在本发明的另一实施方案中，遗传工程化以表达免疫调节剂的细胞经体内而施用于患者。所述细胞可获自患者或MHC相容性供体，且可包括(但不限于)成纤维细胞、骨髓细胞、血细胞(例如，淋巴细胞)、脂肪细胞、肌细胞、内皮细胞等。采用重组DNA技术对所述细胞在体外进行遗传工程化以便导入免疫调节剂的多肽编码序列，或可选地，通过转导(采用病毒载体，优选能将转基因导入细胞基因组中的载体)或转染步骤。包括但不限于，使用质粒、粘粒、YACs、裸DNA、电穿孔、脂质体等。免疫调节剂的编码序列可被置于强构成性或可诱导型启动子或启动子/增强子的控制下以实现免疫调节剂的表达，优选分泌。表达且优选分泌免疫调节剂的工程化细胞可经全身而被导入患者中，例如，导入循环或腹膜内。
或者，可将细胞并入基质中和植入体内，例如，遗传工程化的上皮细胞可作为淋巴性或脉管性移植物的部分而被植入。(例如参见，Anderson等，美国专利序号5,399,349；和Mulligan & Wilson，美国专利序号5,460,959)。
当要施用的细胞是非自体或非MHC相容性细胞时，其可采用防止宿主发展抗导入细胞的免疫反应的众所周知的方法进行施用。例如，所述细胞可被包裹的形式而被导入，虽然所述形式能直接与细胞外环境交换组分，但其能使导入的细胞不被宿主免疫系统识别。
可通过包含核酸、基因或其基因片段的感染性病毒颗粒进行转导以便表达免疫调节剂的真核细胞包括(但不限于)原代细胞，诸如原代有核血细胞，诸如白细胞、粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、淋巴细胞(包括T-淋巴细胞和B-淋巴细胞)，全能干细胞和肿瘤浸润淋巴细胞(TIL细胞)；骨髓细胞；内皮细胞；上皮细胞；角质形成细胞；干细胞；肝细胞包括肝细胞前体细胞；肝细胞包括肝细胞前体细胞；成纤维细胞；间充质细胞；间皮细胞和实质细胞。
在一个实施方案中，细胞可被靶向特异性位点，由此细胞在所述位点发挥治疗性功能。或者，细胞可以是未被靶向特异性位点的细胞，所述细胞发挥全身性治疗功能。
转导的细胞可被用于例如，通过导入宿主细胞治疗HBV，所述宿主细胞诸如是已从患者中取出并用培养扩增的血细胞，根据本发明的感染性病毒颗粒，其包含编码免疫调节剂的基因。所述细胞可在用包含所需基因的感染性病毒颗粒转导前或后进行大量扩增。由此，方法步骤以注射至患者中的所述方式进行实施，转化的细胞将在患者体内产生免疫调节剂。
由转导的细胞所携带的基因或核酸具体地包括免疫调节剂的序列，但还可包含能直接或间接增强细胞疗效的任何序列。由转导细胞携带的基因还可包括能使转导的细胞发挥其通常不具有的疗效的序列，诸如编码可用于治疗血友病的凝固因子的基因。所述基因可编码一种或多种具有疗效的产物。适宜基因或核酸的实例包括编码细胞因子诸如TNF、白细胞介素(白细胞介素1-14)、干扰素(.α，β，γ-干扰素)、T-细胞受体蛋白质和针对抗体诸如免疫球蛋白的抗原结合区的Fc受体的那些基因或核酸。适宜基因的其它实例包括修饰细胞以“靶向”体内那些细胞通常不“靶向”的位点的基因，由此能够在该所述位点使用细胞的治疗性特性。例如，血细胞诸如TIL细胞可例如，通过将单克隆抗体的Fab部分导入细胞中而被修饰，由此使所述细胞识别所需抗原。
通常但并非必须地采用已知为“载体(vector)”的载体将核酸递送至细胞。用于基因治疗的载体最常见类型是病毒。科学家之所以选择病毒是因为其具有进入细胞DNA的独特能力。在基因治疗中用作载体的病毒丧失遗传上的能力，其不能复制自身。大多数基因治疗临床术语依赖小鼠逆转录病毒来递送所需基因。可用作载体的其它病毒包括腺病毒、腺相关病毒、痘病毒和疱疹病毒。
例如，取出来自患者的细胞并在实验室中使其生长。将所述细胞暴露于携带所需基因的病毒。病毒进入细胞中，所需基因成为细胞DNA的一部分。将细胞在实验室中生长，然后将其返回患者中。这类基因治疗被称为体外的，即指“身体外”。在细胞处于患者体外时，将基因转化至患者细胞中。在其它研究中，载体或脂质体(脂肪颗粒)被用于将所需基因递送至患者体内的细胞中。这类基因治疗被称为体内的，因为基因被转化至患者体内的细胞中。
当病毒载体被用于将基因携带至体内时，其可能更多地改变预期细胞。另一危险是新基因可能被插入DNA的错误位置，这可能导致癌症或其它损伤。此外，当DNA被直接插入时，或当使用脂质体递送系统时，DNA有可能被导入生殖细胞，产生可遗传的改变。
其它关注的问题包括转化基因可“过表达”的可能性，这会产生有害量的缺失蛋白质；病毒载体可能导致炎症或免疫反应；以及病毒可能被从患者传递至其它个体或环境中。
现有技术中已知多种载体。本发明中可使用任何已知的载体。在本发明的优选实施方案中，载体可靶向具体的细胞类型以便进行具体的基因递送。
腺病毒载体任何腺病毒载体均可被用于转染细胞和/和细胞系以表达和/和分泌免疫调节剂。腺病毒是包含线性双链DNA基因组的无包膜病毒。目前存在超过40种血清型腺病毒株，其大多数在人类中会导致良性呼吸道感染，亚型C血清型2或5主要被用于载体。生存周期通常不包括整合至宿主基因组内，而作为宿主细胞核中的附加体元件进行复制，因此不存在插入诱变的危险。野生型腺病毒基因组大约为35kb，其中多达30kb可被外源DNA置换(Smith，1995，Venna和Somia，1997)。存在具有调节功能的四个早期转录单位(E1、E2、E3和E4)，和一个完全转录本，其编码结构蛋白质。祖载体可具有失活的E1或E3基因，和由辅助病毒、质粒反向提供的或整合至辅助细胞基因组的缺少的基因(人类胎儿肾细胞，293系，Graham，F.L.，Smiley，J.，Russell，W.L.和Nairn，R.(1997).General Virology 3659-72.)。第二代载体还采用了E2a温度敏感突变体(Engelhardt，J.F.，Litsky，L.，和Wilson，J.M.(1994).Human Gene Therapy 51217-1229.)或E4缺失(Armentano，D.，Zabner，J.，等，(1997).Journal of Virology712408-2416.)。最近的“gutless”载体仅包含末端反向重复序列(ITRs)和围绕转基因的包装序列，所有必需病毒基因由辅助病毒反向提供(Chen，H.，Mack，L.M.，Kelly，R.，等，(1997).Proceedings ofthe National Academy of Sciences of the U.S.A.941645-1650.)。
腺病毒载体在体外和体内转导靶细胞方面非常有效，且可以高滴度制备(＞1011/mL)。除Geddes，B.J.，Harding，T.C.，Lightman，S.L.和Uney，J.B.(1997).Nature Medicine 31402-1404.)外，其显示了采用E1缺失载体在大鼠脑内转基因表达延长，由祖载体的体内转基因表达倾向于是瞬时的(Verma，I.M.和Somia，N.(1997).基因治疗-确信、问题和前途。Nature 389239-242.).静脉内注射后，90％的施用载体经由非免疫介导的机制在肝中降解(Worgall，S.，Wolff，G.，Falck-Pedersen，E.和Crystal R.G.(1997).Human Gene Therapy837-44.)。其后，出现I型MHC限制性免疫反应，采用CD8+CTLs来清除病毒感染的细胞并采用CD4+细胞来分泌IFN-α，其能导致抗腺病毒抗体(Yang，Y.and Wilson，J.M.(1995).Journal of Immmunology1552564-2569.)。腺病毒载体的改变可除去某些CTL表位，但是所述表位识别不同的宿主MHC单倍体(Sparer，T.E.，Wynn，S.G.，Clark等，(1997).Journal ofVirology 712277-2284.Jooss，K.，Ertl，H.C.J.和Wilson，J.M.(1998).Journal of Virology 722945-2954.)。这些细胞中未被破坏的剩余载体具有其失活的启动子(Armentano，D.，Zabner，J.，等，(1997).Journal of Virology 712408-2416.)且存留的抗体妨碍随后施用载体。
包括瞬时免疫抑制治疗的避免免疫反应的方法在延长转基因表达和实现第二基因转化的方面已经取得成功(Jooss，K.，Yang，Y.和Wilson，J.M.(1996).Human.Gene Therapy 71555-1566.Kay，M.A.，Meuse，L.，等，(1997).Proceedings of the National Academy ofSciencesof the U.S.A.944686-4691)。干预较少的方法已经通过对宿主饲以UV灭活的载体而诱导口服耐受性(Kagami，H.，Atkinson，J.C.，等，(1998).Human Gene Therapy 9305-313.)。然而，需要对载体而非宿主进行操作。虽然仅使用复制缺陷型载体，被呈递于免疫系统的病毒蛋白质的表达水平非常低。包含较少基因(终极是不包含表达编码序列的“gutless”载体)的载体的发展已经导致了肝组织内转基因体内表达的延长(Schiedner，G.，Morral，N.，等，(1998).Nature Genetics18180-183.)被包装于腺病毒蛋白质中的大量DNA(其大多少将被降解并被呈递于免疫系统)的开始递送仍会导致临床试验的问题。此外，人群在MHC单倍型方面是异质的且一定比例的人群已经暴露于腺病毒菌株(Gahry-Sdard，H.，Molinier-Frenkel，V.，等，(1997).Journalof Clinical Investigation 1002218-2226)。
至今，对腺病毒靶向宿主细胞的机制了解甚少。因此，仅可能通过使用细胞系启动子/增强子例如肌球蛋白轻链1启动子(Shi，Q.，Wang，Y.和Worton，R.(1997).Human Gene Therapy 8403-410.)和平滑肌细胞SM22a启动子(Kim，S.，Lin，H.，等，(1997).Journalof Clinical Investigation 1001006-1014.)，或通过直接递送至局部区域(Rome，J.J.，Shayani，V.，等，(1994).Human Gene Therapy51249-1258.)来实现组织特异性表达。腺病毒颗粒的摄取已被显示出具有两个阶段过程，包括腺病毒内纤维外壳蛋白与细胞系受体或多个受体(包括I类MHC分子)的起始相互作用(Hong，S.S.，Karayan，L.，等，(1997).EMBO Journal 162294-2306.)和柯萨奇病毒-腺病毒受体(Bergelson，J.M.，Cunningham J.A.，等，(1997).Science2751320-1323.)。腺病毒颗粒的五邻体基质蛋白然后与细胞表面的异二聚体的整合素家族结合(Wickham，T.J.，Mathias，P.，等，(1993).Cell 73309-319.)，借助受体介导的细胞内摄作用使其内化。大多数细胞表达腺病毒纤维外壳蛋白的主要受体，然后内化更具选择性(Harris，J.D.和Lemoine，N.R.(1996).Trends in Genetics12400-404.)增加病毒摄取的方法包括刺激靶细胞表达适宜的整合素(Davison，E.，Diaz，R.M.，等，(1997).Journal of Virology716204-6207.)和将特异性针对靶细胞类型抗体与腺病毒结合(Wickham，T.J.，Lee，G.M，等，(1997b).Journal of Virology717663-7669.Goldman，C.K.，Rogers，B.E.，等，(1997).CancerResearch 571447-1451.)。但是使用抗体增加了载体的制备难度和激活补体系统的潜在危险。通过将受体结合模体掺入纤维外壳蛋白中，Wiclcham等，(Wickham，T.J.，Tzeng，E.，等，(1997a).JournalofVirology 718221-8229.)改变了病毒使其结合由损伤内皮或平滑肌细胞表达的整合素，或由多种细胞类型表达的硫酸肝素。
任何腺相关病毒载体均可被用于转染细胞和/和细胞系以表达和/和分泌免疫调节剂。腺相关病毒(AAV)是非病原性人类细小病毒，依赖辅助病毒，通常是腺病毒进行增殖。其能感染分裂或未分裂的细胞，并在缺失辅助细胞时，以高频整合至宿主基因组的特定位点(19q13-qter)(Kotin，R.M.，Siniscalco，M.，等，(1990).Proceedingsof the National Academy of Sciences of the U.S.A.872211-2215.)野生型基因组时单链DNA分子，由两个基因组成rep，其编码控制病毒复制、结构基因表达和整合至宿主基因组的蛋白质，和cap，其编码衣壳结构蛋白质。在基因组的每一端是145bp末端重复序列(TR)，其包含启动子。
当被用作载体时，rep和cap基因被转基因和其相关调节序列取代。插入部分的全长最大不能超过4.7kb，即野生型基因组的长度(Smith，A.E.(1995).Annual Review of Microbiology 49807-838.)制备重组载体需要反向提供的rep和cap，以及辅助表达基因产物(来自腺病毒基因组的Ela、Elb、E2a、E4和VA RNA)。常规方法是用两个质粒共转染(一个用于载体而另一个用于rep和cap)至感染了腺病毒的293细胞中(Samulski，R.J.，Chang，L.，和Shenk，T.(1989).Journal of Virology 633822-3828.)。然而，该方法繁琐，产率低(＜104颗粒/ml)且易于被腺病毒和野生型AAV污染。低产率的一个原因是rep基因产物对腺病毒复制的抑制作用(Vincent，K.A，Piraino，S.T.和Wadsworth，S.C.(1997).Journal of Virology 711897-1905.)。更为近来的方法除去所有腺病毒结构基因并使用rep抗性质粒(Xiao，X.，Li，J.和Samulski，R.J.(1998)Journal of Virology 722224-2232.)或将rep表达质粒与成熟病毒在感染前结合(Fisher，K.J.，Kelley，W.M，Burda，J.F.和Wilson，J.M.(1996)Human Gene Therapy72079-2087.)。
在缺少rep的情况下，末端重复序列一旦被轻微降解，AAV载体仅能进行随机整合，作为单个原病毒或朝向尾多联体(Rutledge，E.A.和Russell，D.W.(1997).Journal of Virology 718429-8436.)。对AAV载体产生兴趣是由于其能整合至宿主基因组，使得转基因病毒延长。已经报道了基因转化至上皮细胞(Maeda，Y.，Ikeda，U.，等，(1997).Cardiovascular Research 35514-521.)，横纹肌(Fisher，K.J.，Jooss，K.，等，(1997).Nature Medicine 3306-316.Herzog，R.W.，等，(1997).Proceedings of the National Academy of Sciencesof the U.S.A.945804-5809.)和肝细胞(Snyder，R.O.，Miao，C.H.，等，(1997).Nature Genetics 16270-275.)，当转基因不是来源于不同物种是表达延长。针对AAV衣壳的中和抗体是可检测的，但不会妨碍载体的再施用或关闭启动子活性。由于病毒衣壳的简单性，故可以使免疫反应沉默。因为AAV抗体存在于人群中，对上述内容需要进一步的检测。尚没有定位载体递送以外的靶向特定细胞类型的尝试。
具体而言，可以使用美国专利序号5,693,531(由此将其引入作为参考)中公开的腺相关载体，包括AAVp5neo；pSV-β-半乳糖苷酶；TRF169；LZ11；pSP72；pSP72nLacZ；pAdRSV4；pAdRSVnLacZ；AAVmLac；SV40；BluescriptSK；pSV40ori AAV1和pKMTll。
逆转录病毒载体任何逆转录病毒载体均可被用于转染细胞和/和细胞系以表达和/和分泌免疫调节剂。逆转录表达是一类包含单链RNA分子作为基因组的有包膜病毒。感染后，病毒基因组被反转录为双链DNA，其整合至宿主基因组并表达蛋白质。病毒基因组大约是10kb，包含至少三个基因gag(编码核心蛋白)，pol(编码反转录酶)和env(编码病毒包膜蛋白)。在基因组的各末端是长末端重复序列(LTRs)，其包括启动子/增强子区和整合所涉及的序列。此外，还有包装病毒DNA(psi)和env基因中RNA剪接位点所需的序列。某些逆转录病毒包含原癌基因，其在突变时能导致癌症，然而，其在载体制备时被除去。逆转录病毒还可通过整合至邻近细胞性原癌基因，驱动从LTR的不适当的表达，或通过断裂肿瘤抑制基因而转化细胞。该事件(成为插入诱变)虽然极为罕见，但在逆转录病毒作为载体使用是仍可能发生。
逆转录病毒载体最通常基于莫洛尼鼠白血病病毒(Mo-MLV)，其是一种双向病毒，其能够感染小鼠(可使载体在小鼠模型中发展)和人类细胞(可以进行人类的治疗)。病毒基因(gag、pol和env)被兴趣转基因取代并在包装细胞系中的质粒上表达。因为非必需基因缺少包装序列(psi)，其未被包含于病毒体颗粒中。为了防止会导致能够复制的逆转录病毒的重组，应除去所有与载体骨架同源的区域且非必需基因应由至少两个转录单位进行表达(Markowitz，D.，Goff，S.和Bank，A.(1988).基因转化的安全包装路线将病毒基因分置于两个不同的质粒上。Journal of Virology 621120-1124.)。即便如此，确实仍会出现低频率的能够复制的逆转录病毒。
必需区域包括5′和3′LTRs，和5′LTR下游的包装序列。转基因病毒可由5′LTR中的启动子/增强子区，或由可选的病毒(例如巨细胞病毒，劳斯肉瘤病毒)或细胞性(例如βactin，酪氨酸)启动子来驱动。突变分析显示出可除去直至完整gag编码序列和紧接上游区而不会影响病毒包装或转基因表达(Kim，S.H.，Yu，S.S.，等，(1998).Journal of Virology 72994-1004.)。但是，转基因起始密码子的准确定位和5′LTR的少许改变会影响转基因的表达(Rivire，I.，Brose，K.和Mulligan，R.C.(1995).Proceedings of theNational Academy ofSciences of the U.S.A.926733-6737.)。为了辅助鉴别转化细胞，可将选择性标记，诸如新霉素和β半乳糖苷酶包含其中且转基因表达可通过添加内部核糖体位点而被改善(Saleh，M.(1997).Human GeneTherapy 8979-983.)。逆转录病毒载体的可用的携带能力大约为7.5kb(Verma，I.M.和Somia，N.(1997).Nature 389239-242.)，即使采用cDNA，其对于某些基因来说还是太小了。
逆转录病毒包膜与特异性细胞性蛋白质相互作用以确定靶细胞范围。改变env基因或其产物已证实了操作细胞范围的成功方法。方法已包括包膜蛋白和细胞性受体间结合位点的直接修饰，但是这些方法倾向于妨碍病毒颗粒的随后内化(Harris，J.D.和Lemoine，N.R.(1996).Trends in Genetics 12400-404.)。通过用来自红细胞生成素蛋白质(EPO)的150密码子取代env基因的部分，Kasahara等(Kasahara，N.，Dozy，A.M.和Kan，Y.W.(1994).Science 2661374-1376.)使具有高亲和力的带有靶EPO受体的细胞成为可能。将一种抗体经由抗生物素蛋白链菌素桥接与具有对第二细胞特异性抗体高亲和力的病毒颗粒结合，改善了病毒的摄取，但内化倾向于导致病毒降解(Roux，P.，Jeanteur，P.，和Piechaczyk，M.(1989).Proceedings of the NationalAacademy of Sciences USA 869079-9083.).Neda等，(Neda，H.，Wu，C.H.，和Wu.G.Y.(1991)The Journal of Biological Chemistry26614143-14146.)用乳糖处理病毒颗粒，其导致被细胞主要是肝细胞(表达亚洲糖蛋白受体)摄取。随后，出现有效的病毒转基因表达，这可能是由于核内体的酸化使得病毒包膜与核内体膜融合。
病毒在其向性上不同，因此通过已知为假型化的技术，用另一病毒的env基因取代env基因，可扩展宿主谱。水泡性口膜炎病毒G蛋白已被包括在Mo-MLV来源的载体内(Burns，J.C.，Matsubara，T.，等，(1994).Developmental Biology 165285-289.)，其在通过超速离心纯化时也是较为稳定的。近来，Qing(Qing，K.，Bachelot，T.，Mukherjee，P.，等，(1997).Journal of Virology 715663-5667.)通过首先用表达针对逆转录病毒包膜蛋白质的细胞性受体的腺相关载体(如下述)处理受者细胞而改进了多种细胞系中的转导。
逆转录病毒整合和病毒基因的表达需要靶细胞应为分裂的。这限制了对增殖性细胞的体内或体外的基因治疗，由此要从体内取出细胞，进行处理以刺激复制然后用逆转录病毒载体转导，随后将其返回患者。体外细胞可被更有效的转化，这是由于其暴露于较高的病毒滴度和生长因子中(Glimm，H.，Kiem，H.P.，等，(1997).Human GeneTherapy 82079-2086.)，此外，体外处理的肿瘤细胞应与肿瘤质量相关，并可引导肿瘤破坏性作用(Oldfield，E.H.和Ram，Z.(1995).HumanGene Therapy 655-85.；Abdel-Wahab，Z.，Weltz，C.，等，(1997).Cancer 80401-412.)。
慢病毒是逆转录病毒的亚类，其能感染增殖性和非增殖性细胞。其比简单逆转录病毒复杂的多，其包含其它六种蛋白质，tat、rev、vpr、vpu、nef和vif。当前的包装细胞系具有用于假型env基因、转基因构建体和包装构建体的分离的质粒，以提供反向的结构和调节基因(Naldini，L.，Blmer，U.，等，(1996).Science 272263-267.)。采用标记基因的早期结果已得到证实，其显示出在肌肉、肝和神经组织中体内表达延长(Blmer，U.，Naldini，L.，等，(1997).Journal of Virology716641-6649.；Miyoshi，H.，Takahashi，M.，Gage，F.H.和Venna，I.M.(1997).Proceedings of the National Academy of scietices of theU.S.A.9410319-10323.；Kafri，T.，Blmer，U.，等，(1997).NatureGenetics 17314-317)。令人感兴趣地是，转基因由内部工程化的巨细胞病毒启动子所驱动，这与在MoMLV载体中时不同，其未被灭活。这可能是由于对载体注射的免疫反应有限，其在量上等于盐水对照(Blmer，U.，Naldini，L.，Kafri，T.，Trono，D.，Verma，1.M.和Gage，F.H.(1997).Journal of Virology 716641-6649)。
所使用的慢病毒来自人类免疫缺陷病毒(HIV)并正在评估其安全性，为了除去某些非必需调节基因。Vpr和vif的突变体能以减少的效能感染神经元，但不能感染肌肉或肝细胞(Blmer，U.，Naldini，L.，Kafri，T.，Trono，D.，Verma，1.M.和Gage，F.H.(1997).JournalofVirology 716641-6649；Kafri，T.，Blmer，U.，等，(1997).NatureGenetics 17314-317.)。
在特定实施方案中，使用逆转录病毒载体pLXIN、pSIR、pLXSH、pLNCX、pLAPSN、pFB和pFB-Neo。
单纯疱疹病毒载体任何单纯疱疹病毒载体均可用于转染细胞和/或细胞系以表达和/或分泌免疫调节剂。1型单纯疱疹病毒(HSV-1)是人嗜神经病毒，由此兴趣主要集中在将HSV-1用作载体用于基因转化至神经系统。野生型HSV-1病毒能感染神经元，且使其进入溶解生存周期或作为核内附加体而保持潜伏期状态。潜伏期感染的神经元的功能正常，并不被免疫系统排斥。虽然潜伏期病毒几乎是转录沉默的，其确实具有那个在潜伏期期间发挥作用的神经元特异性启动子。针对HSV-1的抗体在人群中是常见的，但是由于疱疹感染引起的并发症诸如脑炎非常罕见。
病毒基因组是152kb的线性双链DNA分子。其存在两个唯一的区域，长和短(称为UL和US)，其可以内部重复序列(IRL和IRS)的任意方向进行连接。在唯一区域的非接头端是末端重复序列(TRL和TRS)。存在高达81个基因(Marconi，P.，Krisky，D.，等，(1996).Proceedings of the National Academy of Sciences UNA 9311319-11320.)，其大约一半对在细胞培养物中的生长是不必需的。这些非必需区一经被删除，40-50kb的外源DNA可进入病毒中(Glorioso，J.C.，DeLuca，N.A.和Fink，D.J(1995).Annual Review of Microbiology49675-710.)。已经鉴别了HSV-1基因的三个主要类型，即极早期(IE或α)基因，早期(E或β)基因和晚期(L或γ)基因。
转染易感细胞后，通过基因转录的暂时协调性序列来调节裂解性复制。Vmw65(皮层结构蛋白质)激活极早期基因(IPO、ICP4、ICP22、ICP27和ICP477)，极早期基因是使产生早期基因的转移活化因子。早期基因表面核苷酸代谢和DNA复制的基因。晚期基因被早期基因活化并编码结构蛋白质。整个周期在小于10小时内发生，并常常导致细胞死亡。
导致潜伏期建立的分子事件尚未被完全确定。潜伏期间基因表达由位于基因组中IRL区域内的潜伏期相关转录本(LATs)所驱动。两种LATs(2.0和1.5kb)以与IC基因ICP0相反的反向进行转录。LATs在HSV-1从潜伏期至再活化(Steiner，I.，Spivack，J.G.，等，(1989).EMBO Journal 8505-511.)和潜伏期建立(Sawtell，N.M.和Thompson，R.L.(1992).Journal of Virology 662157-2169.)中发挥作用。已经鉴定了能够驱动LATs表达的两种潜在活性启动子(Marconi，P.，Krisky，D.，等，(1996).Proceedings of the NationalAcademy of Sciences USA 9311319-11320.)并被证实可用于载体转基因表达。
两种基础途径已被用于制备HSV-1载体，即扩增子和重组HSV-1病毒。扩增子是细菌产生的质粒，其包含col EI ori(大肠杆菌复制起点)，OriS(HSV-1复制起点)，HSV-1包装序列，在极早期启动子控制下的转基因和可选择的标记(Federoff，H.J.，Geschwind，M.D.，Geller，A.I.和Kessler，J.A.(1992).Proceedings of the National Academyof Sciences USA 891636-1640.)。将扩增子转染至包含辅助病毒(温度敏感突变体)的细胞系中，所述辅助病毒可反向提供所有缺少的结构和调节基因。辅助病毒和包含病毒颗粒的扩增子均被递送至受者。更为近期的扩增子包括Epstein-Barr病毒来源的序列而用于附加体质粒维持(Wang，S.and Vos，J.(1996).Journal ofVirology 708422-8430.)。
通过缺失一个极早期基因例如ICP4(其被反向提供)可使重组病毒具有复制缺陷性。虽然其病原性较低且可引导脑组织转的转基因表达，其具有对培养物中神经元的毒性(Marconi，P.，Krisky，D.，等，(1996).Proceedings of the National Academy of Sciences USA9311319-11320.)。大量极早期基因的缺失基本上降低了细胞毒性且还可使在野生型潜伏期病毒中沉默的启动子开始表达。这些启动子可用于引导长期的基因表达。
条件复制性突变体仅能在特定细胞系中复制。允许细胞系具有全部增殖性并为病毒缺陷的补体提供细胞性酶。突变体包括胸苷激酶(During，M.J.，Naegele，J.R.，OMalley，K.L.和Geller，A.1.(1994).Science 2661399-1403.)，核糖核酸酶还原酶(Kramm，C.M.，Chase，M.，等，(1997).Human Gene Therapy 82057-2068.)、UTPase或神经毒力因子g34.5(Kesari，S.，Randazzo，B.P.，等，(1995).LaboratoryInvestigation 73636-648.)。
非病毒载体病毒载体均会诱导某种程度的免疫反应，且具有安全风险(诸如插入诱变和毒性问题)。而且，其能力是有效的，很难实现大规模生产。因此，在本发明的一个实施方案中，采用了基因转化的非病毒方法，其仅需少量的蛋白质，具有事实上的无限能力，不具有感染性或诱变性能力且采用药学技术可实现大规模的生产。非病毒DNA转化的方法有三种，即裸DNA，脂质体和分子结合物。
裸核酸裸DNA或核酸可被用于将免疫调节剂递送至宿主。例如，质粒形式被确信可直接注射至肌肉细胞中(Wolff，J.A.，Malone，R.W.，Williams，P.，Chong，W.，Acsadi，G.，Jani，A.和Felgner P.L.(1990).Science 2471465-1468.)或与被轰击至组织中的金颗粒结合(Cheng，L.，Ziegelhoffer，P.R.和Yang，N.S.(1993).Proceedingsof the NationalAcademy of Sciences of the U.S.A.904455-4459.).
