专利名称：抑制sars冠状病毒感染的中药有效成分及其生物活性测定方法
技术领域：
本发明涉及一类抗SARS冠状病毒药物，具体涉及从植物中分离出的抑制SARS冠状病毒侵染宿主细胞的有效成分。本发明还涉及利用固定化S2蛋白直接测定植物成分生物活性的方法。
背景技术：
SARS病毒是一种带囊膜的冠状病毒，其侵染细胞的第一步就是病毒囊膜与宿主细胞的融合。若能有效抑制囊膜突起中的关键结构域S2蛋白，阻断SARS病毒与宿主细胞的融合，则可防止SARS病毒侵染宿主细胞，起到预防和治疗SARS的目的。
发明内容
本发明的目的是寻找SARS病毒spike蛋白中能与宿主蛋白结合的S2蛋白抑制剂，使其能阻断SARS病毒与宿主细胞融合，从而阻断SARS病毒侵染宿主细胞，达到预防与治疗SARS的目的。
本发明创建了一种利用固定化S2蛋白直接测定植物成分生物活性的方法将S2蛋白伪联到甲基丙烯酸聚合物上制成亲和色谱柱，与质谱联机后利用前沿亲和色谱方法可快速从大量的植物成分中筛选出能有效结合S2蛋白的化合物。根据化合物在亲和色谱柱上的保留时间判断抑制活性的高低。还可通过质谱测定其分子量。
通过上述用固定化S2蛋白直接测定植物成分生物活性的方法，本发明从中药五倍子中发现了母体结构为通式I的一类化合物具有抑制SARS冠状病毒侵染宿主细胞的活性作用，可以达到本发明的目的 式I
其中， 式中m可以为0，1，2，3的任意整数，m＝0，表示O原子上接一个氢原子；m＝1，表示O原子上接一个棓酰基；m＝2表示O原子上接二个棓酰基，图示为GG；m＝3，表示O原子上接三个棓酰基，图示为GGG，R1，R2，R3，R4，R5，R6，R7，R8，R9，R10；R11，R12，R13，R14，R15，R16，R17，R18表示氢原子、1-20个碳原子的烷基羟基，1-8个碳原子的烷氧基，1-20个碳原子上的酰基；(-CAH2AO)B-H(A是2或3，B是1以上的整数)表示的聚亚氧烷基，或者以下述式II结构表示的的糖残基，它们可以相同、也可以不同。
本类化合物还包括相邻的棓酰基通过脱氢形成的化合物(图中示意为G0)，例如三棓酰基-β-D-葡萄糖的柯里拉京及其衍生物，四棓酰基-β-D-葡萄糖脱氢形成的化合物及其衍生物，五棓酰基-β-D-葡萄糖脱氢形成的化合物及其衍生物等。
式(II)式I化合物属于水解类单宁，主要富含于中国五倍子、土耳其五倍子等植物。
式I化合物还包括其水合物。
式I化合物可以形成各种可药用的盐。
将式I化合物与药学上可接受的辅剂结合，可以制备治疗和预防SARS病毒感染的药物。
本发明对式I化合物进行了如下药效学实验1.采用SARS冠状病毒(SARS Cornavirus，下面简称SARS-CoV)假病毒侵染系统进行抗SARS-CoV研究。
HIV-luc/SARS-CoV假病毒检测系统是一种简便、安全的SARS-CoV检测系统。HIV-luc/SARS-CoV假病毒是用SARS-CoV的囊膜蛋白包裹env基因突变并携带luciferase基因的HIV核衣壳形成的SARS-CoV模拟病毒。这种假病毒能够入侵SARS-CoV的宿主细胞VERO E6细胞，但由于缺少囊膜蛋白基因，不能继续产生子代病毒，因而只能进行一轮侵染。假病毒侵染模型可以模拟病毒的入侵过程，因而利用这种模型可以筛选抑制病毒入侵的药物、检测病毒中和抗体。目前，这一方法已普遍使用于HIV-1的中和抗体检测和药物筛选。
2.SARS-CoV真病毒侵染模型，进行式I化合物的抗SARS-CoV研究。
本发明还进行了式I化合物的细胞毒性实验。
以上药理毒理学实验结果证实，本发明提供的式I化合物可抑制SARS冠状病毒侵染宿主细胞，且对细胞毒性低，可作为抗SARS病毒感染的药物。
图1是前沿亲和色谱柱的系统示意图，其中1是ESI-TOF MS，2是三通阀，3是亲和色谱柱，4、5分别是进样器A和B；图2是五倍子粗提物的质谱图，其主要成分的编号与实施例2中表1中编号一致；
图3是来自图2中主要化合物的前沿色谱图。图3表示保留时间和强度的关系。
图4是式I化合物对SARS-CoV假病毒的抑制实验结果。图中lucifease活性％表示luciferase活性抑制百分比，C[mol/L]表示式I化合物的浓度(单位为摩尔/升)。
具体实施例方式
实施例1式I化合物的获得1.提取取干燥五倍子粉碎到适当粒度，用50％丙酮-水室温浸提3次，每次24小时。回收溶剂至小体积。
以氯仿、乙酸乙酯、正丁醇分别与水进行分配，分出氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、水各个部分，进行减压浓缩得氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、水浸膏。