术语“裸”核酸、DNA或RNA是指不含任何发挥辅助、促进或易于进入细胞中作用的递送载体的序列，包括病毒序列、病毒颗粒、脂质体制剂、lipofectin或沉淀剂等。虽然不是非常有效，其可延长体内低水平的表达。与其它基因治疗技术不同，将裸核酸序列导入靶细胞的一个主要优势是细胞中免疫调节剂合成的瞬时特性。研究表明非复制性DNA序列可被导入细胞中以提供所需免疫调节剂在直至6个月的时期内的产生。该方法的简易性和持续的表达已导致DNA疫苗的发展。与常规减毒的和基于蛋白质的疫苗相比，它们不会受预存免疫例如由于母体抗体的影响，相对价廉，并可在单个质粒上递送大量病原体抗原(Manickan，E.，Karem，K.L.，和Rouse，B.T.(1997).C riticalReviews in Immunology 17139-154.)。DNA疫苗正被发展用于那些无现有疫苗例如HIV(Lekutis，C.，Shiver，J.W.，Liu，M.A.，和Letvin，L.N.(1997).The Journal of Immunology 1584471-4477.)或现有疫苗效果不充分，例如流感的情况(Maclclin，M.D.，McCabe，D.，等，(1998).Journal of Virology 721491-1496.)。通过使用高度保守的基因Ulmer等(Ulmer，J.B.，Donnelly，J.J.，等，(1993).Science2541745-1749.)能够免疫小鼠抵抗两种血清学上不同的流感病毒株。然而在大多数情况下，DNA疫苗未显示出优于现有疫苗(Macklin，M.D.，McCabe，D.，等，(1998).Journal of Virology 721491-1496.).免疫反应的实际类型可通过编码适宜的细胞因子的共转化进行控制(Xiang，Z.和Ertl，H.C.(1995).Immunity 2129-135.)且该方法被证实可用于更改不适当的免疫反应(Manickan，E.，Karem，K.L.，和Rouse，B.T.(1997).Critical Reviews in Immunology 17139-154.)。裸DNA的其它用途包括癌症免疫强化作用(如下述，Corr.M.，Tighe，H.，Lee.D.，Dudler，J.，等，(1997).The Journal of LaboratoryInvestigation 1594999-5004.)，胰腺胰岛素功能的修复(Goldfine.I.D.，German，M.S.，Tseng，H.，等，(1997).Nature Biotechnology151378-1382.)和刺激侧支血管发生(Takeshita，S.，Tsurumi，Y.，等，(1996).Laboratory Investigation 75487-501.)。肌肉组织中基因产物的表达可被胶原酶，罂粟碱和缺血状态的共施用改善(Budker，V.，Zhang，G.，Danko，I.，Williams，P.和Wolff，J.(1998).GeneTherapy 5272-276.)。肌肉特异性启动子(Skarli，M.，Kiri，A.，等，(1998).Gene Therapy 5514-520.)和其它基因内调节序列，诸如聚A和转录终止序列(Hartikka，J.，Sawdey，M.，等，(1996).HumanGene Therapy 71205-1217.)也能改善转基因表达。
对于裸多肽注射剂而言，有效剂量的DNA或RNA的范围是约0.05g/kg体重至约50mg/kg体重。优选地，剂量是约0.005mg/kg至约20mg/kg，而更优选地是约0.05mg/kg至约5mg/kg。当然，本领域技术人员应能理解，该剂量将根据注射的组织位点而改变。本领域技术然员可很容易地确定适宜且有效剂量的核酸序列，且要依赖于要治疗的病症和施用途径。施用途径是通过胃肠外途径的注射至组织间隙中，或还可使用其它胃肠外途径，诸如气雾制剂的吸入，尤其是用于递送至肺或支气管组织，喉管或鼻粘膜。此外，裸多肽构建体可在血管成形期间通过方法至使用的导管而被递送至动脉中。
免疫调节剂还可在脂质体制剂至进行递送(诸如Felgner P.L.等所教导的，(1995)Ann.NY Acad.Sci.772126-139和AbdallahB.等，(1995)Biol.Cell 85(1)1-7)，所述脂质体制剂可通过本领域技术人员众所周知的方法进行制备。脂质体是俘获水性液体部分的脂质双层。DNA将自发地与阳离子脂质体的外层表面结合(通过其电特性)且这些脂质体将与细胞膜发生相互作用(Felgner，J.H.，Kumar，R.，等，(1994).Journal of Biological Chemistry 2692550-2561.)。在体外，高达90％的特定细胞系可被转染。通过在阳离子脂质体中包括少量的阴离子液体，DNA可被掺入脂质体的内部表面中，由此保护其不受酶降解。(Crespo等，1996，引用于Alio，S.F.(1997).BiochemicalPharmacology 549-13)。为了促进作为核内体摄取至细胞内，靶向蛋白质已被包含于脂质体至，例如抗MHC抗体(Wang，C.，和Huang，L.(1987).Proceedings of the National Academy of Sciences USA847851-7855.)，转铁蛋白(Stavridis，J.C.，Deliconstantinos，G.，等，(1986).Experimental Cell Research 164568-572.)，和仙台病毒或其F蛋白质(Dzau，J.V.，Mann，M.J，Morishita，R.和Kaneda，Y.(1996).Proceedings of the National Academy of Sciences USA9311421-11425.)仙台病毒另外能使质粒DNA避免被核内体带至细胞质内，由此避免被降解。包含DNA结合蛋白质(28kDa高迁移率组1蛋白质)可通过将质粒带至细胞核内而增强转录(Dzau等，1997AmJ Cardiol.1997 Nov 6；80(9A)33I-39I)。
分子缀合物由DNA结合剂已经结合其上的蛋白质或合成配体组成。对细胞的递送可通过采用与脂质体相似的技术尽心改善。靶向蛋白质包括无唾液酸糖蛋白(Wagner，E.，Cotten，M.，Foisner，R.和Birnstiel，M.L.(1991).Proceedings of the National Acadeniy ofScieyaces USA 884255-4259.)，转铁蛋白(Wu，C.H.，Wilson，J.M.和Wu.，G.Y.(1989).Journal of Biological Chemistry.26416985-16987.)，多聚IgA(Ferkol，T.，Kaetzel，C.S.和Davis，P.B.(1993).Journal of Clinical Investigation 922394-2400.)和腺病毒(Madon，J.和Blum，H.E.(1996).Hepatology 24474-481.)。转基因表达倾向于瞬时，且受到核内体/溶酶体降解的限制。
VI.药学组合物患有任何本文所述疾病(包括乙型肝炎)的人可以如下治疗在药学可接受的载体或稀释剂存在下，给予所述患者有效量的β-2’-脱氧-β-L-赤-呋喃戊糖基核苷，例如β-L-2’-脱氧腺苷、β-L-2’-脱氧胞苷、β-L-2’-脱氧尿苷、β-L-2’-脱氧鸟苷或β-L-2’-脱氧胸苷或其药学上可接受的前药或盐。可以通过任何合适途径给予液体或固体形式的所述活性物质，例如口服给药、胃肠外给药、静脉内给药、皮内给药、皮下给药或局部给药。
将所述活性化合物包括在药学可接受的载体或稀释剂中，其量足以传递给患者治疗有效量的化合物以在体内抑制病毒复制，同时在受治疗患者体内不引起严重毒性效应。“抑制量”指根据例如测定例如本文所述测定测量，足以显示抑制作用的活性成分的量。
所述化合物针对所有上述疾病的优选剂量将在下面范围内约1到50mg/kg体重/日，优选1到20mg/kg体重/日，更一般是0.1到约100mg/kg接受者体重/日。药学上可接受的前药的有效剂量范围可以根据要传递的母体核苷的重量计算。假如所述前药本身表现活性，则可以如上使用所述前药的重量或通过本领域内技术人员已知的其它方法估计有效剂量。
所述化合物最好以单位任何合适的剂型给予，包括但不限于每单位剂型内含7到3000mg，优选70到1400mg活性成分。通常口服剂量50-1000mg是方便的。
理想状态下，应该给予所述活性成分，使得所述活性成分的峰血浆浓度达到从约0.2到70μM，优选约1.0到10μM。这可以如下完成例如，静脉内注射所述活性成分的0.1到5％溶液(可任选地在盐水中)，或将所述活性成分以大剂量(bolus)给予。
所述药物组合物中活性化合物的浓度将依赖于药物的吸收、失活和排泄率以及其它本领域技术人员已知的其它因素。应当注意的是剂量值还会随着要缓解的病症的严重度而变化。还应理解，对于任何特定个体而言，具体的剂量方案和计划应根据个体需要和实施或指导实施组合物的人员的专业判断而随时间进行调整，并且本文所述浓度范围仅是举例，而并不是要限制所要求保护的组合物的范围或实施。所述活性成分可以一次性给予，或者可以分成更小剂量以不同时间间隔给予。
所述活性化合物的优选给药模式是口服。口服组合物一般将包括惰性稀释剂或可食用载体。可以将它们包裹在明胶胶囊中，或者压制成片剂。在口服给予治疗时，所述活性化合物中可以加入赋形剂并以片剂、锭剂或胶囊剂的形式应用。可以包括药学上可配伍的结合剂和/或辅助剂物质作为所述组合物的组成部分。
片剂、丸剂、胶囊剂、锭剂等可以包含任何下面成分或性质相似的化合物粘合剂，例如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂，如淀粉或乳糖、崩解剂，如褐藻酸、Primogel或玉米淀粉；润滑剂，如硬脂酸镁或Sterotes；助流剂，如二氧化硅；甜味剂，如蔗糖或糖精；或矫味剂，如薄荷油、水杨酸甲酯或橙矫味剂(orange flavoring)。当所述剂型是胶囊剂时，除上述类型的物质外，它还可以包含液体载体如脂肪油。此外，剂量单位型可以包含改变所述剂量单位物理形式的各种其它物质，例如糖、虫胶或其它肠包衣物质。
所述化合物可以作为酏剂、悬浮液、糖浆剂、糯米纸囊剂、咀嚼胶等的成分给予。除所述活性化合物外，糖浆剂可以包含蔗糖作为甜味剂，并包含某些防腐剂、染料和颜料和矫味剂。
所述化合物或其药学上可接受的衍生物或盐也可以与其它不削弱所需作用的活性物质混合，或与补充所需作用的物质混合，所述物质例如抗生素、抗真菌剂、消炎药、蛋白酶抑制剂或其它核苷或非核苷抗病毒剂。用于胃肠外、皮内、皮下或局部应用的溶液或悬浮液可以包括下面成分无菌稀释剂如注射用水、盐水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗菌剂例如苄醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂如乙二胺四乙酸；缓冲剂如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐以及用于调节张力的试剂如氯化钠或葡萄糖。所述胃肠外制剂可以封装在玻璃或塑料安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。
假如静脉内给药，则优选载体是生理盐水或磷酸盐缓冲溶液(PBS)。
在优选实施方案中，所述活性化合物与保护所述化合物免受体内快速清除的载体共同制备，例如控释制剂，包括植入物和微囊传递系统。可以使用生物可降解并且生物可配伍的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乙酸。制备所述制剂的方法是本领域内技术人员众所周知的。也可以从Alza Corporation商业化获得所述物质。
脂质体悬浮液(包括用针对病毒抗原的单克隆抗体靶向感染细胞的脂质体)也优选作为药学上可接受的载体。可以根据本领域内技术人员众所周知的方法制备这些悬浮液，所述方法例如在美国专利序号4,522,811中描述。例如，可以如下制备脂质体制剂溶解合适的一种或多种脂质(如硬脂酰磷脂酰乙醇胺、硬脂酰磷脂酰胆碱、arachadoyl磷脂酰胆碱和胆固醇)于无机溶剂中，然后蒸发，在容器表面留下一薄层干脂质。然后在所述容器中加入所述活性化合物或其一磷酸酯、二磷酸酯和/或三磷酸酯衍生物的水溶液。用手旋动所述容器，从容器侧面释放脂物质并分散脂聚集体，由此形成脂质体悬浮液。
VII.控释制剂在该控释制剂的章节内引用的所有美国专利均全文引入作为参考。
自从Kulkami等报道了聚乳酸的合成和生物可降解性后(“聚乳酸用于外科植入体”Arch.Surg，1966，93，839)，生物可降解聚合物领域已得到快速发展。已被报道可作为用于递送装置的基质材料的其它聚合物的实例包括聚酐，聚酯诸如聚乙交酯和聚乳酸-共-乙交酯，聚氨基酸诸如聚赖氨酸，聚氧乙烯的聚合物和共聚物，丙稀酸终止的聚氧乙烯，聚酰胺，聚氨基甲酸酯，聚正酯，聚丙烯腈和是聚偶磷氮。例如参见，Langer的美国专利序号4,891,225和4,906,474(聚酐)，Hutchinson的4,767,628(聚乳酸，聚乳酸-共-乙交酯)，和Tice，等的4,530,840(聚乳酸，聚乙醇酸交酯和共聚物)。还可参见Hubbell，等的美国专利序号5,626,863，其公开了光可聚合性生物可降解水凝胶作为组织接触的材料和控释载体(包含生物可降解单体或寡聚延伸的亲水性寡聚体的聚合的和交联的巨型体的水凝胶，其是能够聚合和交联的封端单体或寡聚体)；和Focal，Inc.提交的PCT WO 97/05185，其涉及多嵌段生物可降解水凝胶用作药物递送和组织处理剂的控释剂。
生物来源的可降解材料是众所周知的，例如，交联的明胶。透明质酸已被交联并被用作生物医学用途的可降解膨胀聚合物(Della Valle等的美国专利4,957,744；“用于降低聚合生物材料的thrombogenicity的表面修饰”Polym.Mater.Sci.Ezlg.，1991，62，731-735])。
多种分散系目前已被用作，或正被研究用作物质，尤其是生物活性化合物的载体。用于药学和美容制剂的分散系可被分为混悬剂和乳剂。混悬剂的定义是采用悬浮剂将大小范围为数纳米直至几百微米的固体颗粒分散于液体介质中。固体颗粒包括微球体，微胶囊和纳米球体。乳剂的定义是将一种液体分散于另一液体中，通过乳化剂诸如表面活性剂和脂质的界面膜稳定。乳剂包括油包水和水包油乳剂，复合型乳剂，微乳剂，微滴剂和脂质体。微滴剂是由球状脂质层与内部油相组成的单层磷脂载体，见于Haynes的美国专利序号4,622,219和4,725,442。脂质体是通过将水不溶性极性脂质与水溶液混合制备的磷脂载体。通过在水中混合不溶性脂质造成的不利熵产生具有俘获的水溶液的磷脂同心闭合膜的高度有序组合。
Dunn，等的美国专利序号4,938,763公开了原位形成植入物的方法，该方法通过将非反应性、水溶性、水不溶性热塑性聚合物在生物相容性、水溶性溶剂中溶解以形成液体，将该液体置于体内，然后使溶质分散以便产生固体植入物。聚合物溶液可经由注射器而被置于体内。植入物可假定其周围腔的形状。在一个可选的实施方案中，植入物由反应性、液体寡聚物聚合物制成，所述聚合物不包含溶剂且原位加工以形成固体，通常采用加入加工催化剂。
大量专利公开了可用于施用β-L-2′-脱氧核苷或核苷酸或其其它确定的前药的药物递送系统。美国专利序号5,749,847公开了通过电转导将核苷酸递送至有机体内的方法。美国专利序号5,718,921公开了包含聚合物和其中分散了药物的微球体。美国专利序号5,629,009公开了用于生物活性因子控释的递送系统。美国专利序号5,578,325公开了非线性亲水性疏水性多嵌段共聚物的纳米颗粒和微颗粒。美国专利序号5,545,409公开了用于生物活性因子控释的递送系统。美国专利序号5,494,682公开了离子交联聚合微胶囊剂。
Andrx Pharmaceuticals，Inc.的美国专利序号5,728,402公开了一种控释制剂，其包括内相，该内相包含与水凝胶形成剂混合的活性药物，其盐、酯或前药，和包含能够抵御胃内溶解的包被物的外相。AndrxPharmaceuticals，Inc.的美国专利序号5,736,159和5,558,879公开了对水溶性较小的药物控释制剂，其中通道在原位形成。
Andrx Pharmaceuticals，Inc.的美国专利序号5,567,441公开了每日一次的控释制剂。美国专利序号5,508,040公开了多颗粒脉冲释药系统。美国专利序号5,472,708公开了基于药物递送系统的脉冲颗粒。美国专利序号5,458,888公开了控释片剂，其可采用具有含药内相和含有聚乙二醇(其平均分子量为3,000-10,000)的外相的混合物进行制备。美国专利序号5,419,917公开了改变药物从水凝胶的释放速率的方法，其基于使用有效量的药学上可接受的可电离的化合物，该化合物能够基本上提供药物从水凝胶的零级释放速率。美国专利序号5,458,888公开了一种控释片剂。
Elan Corporation，plc的美国专利序号5,641,745公开了控释药物制剂，其包含在生物可降解聚合物中的活性药物以形成微球体或纳米球体。生物可降解聚合物适宜地是聚-D，L-1丙交酯或聚-D，L-丙交酯和聚-D，L-丙交酯-共-乙交酯的混合物。Elan Corporation plc的美国专利序号5,616,345公开了用于每日一次施用的受控吸收制剂，其包括与有机酸联合的活性化合物，和保绕核心的多层膜，该膜包含较大比例药学上可接受的成型膜片，水不溶性合成聚合物和较小比例的药学上可接受的成型膜片，水溶性合成聚合物。美国专利序号5,641,515公开了基于生物可降解纳米颗粒的控释制剂。美国专利序号5,637,320公开了用于每日一次施用的受控吸收制剂。美国专利序号5,580,580和5,540,938涉及制剂及其用于治疗神经学疾病的用途。美国专利序号5,533,995涉及具备受控药物递送的被动经皮装置。美国专利序号5,505,962公开了一种控释药物制剂。
VIII.制备活性化合物的方法本发明β-L-2’-脱氧核苷是本领域已知的，并且可依据Holy，Collect.Czech.Chenu.Commun.1972，37(12)，4072-87和Mol.Plays.1967，3(4)，386-95中公开的方法制得。
附图1显示了使用L-核糖或L-木糖作为原料获得β-L-2’-脱氧核苷(β-L-dN)的一般方法。
活性核苷的一磷酸酯、二磷酸酯和三磷酸酯衍生物可依据出版的方法制得。一磷酸酯可依据Imai等，J.Org.Chem.，June 1969，34(6)，1547-1550的方法制得。二磷酸酯可依据Davisson等，J.Org.Chem，1987，52(9)，1794-1801的方法制得。三磷酸酯可依据Hoard等人，J.Am.Clietn.Soc.，1965，87(8)，1785-1788的方法制得。
制备β-L-核苷的β-L-5’-衍生物的方法可以通过本领域内已知的任何方法制备β-L-核苷的β-L-5’衍生物，尤其是通过已知方法用酰基部分保护仲醇，即通过酐或借助偶联剂的帮助保护仲醇。作为非限制性的实施例，可以按照下面反应顺序制备该β-L-5’衍生物 在优选的实施方案中，所述5’-衍生物源自氨酰基部分。该方法的关键原料也是一种合适取代的β-L核苷。所述β-L核苷可以买到，或者可以根据任何已知方法制备，包括使用L-糖部分(如脱氧核糖)的标准偶联反应。这些氨酰基衍生物可以如下制备将氨基酸选择性偶联到β-L-核苷上，最好对所述核苷不施加其它保护。可以使用促进偶联的合适偶联试剂完成所述偶联反应。偶联试剂非限制性的例子有混合三苯膦或各种类型碳二亚胺的Mitsunobu型试剂(如偶氮二羧酸二烷基酯如偶氮二羧酸二异丙酯和偶氮二羧酸二乙酯)。
可以在获得所需结果的任何温度下进行所述偶联反应，所述温度即是适于以可接受的速率进行所述反应而不促进分解或过多副产物的温度。
可以选择能够达到必要温度并能够溶解反应成分的任何反应溶剂。非限制性的例子为任何非质子溶剂，包括但不限于烷基或卤烷基溶剂，如己烷、环己烷、二氯甲烷或二氯乙烷、甲苯、丙酮、乙酸乙酯、二噻烷、THF、二氧杂环己烷、乙腈、乙醚、吡啶、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲亚砜(DMSO)、二甲基乙酰胺或它们的任何组合。
反应方案1是从L-脱氧核糖核苷制备β-L-5’-氨酰基-核苷的非限制性实施例。
反应方案1 制备β-L-核苷的β-L-3’-衍生物的方法可以通过本领域内已知的任何方法制备2’-脱氧-核苷的β-L-3’-衍生物物，尤其是通过已知方法用酰基部分保护伯醇，即通过酐或借助偶联剂的帮助保护伯醇。作为非限制性的实施例，可以按照下面反应顺序制备所述3’-衍生物。

可选地，该3’-衍生物源自氨酰基部分。该方法的关键原料也是一种合适取代的β-L核苷。所述β-L核苷可以购买，或者可以根据任何已知方法制备，包括使用L-糖部分(如脱氧核糖)的标准偶联反应。
这些氨酰基衍生物可以如下制备首先用合适的氧保护基团如酰基或甲硅烷基保护基团选择性保护5’-羟基，并且可任选地保护杂环状基或杂芳香族基的游离胺。然后，可以将游离3’-羟基偶联到N-保护的α或β氨基酸上。
然后，可以使用促进偶联的标准偶联试剂将β-L核苷偶联到氨酰基上。偶联试剂非限制性的例子有混合三苯膦或各种类型碳二亚胺的Mitsunobu型试剂(如偶氮二羧酸二烷基酯如偶氮二羧酸二异丙酯和偶氮二羧酸二乙酯)。
可以在获得所需结果的任何温度下进行所述偶联反应，所述温度即是适于以可接受的速率进行所述反应而不促进分解或过多副产物的温度。
可以选择能够达到必要温度并能够溶解反应成分的任何反应溶剂。非限制性的例子有任何非质子溶剂，包括但不限于烷基或卤烷基溶剂如己烷、环己烷、二氯甲烷或二氯乙烷、甲苯、丙酮、乙酸乙酯、二噻烷、THF、二氧杂环己烷、乙腈、乙醚、吡啶、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲亚砜(DMSO)、二甲基乙酰胺或它们的任何组合。
反应方案2是从L-脱氧核糖核苷制备β-L-3’-氨酰基-核苷的非限制性实施例。
反应方案2 制备β-L-核苷的β-L-3’，5’-双-O-衍生物的方法可以通过本领域内已知的任何方法制备β-L-核苷的β-L-3’，5’-双-O-衍生物，尤其是通过已知方法用酰基部分保护伯醇和仲醇，即通过酐或借助偶联剂的帮助保护伯醇和仲醇。作为非限制性的实施例，可以按照下面反应顺序制备所述3’，5’-双-O-衍生物 在优选实施方案中，所述3’，5’-双-O-衍生物源自氨酰基部分。该方法的关键原料也是一种合适取代的β-L核苷。所述β-L核苷的β-L-3’，5’-双-O-衍生物可以买到，或者可以根据任何已知方法制备，包括使用L-糖部分(如脱氧核糖)的标准偶联反应。然后，可以将游离3’-和5’-羟基偶联到N-保护的α或β氨基酸上。可以使用促进偶联的合适偶联剂完成所述偶联反应。偶联试剂非限制性的例子有混合三苯膦或各种类型碳二亚胺的Mitsunobu型试剂(如偶氮二羧酸二烷基酯如偶氮二羧酸二异丙基酯和偶氮二羧酸二乙基酯)。
可以在获得所需结果的任何温度下进行所述偶联反应，所述温度即是适于以可接受的速率进行所述反应而不促进分解或过多副产物的温度。
可以选择能够达到必要温度并能够溶解反应成分的任何反应溶剂。非限制性的例子有任何非质子溶剂，包括但不限于烷基或卤烷基溶剂如己烷、环己烷、二氯甲烷或二氯乙烷、甲苯、丙酮、乙酸乙酯、二噻烷、THF、二氧杂环己烷、乙腈，乙醚、吡啶、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲亚砜(DMSO)、二甲基乙酰胺或它们的任何组合。
反应方案3是从L-脱氧核糖核苷制备β-L-3’，5’-二-氨酰基-核苷的非限制性实施例。
反应方案3 延长氨酰基部分的可选方法可以通过使3’和5’-羟基与合适的衍生物(例如酰基，尤其是氨酰基)反应，制备标题化合物。假如用氨酰基部分衍生所述核苷，那么需要进一步将游离胺偶联到N-保护的α或β氨基酸上。采用促进偶联反应的适合的偶联试剂可以完成偶联反应。偶联试剂非限制性的例子有混合三苯膦或各种类型碳二亚胺的Mitsunobu型试剂(如偶氮二羧酸二烷基酯如偶氮二羧酸二异丙酯和偶氮二羧酸二乙酯)。
可以在获得所需结果的任何温度下进行所述偶联反应，所述温度即是适于以可接受的速率进行所述反应而不促进分解或过多副产物的温度。
可以选择能够达到必要温度并能够溶解反应成分的任何反应溶剂。非限制性的例子有任何非质子溶剂，包括但不限于烷基或卤烷基溶剂如己烷、环己烷、二氯甲烷或二氯乙烷、甲苯、丙酮、乙酸乙酯、二噻烷、THF、二氧杂环己烷、乙腈、乙醚、吡啶、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲亚砜(DMSO)、二甲基乙酰胺或它们的任何组合。
衍生杂芳香族碱或杂环状碱的可选方法可以通过可任选地保护杂环状或杂芳香族碱(例如N4-胞嘧啶、N6-腺嘌呤或N2-鸟嘌呤)中的任何游离氨基，制备标题化合物。例如，可以通过如下一般方法用酰基部分或二烷基氨基亚甲基部分保护胺。
或 可以在获得所需结果的任何温度下进行所述保护反应，所述温度即是适于以可接受的速率进行所述反应而不促进分解或过多副产物的温度。
可以选择能够达到必要温度并能够溶解反应成分的任何反应溶剂。非限制性的例子有任何非质子溶剂，包括但不限于烷基或卤烷基溶剂如己烷、环己烷、二氯甲烷或二氯乙烷、甲苯、丙酮、乙酸乙酯、二噻烷、THF、二氧杂环己烷、乙腈、乙醚、吡啶、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲亚砜(DMSO)、二甲基乙酰胺或它们的任何组合。
然后，可以将游离3’-羟基偶联到N-保护的α或β氨基酸上。可以使用促进偶联的合适偶联剂完成所述偶联反应。偶联试剂非限制性的例子有混合三苯膦或各种类型碳二亚胺的Mitsunobu型试剂(如偶氮二羧酸二烷基酯如偶氮二羧酸二异丙基酯和偶氮二羧酸二乙基酯)。
可以在获得所需结果的任何温度下进行所述偶联反应，所述温度即是适于以可接受的速率进行所述反应而不促进分解或过多副产物的温度。
可以选择能够达到必要温度并能够溶解反应成分的任何反应溶剂。非限制性的例子有任何非质子溶剂，包括但不限于烷基或卤烷基溶剂如己烷、环己烷、二氯甲烷或二氯乙烷、甲苯、丙酮、乙酸乙酯、二噻烷、THF、二氧杂环己烷、乙腈、乙醚、吡啶、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲亚砜(DMSO)、二甲基乙酰胺或它们的任何组合。
在可替代的实施方案中，可以从氨酰基部分衍生所述N4-或N6-酰基衍生物，可以按照下面反应顺序制备所述N4-或N6-酰基衍生物可任选地保护游离羟基，然后与合适保护的氨基酯进行缩合反应，随后除去所述羟基保护基团(如果需要)。
实施例熔点是在开口的毛细管中在Gallenkamp MFB-595-010M仪器上测定的，并且未校正。UV吸收光谱是在Uvikon 931(KONTRON)分光光度计上在乙醇中记录的。1H-NMR光谱是在DMSO-d6中用BrukerAC 250或400光谱计于室温测定的。化学位移以ppm给出，将DMSO-d5设定为2.49ppm作为参照。进行氘交换，去偶实验或2D-COSY以证实质子分配。信号多重态用s(单峰)、d(双峰)、dd(双双峰)、t(三重峰)、q(四重峰)、br(宽峰)、m(多重峰)代表。所有J-值都是以Hz给出。FAB质谱是以正-(FAB＞0)或负-(PAB＜0)离子模式在JEOL DX 300质谱仪上记录的。基质是3-硝基苄醇(NBA)或甘油与硫代甘油(GT)的混合物(50∶50，v/v)。比旋度是在Perkin-Elmer241分光偏振计(通路长度为1cm)上测定的，并以10-10cm-2g-1为单位给出。元素分析是通过“Service de Microanalyses dU CNRS，Division de vernaison”(France)进行的。因素符号或函数指定的分析在±0.4％理论值内。薄层色谱是在预涂布的Silica Gel 60F254铝片(Merck，Art.5554)上进行的，产物的显形是通过UV吸光，然后用10％硫酸乙醇溶液炭化并加热来完成的。柱色谱法是用Silica Gel 60(Merck，Art.9385)在常压进行的。
实施例12’-脱氧-β-L-胞苷的立体有择合成 1-(3，5-二-O-苯甲酰基-β-L-呋喃木糖基)尿嘧啶(2)将肼水合物(1.4mL，28.7mmol)加到1-(3，5-二-O-苯甲酰基-β-L-呋喃木糖基)尿嘧啶1[Gosselin，G.；Bergogne，M.-C.和Imbach，J.-L.“五种天然核酸碱基的β-L-呋喃木糖基核苷的合成和生物评价”，Journal of Heterocyclic Cheaistry.，1993，30，1229-1233](4.79g，9.68mmol)在吡啶(60mL)和乙酸(15mL)内的溶液中。将该溶液在室温搅拌过夜。加入丙酮(35mL)，并将该混合物搅拌30分钟。将该反应混合物减压蒸发。通过硅胶柱色谱纯化残余物[洗脱剂用甲醇(0-4％)在二氯甲烷中的混合物进行梯度洗脱]，获得了2(3.0g，68％)，将其从环己烷/二氯甲烷中结晶mp＝111-114℃；1H-NMR(DMSO-d6)δ11.35(br s，1H，NH)，7.9-7.4(m，11H，2C6H5CO，H-6)，6.38(d，1H，OH-2’，JOH-2’＝4.2Hz)，5.77(d，1H，H-1’，J1’-2’＝1.9Hz)，5.55(d，1H，H-5，J5-6＝8Hz)，5.54(dd，1H，H-3’，J3’-2’＝3.9Hz和J3’-4’＝1.8Hz)，4.8(m，1H，H-4’)，4.7(m，2H，H-5’and H-5”)，4.3(m，1H，H-2’)；MSFAB＞0(基质GT)m/z 453(M+H)+，105(C6H5CO)+；FAB＜0(基质GT)m/z451(M-H)-，121(C6H5CO2)-，111(B)-；元素分析C23H20N2O8·H2O计算值C，58.09；H，4.76；N，5.96.实测值C，57.71；H，4.42；N，5.70.
1-(3，5-二-O-苯甲酰基-β-L-呋喃阿拉伯糖基)尿嘧啶(3)向1-(3，5-二-O-苯甲酰基-β-L-呋喃阿拉伯糖基)尿嘧啶2(8g，17.7mL)在无水苯-DMSO混合物(265mL，6∶4，v/v)内的溶液中加入无水吡啶(1.4mL)、二环己基碳二亚胺(10.9g，53mmol)和二氯乙酸(0.75mL)。将所得混合物在室温搅拌4小时，然后用乙酸乙酯(400mL)稀释，加入草酸(4.8g，53mmol)在甲醇(14mL)中的溶液。搅拌1小时后，将该溶液过滤。将滤液用饱和氯化钠溶液(2×500mL)、3％碳酸氢钠溶液(2×500mL)和水(2×500mL)洗涤。用硫酸钠将有机相干燥，然后减压蒸发。之后将所得残余物溶解在无水EtOH/苯混合物(140mL，2∶1，v/v)中。在0℃向该溶液中加入NaBH4(0.96g，26.5mmol)。搅拌1小时后，用乙酸乙酯(400mL)将该溶液稀释，然后过滤。将滤液用饱和氯化钠溶液(400mL)和水(400mL)洗涤。用硫酸钠将有机相干燥，然后减压蒸发。通过硅胶柱色谱纯化所得粗产物[洗脱剂用甲醇(0-3％)在二氯甲烷中的混合物进行梯度洗脱]，获得了12(5.3g，66％)，将其从乙腈中结晶mp＝182-183℃；1H-NMR(DMSO-d6)δ11.35(br s，1H，NH)，8.0-7.5(m，11H，2C6H5CO，H-6)，6.23(br s，1H，OH-2’)，6.15(d，1H，H-1’，J1’-2’＝4Hz)，5.54(d，1H，H-5，J5-6＝8.1Hz)，5.37(t，1H，H-3’，J3’-2’＝J3’-4’＝2.6Hz)，4.7-4.6(m，2H，H-5’和H-5”)，4.5(m，1H，H-4’)，4.4(m，1H，H-2’)；MSFAB＞0(基质GT)m/z 453(M+H)+，341(S)+，113(BH2)+，105(C6H5CO)+；FAB＜0(基质GT)m/z 451(M-H)-，121(C6H5CO2)-，111(B)-；元素分析C23H20N2O8计算值C，61.06；H，4.46；N，6.19.实测值C，60.83；H，4.34；N，6.25.
1-(3，5-二-O-苯甲酰基-2-脱氧-β-L-赤-呋喃戊糖基)尿嘧啶(4)向1-(3，5-二-O-苯甲酰基-β-L-呋喃阿拉伯糖基)尿嘧啶3(5.2g，11.4mmoL)在无水1，2-二氯乙烷(120mL)内的溶液中加入苯氧基硫代甲酰氯(4.7mL，34.3mL)和4-(二甲基氨基)吡啶(DMAP，12.5g，102.6mmoL)。将所得溶液在氩气氛下于室温搅拌1小时，然后减压蒸发。将残余物溶解在二氯甲烷(300mL)中，并将该有机溶液依次用冰冷的0.2N盐酸(3×200mL)和水(2×200mL)洗涤，用硫酸钠干燥，并减压蒸发。将粗产物与无水二氧杂环己烷共蒸发几次，并溶解在该溶剂(110mL)中。在氲气氛下向所得溶液中加入三-(三甲基甲硅烷基)硅烷氢化物(4.2mL，13.7mmol)和α，α’-偶氮异丁腈(AIBN，0.6g，3.76mmol)。将该反应混合物加热，井在氩气氛下于100℃搅拌1小时，然后冷却至室温，并减压蒸发。通过硅胶柱色谱纯化残余物[洗脱剂用甲醇(0-5％)进行梯度洗脱]，获得了4(2.78g，56％)，将其从EtOH中结晶mp＝223-225℃；H-NMR(DMSO-d6)δ11.4(br s，1H，NH)，8.0-7.5(m，11H，2C6H5CO，H-6)，6.28(t，1H，H-1’，J＝7Hz)，5.5(m，2H，H-1’和H-5)，4.6-4.4(m，3H，H-4’，H-5’和H-5”)，2.6(m，2H，H-2’和H-2”)；MSFAB＞0(基质GT)m/z 437(M+H)+，3325(S)+；FAB＜0(基质GT)m/z 435(M-H)-，111(B)-；元素分析C23H20N2O7计算值C，63.30；H，4.62；N，6.42.
实测值C，62.98；H，4.79；N，6.40.
2’-脱氧-β-L-胞苷(β-L-dC)在氩气氛下将Lawesson氏试剂(1.72g，4.26mmol)加到1-(3，5-二-O-苯甲酰基-2-脱氧-β-L-赤-呋喃戊糖基)尿嘧啶4(2.66g，6.1mmol)在无水1，2-二氯乙烷(120mL)内的溶液中，并将该反应混合物搅拌回流2小时。然后将溶剂减压蒸发，并通过硅胶柱色谱纯化残余物[洗脱剂使用乙酸乙酯(0-8％)在二氯甲烷中的混合物进行梯度洗脱]，获得了4-硫代中间体，为黄色泡沫状物。将该硫代中间体(1.5g，3.31mmol)在氨的甲醇溶液(在-10℃预饱和的，并紧紧地塞住)(50mL)中的溶液在不锈钢瓶中于100℃加热3小时，然后冷却至0℃。将溶剂减压蒸发。通过硅胶柱色谱纯化所得粗产物[洗脱剂用甲醇(0-20％)在二氯甲烷中的混合物进行梯度洗脱]。最后，合并合适的级分，并经由装置Millex HV-4(0.45μm，Millipore)过滤，减压蒸发，获得了所需的2’-脱氧-β-L-胞苷(β-L-dC)，为泡沫状物(0.6g，80％)，将其从无水EtOH中结晶mp＝198-199℃；1H-NM R(DMSO-d6)δ7.77(d，1H，H-6，J6-5＝7.4Hz)，7.10(br d，2H，NH-2)，6.13(t，1H，H-1’，J＝6.7Hz)，5.69(d，1H，H-5，J5-6＝7.4Hz)，5.19(d，1H，OH-3’，JOH-3＝4.1Hz)，4.96(t，1H，OH-5’，JOH-5’＝JOH-5”＝5.2Hz)，4.1(m，1H，H-3’)，3.75(m，1H，H-4’)，3.5(m，2H，H-5’和H-5”)，2.0(m，1H，H-2’)，1.9(m，1H，H-2”)；MSFAB＞0(基质GT)m/z 228(M+N)+，112(BH2)+；FAB＜0(基质GT)m/z 226(M-N)+，[α]20D＝-69(c 0.52，DMSO)[[α]20D＝+76(c 0.55，DMSO)市售D对映体的盐酸盐]；元素分析C9H13N3O4计算值C，47.57；H，5.77；N，18.49。实测值C，47.35；H，5.68；N，18.29。
实施例22’-脱氧-β-L-胞苷(β-L-dC)的立体选择合成 2-氨基-β-L-呋喃阿拉伯糖并-[1’，2’4，5]-噁唑啉(5)将L-阿拉伯糖(170g，1.13mol；Fluka，＞99.5％，ref 10839)、氨腈(100g，2.38mol；Fluka，＞98％，ref 28330)、甲醇(300mL)、和6M-NH4OH(50mL)的混合物在室温搅拌3天，然后在-10℃保持过夜。通过抽滤收集产物，依次用甲醇和乙醚洗涤，并真空干燥。获得了130g(66.0％)分析纯的化合物5，m.p.170-172℃；1H NMR(DMSO-d6)δppm 6.35(br s，2H，NH2)，5.15(d，1H，H-1，J＝5.6Hz)，5.45(br s，1H，OH-3)，4.70(br s，1H，OH-5)，4.55(d，1H，H-2，J＝5.6Hz)，4.00(br s，1H，H-3)，3.65(m，1H，H-4)，3.25(m，2H，H-5，H-5’).
O2，2’-脱水-β-L-尿苷(6)
将化合物5(98.8g，0.57mol)和丙炔酸甲酯(98mL；Fluka，＞97％，ref 81863)在50％乙醇水溶液(740mL)中的溶液回流5小时，然后冷却，并减压浓缩至初始体积的一半。用丙酮(600mL)沉淀后，通过抽滤收集产物，用乙醇和乙醚洗涤，并干燥。将母液部分浓缩，用丙酮(1000mL)沉淀浓缩物，通过抽滤收集固体，用丙酮和乙醚洗涤，获得了另一批产物。总共获得了80g(62％)化合物6，m.p.236-240℃；1H NMR(DMSO-d6)δppm7.87(d，1H，H-6，J＝7.4Hz)，6.35(d，1H，H-1’，J＝5.7Hz)，5.95(d，1H，H-5，J＝7.4Hz)，5.90(d，1H，OH-3’)，5.20(d，1H，H-2’，J＝5.7Hz)，5.00(m，1H，OH-3’)，4.44(br s，1H，H-3’)，4.05(m，1H，H-4’)，3.25(m，2H，H-5，H-5’).
3’，5’-二-O-苯甲酰基-O2，2’-脱水-β-L-尿苷(7)在氢气下、0℃，向化合物6(71.1g，0.31mol)在无水吡啶(1200mL)内的溶液中加入苯甲酰氯(80.4mL；Fluka，p.a.，ref 12930)。在除去周围环境水分的条件下将该反应混合物在室温搅拌5小时，并加入乙醇来终止反应。将溶剂减压蒸发，将所得残余物与甲苯和无水乙醇共蒸发。用乙醇将粗的混合物稀释，通过抽滤收集沉淀，依次用乙醇和乙醚洗涤，并干燥，获得了129g(95.8％)化合物7，m.p.254℃；1H NMR(DMSO-d6)δppm 8.1-7.4(m，11H，C6H5CO，H-6)，6.50(d，1H，H-1’，J＝5.7Hz)，5.90(d，1H，H-5，J＝7.5Hz)，5.80(d，1H，H-2’，J＝5.8Hz)，5.70(d，1H，H-3’)4.90(m，1H，H-4’)，4.35(m，2H，H-5，H-5’).
3’，5’-二-O-苯甲酰基-2’-氯-2’-脱氧-β-L-尿苷(8)在0℃，向化合物7(60.3g，0.139mol)在二甲基甲酰胺(460mL)内的溶液中加入3.2N-HCl/DMF溶液(208ml，通过在0℃将47.2mL乙酰氯(Fluka，p.a.，ref 00990)加到27.3mL甲醇与133.5mL二甲基甲酰胺的溶液中而制得的)。在除去周围环境水分的条件下将该反应混合物在100℃搅拌1小时，冷却，并倒入水(4000ml)中。通过抽滤收集化合物8的沉淀，用水洗涤，并从乙醇中重结晶。收集晶体，用冷的乙醇和乙醚洗涤，并减压干燥。获得了60.6g(92.6％)化合物8，m.p.164-165℃；1H NMR(DMSO-d6)δppm 8.7(br s，1H，NH)，8.1-7.3(m，11H，C6H5CO，H-6)，6.15(d，1H，H-1’，J＝4.8Hz)，5.5(m，2H，H-5，H-2’)，4.65(m，4H，H-3’，H-4’，H-5’，H-5”).
3’，5’-二-O-苯甲酰基-2’-脱氧-β-L-尿苷(9)将化合物8(60.28g，0.128mol)、三正丁基氢化锡(95ml；Fluka，＞98％，ref 90915)和偶氮二二异丁腈(0.568g；Fluka，＞98％，ref11630)在无水甲苯(720mL)中的混合物搅拌回流5小时，并冷却。通过抽滤收集固体，井用冷的甲苯和石油醚洗涤。将滤液减压浓缩，用石油醚稀释以沉淀出另一批化合物9。获得了54.28g(97.2％)化合物9；m.p.220-221℃；1H NMR(CDCl3)δppm 8.91(brs，1H，NH)，8.1-7.5(m，11H，C6H5CO和H-6)，6.43(q，1H，H-1’，J1’，2’＝5.7Hz和J1’，2”＝8.3Hz)，5.7-5.6(m，2H，H-3’和H-5)，4.8-4.6(m，3H，H-5’，H-5”和H-4’)，2.8-2.7(m，1H，H-2’)，2.4-2.3(m，1H，H-2”).
3’，5’-二-O-苯甲酰基-2’-脱氧-β-L-4-硫代-尿苷(10)将化合物155(69g，0.158mol和Lawesson氏试剂(74g；Fluka，＞98％，ref 61750)在无水二氯甲烷(3900mL)中的溶液在氩气氛下回流过夜。将溶剂蒸发后，通过硅胶柱色谱纯化残余物[洗脱剂用甲醇(0-2％)在二氯甲烷中的混合物进行梯度洗脱]，以定量产率获得了纯的化合物10(73g)；1H NMR(CDCl3)δppm 9.5(br s，1H，NH)，8.1-7.4(m，10H，C6H5CO)，7.32(d，1H，H-6，J＝7.7Hz)，6.30(dd，1H，H-1’，J＝5.6Hz和J＝8.2Hz)，6.22(d，1H，H-5，J＝7.7Hz)，5.6(m，1H，H-3’)，4.7(m，2H，H-5’，H-5”)，4.5(m，1H，H-4’)，2.8(m，1H，H-2’)，2.3(m，1H，H-2”).
2’-脱氧-β-L-胞嘧啶将化合物10(7.3g，0.016mol)在用氨饱和的甲醇(73mL)中的溶液在不锈钢圆筒中于100℃加热3小时。小心地冷却后，将溶剂减压蒸发。将残余物的水溶液用乙酸乙酯洗涤，并蒸发至干。用其它9份化合物10样本(各7.3g)(10的总量为73g)进行该方法。合并10份残余物，用无水乙醇稀释，冷却，获得了晶体2’-脱氧-β-L-胞嘧啶，通过固相-液相萃取方法(在乙酸乙酯中回流1小时)来将微量苯甲酰胺从2’-脱氧-β-L-胞嘧啶中除去。获得了28.75g(78.％)化合物6；m.p.141-145℃；1H NMR(DMSO)δppm 8.22和8.00(2br s，2H，NH2)，7.98(d，1H，H-6，J＝7.59Hz)，6.12(t，1H，H-1’，J＝6.5Hz和J＝7.6Hz)，5.89(d，1H，H-5，J＝7.59Hz)，5.3(br s，1H，OH-3’)，5.1(br s，1H，OH-5’)，4.2(m，1H，H-3’)，3.80(q，1H，H-4，J＝3.6Hz和J＝6.9Hz)，3.6-3.5(m，2H，H-5’，H-5”)，2.2-2.0(m，2H，H-2’，H-2”)；FAB＜0，(GT)m/e 226(M-H)-，110(B)-；FAB＞0(GT)228(M+H)+，112(B+2H)+；[α]D20-56.48(c＝1.08在DMSO中)；UV(pH7)λmax＝270nm(ε＝10000).
实施例32’-脱氧-β-L-胸苷(β-L-dT)的立体选择合成 3’，5-二-O-苯甲酰基-2’-脱氧-5-碘-β-L-尿苷(11)将化合物9(105.8g，0.242mol)、碘(76.8g；Fl uka，99.8％，ref 57650)、硝酸铈铵(CAN)(66.4gAldrich，＞98.5％，ref 21，547-3)和乙腈(2550ml)的混合物在80℃搅拌3小时，然后将该反应混合物在室温冷却，导致结晶出化合物11(86.6g，63.5％)；
m.p.192-194℃；1H NMR(DMSO)δppm.g.34(s，1H，NH)，8.2-7.2(m，11H，2C6H5CO，H-6)，6.31(q，1H，H-1’，J＝5.5Hz和J＝8.7Hz)，5.5(m，1H，H-3’)，4.7(m，2H，H-5’，H-5”)，4.5(m，1H，H-4’)，2.7(m，1H，H-2’)，2.3(m，1H，H-2”)；FAB＜0，(GT)m/e 561(M-H)-，237(B)-；FAB＞0(GT)563(M+H)+；[α]D20+39.05(c＝1.05在DMSO中)；UV(EtOH 95)υmax＝281nm(ε＝9000)，υmin＝254nm(ε＝4000)，υmax＝229nm(ε＝31000)；元素分析C23H19IN2O7计算值C，49.13H，3.41N，4.98I，22.57.实测值C，49.31H，3.53N，5.05I，22.36.
3’，5-二-O-苯甲酰基-3-N-甲苯酰基-β-L-胸苷(13)在0℃，向化合物11(86.6g，0.154mol)在含有N-乙基二异丙基胺(53.6mL；Aldrich，＞99.5％，ref 38，764-9)的无水吡啶(1530ml)内的溶液中分批添加对甲苯甲酰氯(40.6mL，Aldrich，98％，ref10，663-1)。将该反应混合物在室温搅拌2小时，然后加入水以终止反应，并用二氯甲烷萃取该反应混合物。将有机相用水洗涤，用硫酸钠干燥，并蒸发至干，获得了粗的3’，5-二-O-苯甲酰基-2’-脱氧-3-N-甲苯酰基-5-碘-β-L-尿苷(12)，其可不用进一步纯化直接用于下一步骤。
将粗的混合物12、乙酸钯(3.44g；Aldrich，＞99.98％，ref 37，987-5)、三苯基膦(8.0g；Fluka，＞97％，ref 93092)在N-甲基吡咯烷酮(1375ml；Aldrich，＞99％，ref 44，377-8)中的溶液与三乙胺(4.3ml)在室温搅拌45分钟。然后在氩气氛下、0℃滴加四甲基锡(42.4mL；Aldlich，＞99％，ref 14，647-1)。在100-110℃搅拌过夜后，将该反应混合物倒入水中，并用乙醚萃取。用硫酸钠将该有机溶液干燥，并减压浓缩。通过硅胶柱色谱纯化残余物[洗脱剂用乙酸乙酯(0-10％)在甲苯中的混合物进行梯度洗脱]，获得了化合物13，为泡沫状物(42.3g，2步的产率为48.3％)。
1H NMR(DMSO)δppm.8.3-7.2(m，15H，2C6H5CO，1CH3C6H4CO，H-6)，6.29(t，1H，H-1’，J＝7.0Hz)，5.7(m，1H，H-3’)，4.7-4.5(m，3H，H-5’，H-5”，H-4’)，2.7-2.6(m，2H，H-2’，H-2”)；FAB＜0，(GT)m/e 567(M-H)-，449(M-CH3C6H4CO)-，243(B)-，121(C6H5COO)-；FAB＞0(GT)1137(2M+H)+，569(M+H)+，325(M-B)-，245(B+2H)+，119(CH3C6H5CO)+.
2’-脱氧-β-L-胸苷将化合物13(42.3g，0.074mol)在用氨饱和的甲醇(1850mL)中的溶液在室温搅拌2天。将溶剂蒸发后，用水将残余物稀释，并用乙酸乙酯洗涤数次。分离出水层，减压蒸发，通过硅胶柱色谱纯化残余物[洗脱剂用甲醇(0-10％)在二氯甲烷中的混合物进行梯度洗脱]，获得了纯的2’-脱氧-β-L-胸苷(11.62g，64.8％)，将其从乙醇中结晶；m.p.185-188℃；1H NMR(DMSO)δppm 11.3(s，1H，NH)，7.70(s，1H，H-6)，6.2(pt，1H，H-1’)，5.24(d，1H，OH-3’，J＝4.2Hz)，5.08(t，1H，OH-5’，J＝5.1Hz)，4.2(m，1H，H-3’)，3.7(m，1H，H-4’)，3.5-3.6(m，2H，H-5’，H-5”)，2.1-2.0(m，2H，H-2’，H-2”)；FAB＜0，(GT)m/e 483(2M-H)-，349(M+T-H)-，2+41(M-H)-，125(B)-；FAB＞0(GT)243(M+H)+，127(B+2H)+；)+；[α]D20-13.0(c＝1.0在DMSO中)；UV(pH1)υmax＝267nm(ε＝9700)，υmin＝234nm(ε＝2000).
实施例4β-L-dC 5’-L-缬氨酰酯的化学合成作为β-L-dC氨基酯的合成的示例性实例，通过使用(CH3)3SiCl通过首先保护β-L-dC的胺基合成β-L-dC 5’-L-缬氨酰酯。通过加入N-Boc L-缬氨酸使保护的β-L-dC酯化。然后将该酯去保护从而生成β-L-dC 5’-L-缬氨酰酯。美国专利序号5,700,936和4,957,924O酯描述了用于合成氨基酸酯的其它方法，所述专利引入此处作为参考。L-dA，L-dC，L-dT，和L-dU的L-缬氨酰基5’-O-酯是本发明优选的实施方式。
参考文件1by modification of a previously described procedure inthe D seriesNyilas，A.等Tetrahedron 1990，46(6)，2149-2164.
参考文件by modification of a previously described procedure forthe acyclovir L-valyl esterBeauchamp，L.M..等Antiviral Chemistry& Chemotherapy 1992，3(3)，157-164.
实施例54N-mMTr-2’-脱氧-β-L-胞苷(1，图1)在无水吡啶(44ml)中溶解β-L-dC(1g；4.40mmol)。用三甲基甲硅烷基基团(TMSCl，3.34ml，26.4mmol)短暂保护后，加入mMTrCl(3.38mg，11mmol)和4-二甲氨基吡啶(DMAP，540mg，4.40mmol)，所述反应混合物在室温搅拌3天{A.Nyilas；C.Glemarec；J.Chattopadhyaya；Tetrahedron Lett.1990，46，2149-2164}。用碳酸氢钠萃取后，有机层用水洗涤，随后蒸发并用二氧杂环己烷(40mL)溶解。逐滴加入氨水(8.5ml)，所述反应混合物搅拌过夜。蒸发所有挥发性物质后，固体残余物在硅胶柱上纯化{洗脱剂CH2CL2中MeOH(0-10％)的阶式梯度}，产生泡沫状的所需化合物1(1.02g，46.5％)。
1H NMR(DMSO-d6)δppm 8.39(br s，1H，NH，可交换的D2O)，7.70(d，1H，H-6，J＝7.3Hz)，7.4-6.8(m，14H，(C6H5)2C(C6H4)OCH3)，6.23(d，1H，H-5，J＝7.3Hz)，6.02(t，1H，H-1’，J＝6.5Hz)，5.16(d，1H，OH-3’，J＝3.8Hz，可交换的D2O)，4.9(br s，1H，OH-5’，可交换的D2O)，4.1(m，1H，H-3’)，3.7(m，4H，H-4’，OCH3)，3.5(m，2H，H-5’，H-5”)，2.1-1.8(2m，2H，H-2’，H-2”)；FAB＜0，(GT)m/e 498(M-H)-，382(B)-；226(M-mMTr)-；FAB＞0(GT)500(M+H)+，273(mMTr)+；UV(EtOH 95)λmax＝279nm；λmin＝250nm.
实施例64N-mMTr-2’-脱氧-β-L-胞苷的5’-L-N-(叔丁氧基羰基)缬氨酸酯(2，图1)将化合物1(1g，2.0mmol)在无水DMF(34ml)中的溶液中顺序加入4-二甲氨基吡啶(DMAP，37mg，0.3mmol)、N-(叔丁氧基羰基)-L-缬氨酸(Boc-Val-OH，587mg，2.7mmol)和N，N-二环己基碳二亚胺(DCC，660mg，3.2mmol){L.M.Beauchamp；G.F.Orr；P.De Miranda；T.Burnette；T.A.KrenitSky；AntiviraChem.Chemother.1992，3，157-164}。所述溶液在室温搅拌。40小时后，在所述反应混合中再加入DMAP(37mg，0.3mmol)、Boc-Val-OH(587mg，2.7mmol)和DDC(660mg，3.2mmol)，然后在室温搅拌40小时。过滤所述混合物，减压从滤液中除去DMF，残余物在硅胶柱上色谱分离{洗脱剂CH2Cl2中MeOH(0-10％)的阶式梯度}，产生泡沫状的所需化合物2(515mg，37％)。
1H NMR(DMSO-d6)δppm 8.44(br s，1H，NH，可交换的D2O)，7.7-6.8(m，15H，，H-6和(C6H5)2C(C6H4)OCH3)，6.26(d，1H，H-5，J＝7.3Hz)，6.06(t，1H，H-1’，J＝6.6Hz)，5.7(bs，1H，OH-3’，可交换的D2O)，4.2-4.0(m，3H，H-3’，H-4’和CH)，3.8-3.9(m，2H，H-5’，H-5”)，3.7(s，3H，，OCH3)，2.0-1.9(m，3H，H-2’，H-2”，CH)，1.36(s，9H，(CH3)3C)，0.86(m，6H，(CH3)2CH)；FAB＜0，(GT)m/e 1395(2M-H)-，697(M-H)-，425(M-mMTr)-，382(B)-；216(BocVal-H)-；FAB＞0(GT)384(B+2H)+，273(mMTr)+；57(CH3)3C)+；UV(EtOH 95)λmax＝279nm；λmin＝249nm.
实施例7
2’-脱氧-β-L-胞苷盐酸盐的5’-L缬氨酸酯(3，图1)将化合物2(500mg，0.715mmol)溶解于三氟乙酸在CH2Cl2中的20％溶液(25ml)中，加入三异丙基甲硅烷(1.47ml，71.5mmol)。所述反应混合物在室温搅拌1小时，然后缬氨酸酯在Et2O中作为三氟乙酸盐沉淀。所述沉淀与水几次共蒸发后，用水(2ml)溶解，用HCl在二氧杂环己烷中的饱和溶液(20ml)处理，然后减压蒸发。所述处理重复3次，所需化合物3最终为盐酸盐在醚(207mg，73％)中沉淀。
1H NMR(DMSO-d6)δppm 9.7(br s，1H，1/2NH2，可交换的D2O)，8.6(br s，4H，1/2NH2，NH3，可交换的D2O)，7.98(d，1H，，H-6J＝7.8Hz)，6.17(d，1H，H-5，J＝7.8Hz)，6.11(pt，1H，H-1’)，5.5(bs，＜1H，OH-3’，可交换的D2O)，4.4(m，2H，H-5’，H-5”)，4.3(m，1H，H-3’)，4.2-4.0(m，2H，H-4’，CH)，3.8-3.9，3.7(s，3H，，OCH3)，2.3-2.1(m，3H，H-2’，H-2”，CH)，0.94(dd，6H，(CH3)2CH，J＝3.7和6.6Hz)；FAB＜0，(GT)m/e 361(M+Cl)-，325(M-H)-，116(Val-H)-，110(B)-；216(BocVal-H)-；FAB＞0(GT)653(2M+H)+，327(M+H)+；112(B+2H)+；)+；{α}D20-28.57(c＝0.49在DMSO中)；UV(EtOH 95)λmax＝272nm(ε8700)；λmin＝255nm(ε7600)；HPLC rt＝8.37分钟(在20mM三乙基乙酸铵缓冲液中CH3N从0到50％的梯度，运行30分钟，流速1ml/分钟)。
实施例8N4-乙酰基-2’-脱氧-β-L-胞苷(4，图2)在核苷β-L-dC(415mg，1.83mmol)在N，N-二乙基甲酰胺(9.2ml)的悬浮液中加入乙酸酐(207μl，2.20mmol)，所述混合物在室温搅拌24小时[V.Bhat；B.G.Ugarkar；V.A.Sayeed，K.Grimm；N.Kosora；P.A.Domenico；E.Stocker，Nucleosides & Nucleotides，1989，8(2)，179-183]。减压除去DMF后，所得残余物通过硅胶柱色谱纯化[洗脱利CH2Cl2中的15％MeOH]，得所需化合物(310mg，63％)，然后用乙醇结晶；
rap128-170℃；1H NMR(DMSO-d6)δppm 10.86(s，1H，NH，可交换的D2O)，8.31(d，1H，，H-6，J＝7.5Hz)，7.18(d，1H，H-5，J＝7.5Hz)，6.09(t，1H，H-1’，J＝6.3Hz)，5.25(d，1H，OH-3’，可交换的D2O，J＝4.2Hz)，5.03(t，1H，OH-5′，可交换的D2O，J＝5.0Hz)，4.1-4.2(m，1H，H-3′)，3.8(m，1H，H-4′)，3.4-3.6(m，2H，2H，H-5′，H-5″)，2.2-2.3(m，1H，H-2′)，2.08(s，3H，CH3)，2.0-1.9(m，1H，H-2″)；FAB＜0，(GT)m/e 806(3M-H)-，537(2M-H)-，360(M+G-H)-，268(M-H)-，152(B)-；FAB＞0(GT)808(3M+H)+，539(2M+H)+，362(M+G+H)+，270(M+H)+，154(B+2H)+，117(S)+；UV(H2O)λmax＝297nm(ε8300)；λmin＝270nm(ε3500)；λmax＝245nm(ε14400)；λmin＝226nm(ε5800)；[α]D20-81.31(c＝1.07在DMSO中).
实施例9N4-[(二甲氨基)亚甲基]-2’-脱氧-β-L-胞苷(5，图3)标题化合物按照公开的开发用于制备对应D-对映异构体的方法制备[S.G.Kerr和T.I.Kalman，J.Pharm.Sci.1994，83，582-586)。用二乙基甲酰胺缩二甲醇(dimethylformamide dimethylacetal)(2.8ml，21.08mmol)处理L-dC(500mg，2.20mmol)在DMF(4.8ml)中的溶液，然后在室温搅拌过夜。所述溶液减压蒸发，然后与乙醇共蒸发。从乙醇/乙醚中结晶，得到为淡黄色结晶的标题化合物(501.2mg，81％)。mp 174-176℃(D-对映异构体的lit.188-190℃)；1H NMR(DMSO-d6)δppm 8.60(s，1H，N＝CH)，8.00(d，1H，H-6)，6.15(t，J＝6.6Hz，1H，H-1′)，5.96(d，J＝7.2Hz，1H，H-5)，5.22(d，J＝4.2Hz，1H，OH-3′)，5.01(t，J＝5.2Hz，1H，OH-5′)，4.20(m，1H，H-4′)，3.80(m，1H，H-3′)，3.56(m，2H，H-5′和H-5″)，3.15和3.02(2s，3H and 3H，N(CH3)2)，2.22-1.90(2m，1H和1H，H-2′和H-2″)；FAB＞0(GT)847(3M+H)+，565(2M+H)+，283(M+H)，FAB＜0，(GT)m/z 599(2M+Cl)-，317(M+Cl)-，165(B)-.
实施例103’，5’-二-O-乙酰基-2’-脱氧-β-L-胞苷(6，图4)标题化合物可以从L-dC一个步骤合成，然后进行Breiher等开发的用于制备D-对映异构体的方法[R.G.Breiner；W.Rose；J.A.Dunn；J.E.Mae Diarmid和J.Bardos；J.Med.Chem.1990，33，2596-2603]。L-dC(765mg，3.37mmol)和乙酰氯(960μl，13.48mmol)在冰乙酸(4.8ml)中的溶液在室温下搅拌10分钟，然后加入无水氯仿(3.5ml)，继续搅拌24小时。所述溶液减压蒸发，然后用乙醇共蒸发。从乙醇中结晶产生78％所需化合物，mp 192-193℃(D-对映异构体的lit.187-189℃[Breiner等，J.Med.Chem.1990，33，2596-2603]；1HNMR(DMSO-d6)δppm 9.8和8.7(2br s，＜3H，NH3+，可交换的D2O)，8.0(d，1H，H-6J＝7.8Hz)，6.18(d，1H，H-5，J＝7.8Hz)，6.08(t，1H，H-1′，J＝6.7Hz)，5.2(m，1H，H-3′)，4.3-4.1(m，3H，H-4′，H-5′，H-5″)，2,4-2,5(m，2H，H-2′，H-2″)，2.06和2.03(2s，6H，2CH3)；FAB＜0，(GT)m/e 968(3M+Cl)-，657(2M+Cl)-，438(M+G+Cl)-，346(M+Cl)-，310(M-H)-，110(B)-；59(CH3COO)-；FAB＞0(GT)623(2M+H)+，312(M+H)+，201(S)+，112(B+2H)+，43(CH3CO)+；[α]D2036.27(c＝1.02in DMSO)；UV(MeOH)λmax＝277nm(ε9900)；λmin＝246nm(ε5000).
实施例112’-脱氧-β-L-胞苷的3’，5’-L-N-(叔丁氧基羰基)缬氨酸二酯(9，图5)用Boc-Val-OH(1.31g，6.03mmol)、DMAP(86.5mg，0.71mmol)、盐酸1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)(1.36g，7.09mmol)处理N4-[(二甲氨基)亚甲基]-2’-脱氧-β-L-胞苷(7，500mg，1.77mmol)在DMF(35ml)中的溶液，然后在室温搅拌40小时。额外加入Boc-Val-OH(655mg，3.01mmol)、DMAP(43.2mg，0.35mmol)、EDC(680mg，3.55mmol)，所述溶液继续搅拌20小时。减压蒸发后，用CH2Cl2溶解残余物，然后用水萃取几次。有机层用盐水(100ml)洗涤，干燥(Na2SO4)，减压蒸发获得粗产物8，该粗产物不用纯化，直接用于下一步。所述残余物用二氧杂环己烷(18ml)溶解，用26％NH4OH水溶液处理，然后在室温搅拌1小时。所述溶液减压蒸发，残余物使用CH2Cl2中的MeOH(0-5％)阶式梯度洗脱在硅胶上进行色谱纯化，得到标题化合物(698.7mg，由，由9开始的产率为58％)。
1H NMR(DMSO-d6)δppm 7.58(d，1H，H-6)，7.29-7.18(m，4H，NH-Boc和NH2)，6.20(t，J＝6.6Hz，1H，H-1’)，5.75(d，J＝7.3Hz，1H，H-5)，5.20(br.s，1H，H-3’)，4.29(m，2H，H-5′和H-5″)，4.14(br.s，1H，H-4′)，3.86(m，2H，CH-NH-Boc)，2.31-2.21(m，2H，H-2′和H-2″)，2.13-1.98(m，2H，CH(iPr))，1.38和1.36(2s，18H，tBu)，0.88和0.85(2d，J＝6.8Hz，12H，CH(CH3)2)；13C NMR(DMSO-d6)δppm 172.67和172.46，166.41，156.64和155.70，141.39，95.43，85.78，82.03，79.14，75.57，64.90，60.37和60.11，37.40，30.33，29.00，19.83-19.12；FAB＞0(GT)626(M+H)+，112(B+2H)+，255(M-Boc)+；FAB＜0，(GT)m/z 1249(2M-H)-，624(M-H)-.
实施例122’-脱氧-β-L-胞苷盐酸盐的3，5’-L-缬氨酸酯(10，图5)用二氧杂环己烷的26％HCl溶液(30ml)处理9(675mg，1.08mmol)在二氧杂环己烷中的溶液(30ml)，在室温下搅拌1小时55分钟。所得白色悬浮液减压蒸发。白色固体残余物用最小量MeOH溶解，在乙醚中沉淀，得到为白色固体的标题化合物10。Mp 187℃(分解)；1H NMR(DMSO-d6)δppm 9.79(br s，1H，1/2NH2)，8.72(br s，7H，1/2NH2和NH3+)，8.04(d，1H，H-6)，6.21(d，J＝7.8Hz，1H，H-5)，6.16(t，J＝6.9Hz，1H，H-1′)，5.39(m，1H，H-3′)，4.50-4.40(m，3H，H-4′，H-5′和H-5″)，3.90(2 br.d，2H，CH-NH3+)，2.63-2.50(2m，2H，H-2′and H，2″)，2.21(m，2H，CH(iPr))，1.02-0.94(m，12H，CH(CH3)2)；13C NMR(DMSO-d6)δppm169.50和168.94，161.02，148.50，145.26，95.18，87.19，82.15，76.14，65.77和65.59，58.12和58.07，37.00，30.16，19.26-18.51；FAB＞0(GT)426(M+H)+，112(B+2H)+；FAB＜0，(GT)m/z 885(2M+Cl)-，460(M+Cl)；UV(H2O)λmax＝270nm(ε7600).
实施例132’-脱氧-β-L-胞苷的N4-Boc-缬氨酸酯(13，图6)用氯代三甲基硅烷(6ml，47.28mmol)处理L-dC(1.80g，7.92mmol)和三乙胺(8.8mg，63.14mmol)在无水THF(80ml)中的混合物，并搅拌过夜。加入NH4Cl的饱和水溶液(26ml)和水(10ml)，中止反应。水层用EtOAc萃取三次。合并有机层，用盐水洗涤，干燥(Na2SO4)，减压蒸发，产生包含11的粗淡黄色泡沫油，不用纯化，直接用于下一步。该残余物用CH2Cl2(104ml)溶解，用N-(叔丁氧基羰基)-L-缬氨酸(Boc-Val-OH，1.72g，7.90mmol)、苯并三唑-1-基氧基-三(二甲氨基)鏻六氟磷酸盐(BOP，4.20g，9.50mmol)、三乙胺(2.2ml，15.78mmol)处理，然后在室温下搅拌2天。所述溶液用EtOAc稀释，然后用饱和NaHCO3萃取二次。有机层干燥(Na2SO4)，减压蒸发，产生粗品物质12，不用纯化，直接用于下一步。该残余物用二氧杂环己烷(80ml)溶解，用26％NH4OH水溶液处理，然后在室温下搅拌6小时45分钟。所述溶液减压蒸发，用无水EtOH共蒸发，残余物用CH2Cl2中的MeOH(5-10)阶式梯度洗脱在硅胶上进行色谱纯化，得到为泡沫的标题化合物13(1.64g，总产率48.5％)。
1H NMR(DMSO-d6)δppm 10.88(s，1H，NH-4)，8.40(d，1H，H-6)，7.26(d，J＝7.4Hz，1H，H-5)，7.06(d，J＝8.2Hz，1H，CH-NH-Boc)，6.15(t，J＝6.3Hz，1H，H-1′)，5.32(d，J＝4.2Hz，1H，OH-3′)，5.09(t，J＝5.2Hz，1H，OH-5′)，4.27(m，1H，H-3′)，4.06(pt，J＝7.5Hz，1H，CH-NH-Boc)，3.91(m，1H，H-4′)，3.63(m，2H，H-5′和H-5″)，235(m，1H，H-2”)，2.06(m，2H，H-2′和CH(CH3)2)，1.43(s，9H，tBu)，0.92(pt，J＝6.6Hz，6H，CH(CH3)2)；13C NMR(DMSO-d6)δppm 174.41，162.94，156.47，155.24，146.10，96.06，88.79，87.10，79.09，70.75，61.78，61.55，41.74，30.63，29.02，19.91和19.10；FAB＞0(GT)853(2M+H)+，427(M+H)+311(B+2H)+，255(M-Boc)+；FAB＜0，(GT)m/z 851(2M-H)-，425(M-H)-，309(B)-.
实施例143’，5’-N4-三缬氨酰基-2’-脱氧胞苷(14，图7)原料3’，5’-N4-三(Boc-缬氨酰基)-2’-脱氧胞苷溶解于CH2Cl2中，由于有一些不溶性物质，因此通过Perlita过滤所述样品。这导致所用CH2Cl2的体积增加。然后边搅拌边加入HCl/二氧杂环己烷试剂。几秒钟内，在所述溶液中可以观察到鼓泡现象，然后溶液变浊。所述混合物在室温下搅拌约1小时。在此期间，沉淀成为更多的结晶。快速过滤所述混合物，用CH2Cl2洗滤饼，然后在泵上干燥，得到0.16g乳白色晶体(69％)。试剂和条件在下面表1更明确描速。
表1
实施例15对DiBoc缬氨酰基-2’-dC和DiBoc缬氨酰基-2’-dU的HPLC测定方法将所需化合物溶解在无水乙醇中，制备1.0mg/mL样品。然后所述溶液用含50％MeOH和50％KH2PO4(0.015M，pH＝3.30-3.50)的溶液稀释直到获得0.16mg/mL的浓度。(注意所有使用的溶剂都在使用前脱气。)随后将20μl所述溶液立即注射进WATERS的HPLC柱(NOVAPAK Cl8-4pm-3.9×150mm)。流速设为1mL/分钟，柱温设为35℃。为检测所述化合物，检测Di-Boc 2’-dC时检测波长设为275nm，检测Di-Boc2’dU时检测波长设为260nm，15分钟后在204nm检测杂质。所述柱子使用泵A输送的KH2PO4(0.015M，pH＝3.30-3.50，用10％(体积比)H3PO4调整)和泵B输送的HPLC级乙腈。梯度模式见表2。
表2
IX.所述活性化合物的药代动力学人DNA聚合酶和线粒体功能在体外不受L-dC影响。L-dC对于人外周血单核细胞(PBMC)、骨髓祖先细胞和许多人类和其它非人类哺乳动物来源的细胞系是无细胞毒性的。
抗病毒核苷和核苷类似物在病毒复制期间显示它们的抗病毒效应，如细胞内三磷酸酯衍生物在病毒聚合酶水平上显示作用。如同天然核苷(D-脱氧胞苷和D-胸苷)和抗病毒核苷类似物(如拉米夫定和齐多夫定(zidovudine))一样，L-dC通过磷酸化在细胞内被激活。在人肝细胞中，脱氧胞苷激酶(dCK)负责将L-dC以依赖于剂量的方式初步转化为5’-一磷酸酯(MP)衍生物。L-dC-MP随后转化为5’-二磷酸酯(DP)形式，所述形式接着转化为细胞内主要的5’-三磷酸酯(TP)代谢物。HepG2细胞暴露于10μM L-dC(在初级人肝细胞中是90.1μM)24小时后，L-dC-TP水平达到72.4μM，其细胞内半衰期是15.5小时。在内源聚合酶测定中，L-dC-TP抑制WHV的病毒体相关DNA聚合酶，其50％抑制浓度(IC50)是1.82μM。L-dC抑制HBV DNA聚合酶的详细机制在研究中。HepG2细胞或人肝细胞在初级培养物中暴露于L-dC也产生第二种TP衍生物，β-L-2’-脱氧尿苷5’-三磷酸酯(L-dU-TP)。HepG2细胞暴露于10μM L-dC(在初级人肝细胞中是43.5μM)24小时后，L-dC-TP水平达到18.2μM。
在初级人肝细胞培养物和在人肝细胞瘤细胞系(HepG2)中，L-dC的主要代谢物是L-dC-FP。这些细胞暴露于L-dC也导致L-dU-TP的形成。L-dC-TP和L-dU-TP直到100μM(测试的最高浓度)仍不抑制人DNA聚合酶α、β和γ。
实施例16溶解性研究比较天然脱氧核糖胞嘧啶(D-dC)、L-dC的3’-缬氨酰酯和L-dC的3’，5’-二缬氨酰酯在水中的溶解度。如下评估L-dC的溶解性首先顺序注射如表3所示已知浓度的β-L-dC，分析HPLC数据(即曲线下的面积)。HPLC运行条件如下Nova-Pack C18柱(3.9×150mm)，20mM乙酸三乙铵缓冲液(TEAAc)中CH3CN 0-25％的梯度，时间十五分钟，流速每分钟1mL。溶液浓度对曲线下面积具有下面线性关系y＝4150049477x-4334.46845(图8a)。
表3
随后，用天然脱氧核糖胞嘧啶(D-dC)制备饱和溶液；取3个样品，注射入HPLC。该饱和溶液的浓度测定为1.07、1.08和0.96mol/L；因此，该饱和溶液的平均饱和浓度为1.03mol/L或272g/L。所述结果在表4中列表。
表4
相似地，评估β-L-dC的3’-缬氨酰酯盐酸盐在水中的溶解度。如下制作校准曲线顺序注射各种浓度β-L-dC的3’-缬氨酰酯盐酸盐进HPLC，测量曲线下面积，如表5所示。同样，HPLC运行条件如下Nova-Pack Cl8柱(3.9×150mm)，20mM乙酸三乙铵缓冲液(TEAAc)中CH3CN 0-25％的梯度，时间十五分钟，流速每分钟1mL。溶液浓度对曲线下面积具有下面线性关系y＝3176423963x-33051.63。
表5
随后，尝试制备β-L-dC的3’-缬氨酰酯盐酸盐的饱和溶液；然而，没有获得一份溶液。因此，将实验室中容易获得的最大量β-L-dC的3’-缬氨酰酯盐酸盐溶解于水中。收集3份样品，根据HPLC的曲线下面积确定平均浓度为1.013、0.996和1.059mol/L。所述结果在表6中列表。
表6
所有三个结果都在从校准曲线上预测的范围内，这表明所述化合物在这些高浓度下完全溶解，表明该样品的饱和溶液大于这三个样品的平均值，即大于1.023mol/L或408g/L。
评估β-L-dC的3’，5’-二缬氨酰酯盐酸盐在水中的溶解度。如下制作校准曲线顺序注射各种浓度β-L-dC的3’，5’-二缬氨酰酯盐酸盐进HPLC，测量曲线下面积，如表7所示。同样，HPLC运行条件如下Nova-Pack Cl8柱(3.9×150mm)，20mM乙酸三乙铵缓冲液(TEAAc)中CH3CN 0-25％的梯度，时间十五分钟，流速每分钟1mL。溶液浓度对曲线下面积具有下面线性关系y＝3176423963x-33051.63(图8b)。
表7
随后，尝试制备β-L-dC的3’，5’-二缬氨酰酯盐酸盐的饱和溶液；然而，没有获得一份溶液。因此，将实验室中溶液获得的最大量β-L-dC的3’，5’-二缬氨酰酯盐酸盐溶解于水中。收集3份样品，根据HPLC的曲线下面积确定平均浓度为2.8、2.4和2.4mol/L。所述结果在表8中列表。
表8
所有三个结果都在从校准曲线预测的范围内，这表明所述化合物在这些高浓度完全溶解，表明该样品的饱和溶液大于这三个样品的平均值，即大于2.5mol/L或1337g/L。
对β-L-dC的5’-缬氨酰酯盐酸盐(大于5.1mol/L或1664g/L)和β-L-dC的3’，5’-二乙酰酯盐酸盐(3.3mol/L或1148g/L)进行相似的溶解度研究。累积结果列表于表9。
表9
Log P研究-磷酸盐缓冲液将约1.5mg D-dC溶解于2.2mL 0.02M磷酸盐缓冲液(A，100mL，pH7.2)，所述磷酸盐缓冲液由磷酸氢钾溶液(28.5mL)和磷酸二氢钾溶液(71.5mL)的混合物制成，然后用辛醇-1(B)饱和。在1mL该溶液中，加入1mL用0.02M磷酸盐缓冲液(A)饱和的辛醇-1(B)。振荡所得的混合物并离心；从每个阶段取三个样品并用HPLC分析，如表10所示。HPLC运行条件如下Nova-Pack C18柱(3.9×150mm)，20mM乙酸三乙铵缓冲液(TEAAc)中CH3CN 0-25％的梯度，时间十五分钟，流速每分钟1mL。发现D-dC的log P是-1.41；因此，D-dC亲水强于亲辛醇。
表10
相似地，将约1.5mg L-dC-3’-缬氨酰酯盐酸盐溶解于2.5mL 0.02M磷酸盐缓冲液(A，100mL，pH7.2)，所述磷酸盐缓冲液由磷酸氢钾溶液(28.5mL)和磷酸二氢钾溶液(71.5mL)的混合物制成。所述溶液随后用辛醇-1(B)饱和。在1mL该溶液中，加入1mL用0.02M磷酸盐缓冲液(A)饱和的辛醇-1(B)。振荡所得的混合物并离心；从每个阶段取三个样品并用HPLC分析，如表11所示。HPLC运行条件如下Nova-Pack CL8柱(3.9×150mm)，20mM乙酸三乙铵缓冲液(TEAAc)中CH3CN 0-25％的梯度，时间十五分钟，流速每分钟1mL。
表11
发现L-dC-3’-缬氨酸酯盐酸盐的log P是-1.53；因此，L-dC-3’-缬氨酸酯盐酸盐亲水强于亲辛醇的程度大于D-dC。
计算L-dC-5’-缬氨酸酯盐酸盐和L-dC-3’，5’-二缬氨酸酯盐酸盐的log P值。所述结果列表于表12。然而，应当注意的是L-dC-3’，5’-二缬氨酸酯盐酸盐的log P值可能低于测量值(-0.86)。在实验期间观察到所述二缬氨酸酯明显转化为3’-或5’-单缬氨酰酯甚至L-dC。检测到水相中50％的L-dC-3’，5’-二缬氨酸酯盐酸盐发生转化，有机相中14％的L-dC-3’，5’-二缬氨酸酯盐酸盐发生转化。该转化是由于所述酯在pH7的磷酸盐缓冲液中的不稳定性所致(见实施例15和16)。
表12
Log P’研究-MilliQ水为避免二缬氨酸酯转化为一酯和L-dC，使用MilliQ水(A’)而不是磷酸盐缓冲液(pH6.5而不是7.2)进行log P研究。重要的是要注意仅有二缬氨酰酯的盐酸盐形式能够用水进行所述研究。将约1.5mgL-dC-3’，5’-二缬氨酰酯盐酸盐溶解于2.2mL用辛醇-1(B)饱和的MilliQ水(A’，pH6.5)中。在1mL该溶液中，加入1mL用MilliQ件(A’)饱和的辛醇-1(B)。振荡所得的混合物并离心；从每个阶段取三个样品并用HPLC分析，如表13所示。HPLC运行条件如下Nova-Pack C18柱(3.9×150mm)，20mM乙酸三乙铵缓冲液(TEAAc)中CH3CN0-25％的梯度，时间十五分钟，流速每分钟1mL。发现在这些条件下3’，5’-二缬氨酸酯的log P’是-2.72，这表明在磷酸盐缓冲液中有抗衡离子的强烈作用。在水相或有机相中没有观察到所述二缬氨酸酯转化为单酯或L-dC。
表13
相似地，将约1.5mg L-dC-5’-缬氨酰酯盐酸盐溶解于2.2mL用辛醇-1(B)饱和的MiliQ水(A’，pH6.5)中。在1mL该溶液中，加入1mL用MilliQ水(A’)饱和的辛醇-1(B)。振荡所得的混合物并离心；从每个阶段取三个样品并用HPLC分析，如表14所示。HPLC运行条件如下Nova-Pack Cl8柱(3.9×150mm)，20mM乙酸三乙铵缓冲液(TEAAc)中CH3CN 0-25％的梯度，时间十五分钟，流速每分钟1mL。发现在这些条件下5’-缬氨酸酯的log P’是-2.75，比使用磷酸盐缓冲液进行的log P研究中获得的值低。
表14
在这些条件下，L-dC-5’-缬氨酰酯盐酸盐和L-dC-3’，5’-二缬氨酰酯盐酸盐的log P’值非常相似(表15)。
表15
在pH7.4的稳定性计算L-dC-3’-缬氨酸酯盐酸盐每种代谢物的分解速率。在0.2MTris-HCl溶液中，37℃下，测得L-dC-3’-缬氨酸酯盐酸盐在pH7.40时的半衰期是7小时。在这些条件下，L-dC-3’-缬氨酸酯盐酸盐仅转化为L-dC。没有检测到胞嘧啶，因此，没有可检测的糖苷键破裂。
相似地，计算L-dC-3’，5’-二缬氨酸酯盐酸盐每种代谢物的分解速率。在0.2M Tris-HCl溶液中，37℃下，测得L-dC-3’，5’-二缬氨酸酯盐酸盐在pH7.42时的半衰期是2.4小时。在这些条件下，L-dC-3’，5’-二缬氨酸酯盐酸盐部分水解为3’-和5’-缬氨酰基-L-dC，所述物质随后转化为L-dC。没有检测到胞嘧啶，因此，没有可检测的糖苷键破裂(方案4，图9a和图9b)。
方案4 在pH7.20时的稳定性研究在20mM磷酸盐缓冲液中，测得L-dC-3’，5’-二缬氨酸酯盐酸盐在pH7.20时的半衰期是2.2小时。在这些条件下，L-dC-3’，5’-二缬氨酸酯盐酸盐部分水解为3’-和5’-缬氨酰基-L-dC，这两种物质随后转化为L-dC。没有检测到胞嘧啶，因此，没有可检测的糖苷键破裂(方案5，图10a和图10b)，
方案5 在pH4.5时的稳定性研究在20mM乙酸盐缓冲液中，测得L-dC-3’-缬氨酸酯盐酸盐在pH4.5时的半衰期是8.6天。同样，L-dC-3’-缬氨酸酯盐酸盐仅仅转化为L-dC。没有检测到胞嘧啶，因此，没有可检测的糖苷键破裂。
相似地，在20mM乙酸盐缓冲液中，测得L-dC-3’，5’-二缬氨酸酯盐酸盐在pH4.51时的半衰期是44小时。在这些条件下，L-dC-3’，5’-二缬氨酸酯盐酸盐部分水解为3’-和5’-缬氨酰基-L-dC，这两种物质随后转化为L-dC。没有检测到胞嘧啶，因此，没有可检测的糖苷键破裂(图11a和图11b)。
在pH1.2时的稳定性研究在135mM KCl-HCl缓冲液中，测得L-dC-3’-缬氨酸酯盐酸盐在pH1.2时的半衰期是48小时。没有检测到胞嘧啶，因此，没有可检测的糖苷键破裂。
相似地，对L-dC-5’-缬氨酸酯盐酸盐进行稳定性研究。该化合物在pH1.2时非常稳定，直到23小时都没有检测到其它代谢物或分解产物。在溶液中直到第2天仍没有检测到糖苷键破裂。
发现L-dC的3’，5’-二乙酰酯在pH1.2时的半衰期是11.2小时。在这些条件下，所述化合物部分水解为3’-或5’-衍生物，这两种物质随后转化为L-dC。在溶液中直到第2天仍没有检测到糖苷键破裂。
发现L-dC的3’，5’-二缬氨酰酯在pH1.23时非常稳定，因为在这些条件下直到48小时仍没有检测到其它化合物。在溶液中直到第2天仍没有检测到糖苷键破裂(图12)。
或者，当用二甲氨基亚甲基或乙酰基掩蔽L-dC的N4位时，所述化合物在pH1.2时的半衰期分别仅是26分钟或50分钟。
L-dC在猕猴体内的单剂生物利用度测定将L-dC静脉内或口服给予猕猴后L-dC的药代动力学。在该研究中，将单剂静脉内剂量10mg/kg氚([3H])放射标记的L-dC给予三只猕猴。在六周清除期后，同样的三只猕猴接受相同的L-dC口服剂量。在给药前和给药后0.25、0.5、1、2、3、6、8和24小时收集用于药代动力学分析的血液样品。使用盘收集器(pan catch)在下面时间收集用于药代动力学分析的尿样品给药前和给药后的下面间隔0-2小时、2-4小时、4-8小时和8-12小时，此后以12小时间隔直到给药后336小时。使用反相高效液相色谱技术检测所述药物并测定浓度。通过非建模(non-modeling)的数学方法分析血液和尿药物水平数据，根据线性梯形法则推导AUC。
静脉内给予L-dC。在所有动物中，静脉给药后L-dC的平均Cmax是95.7μM，出现在最早取样时间(给药后15分钟)。静脉内团(bolus)推注后L-dC血浆浓度随时间降低，平均t1/2是1.59小时。静脉内给药后L-dC的总清除(CL)和肾清除(CLR)分别平均是0.53L/小时/kg和0.46L/小时/kg。平均表现分布体积(Vd)是1.22L/kg，这表明L-dC具有显著的血管外组织分布。
尿排泄是快速的，在2小时内回收71％给药剂量。L-dC占尿中回收剂量的大部分(94％)。肾清除(0.46L/小时/kg)占总L-dC清除的87％，这提示肾清除是主要排除途径。
在血浆和尿中检测到L-dU，这表明在静脉内给药后也发生L-dC的代谢排除。在血浆中检测到在检测限附近的低水平L-dU(检测下限(LLOD)＝0.1μM)。L-dU的肾排除占尿中回收的总剂量的4.0％。除L-dU外，在血浆或尿中没有检测到其它代谢物。
口服给予L-dC。Cmax是3.38μM，出现在Tmax2.33小时。L-dC的血浆浓度以两阶段(biphasic manner)方式降低，平均末端t1/2是2.95小时，24小时后所有猕猴体内的L-dC血浆浓度低于检测限。L-dC从胃肠道吸收，平均口服生物利用度(F)是16.4％。
在血浆和尿中检测到L-dU，这提示在口服给药之后发生L-dU的代谢排除。在血浆中检测到在LLOD时低水平L-dU。除L-dU外，在血浆和尿中没有检测到其它代谢物。
12小时内在尿中回收约8.5％的口服给药剂量。72小时后回收15.5％±8％。L-dC占尿中排泄药物的大部分(约69％)。L-dU的肾排泄占总回收剂量的29％。不收集粪便。
表16展示L-dC在猕猴中静脉内给予和口服给予的药代动力学结果的综述。
表16在猕猴中静脉内给予和口服给予L-dC(10mg/kg)的药代动力学分析
平均值(±SD)L-dC在恒河猴中的单剂生物利用度测定将L-dC口服给予恒河猴后L-dC的药代动力学。在该研究中，将单剂口服剂量10mg/kg氚([3H])放射标记的L-dC给予三只恒河猴。在给药前和给药后0.25、0.5、1、2、3、6、8和24小时收集用于药代动力学分析的血液样品。使用盘收集器(pan catch)在下面时间收集用于药代动力学分析的尿样品给药前和给药后的下面间隔0-2小时、2-4小时、4-8小时和8-12小时，此后以12小时间隔直到给药后336小时。使用反相HPLC技术检测所述药物并测定浓度。通过非建模(non-modeling)的数学方法分析血液和尿药物水平数据，根据线性梯形法则推导AUC。
平均AUC0.25→8和Cmax值分别是12.2mgM.h和3.23mgM。Cmax出现在Tmax0.83小时。平均t1/2是3.34小时，24小时后所有恒河猴体内L-dC血浆浓度低于检测水平。L-dC的平均肾清除是0.273L/小时/kg。在接受L-dC的恒河猴的血浆中没有观察到代谢物。
8小时后在尿中回收约8.5％给予的口服剂量(L-dC的口服生物利用度是约16％)。48小时后回收15％。L-dC占尿中排泄药物的大部分(约77％)。L-dC的肾排泄占总回收剂量的23％。除L-dU外，没有检测到其它代谢物。
L-dC口服给予恒河猴后AUC和Cmax类似于在猕猴中观察到的所述值。
L-dC在大鼠中的单剂生物利用度测定L-dC在大鼠内的药代动力学和生物利用度。在该研究中，将单剂静脉内剂量10mg/kg氚([3H])放射标记的L-dC给予三只雌性Sprague-Dawley大鼠。第二组三只动物接受相同的L-dC口服剂量。在给药后0.17、0.33、0.5、1、2、3、4、6、8和24小时收集用于药代动力学分析的血液样品。在给药后8小时和24小时收集尿。使用反相HPLC技术在血浆和尿中检测所述药物并测定浓度。通过非建模(non-modeling)的数学方法分析血液和尿药物水平数据，根据线性梯形法则推导AUC。
静脉内给予L-dC。平均AUC0.25→8值是30.1mM.小时。在所有动物中，L-dC的平均Cmax值是91.1mgM，出现在最早取样时间(给药后10分钟)。静脉内团(bolus)推注后L-dC血浆浓度以两阶段方式降低，平均t1/2是1.21小时。L-dC的CL平均是1.44L/小时/kg。平均Vd是2.53L/kg，这表明L-dC具有显著的血管外组织分布。在接受L-dC的大鼠的血浆中没有观察到代谢物。
L-dC占尿中回收放射性的大部分。在尿中检测到L-dU，这提示在静脉内给药后发生L-dC的代谢排除。
口服给予L-dC。平均AUC0.25→8值是4.77mM.小时。平均Cmax是1.50mgM，出现在Tmax1.0小时。L-dC的血浆浓度降低，t1/2为2.52小时降低。L-dC从胃肠道有限摄取，平均口服生物利用度(F)是15.4％。口服给予L-dC后在大鼠血浆中没有观察到代谢物。
L-dC占尿中回收放射性的大部分。在血浆和尿中检测到L-dU，这提示在静脉内给药后发生L-dC的代谢排除。
表17展示静脉内给予和口服给予L-dC的药代动力学结果的综述。
表17在大鼠中静脉内给予和口服给予L-dC(10mg/kg)的药代动力学分析
平均值(±SD)L-dC在旱獭体内的单剂生物利用度测定L-dC在旱獭体内的药代动力学和生物利用度。在该研究中，将单剂静脉内剂量10mg/kg氚([3H])放射标记的L-dC给子三只旱獭。在给药后2、5、15和30分钟以及1.0、1.5、2.0、3.0、4.0和24小时收集用于药代动力学分析的血液样品。在七周清除期后，同样动物接受单剂口服剂量10mg/kg L-dC。在给药后15和30分钟以及1.0、1.5、2.0、3.0、4.0和24小时收集用于药代动力学分析的血液样品。在给药后24小时时间内收集尿。测定血浆药物水平、CL、t1/2和F。使用HPLC方法和在线(in-line)放射性检测以及闪烁计数测定药物水平。
静脉内给予L-dC。在所有动物中，L-dC的平均Cmax是112μM，出现在最早取样时间(给药后2分钟)。静脉内团(bolus)推注后L-dC血浆浓度以两阶段方式降低，平均t1/2是2.85小时。L-dC的CL平均是0.39L/小时/kg。平均Vd是1.17L/kg。L-dC占尿中回收放射性的大部分。在血浆和尿中检测到L-dU，这表明在静脉内给药后发生L-dC的代谢排除。在血浆中间断检测到的L-dU水平在测定方法定量限上或以下，平均Cmax是0.75μM。
口服给予L-dC。Cmax是1.37μM，出现在Tmax3小时。L-dC的血浆浓度降低，平均t1/2是5.22小时。L-dC从胃肠道吸收，平均生物利用度从5.60到16.9％，平均9.57％。L-dC占尿中回收放射性的大部分。在血浆和尿中检测到L-dU，这表明在口服给药后发生L-dC的代谢排除。血浆中的L-dU接近定量限，平均Cmax是0.19μM。
表18展示静脉内给予和口服给予L-dC的药代动力学结果的综述。
表18在旱獭中静脉内给予和口服给予L-dC(10mg/kg)的药代动力学分析
a 对于静脉内给予，t＝0.033小时，对于口服给予，t＝0.25小时b 平均值(±SD)L-dC的前体药物的生物利用度用或不用L-dT，评估L-dC、L-dC的5’-单酯、L-dC的二缬氨酸酯和L-dC的二乙酰酯在猕猴中的生物利用度。当将L-dC的二缬氨酸酯口服给予猕猴时，约73％剂量得到吸收。在吸收的L-dC的二缬氨酸酯中，超过99％快速转化为L-dC，在血浆中产生高L-dC浓度并且再也检测不到L-dC的二缬氨酸酯。口服给予L-dC的二缬氨酸酯后，在早期检测到低血浆浓度的L-dC的单缬氨酸酯。间断检测到低血浆浓度的β-L-2’-脱氧尿苷(L-dU)。没有检测到其它代谢物。结果显示于表19。如下表所表明的，L-dC的3’，5’-二缬氨酰酯与L-dT的组合提供最高的L-dC生物利用度。
表19
1根据L-dC(口服剂量)的AUC估计2与10mg/kg L-dT共同给予3根据总放射性剂量的比活(specific activity)5’-单缬氨酸酯研究ND，未测定纯度＝87％L-dC-单缬氨酸酯，12％L-dCdival-L-dC在猕猴中的单剂生物利用度三只雄性非原初(non-naive)猕猴(macaca fascicularis)静脉内接受溶于无菌9.0％盐水中的10mg/kg的dival-L-dC以及痕量氚([H))标记的drub(250μCi)。在六周清除期后，同样的三只动物接受相同口服剂量的dival-L-dC。在给药前(约18小时)和给药后0.25、0.50、1、2、3、4、6、8和24小时收集血液样品于肝素化的管中。在下面时间收集尿给药后0-2小时、2-4小时、4-8小时和8-12小时，此后以12小时间隔直到给药后336小时。使用液相色谱-质谱(LC-MS)技术定量血浆和尿中的药物。给予dival-L-dC后，使用非建模数学方法以及根据线性梯形法则推导的时间-浓度曲线下的面积(AUC)分析L-dC血浆浓度随时间的变化。在静脉内给予和口服给予dival-L-dC后，从所述L-dC AUC计算L-dC的生物利用度(F)，其中F＝AUC口服给予/AUC静脉内给予x静脉内给予剂量/口服给予剂量。
静脉内给予的dival-L-dC在静脉内给予后快速转化为L-dC。在15分钟(1.39μM)和30分钟(0.36μM，3只动物中的1只)在血浆中检测到dival-L-dC[定量下限(LLOQ)＝23μM或100ng/mL]。给药后30分钟在血浆中检测不到dival-L-dC。在15分钟在血浆中检测到dival-L-dC的部分去酯化形式β-L-2’-脱氧胞苷-5’-缬氨酸酯(3.23μM)，其浓度在2小时内降到0.08μM(LLOQ＝0.031μM或10ng/mL)。静脉内给药后，L-dC代表血浆中存在药物的大部分。L-dC的平均AUC0.25→8是19.8μM.h。L-dC的平均峰血浆浓度(Cmax)是24.6μM(LLOQ＝0.088μM或20ng/mL)，在所有动物中在最早取样时间(给药后15分钟)出现。L-dc的血浆浓度以两阶段方式降低，平均t1/2是1.73小时。L-dC的总体内清除(CL)和表现分布体积(Vd)分别平均是1.01L/小时/kg和2.46L/kg，这表明L-dC有显著的血管外组织分布。dival-L-dC和L-dC与离体的人血浆蛋白的结合分别是13.3±2.6％和19.7±5.9％。人血浆蛋白结合对dival-L-dC和L-dC游离药物水平的影响是最低限度的，这提示预计没有涉及结合位点取代的药物相互作用，尿排泄是迅速的，静脉内给药后2小时内排泄出58±3％的dival-L-dC给予剂量。L-dC占尿中排泄药物的大部分(约93％)。在血浆和尿中也检测到L-dU。这提示在给予dival-L-dC之后也发生L-dC的代谢排除。在间断的时间点，三只动物的两只的血浆中检测到低水平L-dU，浓度范围从0.22μM到0.88μM(LLOQ＝0.22μM或50ng/mL)。第三只动物体内在任何时间点都没有可检测水平的L-dU。L-dU和dival-L-dC的部分去酯化形式β-L-2’-脱氧胞苷-5’-缬氨酸酯的肾排泄是较少的，分别占总回收剂量的约2.5％和3.7％。静脉内给药后2小时，在三只动物的一只的尿中检测到dival-L-dC，占回收剂量的约0.15％。
因为单缬氨酸酯和L-dU在血浆和尿中的浓度间断并且低，所以无法对这些代谢物进行药代动力学分析。dival-L-dC单缬氨酸酯的表现是无法预料的，因为它代表dival-L-dC到L-dC的转化，是所述转化的中间体。此外，在猴、大鼠和人原代肝细胞和HepG2细胞提取物中的体外细胞代谢研究证明L-dC并不是直接脱氨形成L-dU，而是L-dC一磷酸酯(-MP)转化为L-dU-MP，L-dU-MP或者受激活成为L-dU二磷酸酯(-DP)和三磷酸酯(-TP)，或者代谢形成L-dU，L-dU随后在细胞外区室(血浆)中检测到。L-dU是无细胞毒性的(CC50＞200μM)，L-dU-TP在体外对抗乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸(DNA)聚合酶的IC50是5.26μM(见Microbiology和Virology，第10部分)。
口服给予的dival-L-dC在口服给药后也快速转化为L-dC，并且在任何时间点在血浆样品中检测不到(dival-L-dC在溶液中的LLOQ＝0.23μM或100ng/mL)。在30分钟和1小时在血浆中可以检测到dival-L-dC部分去酯化代谢物β-L-2’-脱氧胞苷-5’-缬氨酸酯，其浓度范围从0.034β到0.107β(单酯在溶液中的LLOQ＝0.031μM或10ng/mL)。dival-L-dC在血浆中检测不到。
口服给予dival-L-dC后，L-dC代表血浆药物水平的大部分(在Cmax时多于99％)。L-dC的平均AUC0.25→8值是14.0μM.小时。L-dC的Cmax是8.26μM(L-dC在溶液中的LLOQ＝0.088μM或20ng/mL)，出现在给予dival-L-dC后0.67小时。L-dC的血浆浓度以两阶段方式降低，平均t1/2是2.28小时。给予dival-L-dC后L-dC的平均口服生物利用度是72.7％±22％。
在血浆中还检测到L-dU，这表明口服给予dival-L-dC后发生L-dC的代谢排除。在三只动物的两只中，在从30分钟到4小时的血浆中检测到低水平的L-dU，其浓度范围从0.24μM到0.66μM(L-dU在溶液中的LLOQ＝0.22μM或50ng/mL)，在一只动物中仅在8小时检测到，其浓度为0.39μM。
口服给药后，dival-L-dC从胃肠道快速吸收，并由首过(first-pass)肠代谢和/或肝代谢转化为L-dC。dival-L-dC和L-dC代谢都与肝微粒体酶无关。给予高剂量水平dival-L-dC后，L-dC单缬氨酸酯在转化为L-dC前能够短暂检测到。口服给药后检测不到dival-L-dC。检测到间断的低血浆水平L-dU，其水平在测定方法定量下限上或以下。细胞摄取L-dC后，将L-dC脱氨化，形成L-dU。
在尿中4小时内回收约31±8％的口服给予剂量。72小时后回收39±8％。L-dC占尿中排泄药物的大部分(约95％)。L-dU和dival-L-dC部分去酯化形式β-L-2’-脱氧胞苷-5’-缬氨酸酯的肾排泄是较少的，分别占总回收剂量的约2.5％和0.2％。在尿中没有检测到dival-L-dC。
表20代表静脉内给予和口服给予dival-L-dC后L-dC的药代动力学结果的综述。
表20在猕猴中静脉内给予和口服给予dival-L-dC(10mg/kg)的药代动力学分析药代动力学参数2
(3)平均值[±标准差(SD)]表21代表静脉内给予和口服给子dival-L-dC后dival-L-dC代谢物形式(L-dC单缬氨酸酯、L-dC和L-dU)的示意图。
表21静脉内给予和口服给予dival-L-dC的代谢物形式
L-dC通过dival-L-dC在猕猴中的口服生物利用度三只雄性非原初(non-naive)猕猴(macaca fascicularis)口服接受溶于无菌0.9％盐水中的10mg/kg dival-L-dC以及痕量氚([H])标记的药物(250μCi)。在给药前(约18小时)和给药后0.25、0.50、1、2、3、4、6、8和24小时收集血液样品于肝素化的管中。在下面时间收集尿给药后0-2小时、2-4小时，4-8小时和8-12小时，此后以12小时间隔直到给药后336小时。使用HPLC分析定量血浆和尿中的药物。给予dival-L-dC后，使用非建模数学方法以及根据线性梯形法则推导的时间-浓度曲线下的面积(AUC)分析L-dC血浆浓度随时间的变化。Dival-L-dC口服给予后快速吸收并转化为L-dC。血浆样品的放射色谱高压液相色谱(HPLC)证实大部分回收的放射性是L-dC。仅在一只动物体内在给药后15分钟检测到dival-L-dC，其浓度为0.35μM。在血浆或尿中没有检测到dival-L-dC部分去酯化形式β-L-2’-脱氧胞苷-5’-缬氨酸酯。在尿中8小时内回收约26％的口服给予剂量。72小时后回收31％。L-dC占尿中排泄药物的大部分(约89％)。L-dU的肾排泄是较少的，占回收剂量的约10％。在尿中没有检测到dival-L-dC或其部分去酯化形式以及其它代谢物。
总药代动力学模式类似于药代动力学研究的结果，正如类似于Cmax与AUC比例所证明的。在三只动物的两只动物体内的血浆中检测到低水平L-dU，平均Cmax是0.33μM。在第三只动物的血浆中没有检测到L-dU。L-dU的水平在定量限或以下，使得无法进行药代动力学分析。
dival-L-dC的体外代谢进行研究以确定dival-L-dC及其去酯化代谢物在人血浆中的稳定性和蛋白结合。dival-L-dC在37℃下与人血浆温育，并在不同时间点分析样品直到24小时(图13)。24小时后检测不到dival-L-dC，其完全转化为L-dC。还观察到两种其它的代谢物(β-L-2’-脱氧胞苷-5’-缬氨酸酯和β-L-2’-脱氧胞苷-缬氨酸酯)。这些代谢物的短暂存在表明它们是从dival-L-dC转化为L-dC的中间体。经测定，37℃下dival-L-dC在人血浆中的体外半衰期约是39分钟。
还使用超滤方法研究人血浆蛋白结合对dival-L-dC和L-dC游离水平的影响。dival-L-dC的血浆蛋白结合是13.3％±2.6％。L-dC与血浆蛋白的结合是19.7％±5.9％。该研究显示人血浆蛋白结合对dival-L-dC和L-dC的影响是较小的，这提示预期没有涉及结合位点取代的药物相互作用。
L-dC的代谢激活和细胞内模式使用HepG2细胞和人原代肝细胞研究L-dC的细胞代谢。高压液相色谱(HPLC)分析证明L-dC在肝细胞中被大范围的磷酸化。HepG2细胞暴露于10μM L-dC 24小时后细胞内主要代谢物是L-dC-TP，其浓度达到72.4±1.8μM(见表23)。在初级人肝细胞中，在24小时L-dC-TP的浓度是90.1±37μM，类似于HepG2细胞中的磷酸化水平。肝细胞暴露于L-dC导致第二种5’-三磷酸酯衍生物L-dU-TP的激活。在暴露于10μM L-dC的HepG2细胞中，L-dU-TP水平在24小时达到18.2μM(在初级人肝细胞中是43.5pM)。在初级大鼠和猴肝细胞中，L-dC磷酸化的程度稍低。
表23L-dC(10μM)在肝细胞中的激活
(a)细胞与[3H]-L-dC温育24小时，比活HepG2测定＝0.5Ci/mmol；人、猴和大鼠肝细胞测定＝1.0Ci/mmol。
除L-dC和L-dU的磷酸化衍生物外，还观察到形成[β-L-2’-脱氧脂核苷酸(deoxyliponucleotide)代谢物。在暴露于10μM L-dC达24小时的HepG2细胞和原代肝细胞培养物中，检测到[3-L-2’-脱氧胞苷-5’-二磷酸胆碱(L-dC-DP-胆碱)的浓度分别为25.6μM(范围25.6-25.7μM)和12.3μM(范围8.82-15.8μM)。
HepG2细胞暴露于10μM[3H]-L-dC达24小时后获得的代谢模式图见图14。L-dC-TP的表现细胞内半衰期是15.5±0.34小时，这与病毒反跳实验中停药后延长的抗病毒活性相关。在初级人肝细胞中检测到的磷酸化模式是定性的，在定量上类似于使用HepG2细胞获得的模式(图15)。
与代谢激活有关的细胞激酶D-脱氧胞苷(dCyd)是胞质dCyd激酶(dCK)和线粒体胸苷激酶(TK2)转化生成dCyd-5’-一磷酸(dCMP)的天然底物。胞质胸苷激酶(TK1)和TK2利用D-胸苷(Thd)作为天然底物转化生成Thd-5’-一磷酸(TMP)。在使用L-dC和天然内源Thd和dCyd的竞争性研究中鉴定涉及初步磷酸化L-dC的细胞激酶。L-dC的细胞内磷酸化由dCyd而不是Thd以依赖于剂量的方式降低。因此，dCyd作为L-dC磷酸化的抑制剂起作用。当HepG2细胞暴露于Thd和dCyd或者暴露于单独的dCyd时，L-dC细胞内磷酸化的改变相似。L-dC磷酸化仅受到天然脱氧嘧啶dCyd抑制，这提示dCK与L-dC磷酸化有关。
在激酶缺陷型细胞系中进一步研究这些嘧啶核苷激酶活性在L-dC磷酸化中的作用。L-dC磷酸化代谢物的数量在dCK缺陷型细胞中显著降低。然而，没有观察到在TK1缺陷型细胞内的L-dC磷酸化的显著变化。这些数据与上述竞争性研究一致，表明dCK在L-dC磷酸化生成L-dC-MP的过程中起关键作用。
使用HepG2细胞的胞质提取物作为酶来源，L-dC、Thd和dCyd磷酸化的稳态动力学相似，正如表观Michaelis-Menten常数(Km)和最大初速度(Vmax)值所表明的那样(L-dCKm是5.75mM，Vmax是1.12mmol/分钟/mg蛋白；ThdKm是4.06mM，Vmax是1.26mmol/分钟/mg蛋白；dCydKm是4.85mM，Vmax是2.15mmol/分钟/mg蛋白)。此外，L-dC、Thd和dCyd磷酸化的效能相似，所述效能根据它们对应的Vmax/Km值定义(分别是0.19、0.31和0.44)。
此外，在旱獭肝提取物中比较L-dC的细胞内磷酸化水平以及天然内源底物(Thd和dCyd)的细胞内磷酸化水平。进行所述比较以支持在慢性乙型肝炎病毒感染的旱獭模型中进行的抗病毒测试。L-dC磷酸化类似于所述内源底物的磷酸化。此外，所述L-dC的磷酸化水平与人肝提取物中L-dC和所述内源底物的磷酸化类似。
X.活性化合物对抗抗药性HBV的活性β-L-2’-脱氧核苷，尤其是β-L-2’-脱氧胞苷和β-L-2’-脱氧胸苷，是抗药性HBV(M552V)的有效且选择性的抑制剂。包含YMDD突变(其定义为HBV聚合酶的酪氨酸，蛋氨酸，天冬氨酸，天冬氨酸核苷酸结合基因座中的氨基酸置换)的HBV重组体可被用于生成表达拉米夫定抗性HBV的细胞系，虽然这些基因组的复制活性在体外通常低于野生型HBV(Fu和Cheng，1998)。这些重组体系统提供了解决抗性问题的最佳途径。通过采用Huh-7肝细胞(用于所述评估的优选细胞系统)的瞬时转染分析法，根据Ono等(2001年)所描述的方法，可以尝试确定LdT(IND 60，459)对抗拉米夫定抗性HBV株(YMDD突变体)的活性。然而，在Huh-7细胞中，即使针对野生型HBV，LdT也表现出弱活性。虽然Huh-7细胞可以良好地对拉米夫定磷酸化，但LdT被最小限度地磷酸为活性三磷酸酯。这些结果在向LdT End ofPhase 2 Meeting(IND 60，459；Serial 024)的代理处提交的材料中进行了总结。因此，Oho等的系统不适于分析这些药物。
作为可选方法，借助瞬时转染将突变的HBV基因组导入HepG2细胞中。这些试验同样未能成功，主要是由于这些细胞的可转染性较弱且多变，这阻碍了获得抗病毒功效的一致性值。
解决LdT和LdC抗性问题的更为适宜的方法是通过采用表达具有野生型基因组以及分别在552和515或528位的拉米夫定抗性突变的重组HBV病毒的稳定HepG2细胞系。与先前的方法相比较，这些稳定细胞系提供了一致性聚合酶表达水平以及良好的信噪比。
测定药物LdT(telbivudine)和LdC的抵抗乙型肝炎病毒(HBV)的拉米夫定抗性株的体外活性。已被确定在临床情况下产生对拉米夫定治疗抗性的HBV的生物学相关突变体(亚型ayw)出现于聚合酶基因中并包含两个单突变体，M552V和M552I(其见于关键YMDD活性位点模体中)以及两个双突变体L515M/M552V和L515M/M552I。[本文所指L515M突变体相当于在HBV抗性研究中通常引述的B区中的L526M或L528M突变编号的不同反映出不同HBV基因型中的序列插入/缺失]。
材料和方法通过定向诱变制备于这些拉米夫定抗性突变体相应的重组DNA构建体。试验系统包括含有各转染的突变基因组，以及野生型对照HBV基因组的稳定细胞系。测定LdT(telbivudine)和LdC，以及对照药物拉米夫定和PMEA抵抗各个试验细胞系中突变的和野生型HBV基因组的抗病毒活性。
虽然LdC确实达到抵抗L515M/M552V突变体的EC50，但LdT(telbivudine)和LdC表现出抵抗M552I氮突变体或L515M/M552V和L515M/M552I双突变体的最小活性。然而，与拉米夫定相反，此两种药物保留了几乎全部的抵抗M552V单突变HBV基因组的活性。M552V突变具有对拉米夫定的显著抗性，其被认为是突破拉米夫定抗性发展的主要途径中的关键中间体。在用拉米夫定治疗的患者中，M552V突变体通常在高抗性L515M/M552V双突变体出现前4至8周出现(Gauthier等，1999)，其以被报道可以对乙型肝炎患者中60-70％的所有拉米夫定抗性给出解释(Ahmed等，2000).
这些结果提示LdT(telbivudine)和LdC抵抗M552V突变的活性可辅助抑制在患者中出现较大比例的由YMDD介导的抗病毒抗性。结合在目前的IIB期临床试验中对LdT治疗的患者(与拉米夫定受者相比)所观测到的HBV复制的更好的定量抑制，这些结果提示YMDD介导的HBV对LdT的抗性可能基本上不如在拉米夫定治疗中观察到的常见。
在拉米夫定(100mg qd)的控制的临床研究中(施用于HBV感染患者)，在治疗一年后，YMDD突变HBV的发生率是14-32％，而在治疗二-三年后为58％。突变病毒与相对不具有YMDD突变的拉米夫定治疗的患者降低的治疗反应的证据相关联。
对获自患者的病毒分离物的基因型分析(所述患者在接受拉米夫定时存在更新的HBV复制)显示出HBV对拉米夫定敏感性的降低与如下突变相关，该突变导致HBV聚合酶催化区的YMDD模体中蛋氨酸至缬氨酸或异亮氨酸的置换(552位)和515或528位的亮氨酸至蛋氨酸的置换(依据HBV的基因型/亚型)。
目前，尚没有基于细胞的HBV感染系统可用于评价抗病毒剂抵抗获自患者的拉米夫定抗性HBV分离物感染细胞的活性。DHBV体外模型尚未被证实可用于选择抗药性突变，因为该模型中使用的原代鸭肝细胞在细胞培养中无法保持超过数周。旱獭体外模型中抗药性突变体的选择的关联性是不确定的，因为旱獭中拉米夫定抗性突变体的谱与HBV感染患者中鉴定的不符。
包含YMDD突变的HBV重组体可被用于生成表达拉米夫定抗性HBV的细胞系，虽然这些基因组的复制活性在体外通常低于野生型HBV(Fu和Cheng，1998)。这些重组体系统提供了解决抗性问题的最佳途径。通过采用Huh-7肝细胞(用于所述评估的优选细胞系统)的瞬时转染分析法，根据Ono等(2001年)所描述的方法，可以尝试确定LdT(IND 60，459)对抗拉米夫定抗性HBV株(YMDD突变体)的活性。然而，在Huh-7细胞中，即使针对野生型HBV，LdT也表现出弱活性。进一步的研究揭示，虽然Huh-7细胞可以良好地对拉米夫定磷酸化，但LdT被最小限度地磷酸为活性三磷酸酯。这些结果在向LdT End of Phase 2Meeting(IND 60，459；Serial 024)的代理处提交的材料中进行了总结。因此，Ono等的系统不适于分析该类型的药物。
作为可选方法，借助瞬时转染将突变的HBV基因组导入HepG2细胞中。这些试验同样未能成功，主要是由于这些细胞的可转染性较弱且多变，这阻碍了获得抗病毒功效的一致性值。
解决LdT和LdC抗性问题的更为适宜的方法是通过采用表达具有野生型基因组以及分别在552和515或528位的拉米夫定抗性突变的重组HBV病毒的稳定HepG2细胞系。与先前的方法相比较，这些稳定细胞系提供了一致性聚合酶表达水平以及良好的信噪比。
实施例17转染HepG2细胞以建立拉米夫定抗性稳定细胞系获取具有拉米夫定抗性性状和野生型HBV基因组的稳定转化的细胞，对其检测LdT和LdC抵抗突变体的活性，采用拉米夫定和阿德福韦作为对照。
HepG2生长培养基EMEM(Mediatech，Cat#MT 10-010-CV)10％FBS(Mediatech，Cat#MT35-011-CV)1×L-谷氨酰胺(2mM终浓度)1×青霉素-链霉素(100I.U./100μg/ml终浓度)1×丙酮酸钠(1mM终浓度)1×非必需氨基酸(NEAA，0.1mM终浓度)HepG2转染培养基EMEM(Mediatech，Cat#MT 10-010-CV)10％FBS(Mediatech，Cat#MT35-011-CV)
1×L-谷氨酰胺(2mM终浓度)1×丙酮酸钠(1mM终浓度)1×NEAA(0.1mM终浓度)HepG2稳定细胞系生长/选择培养基EMEM(Mediatech，Cat#MT 10-010-CV)10％FBS(Mediatech，Cat#MT35-011-CV)1×L-谷氨酰胺(2mM终浓度)1×青霉素-链霉素(100I.U./100μg/ml终浓度)1×丙酮酸钠(1mM终浓度)1×NEAA(0.1mM终浓度)500μg/ml Geneticin(G-418，Life Technologies Cat#10131)构建体pCMV-WT(ayw)pCMV-M552VpCMV-M552IpCMV-L515M/M552VpCMV-L515M/M552IpCMV-neo所有构建体均包含在CMV启动子后克隆的HBV基因组。通过采用pCMV-hbv作为亲本和商业试剂盒(Stratagene’s QuikChange kit，Cat#200518-5)按照现有技术的描述(Allen等，1998)进行定向诱变来生成包含点突变聚合酶基因的HBV质粒。pCMVhbv(Dr.C.Seeger惠赠，Fox Chase Cancer Institute)包含超长HBV基因组亚型ayw。未制备包含单L515M突变的构建体，因为该突变被认为仅产生对拉米夫定最小的抗性；其仅可作为补偿性突变(Gauthier等，1999)。
质粒pCMV-neo被用于提供对G-418抗生素(新霉素)的抗性。该质粒包含pEGFP-Nl(Clontech Cat#6085-1)主链，其具有SV40-驱动Kanr/Neor表达盒而没有EGFP表达盒。
制备用于转染的细胞将3mL HepG2生长培养基中的细胞铺于胶原包被的6孔板上(Biocoat，Becton Dickinson，Cat#35-4400)，每孔2×105细胞。细胞于37℃过夜孵育。
制备Fugene:DNA复合物用各构建体转染胶原包被的6孔板的2个孔。对照包括含有无pCMV-neo DNA的pCMVhbv野生型构建体的1个孔和仅含有neoR-质粒的1个孔。根据厂商建议的步骤以Fugene对DNA3∶1的比率(3ul Fugene+lug超螺旋质粒DNA/孔)用Fugene(Roche cat#1815091)转染细胞。简言之，在微量离心管中将6μLFugene稀释于200ul无血清EMEM培养基。然后加入2μg各HBV质粒DNA和0.2μg pCMVneoDNA。轻柔混合该溶液，然后于室温孵育15分钟。
细胞转染抽吸6-孔板并加入2ml HepG2转染培养基。Fugene然后缓慢将DNA复合物溶液缓慢加至细胞，同时振荡平板以均匀分散溶液。平板于37℃过夜孵育。次日，加入HepG2稳定细胞系生长/选择培养基。
实施例18选择稳定细胞系克隆和亚克隆对转染的细胞每周加培养基两次，持续21/2周，直至形成清晰的G418抗性克隆。用吸管从6孔板中取出呈现“克隆性”的克隆(不与任何其它克隆接触)，然后将其在150μL HepG2稳定细胞系生长培养基/选择培养基中置于BD96孔胶原板上。对每个构建体取16个克隆。
每3-4日更换培养基。通过100μl培养上清检测表达HBV的克隆，经由ELISA(如下)鉴定HbeAg的存在。通过在96孔板中的有限稀释将阳性克隆亚克隆，2周后(每3-4日更换培养基)通过ELISA筛选培养物。扩增阳性细胞，冷冻保存，然后通过有限稀释对细胞系再次亚克隆，两周后通过ELISA筛选培养上清。
实施例19稳定转染的细胞系的试验筛选稳定的细胞系用于通过两个试验表达病毒基因组。第一个检测是半定量ELISA测定，其检测乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)(与病毒复制相关的病毒蛋白标记物)。然后采用内源聚合酶测定对产生高水平HbeAg的细胞系实施检测复制的病毒基因组产生的试验。
稳定细胞系培养上清的HBeAg-ELISA俘获抗体是以10ug/ml使用的小鼠抗HbeAg mAb。使用直接来自96孔板的100ul培养上清。检测抗体是在10％FCS/TNE中1∶3,000稀释的多克隆(兔)抗HBc/eAg抗体(DAKO，Cat#B0586)。过氧化物酶结合的山羊抗兔IgG(1∶10,000；Zymed Cat#81-6120)被用于显像，底物是柠檬酸盐/磷酸盐缓冲液中的邻苯二胺(Zymed Cat#00-2003)。用2N Na2SO4终止显影，然后在Fusion读板器(Packard Instuments)中读取490nm光密度(O.D.)。
细胞裂解物的内源聚合酶测定法(EPA)在12孔胶原板中生长细胞3-4日至100％融合，然后在1ml 50mM Tris-HCl pH7.4，150mMNaCl，5mM MgCl2，0.2％NP-40中制备细胞溶质裂解物。基本上按照已有描述(Seifer等，1998)实施EPAs。简言之，采用多克隆兔抗HBc/eAg抗体(DaKo Cat#B0586)，4℃过夜以便从细胞溶质裂解物总免疫沉淀细胞内HBV核壳，然后将其固定于蛋白A琼脂糖CL-4B珠(Amersham Phannacia Cat#17-0780-01)上。然后洗涤固定的衣壳，在包含50mM Tris-HCl pH7.4，75mM NH4Cl，1mM EDTA，20mMMgCl2，0.1mM P-ME，0.5％NP-40，100μM冷dGTP，TTP，CTP和50nM33P-dATP(Perkin Elmer Life Sciences Cat#NEG 612H)的50ul反应体积中开始内源聚合酶反应，37℃孵育过夜。用1mg/ml蛋白酶K(Roche，Cat#1373196)于37℃消化1小时后，经由酚/氯仿提取释放33P标记的HBV DNA。核酸最终用等体积5M NH4-醋酸和2.5体积100％EtOH沉淀，在1％天然琼脂糖凝胶上用Tris-硼酸缓冲液进行分离。用7％TCA固定凝胶，然后干燥，或者在室温下过夜，借助毛细管转移在0.4N NaOH中将凝胶印迹在带正电的尼龙膜(PallBiodyne Plus Cat#60406)。将干燥的凝胶/膜曝于磷光屏(MolecularDynamics)室温过夜，然后扫描(Storm 860，Molecular Dynamics)并用ImageQuant(Molecular Dynamics)软件定量。
作为具有HbeAg高表达以及高水平产生复制性基因组而被选择的克隆细胞系命名如下
实施例20抗病毒试验LdT(telbivudine，Idenix)，LdC-HCl(Idenix)，拉米夫定(Moravec)和PMEA(Moravec)PMEA是阿德福韦前药的活性成分。
将细胞在包含5％FBS，2mM L-谷氨酰胺，100I.U.青霉素/100μg/mL链霉素和0.5mg/mL G-418的2ml DMEM中以0.5-1×106细胞/孔的密度接种于12孔Biocoat胶原I板(Becton Dickinson Cat#35-4500)。
在100％DMSO中按200×保存物新鲜制备药物稀释物。对于每个试验而言，在使用前将4等份各药物稀释组保存于-20℃。细胞一经达到融合，即通过在2ml新鲜DMEM+5％FBS中加入10μL药物稀释物开始药物处理。由此，DMSO终浓度不会超过0.5％。无药物对照孔仅接受10μl DMSO。用2mL新鲜药物/培养基每隔一日处理细胞，共持续8日。然后按下述收集细胞裂解物抽吸培养基，然后用1mL PBS仔细冲洗细胞单层一次。
加入1ml裂解缓冲液(50mM Tris-HCl pH7.5/150mM NaCl/5mM MgCl2/0.2％NP-40)。于冰上保存30分钟至4小时。
收集裂解的细胞。移至1.5ml微量管中。
通过室温下，14,000rpm离心5分钟使裂解液澄清。
将澄清的裂解液移至新管。在干冰上快速冷冻，然后保存于-80℃以备继续进行基本上如上所述的内源聚合酶测定法。
通过采用Xlfit软件的曲线拟合从磷光数据中得到EC50’s。
表24总结了当检测当对LdT和LdC，以及拉米夫定和PME对照进行检测抵抗不同突变体和在稳定转染的HepG2细胞中表达野生型HBV基因组的活性所得到的结果。表24a中给出抗病毒活性。对于抵抗野生型病毒的不同药物所得到的EC50值一般具有与现有技术报道的值良好的一致，除了LdT的平均EC50值高于大多数我们先前的研究中所见的大约200nM的典型值。细胞培养物中LdT的抗病毒活性是非常多变的，而且LdT在细胞培养测定法中的效能似乎不能作为临床情况下患者中所见功效的预测指标。
关于针对拉米夫定抗性突变体所检测的活性，PMEA保持了抵抗所有突变体的显著活性，这于先前报道的一致(参见GileadFDA简报文件，2002)。针对两个双或M552I单突变图，虽然LdC显示出抵抗L515M/M552V突变体的边缘活性(EC50约为780μM)，LdT，LdC和拉米夫定大多是无活性的(EC50＞1mM)。本研究的主要发现是LdT和LdC保持了基本上全部抵抗M552V单突变体的活性，而拉米夫定抵抗该突变的活性显著消失。
拉米夫定抗性突变体对药物所观测功效的作用可从表24b中给出的倍数抗性分析中得以最佳显现。该研究中得到的结果与先前研究大体广泛一致(如GileadFDA Advisory Committee简报文件所示，2002)。表24b清楚的显示出，当针对双突变体或M552I单突变体时，LdT，LdC和拉米夫定基本上表现出倍数抗性。然而，单M552V突变体的情况非常不同。LdT和LdC基本上呈现无改变的抵抗该突变体的抗病毒活性，各倍数抗性改变为1.2和2.1倍，而拉米夫定在我们手中显示出24.8倍的抗性和根据Glaxo组(Allen等，1998)的153倍抗性。
LdT和LdC均相对不具有抵抗在具有拉米夫定抗性的乙型肝炎患者中常见的双突变HBV株的活性。如果这些体外结果具有临床活性的预测性，则该结果提示目前处于临床研究的LdT和LdC前药可在具有拉米夫定抗性的患者(含有双突变体HBV株)中抗HBV活性最小。然而，现有技术中两篇最近的摘要报道突出显示了如下问题，实验室转化体的结果关于临床中活性具有较弱预测性。Gilead病毒学家的报告(Delaney等，2001)指出恩替卡韦抗YMDD突变HBV株的体外活性最小，而同一会议(AASLD 2001)的另一摘要公开了由恩替卡韦赞助商(Bristol Myers Squibb)指导的大型前瞻性试验的结果，其中恩替卡韦治疗在拉米夫定抗性乙型肝炎患者株基本上产生HBV DNA的减少(REF xxx)。由此，由对于HBV相关实验室结果的有问题的临床预测值看来，需要对拉米夫定抗性HBV患者中LdT(和LdC)实施小型临床试验，而不管这两种化合物在体外表现除针对双突变HBV株的最小活性。
该研究证实了与拉米夫定相反，LdT和LdC抗M552V HBV突变体的抗病度活性基本上未改变。M552V突变是拉米夫定抗性发展关键因素，因为其被认为是导致M515L/M552V双突变体的途径中的第一步，这可以解释乙型肝炎患者中60-70％的拉米夫定抗性(Ahmed等，2000)。该体外发现具有全面了解LdT(telbivudine)的可能抗性图形的重要意义，因为抗关键M552V突变的活性可辅助抑制在用LdT(telbivudine)治疗的乙型肝炎患者中出现病毒抗性。
虽然临床抗病毒抗性模式仅能来自临床试验，LdT和LdC抗M552V HBV突变体的未改变的活性，结合在目前的IIB期临床试验中对LdT治疗的患者所观测到的HBV复制的更好的定量抑制，提示MDD介导的HBV对LdT的抗性可能基本上不如在拉米夫定治疗中观察到的常见。
表24.按细胞内核壳的EPA测定的，LdT，LdC，拉米夫定和PMEA抗野生型和来自稳定细胞系的拉米夫定抗性突变HBV病毒的抑制图[(a)抗病毒效能；和(b)倍数抗性]。
表24a抗病毒效能
表24b倍数抗性
两个表中的所有数字均代表来自三至四个独立试验的平均值+/-SD。
EC50＝在细胞培养物中降低50％病毒产生的有效浓度倍数抗性＝突变体HBV的EC50除以野生型HBV EC50Ahmed SNS，Tavan D，Pichoud C，等，“通过在用拉米夫定治疗慢性乙型肝炎的患者中确定乙型肝炎病毒聚合酶突变对病毒抗性早期检测”Hepatology 2000，32，1078-1088。
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已经参照本发明的优选实施方案描述了本发明。根据前面本发明的详细描述，对本发明的改变和修改对于本领域内技术人员是显而易见的。所有这些改变和修改都包括在本发明的范围内。
权利要求
1.一种治疗抗药型HBV感染的宿主的方法，其包括施用有效量的β-L-2’-脱氧核苷，或其药学上可接受的盐、酯或前药。
2.一种治疗抗药型HBV感染的宿主的方法，其包括施用有效量的β-L-2’-脱氧胸苷，或其药学上可接受的盐、酯或前药。
3.一种治疗抗药型HBV感染的宿主的方法，其包括施用有效量的β-L-2’-脱氧胞苷，或其药学上可接受的盐、酯或前药。
4.一种治疗抗药型HBV感染的宿主的方法，所述抗药型HBV表现为在DNA聚合酶区内552位密码子由蛋氨酸至缬氨酸的突变，该方法包括施用有效量的β-L-2’-脱氧核苷，或药学上可接受的盐、酯或前药。
5.一种治疗抗药型HBV感染的宿主的方法，所述抗药型HBV表现为在DNA聚合酶区内552位密码子由蛋氨酸至缬氨酸的突变，该方法包括施用有效量的式(I)的化合物 或其药学上可接受的盐、酯或前药，其中R1和R2独立地是氢、直链烷基、支链烷基或环状烷基、酰基、乙酰基、丁酰基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、CO-芳氧基烷基、CO-取代的芳基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳烷基磺酰基、氨基酸残基、一磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯或磷酸酯衍生物；X是O、S、SO2或CH2；且BASE为可任选被取代的嘌呤碱基或嘧啶碱基。
6.一种治疗抗药型HBV感染的宿主的方法，所述抗药型HBV表现为在DNA聚合酶区内552位密码子由蛋氨酸至缬氨酸的突变，该方法包括施用有效量的下式的化合物 或其药学上可接受的盐、酯或前药，其中R1和R2独立地是氢、直链烷基、支链烷基或环状烷基、酰基、乙酰基、丁酰基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、CO-芳氧基烷基、CO-取代的芳基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳烷基磺酰基、氨基酸残基、一磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯或磷酸酯衍生物；Y是OR3、NR3R4或SR3；X1和X2独立地选自H、直链烷基、支链烷基或环状烷基、酰基、乙酰基、丁酰基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、卤素、OR5、NR5R6或SR5；且R3、R4、R5和R6独立地是H、直链烷基、支链烷基或环状烷基、二烷基氨基亚烷基、酰基、乙酰基、丁酰基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、CO-芳氧基烷基、CO-取代的芳基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳烷基磺酰基、氨基酸残基、一磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯或磷酸酯衍生物。
7.一种治疗抗药型HBV感染的宿主的方法，所述抗药型HBV表现为在DNA聚合酶区内552位密码子由蛋氨酸至缬氨酸的突变，该方法包括施用有效量的下式的化合物 或其药学上可接受的盐、酯或前药，其中R1和R2独立地是氢、直链烷基、支链烷基或环状烷基、酰基、乙酰基、丁酰基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、CO-芳氧基烷基、CO-取代的芳基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳烷基磺酰基、氨基酸残基、一磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯或磷酸酯衍生物；Y是OR3、NR3R4或SR3；X1选自H、直链烷基、支链烷基或环状烷基、酰基、乙酰基、丁酰基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、卤素、OR5、NR5R6或SR5；且R3、R4、R5和R6独立地是H、直链烷基、支链烷基或环状烷基、二烷基氨基亚烷基、酰基、乙酰基、丁酰基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、CO-芳氧基烷基、CO-取代的芳基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳烷基磺酰基、氨基酸残基、一磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯或磷酸酯衍生物。
8.一种治疗抗药型HBV感染的宿主的方法，所述抗药型HBV表现为在DNA聚合酶区内552位密码子由蛋氨酸至缬氨酸的突变，其包括施用有效量的下式的化合物 或其药学上可接受的盐、酯或前药，其中R1和R2独立地是氢、直链烷基、支链烷基或环状烷基、酰基、乙酰基、丁酰基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、CO-芳氧基烷基、CO-取代的芳基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳烷基磺酰基、氨基酸残基、一磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯或磷酸酯衍生物；且R3和R4独立地是H、直链烷基、支链烷基或环状烷基、二烷基氨基亚烷基、酰基、乙酰基、丁酰基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、CO-芳氧基烷基、CO-取代的芳基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳烷基磺酰基、氨基酸残基、一磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯或磷酸酯衍生物。
9.权利要求8的方法，其中R3和/或R4是H。
10.权利要求8的方法，其中R1和/或R2是H。
11.权利要求8的方法，其中至少一个R1、R2或R4是下式的氨基酸残基C(O)C(R8)(R9)(NR10R11)其中R8是氨基酸侧链、烷基、芳基、杂芳基、杂环基，或者，R8可任选地与R10连接形成环状结构；R9是氢、烷基或芳基；且R10和R11独立地是氢、酰基或烷基。
12.权利要求11的方法，其中氨基酸残基是L-缬氨酰基。
13.一种治疗抗药型HBV感染的宿主的方法，所述抗药型HBV表现为在DNA聚合酶区内552位密码子由蛋氨酸至缬氨酸的突变，该方法包括施用有效量的下式的化合物 或其药学上可接受的盐、酯或前药。
14.一种治疗抗药型HBV感染的宿主的方法，所述抗药型HBV表现为在DNA聚合酶区内552位密码子由蛋氨酸至缬氨酸的突变，该方法包括施用有效量的下式的化合物 或其药学上可接受的盐、酯或前药。
15.一种治疗抗药型HBV感染的宿主的方法，所述抗药型HBV表现为在DNA聚合酶区内552位密码子由蛋氨酸至缬氨酸的突变，该方法包括施用有效量的下式的化合物 或其药学上可接受的盐、酯或前药。
16.一种治疗抗药型HBV感染的宿主的方法，所述抗药型HBV表现为在DNA聚合酶区内552位密码子由蛋氨酸至缬氨酸的突变，该方法包括施用有效量的下式的化合物 或其药学上可接受的盐、酯或前药。
17.一种治疗抗药型HBV感染的宿主的方法，所述抗药型HBV表现为在DNA聚合酶区内552位密码子由蛋氨酸至缬氨酸的突变，该方法包括施用有效量的下式的化合物 或其药学上可接受的盐、酯或前药，其中R1和R2独立地是氢、直链烷基、支链烷基或环状烷基、酰基、乙酰基、丁酰基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、CO-芳氧基烷基、CO-取代的芳基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳烷基磺酰基、氨基酸残基、一磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯或磷酸酯衍生物；且R3是氢、直链烷基、支链烷基或环状烷基、二烷基氨基亚烷基、酰基、乙酰基、丁酰基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、CO-芳氧基烷基、CO-取代的芳基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳烷基磺酰基、氨基酸残基、一磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯或磷酸酯衍生物。
18.权利要求17的方法，其中R3是H。
19.权利要求17的方法，其中R1和/或R2是H。
20.权利要求17的方法，其中至少一个R1或R2是下式的氨基酸残基C(O)C(R8)(R9)(NR10R11)其中R8是氨基酸侧链、烷基、芳基、杂芳基、杂环基，或者，R8可任选地与R10连接形成环状结构；R9是氢、烷基或芳基；且R10和R11独立地是氢、酰基或烷基。
21.权利要求20的方法，其中氨基酸残基是L-缬氨酰基。
22.一种治疗抗药型HBV感染的宿主的方法，所述抗药型HBV表现为在DNA聚合酶区内552位密码子由蛋氨酸至缬氨酸的突变，该方法包括施用有效量的下式的化合物 或其药学上的盐、酯或前药。
23.一种治疗抗药型HBV感染的宿主的方法，所述抗药型HBV表现为在DNA聚合酶区内552位密码子由蛋氨酸至缬氨酸的突变，该方法包括施用有效量的下式的化合物 或其药学上可接受的盐、酯或前药。
24.一种治疗抗药型HBV感染的宿主的方法，所述抗药型HBV表现为在DNA聚合酶区内552位密码子由蛋氨酸至缬氨酸的突变，该方法包括施用有效量的下式的化合物 或其药学上可接受的盐、酯或前药。
25.一种治疗抗药型HBV感染的宿主的方法，所述抗药型HBV表现为在DNA聚合酶区内552位密码子由蛋氨酸至缬氨酸的突变，该方法包括施用有效量的下式的化合物 或其药学上可接受的盐、酯或前药。
26.一种防止或抑制HBV的DNA聚合酶区内552位密码子由蛋氨酸至缬氨酸的突变在宿主中表达的方法，该方法包括施用有效量的β-L-2’-脱氧核苷，或药学上可接受的盐、酯或前药。
27.一种防止或抑制HBV的DNA聚合酶区内552位密码子由蛋氨酸至缬氨酸的突变在宿主中表达的方法，该方法包括施用有效量的式(I)的化合物 或其药学上可接受的盐、酯或前药，其中R1和R2独立地是氢、直链烷基、支链烷基或环状烷基、酰基、乙酰基、丁酰基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、CO-芳氧基烷基、CO-取代的芳基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳烷基磺酰基、氨基酸残基、一磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯或磷酸酯衍生物；X是O、S、SO2或CH2；和BASE为可任选被取代的嘌呤碱基或嘧啶碱基。
28.一种防止或抑制HBV的DNA聚合酶区内552位密码子由蛋氨酸至缬氨酸的突变在宿主中表达的方法，该方法包括施用有效量的下式的化合物 或其药学上可接受的盐、酯或前药，其中R1和R2独立地是氢、直链烷基、支链烷基或环状烷基、酰基、乙酰基、丁酰基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、CO-芳氧基烷基、CO-取代的芳基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳烷基磺酰基、氨基酸残基、一磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯或磷酸酯衍生物；Y是OR3、NR3R4或SR3；X1和X2独立地选自H、直链烷基、支链烷基或环状烷基、酰基、乙酰基、丁酰基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、卤素、OR5、NR5R6或SR5；且R3、R4、R5和R6独立地是H、直链烷基、支链烷基或环状烷基、二烷基氨基亚烷基、酰基、乙酰基、丁酰基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、CO-芳氧基烷基、CO-取代的芳基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳烷基磺酰基、氨基酸残基、一磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯或磷酸酯衍生物。
29.一种防止或抑制HBV的DNA聚合酶区内552位密码子由蛋氨酸至缬氨酸的突变在宿主中表达的方法，该方法包括施用有效量的下式的化合物 或其药学上可接受的盐、酯或前药，其中R1和R2独立地是氢、直链烷基、支链烷基或环状烷基、酰基、乙酰基、丁酰基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、CO-芳氧基烷基、CO-取代的芳基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳烷基磺酰基、氨基酸残基、一磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯或磷酸酯衍生物；Y是OR3、NR3R4或SR3；X1选自H、直链烷基、支链烷基或环状烷基、酰基、乙酰基、丁酰基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、卤素、OR5、NR5R6或SR5；且R3、R4、R5和R6独立地是H、直链烷基、支链烷基或环状烷基、二烷基氨基亚烷基、酰基、乙酰基、丁酰基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、CO-芳氧基烷基、CO-取代的芳基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳烷基磺酰基、氨基酸残基、一磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯或磷酸酯衍生物。
30.一种防止或抑制HBV的DNA聚合酶区内552位密码子由蛋氨酸至缬氨酸的突变在宿主中表达的方法，该方法包括施用有效量的下式的化合物 或其药学上可接受的盐、酯或前药，其中R1和R2独立地是氢、直链烷基、支链烷基或环状烷基、酰基、乙酰基、丁酰基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、CO-芳氧基烷基、CO-取代的芳基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳烷基磺酰基、氨基酸残基、一磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯或磷酸酯衍生物；且R3和R4独立地是H、直链烷基、支链烷基或环状烷基、二烷基氨基亚烷基、酰基、乙酰基、丁酰基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、CO-芳氧基烷基、CO-取代的芳基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳烷基磺酰基、氨基酸残基、一磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯或磷酸酯衍生物。
31.权利要求30的方法，其中R3和/或R4是H。
32.权利要求30的方法，其中R1和/或R2是H。
33.权利要求30的方法，其中至少一个R1、R2或R4是下式的氨基酸残基C(O)C(R8)(R9)(NR10R11)其中R8是氨基酸侧链、烷基、芳基、杂芳基、杂环基，或者，R8可任选地与R10连接形成环状结构；R9是氢、烷基或芳基；且R10和R11独立地是氢、酰基或烷基。
34.权利要求33的方法，其中氨基酸残基是L-缬氨酰基。
35.一种防止或抑制HBV的DNA聚合酶区内552位密码子由蛋氨酸至缬氨酸的突变在宿主中表达的方法，该方法包括施用有效量的下式的化合物 或其药学上的盐、酯或前药。
36.一种防止或抑制HBV的DNA聚合酶区内552位密码子由蛋氨酸至缬氨酸的突变在宿主中表达的方法，该方法包括施用有效量的下式的化合物 或其药学上的盐、酯或前药。
37.一种防止或抑制HBV的DNA聚合酶区内552位密码子由蛋氨酸至缬氨酸的突变在宿主中表达的方法，该方法包括施用有效量的下式的化合物 或其药学上可接受的盐、酯或前药。
38.一种防止或抑制HBV的DNA聚合酶区内552位密码子由蛋氨酸至缬氨酸的突变在宿主中表达的方法，该方法包括施用有效量的下式的化合物 或其药学上可接受的盐、酯或前药。
39.一种防止或抑制HBV的DNA聚合酶区内552位密码子由蛋氨酸至缬氨酸的突变在宿主中表达的方法，该方法包括施用有效量的下式的化合物 或其药学上可接受的盐、酯或前药，其中R1和R2独立地是氢、直链烷基、支链烷基或环状烷基、酰基、乙酰基、丁酰基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、CO-芳氧基烷基、CO-取代的芳基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳烷基磺酰基、氨基酸残基、一磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯或磷酸酯衍生物；且R3是H、直链烷基、支链烷基或环状烷基、二烷基氨基亚烷基、酰基、乙酰基、丁酰基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、CO-芳氧基烷基、CO-取代的芳基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳烷基磺酰基、氨基酸残基、一磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯或磷酸酯衍生物。
40.权利要求39的方法，其中R3是H。
41.权利要求39的方法，其中R1和/或R2是H。
42.权利要求39的方法，其中至少一个R1或R2是下式的氨基酸残基C(O)C(R8)(R9)(NR10R11)其中R8是氨基酸侧链、烷基、芳基、杂芳基、杂环基，或者，R8可任选地与R10连接形成环状结构；R9是氢、烷基或芳基；且R10和R11独立地是氢、酰基或烷基。
43.权利要求42的方法，其中氨基酸残基是L-缬氨酰基。
44.一种防止或抑制HBV的DNA聚合酶区内552位密码子由蛋氨酸至缬氨酸的突变在宿主中表达的方法，该方法包括施用有效量的下式的化合物 或其药学上可接受的盐、酯或前药。
45.一种防止或抑制HBV的DNA聚合酶区内552位密码子由蛋氨酸至缬氨酸的突变在宿主中表达的方法，该方法包括施用有效量的下式的化合物 或其药学上的盐、酯或前药。
46.一种防止或抑制HBV的DNA聚合酶区内552位密码子由蛋氨酸至缬氨酸的突变在宿主中表达的方法，该方法包括施用有效量的下式的化合物 或其药学上可接受的盐、酯或前药。
47.一种防止或抑制HBV的DNA聚合酶区内552位密码子由蛋氨酸至缬氨酸的突变在宿主中表达的方法，该方法包括施用有效量的下式的化合物 或其药学上可接受的盐、酯或前药。
48.一种防止或抑制宿主中HBV的DNA聚合酶区内552位密码子由蛋氨酸至缬氨酸的突变和526或528位密码子由亮氨酸至蛋氨酸的突变表达的方法，该方法包括施用有效量的β-L-2’-脱氧核苷，或药学上可接受的盐、酯或前药。
49.一种防止或抑制宿主中HBV的DNA聚合酶区内552位密码子由蛋氨酸至缬氨酸的突变和526或528位密码子由亮氨酸至蛋氨酸的突变表达的方法，该方法包括施用有效量的式(I)的化合物 或其药学上的盐、酯或前药，其中R1和R2独立地是氢、直链烷基、支链烷基或环状烷基、酰基、乙酰基、丁酰基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、CO-芳氧基烷基、CO-取代的芳基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳烷基磺酰基、氨基酸残基、一磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯或磷酸酯衍生物；X是O、S、SO2或CH2；且BASE为可任选被取代的嘌呤碱基或嘧啶碱基。
50.一种防止或抑制宿主中HBV的DNA聚合酶区内552位密码子由蛋氨酸至缬氨酸的突变和526或528位密码子由亮氨酸至蛋氨酸的突变表达的方法，该方法包括施用有效量的下式的化合物 或其药学上的盐、酯或前药，其中R1和R2独立地是氢、直链烷基、支链烷基或环状烷基、酰基、乙酰基、丁酰基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、CO-芳氧基烷基、CO-取代的芳基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳烷基磺酰基、氨基酸残基、一磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯或磷酸酯衍生物；Y是OR3、NR3R4或SR3；X1和X2独立地选自H、直链烷基、支链烷基或环状烷基、酰基、乙酰基、丁酰基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、卤素、OR5、NR5R6或SR5；且R3、R4、R5和R6独立地是H、直链烷基、支链烷基或环状烷基、二烷基氨基亚烷基、酰基、乙酰基、丁酰基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、CO-芳氧基烷基、CO-取代的芳基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳烷基磺酰基、氨基酸残基、一磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯或磷酸酯衍生物。
51.一种防止或抑制宿主中HBV的DNA聚合酶区内552位密码子由蛋氨酸至缬氨酸的突变和526或528位密码子由亮氨酸至蛋氨酸的突变表达的方法，该方法包括施用有效量的下式的化合物 或其药学上的盐、酯或前药，其中R1和R2独立地是氢、直链烷基、支链烷基或环状烷基、酰基、乙酰基、丁酰基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、CO-芳氧基烷基、CO-取代的芳基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳烷基磺酰基、氨基酸残基、一磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯或磷酸酯衍生物；Y是OR3、NR3R4或SR3；X1选自H、直链烷基、支链烷基或环状烷基、酰基、乙酰基、丁酰基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、卤素、OR5、NR5R6或SR5；且R3、R4、R5和R6独立地是H、直链烷基、支链烷基或环状烷基、二烷基氨基亚烷基、酰基、乙酰基、丁酰基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、CO-芳氧基烷基、CO-取代的芳基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳烷基磺酰基、氨基酸残基、一磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯或磷酸酯衍生物。
52.一种防止或抑制宿主中HBV的DNA聚合酶区内552位密码子由蛋氨酸至缬氨酸的突变和526或528位密码子由亮氨酸至蛋氨酸的突变表达的方法，该方法包括施用有效量的下式的化合物 或其药学上的盐、酯或前药，其中R1和R2独立地是氢、直链烷基、支链烷基或环状烷基、酰基、乙酰基、丁酰基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、CO-芳氧基烷基、CO-取代的芳基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳烷基磺酰基、氨基酸残基、一磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯或磷酸酯衍生物；和R3和R4独立地是H、直链烷基、支链烷基或环状烷基、二烷基氨基亚烷基、酰基、乙酰基、丁酰基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、CO-芳氧基烷基、CO-取代的芳基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳烷基磺酰基、氨基酸残基、一磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯或磷酸酯衍生物。
53.权利要求52的方法，其中R3和/或R4是H。
54.权利要求52的方法，其中R1和/或R2是H。
55.权利要求52的方法，其中至少一个R1、R2或R4是下式的氨基酸残基C(O)C(R8)(R9)(NR10R11)其中R8是氨基酸侧链、烷基、芳基、杂芳基、杂环基，或者，R8可任选地与R10连接形成环状结构；R9是氢、烷基或芳基；且R10和R11独立地是氢、酰基或烷基。
56.权利要求55的方法，其中氨基酸残基是L-缬氨酰基。
57.一种防止或抑制宿主中HBV的DNA聚合酶区内552位密码子由蛋氨酸至缬氨酸的突变和526或528位密码子由亮氨酸至蛋氨酸的突变表达的方法，该方法包括施用有效量的下式的化合物 或其药学上的盐、酯或前药。
58.一种防止或抑制宿主中HBV的DNA聚合酶区内552位密码子由蛋氨酸至缬氨酸的突变和526或528位密码子由亮氨酸至蛋氨酸的突变表达的方法，该方法包括施用有效量的下式的化合物 或其药学上可接受的盐、酯或前药。
59.一种防止或抑制宿主中HBV的DNA聚合酶区内552位密码子由蛋氨酸至缬氨酸的突变和526或528位密码子由亮氨酸至蛋氨酸的突变表达的方法，该方法包括施用有效量的下式的化合物 或其药学上可接受的盐、酯或前药。
60.一种防止或抑制宿主中HBV的DNA聚合酶区内552位密码子由蛋氨酸至缬氨酸的突变和526或528位密码子由亮氨酸至蛋氨酸的突变表达的方法，该方法包括施用有效量的下式的化合物 或其药学上可接受的盐、酯或前药。
61.一种防止或抑制宿主中HBV的DNA聚合酶区内552位密码子由蛋氨酸至缬氨酸的突变和526或528位密码子由亮氨酸至蛋氨酸的突变表达的方法，该方法包括施用有效量的下式的化合物 或其药学上的盐、酯或前药，其中R1和R2独立地是氢、直链烷基、支链烷基或环状烷基、酰基、乙酰基、丁酰基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、CO-芳氧基烷基、CO-取代的芳基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳烷基磺酰基、氨基酸残基、一磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯或磷酸酯衍生物；且R3是H、直链烷基、支链烷基或环状烷基、二烷基氨基亚烷基、酰基、乙酰基、丁酰基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、CO-芳氧基烷基、CO-取代的芳基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳烷基磺酰基、氨基酸残基、一磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯或磷酸酯衍生物。
62.权利要求61的方法，其中R3是H。
63.权利要求61的方法，其中R1和/或R2是H。
64.权利要求61的方法，其中至少一个R1或R2是下式的氨基酸残基C(O)C(R8)(R9)(NR10R11)其中R8是氨基酸侧链、烷基、芳基、杂芳基、杂环基，或者，R8可任选地与R10连接形成环状结构；R9是氢、烷基或芳基；且R10和R11独立地是氢、酰基或烷基。
65.权利要求64的方法，其中氨基酸残基是L-缬氨酰基。
66.一种防止或抑制宿主中HBV的DNA聚合酶区内552位密码子由蛋氨酸至缬氨酸的突变和526或528位密码子由亮氨酸至蛋氨酸的突变表达的方法，该方法包括施用有效量的下式的化合物 或其药学上可接受的盐、酯或前药。
67.一种防止或抑制宿主中HBV的DNA聚合酶区内552位密码子由蛋氨酸至缬氨酸的突变和526或528位密码子由亮氨酸至蛋氨酸的突变表达的方法，该方法包括施用有效量的下式的化合物 或其药学上可接受的盐、酯或前药。
68.一种防止或抑制宿主中HBV的DNA聚合酶区内552位密码子由蛋氨酸至缬氨酸的突变和526或528位密码子由亮氨酸至蛋氨酸的突变表达的方法，该方法包括施用有效量的下式的化合物 或其药学上可接受的盐、酯或前药。
69.一种防止或抑制宿主中HBV的DNA聚合酶区内552位密码子由蛋氨酸至缬氨酸的突变和526或528位密码子由亮氨酸至蛋氨酸的突变表达的方法，该方法包括施用有效量的下式的化合物 或其药学上可接受的盐、酯或前药。
70.权利要求1-69任一项的方法，其还包括联合和/或交替施用有效量的一种或多种其它抗HBV剂。
71.权利要求70的方法，其中其它抗HBV剂选自3TC、FTC、L-FMAU、DAPD、DXG、泛昔洛韦、喷昔洛韦、BMS-200475、bis pomPMEA(阿德福韦二匹伏酯)、洛布卡韦、更昔洛韦、替诺福韦、Lfd4C、磷卡萘(膦酰基甲酸三钠)、异丙肌苷、左旋咪唑、N-乙酰胱氨酸(NAC)、干扰素、聚乙二醇化干扰素、ISS、利巴韦林、PC 1323或聚腺环聚尿苷酸。
72.权利要求71的方法，其中至少一种其它抗HBV剂是干扰素。
73.权利要求72的方法、其中干扰素选自干扰素α、聚乙二醇化干扰素α、干扰素α-2a、干扰素α-2b、聚乙二醇化干扰素α-2a、聚乙二醇化干扰素α-2b、ROFERON(干扰素α-2a)、PEGASYS(聚乙二醇化干扰素α-2a)、INTRONA(干扰素α-2b)、PEG-INTRON(聚乙二醇化干扰素α-2b)、干扰素β、干扰素γ、干扰素τ、干扰素ω、复合干扰素、INFERGEN(干扰素alphacon-1)、OMNIFERON(天然干扰素)、REBIF(干扰素β-1a)、ω干扰素、口服干扰素α、干扰素γ-1b、SuperFeron(天然人多亚型IFN-α)和HuFeron(人IFN-β)。
74.权利要求1-73任一项的方法，其中宿主是哺乳动物。
75.权利要求74的方法，其中宿主是人。
76.一种用于治疗抗药型HBV感染的宿主的药物组合物，其包括有效量的β-L-2’-脱氧核苷，或其药学上可接受的盐、酯或前药，任选地在药学上可接受的载体或稀释剂中。
77.一种用于治疗抗药型HBV感染的宿主的药物组合物，其包括有效量的β-L-2’-脱氧胸苷，或其药学上可接受的盐、酯或前药，任选地在药学上可接受的载体或稀释剂中。
78.一种用于治疗抗药型HBV感染的宿主的药物组合物，其包括有效量的β-L-2’-脱氧胞苷，或其药学上可接受的盐、酯或前药，任选地在药学上可接受的载体或稀释剂中。
79.一种用于治疗抗药型HBV感染的宿主的药物组合物，所述抗药型HBV表现为在DNA聚合酶区内552位密码子由蛋氨酸至缬氨酸的突变，其包括有效量的β-L-2’-脱氧核苷，或其药学上可接受的盐、酯或前药，任选地在药学上可接受的载体或稀释剂中。
80.一种用于治疗抗药型HBV感染的宿主的药物组合物，所述抗药型HBV表现为在DNA聚合酶区内552位密码子由蛋氨酸至缬氨酸的突变，其包括有效量的式(I)的化合物 或其药学上的盐、酯或前药，其中R1和R2独立地是氢、直链烷基、支链烷基或环状烷基、酰基、乙酰基、丁酰基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、CO-芳氧基烷基、CO-取代的芳基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳烷基磺酰基、氨基酸残基、一磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯或磷酸酯衍生物；X是O、S、SO2或CH2；且BASE为可任选被取代的嘌呤碱基或嘧啶碱基；任选地在药学上可接受的载体或稀释剂中。
81.一种用于治疗抗药型HBV感染的宿主的药物组合物，所述抗药型HBV表现为在DNA聚合酶区内552位密码子由蛋氨酸至缬氨酸的突变，其包括有效量的下式的化合物 或其药学上的盐、酯或前药，其中R1和R2独立地是氢、直链烷基、支链烷基或环状烷基、酰基、乙酰基、丁酰基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、CO-芳氧基烷基、CO-取代的芳基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳烷基磺酰基、氨基酸残基、一磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯或磷酸酯衍生物；Y是OR3、NR3R4或SR3；X1和X2独立地选自H、直链烷基、支链烷基或环状烷基、酰基、乙酰基、丁酰基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、卤素、OR5、NR5R6或SR5；且R3、R4、R5和R6独立地是H、直链烷基、支链烷基或环状烷基、二烷基氨基亚烷基、酰基、乙酰基、丁酰基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、CO-芳氧基烷基、CO-取代的芳基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳烷基磺酰基、氨基酸残基、一磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯或磷酸酯衍生物；任选地在药学上可接受的载体或稀释剂中。
82.一种用于治疗抗药型HBV感染的宿主的药物组合物，所述抗药型HBV表现为在DNA聚合酶区内552位密码子由蛋氨酸至缬氨酸的突变，其包括有效量的下式的化合物 或其药学上的盐、酯或前药，其中R1和R2独立地是氢、直链烷基、支链烷基或环状烷基、酰基、乙酰基、丁酰基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、CO-芳氧基烷基、CO-取代的芳基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳烷基磺酰基、氨基酸残基、一磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯或磷酸酯衍生物；Y是OR3、NR3R4或SR3；X1选自H、直链烷基、支链烷基或环状烷基、酰基、乙酰基、丁酰基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、卤素、OR5、NR5R6或SR5；且R3、R4、R5和R6独立地是H、直链烷基、支链烷基或环状烷基、二烷基氨基亚烷基、酰基、乙酰基、丁酰基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、CO-芳氧基烷基、CO-取代的芳基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳烷基磺酰基、氨基酸残基、一磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯或磷酸酯衍生物；任选地在药学上可接受的载体或稀释剂中。
83.一种用于治疗抗药型HBV感染的宿主的药物组合物，所述抗药型HBV表现为在DNA聚合酶区内552位密码子由蛋氨酸至缬氨酸的突变，其包括有效量的下式的化合物 或其药学上的盐、酯或前药，其中R1和R2独立地是氢、直链烷基、支链烷基或环状烷基、酰基、乙酰基、丁酰基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、CO-芳氧基烷基、CO-取代的芳基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳烷基磺酰基、氨基酸残基、一磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯或磷酸酯衍生物；和R3和R4独立地是H、直链烷基、支链烷基或环状烷基、二烷基氨基亚烷基、酰基、乙酰基、丁酰基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、CO-芳氧基烷基、CO-取代的芳基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳烷基磺酰基、氨基酸残基、一磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯或磷酸酯衍生物；任选地在药学上可接受的载体或稀释剂中。
84.权利要求83的药物组合物，其中R3和/或R4是H。
85.权利要求83的药物组合物，其中R1和/或R2是H。
86.权利要求83的药物组合物，其中至少一个R1、R2或R4是下式的氨基酸残基C(O)C(R8)(R9)(NR10R11)其中R8是氨基酸侧链、烷基、芳基、杂芳基、杂环基，或者，R8可任选地与R10连接形成环状结构；R9是氢、烷基或芳基；和R10和R11独立地是氢、酰基或烷基。
87.权利要求86的药物组合物，其中氨基酸残基是L-缬氨酰基。
88.一种用于治疗抗药型HBV感染的宿主的药物组合物，所述抗药型HBV表现为在DNA聚合酶区内552位密码子由蛋氨酸至缬氨酸的突变，其包括有效量的下式的化合物 或其药学上可接受的盐、酯或前药；任选地在药学上可接受的载体或稀释剂中。
89.一种用于治疗抗药型HBV感染的宿主的药物组合物，所述抗药型HBV表现为在DNA聚合酶区内552位密码子由蛋氨酸至缬氨酸的突变，其包括有效量的下式的化合物 或其药学上可接受的盐、酯或前药；任选地在药学上可接受的载体或稀释剂中。
90.一种用于治疗抗药型HBV感染的宿主的药物组合物，所述抗药型HBV表现为在DNA聚合酶区内552位密码子由蛋氨酸至缬氨酸的突变，其包括有效量的下式的化合物 或其药学上可接受的盐、酯或前药；任选地在药学上可接受的载体或稀释剂中。
91.一种用于治疗抗药型HBV感染的宿主的药物组合物，所述抗药型HBV表现为在DNA聚合酶区内552位密码子由蛋氨酸至缬氨酸的突变，其包括有效量的下式的化合物 或其药学上可接受的盐、酯或前药；任选地在药学上可接受的载体或稀释剂中。
92.一种用于治疗抗药型HBV感染的宿主的药物组合物，所述抗药型HBV表现为在DNA聚合酶区内552位密码子由蛋氨酸至缬氨酸的突变，其包括有效量的下式的化合物 或其药学上的盐、酯或前药，其中R1和R2独立地是氢、直链烷基、支链烷基或环状烷基、酰基、乙酰基、丁酰基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、CO-芳氧基烷基、CO-取代的芳基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳烷基磺酰基、氨基酸残基、一磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯或磷酸酯衍生物；且R3是氢、直链烷基、支链烷基或环状烷基、二烷基氨基亚烷基、酰基、乙酰基、丁酰基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、CO-芳氧基烷基、CO-取代的芳基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳烷基磺酰基、氨基酸残基、一磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯或磷酸酯衍生物；任选地在药学上可接受的载体或稀释剂中。
93.权利要求92的药物组合物，其中R3是H。
94.权利要求92的药物组合物，其中R1和/或R2是H。
95.权利要求92的药物组合物，其中至少一个R1或R2是下式的氨基酸残基C(O)C(R8)(R9)(NR10R11)其中R8是氨基酸侧链、烷基、芳基、杂芳基、杂环基，或者，R8可任选地与R10连接形成环状结构；R9是氢、烷基或芳基；且R10和R11独立地是氢、酰基或烷基。
96.权利要求95的药物组合物，其中氨基酸残基是L-缬氨酰基。
97.一种用于治疗抗药型HBV感染的宿主的药物组合物，所述抗药型HBV表现为在DNA聚合酶区内552位密码子由蛋氨酸至缬氨酸的突变，其包括有效量的下式的化合物 或其药学上的盐、酯或前药；任选地在药学上可接受的载体或稀释剂中。
98.一种用于治疗抗药型HBV感染的宿主的药物组合物，所述抗药型HBV表现为在DNA聚合酶区内552位密码子由蛋氨酸至缬氨酸的突变，其包括有效量的下式的化合物 或其药学上可接受的盐、酯或前药；任选地在药学上可接受的载体或稀释剂中。
99.一种用于治疗抗药型HBV感染的宿主的药物组合物，所述抗药型HBV表现为在DNA聚合酶区内552位密码子由蛋氨酸至缬氨酸的突变，其包括有效量的下式的化合物 或其药学上可接受的盐、酯或前药；任选地在药学上可接受的载体或稀释剂中。
100.一种用于治疗抗药型HBV感染的宿主的药物组合物，所述抗药型HBV表现为在DNA聚合酶区内552位密码子由蛋氨酸至缬氨酸的突变，其包括有效量的下式的化合物 或其药学上可接受的盐、酯或前药；任选地在药学上可接受的载体或稀释剂中。
101.一种用于防止或抑制HBV的DNA聚合酶区内552位密码子由蛋氨酸至缬氨酸的突变在宿主中表达的药物组合物，其包括有效量的β-L-2’-脱氧核苷，或其药学上可接受的盐、酯或前药，任选地在药学上可接受的载体或稀释剂中。
102.一种用于防止或抑制HBV的DNA聚合酶区内552位密码子由蛋氨酸至缬氨酸的突变在宿主中表达的药物组合物，其包括有效量的式(I)的化合物 或其药学上的盐、酯或前药，其中R1和R2独立地是氢、直链烷基、支链烷基或环状烷基、酰基、乙酰基、丁酰基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、CO-芳氧基烷基、CO-取代的芳基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳烷基磺酰基、氨基酸残基、一磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯或磷酸酯衍生物；X是O、S、SO2或CH2；且BASE为可任选被取代的嘌呤碱基或嘧啶碱基；任选地在药学上可接受的载体或稀释剂中。
103.一种用于防止或抑制HBV的DNA聚合酶区内552位密码子由蛋氨酸至缬氨酸的突变在宿主中表达的药物组合物，其包括有效量的下式的化合物 或其药学上的盐、酯或前药，其中R1和R2独立地是氢、直链烷基、支链烷基或环状烷基、酰基、乙酰基、丁酰基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、CO-芳氧基烷基、CO-取代的芳基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳烷基磺酰基、氨基酸残基、一磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯或磷酸酯衍生物；Y是OR3、NR3R4或SR3；X1和X2独立地选自H、直链烷基、支链烷基或环状烷基、酰基、乙酰基、丁酰基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、卤素、OR5、NR5R6或SR5；且R3、R4、R5和R6独立地是H、直链烷基、支链烷基或环状烷基、二烷基氨基亚烷基、酰基、乙酰基、丁酰基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、CO-芳氧基烷基、CO-取代的芳基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳烷基磺酰基、氨基酸残基、一磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯或磷酸酯衍生物；任选地在药学上可接受的载体或稀释剂中。
104.一种用于防止或抑制HBV的DNA聚合酶区内552位密码子由蛋氨酸至缬氨酸的突变在宿主中表达的药物组合物，其包括有效量的下式的化合物 或其药学上的盐、酯或前药，其中R1和R2独立地是氢、直链烷基、支链烷基或环状烷基、酰基、乙酰基、丁酰基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、CO-芳氧基烷基、CO-取代的芳基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳烷基磺酰基、氨基酸残基、一磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯或磷酸酯衍生物；Y是OR3、NR3R4或SR3；X1选自H、直链烷基、支链烷基或环状烷基、酰基、乙酰基、丁酰基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、卤素、OR5、NR5R6或SR5；且R3、R4、R5和R6独立地是H、直链烷基、支链烷基或环状烷基、二烷基氨基亚烷基、酰基、乙酰基、丁酰基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、CO-芳氧基烷基、CO-取代的芳基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳烷基磺酰基、氨基酸残基、一磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯或磷酸酯衍生物；任选地在药学上可接受的载体或稀释剂中。
105.一种用于防止或抑制HBV的DNA聚合酶区内552位密码子由蛋氨酸至缬氨酸的突变在宿主中表达的药物组合物，其包括有效量的下式的化合物 或其药学上的盐、酯或前药，其中R1和R2独立地是氢、直链烷基、支链烷基或环状烷基、酰基、乙酰基、丁酰基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、CO-芳氧基烷基、CO-取代的芳基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳烷基磺酰基、氨基酸残基、一磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯或磷酸酯衍生物；和R3和R4独立地是H、直链烷基、支链烷基或环状烷基、二烷基氨基亚烷基、酰基、乙酰基、丁酰基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、CO-芳氧基烷基、CO-取代的芳基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳烷基磺酰基、氨基酸残基、一磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯或磷酸酯衍生物；任选地在药学上可接受的载体或稀释剂中。
106.权利要求105的药物组合物，其中R3和/或R4是H。
107.权利要求105的药物组合物，其中R1和/或R2是H。
108.权利要求105的药物组合物，其中至少一个R1、R2或R4是下式的氨基酸残基C(O)C(R8)(R9)(NR10R11)其中R8是氨基酸侧链、烷基、芳基、杂芳基、杂环基，或者，R8可任选地与R10连接形成环状结构；R9是氢、烷基或芳基；且R10和R11独立地是氢、酰基或烷基。
109.权利要求108的药物组合物，其中氨基酸残基是L-缬氨酰基。
110.一种用于防止或抑制HBV的DNA聚合酶区内552位密码子由蛋氨酸至缬氨酸的突变在宿主中表达的药物组合物，其包括有效量的下式的化合物 或其药学上的盐、酯或前药；任选地在药学上可接受的载体或稀释剂中。
111.一种用于防止或抑制HBV的DNA聚合酶区内552位密码子由蛋氨酸至缬氨酸的突变在宿主中表达的药物组合物，其包括有效量的下式的化合物 或其药学上可接受的盐、酯或前药；任选地在药学上可接受的载体或稀释剂中。
112.一种用于防止或抑制HBV的DNA聚合酶区内552位密码子由蛋氨酸至缬氨酸的突变在宿主中表达的药物组合物，其包括有效量的下式的化合物 或其药学上可接受的盐、酯或前药；任选地在药学上可接受的载体或稀释剂中。
113.一种用于防止或抑制HBV的DNA聚合酶区内552位密码子由蛋氨酸至缬氨酸的突变在宿主中表达的药物组合物，其包括有效量的下式的化合物 或其药学上可接受的盐、酯或前药；任选地在药学上可接受的载体或稀释剂中。
114.一种用于防止或抑制HBV的DNA聚合酶区内552位密码子由蛋氨酸至缬氨酸的突变在宿主中表达的药物组合物，其包括有效量的下式的化合物 或其药学上可接受的盐、酯或前药，其中R1和R2独立地是氢、直链烷基、支链烷基或环状烷基、酰基、乙酰基、丁酰基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、CO-芳氧基烷基、CO-取代的芳基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳烷基磺酰基、氨基酸残基、一磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯或磷酸酯衍生物；且R3是氢、直链烷基、支链烷基或环状烷基、二烷基氨基亚烷基、酰基、乙酰基、丁酰基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、CO-芳氧基烷基、CO-取代的芳基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳烷基磺酰基、氨基酸残基、一磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯或磷酸酯衍生物；任选地在药学上可接受的载体或稀释剂中。
115.权利要求114的药物组合物，其中R3是H。
116.权利要求114的药物组合物，其中R1和/或R2是H。
117.权利要求114的药物组合物，其中至少一个R1或R2是下式的氨基酸残基C(O)C(R8)(R9)(NR10R11)其中R8是氨基酸侧链、烷基、芳基、杂芳基、杂环基，或者，R8可任选地与R10连接形成环状结构；R9是氢、烷基或芳基；且R10和R11独立地是氢、酰基或烷基。
118.权利要求117的药物组合物，其中氨基酸残基是L-缬氨酰基。
119.一种用于防止或抑制HBV的DNA聚合酶区内552位密码子由蛋氨酸至缬氨酸的突变在宿主中表达的药物组合物，其包括有效量的下式的化合物 或其药学上可接受的盐、酯或前药；任选地在药学上可接受的载体或稀释剂中。
120.一种用于防止或抑制HBV的DNA聚合酶区内552位密码子由蛋氨酸至缬氨酸的突变在宿主中表达的药物组合物，其包括有效量的下式的化合物 或其药学上可接受的盐、酯或前药；任选地在药学上可接受的载体或稀释剂中。
121.一种用于防止或抑制HBV的DNA聚合酶区内552位密码子由蛋氨酸至缬氨酸的突变在宿主中表达的药物组合物，其包括有效量的下式的化合物 或其药学上的盐、酯或前药；任选地在药学上可接受的载体或稀释剂中。
122.一种用于防止或抑制HBV的DNA聚合酶区内552位密码子由蛋氨酸至缬氨酸的突变在宿主中表达的药物组合物，其包括有效量的下式的化合物 或其药学上可接受的盐、酯或前药；任选地在药学上可接受的载体或稀释剂中。
123.一种用于防止或抑制HBV的DNA聚合酶区内552位密码子由蛋氨酸至缬氨酸和526位或528位密码子由亮氨酸至蛋氨酸的突变在宿主中表达的药物组合物，其包括有效量的β-L-2’-脱氧核苷，或其药学上可接受的盐、酯或前药，任选地在药学上可接受的载体或稀释剂中。
124.一种用于防止或抑制HBV的DNA聚合酶区内552位密码子由蛋氨酸至缬氨酸和526位或528位密码子由亮氨酸至蛋氨酸的突变在宿主中表达的药物组合物，其包括有效量的式(I)的化合物 或其药学上的盐、酯或前药，其中R1和R2独立地是氢、直链烷基、支链烷基或环状烷基、酰基、乙酰基、丁酰基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、CO-芳氧基烷基、CO-取代的芳基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳烷基磺酰基、氨基酸残基、一磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯或磷酸酯衍生物；X是O、S、SO2或CH2；且BASE为可任选被取代的嘌呤碱基或嘧啶碱基；任选地在药学上可接受的载体或稀释剂中。
125.一种用于防止或抑制HBV的DNA聚合酶区内552位密码子由蛋氨酸至缬氨酸和526位或528位密码子由亮氨酸至蛋氨酸的突变在宿主中表达的药物组合物，其包括有效量的下式的化合物 或其药学上的盐、酯或前药，其中R1和R2独立地是氢、直链烷基、支链烷基或环状烷基、酰基、乙酰基、丁酰基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、CO-芳氧基烷基、CO-取代的芳基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳烷基磺酰基、氨基酸残基、一磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯或磷酸酯衍生物；Y是OR3、NR3R4或SR3；X1和X2独立地选自H、直链烷基、支链烷基或环状烷基、酰基、乙酰基、丁酰基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、卤素、OR5、NR5R6或SR5；且R3、R4、R5和R6独立地是H、直链烷基、支链烷基或环状烷基、二烷基氨基亚烷基、酰基、乙酰基、丁酰基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、CO-芳氧基烷基、CO-取代的芳基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳烷基磺酰基、氨基酸残基、一磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯或磷酸酯衍生物；任选地在药学上可接受的载体或稀释剂中。
126.一种用于防止或抑制HBV的DNA聚合酶区内552位密码子由蛋氨酸至缬氨酸和526位或528位密码子由亮氨酸至蛋氨酸的突变在宿主中表达的药物组合物，其包括有效量的下式的化合物 或其药学上可接受的盐、酯或前药，其中R1和R2独立地是氢、直链烷基、支链烷基或环状烷基、酰基、乙酰基、丁酰基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、CO-芳氧基烷基、CO-取代的芳基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳烷基磺酰基、氨基酸残基、一磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯或磷酸酯衍生物；Y是OR3、NR3R4或SR3；X1选自H、直链烷基、支链烷基或环状烷基、酰基、乙酰基、丁酰基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、卤素、OR5、NR5R6或SR5；且R3、R4、R5和R6独立地是H、直链烷基、支链烷基或环状烷基、二烷基氨基亚烷基、酰基、乙酰基、丁酰基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、CO-芳氧基烷基、CO-取代的芳基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳烷基磺酰基、氨基酸残基、一磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯或磷酸酯衍生物；任选地在药学上可接受的载体或稀释剂中。
127.一种用于防止或抑制HBV的DNA聚合酶区内552位密码子由蛋氨酸至缬氨酸和526位或528位密码子由亮氨酸至蛋氨酸的突变在宿主中表达的药物组合物，其包括有效量的下式的化合物 或其药学上可接受的盐、酯或前药，其中R1和R2独立地是氢、直链烷基、支链烷基或环状烷基、酰基、乙酰基、丁酰基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、CO-芳氧基烷基、CO-取代的芳基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳烷基磺酰基、氨基酸残基、一磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯或磷酸酯衍生物；且R3和R4独立地是H、直链烷基、支链烷基或环状烷基、二烷基氨基亚烷基、酰基、乙酰基、丁酰基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、CO-芳氧基烷基、CO-取代的芳基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳烷基磺酰基、氨基酸残基、一磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯或磷酸酯衍生物；任选地在药学上可接受的载体或稀释剂中。
128.权利要求127的药物组合物，其中R3和/或R4是H。
129.权利要求127的药物组合物，其中R1和/或R2是H。
130.权利要求127的药物组合物，其中至少一个R1、R2或R4是下式的氨基酸残基C(O)C(R8)(R9)(NR10R11)其中R8是氨基酸侧链、烷基、芳基、杂芳基、杂环基，或者，R8可任选地与R10连接形成环状结构；R9是氢、烷基或芳基；且R10和R11独立地是氢、酰基或烷基。
131.权利要求130的药物组合物，其中氨基酸残基是L-缬氨酰基。
132.一种用于防止或抑制HBV的DNA聚合酶区内552位密码子由蛋氨酸至缬氨酸和526位或528位密码子由亮氨酸至蛋氨酸的突变在宿主中表达的药物组合物，其包括有效量的下式的化合物 或其药学上可接受的盐、酯或前药；任选地在药学上可接受的载体或稀释剂中。
133.一种用于防止或抑制HBV的DNA聚合酶区内552位密码子由蛋氨酸至缬氨酸和526位或528位密码子由亮氨酸至蛋氨酸的突变在宿主中表达的药物组合物，其包括有效量的下式的化合物 或其药学上的盐、酯或前药；任选地在药学上可接受的载体或稀释剂中。
134.一种用于防止或抑制HBV的DNA聚合酶区内552位密码子由蛋氨酸至缬氨酸和526位或528位密码子由亮氨酸至蛋氨酸的突变在宿主中表达的药物组合物，其包括有效量的下式的化合物 或其药学上可接受的盐、酯或前药；任选地在药学上可接受的载体或稀释剂中。
135.一种用于防止或抑制HBV的DNA聚合酶区内552位密码子由蛋氨酸至缬氨酸和526位或528位密码子由亮氨酸至蛋氨酸的突变在宿主中表达的药物组合物，其包括有效量的下式的化合物 或其药学上的盐、酯或前药；任选地在药学上可接受的载体或稀释剂中。
136.一种用于防止或抑制HBV的DNA聚合酶区内552位密码子由蛋氨酸至缬氨酸和526位或528位密码子由亮氨酸至蛋氨酸的突变在宿主中表达的药物组合物，其包括有效量的下式的化合物 或其药学上的盐、酯或前药，其中R1和R2独立地是氢、直链烷基、支链烷基或环状烷基、酰基、乙酰基、丁酰基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、CO-芳氧基烷基、CO-取代的芳基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳烷基磺酰基、氨基酸残基、一磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯或磷酸酯衍生物；且R3是氢、直链烷基、支链烷基或环状烷基、二烷基氨基亚烷基、酰基、乙酰基、丁酰基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、CO-芳氧基烷基、CO-取代的芳基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳烷基磺酰基、氨基酸残基、一磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯或磷酸酯衍生物；任选地在药学上可接受的载体或稀释剂中。
137.权利要求136的药物组合物，其中R3是H。
138.权利要求136的药物组合物，其中R1和/或R2是H。
139.权利要求136的药物组合物，其中至少一个R1或R2是下式的氨基酸残基C(O)C(R8)(R9)(NR10R11)其中R8是氨基酸侧链、烷基、芳基、杂芳基、杂环基，或者，R8可任选地与R10连接形成环状结构；R9是氢、烷基或芳基；和R10和R11独立地是氢、酰基或烷基。
140.权利要求139的药物组合物，其中氨基酸残基是L-缬氨酰基。
141.一种用于防止或抑制HBV的DNA聚合酶区内552位密码子由蛋氨酸至缬氨酸和526位或528位密码子由亮氨酸至蛋氨酸的突变在宿主中表达的药物组合物，其包括有效量的下式的化合物 或其药学上的盐、酯或前药。
142.一种用于防止或抑制HBV的DNA聚合酶区内552位密码子由蛋氨酸至缬氨酸和526位或528位密码子由亮氨酸至蛋氨酸的突变在宿主中表达的药物组合物，其包括有效量的下式的化合物 或其药学上可接受的盐、酯或前药。
143.一种用于防止或抑制HBV的DNA聚合酶区内552位密码子由蛋氨酸至缬氨酸和526位或528位密码子由亮氨酸至蛋氨酸的突变在宿主中表达的药物组合物，其包括有效量的下式的化合物 或其药学上可接受的盐、酯或前药。
144.一种用于防止或抑制HBV的DNA聚合酶区内552位密码子由蛋氨酸至缬氨酸和526位或528位密码子由亮氨酸至蛋氨酸的突变在宿主中表达的药物组合物，其包括有效量的下式的化合物 或其药学上可接受的盐、酯或前药。
145.权利要求1-69任一项的药物组合物，其进一步包括有效量的一种或多种其它抗HBV剂。
146.权利要求145的药物组合物，其中其它抗HBV剂选自3TC、FTC、L-FMAU、DAPD、DXG、泛昔洛韦、喷昔洛韦、BMS-200475、bis pom PMEA(阿德福韦二匹伏酯)、洛布卡韦、更昔洛韦、替诺福韦、Lfd4C、磷卡萘(膦酰基甲酸三钠)、异丙肌苷、左旋咪唑、N-乙酰胱氨酸(NAC)、干扰素、聚乙二醇化干扰素、ISS、利巴韦林、PC 1323或聚腺环状聚尿苷酸。
147.权利要求146的药物组合物，其中至少一种其它抗HBV剂是干扰素。
148.权利要求147的药物组合物，其中干扰素选自干扰素α、聚乙二醇化干扰素α、干扰素α-2a、干扰素α-2b、聚乙二醇化干扰素α-2a、聚乙二醇化干扰素α-2b、ROFERON(干扰素α-2a)、PEGASYS(聚乙二醇化干扰素α-2a)、INTRONA(干扰素α-2b)、PEG-INTRON(聚乙二醇化干扰素α-2b)、干扰素β、干扰素γ、干扰素τ、干扰素ω、复合干扰素、INFERGEN(干扰素alphacon-1)、OMNIFERON(天然干扰素)、REBIF(干扰素β-1a)、ω干扰素、口服干扰素α、干扰素γ-1b、SuperFeron(天然人多亚型IFN-α)和HuFeron(人IFN-β)。
149.权利要求76-148任一项的药物组合物，其中宿主是哺乳动物。
150.权利要求149的药物组合物，其中宿主是人。
151.权利要求76-78和145-150任一项的药物组合物用于治疗抗药型HBV感染的宿主的用途。
152.权利要求76-78和145-150任一项的药物组合物在制备用于治疗抗药型HBV感染的宿主的药物中的用途。
153.权利要求79-100和145-150任一项的药物组合物在治疗抗药型HBV感染的宿主中的用途，所述抗药型HBV表现为在DNA聚合酶区内552位密码子由蛋氨酸至缬氨酸的突变。
154.权利要求79-100和145-150任一项的药物组合物在制备用于治疗抗药型HBV感染的宿主的药物中的用途，所述抗药型HBV表现为在DNA聚合酶区内552位密码子由蛋氨酸至缬氨酸的突变。
155.权利要求101-122和145-150任一项的药物组合物用于防止或抑制HBV的DNA聚合酶区内552位密码子由蛋氨酸至缬氨酸的突变在宿主中表达的用途。
156.权利要求101-122和145-150任一项的药物组合物在制备用于防止或抑制HBV的DNA聚合酶区内552位密码子由蛋氨酸至缬氨酸的突变在宿主中表达的药物中的用途。
157.权利要求101-122和145-150任一项的药物组合物用于防止或抑制HBV的DNA聚合酶区内552位密码子由蛋氨酸至缬氨酸和526位或528位密码子由亮氨酸至蛋氨酸的突变在宿主中表达的用途。
158.权利要求101-122和145-150任一项的药物组合物在制备用于防止或抑制HBV的DNA聚合酶区内552位密码子由蛋氨酸至缬氨酸和526位或528位密码子由亮氨酸至蛋氨酸的突变在宿主中表达的药物中的用途。
159.权利要求151-158任一项的用途，其中宿主是哺乳动物。
160.权利要求159的用途，其中宿主是人。
全文摘要
β－L－2’－脱氧核苷已被发现具有对抗存在突变的抗药性乙型肝炎病毒的活性。本发明公开了在宿主中治疗拉米夫定抗性HBV(M552V)的方法，该方法包括施用β－L－2’脱氧核苷或其药学上可接受的盐、酯或前药。此外，本发明公开了防止原初宿主中发生拉米夫定抗性HBV(M552V)突变的方法，该方法包括施用β－L－2’－脱氧核苷或其药学上可接受的盐、酯或前药。还公开了防止和/或抑制宿主中出现HBV双突变体(L528M/M552V)的方法，该方法包括施用β－L－2’－脱氧核苷或其药学上可接受的盐、酯或前药。
文档编号A61K31/7072GK1777363SQ03825115
公开日2006年5月24日 申请日期2003年9月15日 优先权日2002年9月13日
发明者D·斯坦德林, J·-P·索马多西, A·L·佩蒂, M·塞菲尔 申请人:艾登尼科斯(开曼)有限公司