将乙酸乙酯部分用葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱层析分离，以甲醇-水-丙酮溶剂进行梯度洗脱，聚酰胺薄膜薄层检测，用紫外光和三氯化铁溶液显色指示馏分。得到包括二棓酰基、三棓酰基、四棓酰基葡萄糖粗品和以五取代棓酰基-β-D-葡萄糖核上的C-2、C-3、C-4有任意分布的缩酚酸棓酰基的五到十二棓酰基葡萄糖粗品。
二棓酰基、三棓酰基、四棓酰基葡萄糖粗品分别反复经过Sephadex LH-20柱层析纯化，以甲醇-水-丙酮溶剂进行梯度洗脱，聚酰胺薄膜薄层检测，用紫外光和三氯化铁溶液显色指示馏分。甲醇-水重结晶分别得到二棓酰基、三棓酰基、四棓酰基葡萄糖纯品。
以五取代棓酰基--D-葡萄糖核上的C-2、C-3、C-4有任意分布的缩酚酸棓酰基的五到十二棓酰基葡萄糖粗品分别反复经过Sephadex LH-20柱层析纯化，以甲醇-水-丙酮溶剂进行梯度洗脱，聚酰胺薄膜薄层检测紫外光和三氯化铁溶液显色指示馏分进一步提纯。再以制备色谱反相柱材料、甲醇-水-草酸洗脱、紫外光(λ＝280nm)检测纯化制备五到十二棓酰基葡萄糖纯品。
2.二棓酰基、三棓酰基、四棓酰基葡萄糖和以五取代棓酰基-β-D-葡萄糖核上的C-2、C-3、C-4有任意分布的缩酚酸棓酰基的五到十二棓酰基葡萄糖衍生物系列化合物。
对棓酰基上的酚羟基的烷基化衍生物，根据碳原子个数可分为低级酯(如甲酯、乙酯、丙酯等)和高级酯(如辛酯、月桂酯、十八碳醇酯等)和特殊的酯(如甘油醇酯)。对甲苯磺酸做催化剂，二氧六环为溶剂制备烷基化衍生物，其具有更好的脂溶性。
对棓酰基上的酚羟基的烷氧基化衍生物，对棓酰基上的酚羟基进行烷氧基化反应(如甲氧基化反应、乙氧基化反应、丙氧基化反应等)。
实施例2利用固定化S2蛋白直接测定植物成分生物活性利用S2蛋白伪联到自制的甲基丙稀酸聚合物上制成亲和色谱柱与质谱联机后通过前沿色谱方法从实施例1所得的五倍子活性部位、粗提物中筛选出能与S2蛋白结合的活性物质。
将5.0毫克的S2蛋白溶于0.5ml DMSO，再加2.8mg的EDCI作为活化试剂，然后在0.1M NaHCO3的缓冲液(pH＝7)中伪联到甲基丙烯酸聚合物载体上，最后得到在1g载体上固定化3.0mg的S2蛋白。在将固定化S2蛋白装在2.1×30mm亲和柱上，用2mMNH4Ac溶液(pH6.7)平衡4小时，用图1装置进行筛选。
将500μl五倍子粗提物用2mM NH4AC配成0.1mg.ml-1浓度注入进样器A中，同时将500μl甲醇溶剂注入进样器B中，使两种溶液以5μl.min-1的速度进入三通阀混合，混合溶液进入ESI-TOF检测。
表1 五倍子中10个主要成份的保留时间
表2 表1中两个保留时间最长的化合物对SARS活病毒的抑制活性数据
*C表示完全抑制SARS病毒时化合物的浓度实施例3式I化合物对细胞的毒性
1.实验材料受试式I化合物结构如下 细胞系Vero E6，用DMEM+10％FBS培养2.实验方法用DMEM+2％FBS将受试化合物进行连续倍比稀释，取经稀释的受试化合物50微升加入到96孔板中长成单层的VERO E6细胞中，每个稀释度接种8个孔，37摄氏度CO2培养箱培养60-72小时后，各孔加入MTT(5毫克/毫升)10微升，继续培养4小时，吸去培养基，于各孔中加入100微升DMSO，稍稍振荡，于570纳米(参考波长630纳米)波长测定OD值。
3.实验结果得到受试化合物对VERO E6细胞的半数毒性浓度(CC50)为851.1微克/毫升。实施例4对SARS假病毒的抑制实验1.实验材料1)细胞系293T，Vero E6用DMEM+10％FBS培养2)质粒携带人源化SARS-CoV的S蛋白的表达质粒pCMV-hs和报告质料pHIV-luc由本实验室提供3)受试式I化合物结构同实施例32.实验方法1)产生HIV-SARS假病毒培养293T细胞，转染前一天将293T细胞传代至10厘米培养皿中，使细胞密度为2×106细胞/孔，pHIV-luc和pCMV-hs表达质粒共转染293T细胞，构建假病毒a)取pHIV-luc和pCMV-hs表达质粒各10微克置450微升灭菌水中，混匀，加入62微升2摩尔CaCl2，混匀；b)取500微升2×HBS置5毫升试管中，以2滴/秒的速率加入DNA/CaCl2，加完后，轻弹管壁混匀；c)将上述1毫升沉淀中逐滴加入10厘米培养皿中培养的细胞上清中，轻轻混匀，置CO2培养箱培养48小时d)收取细胞的培养上清，1000转/分离心5分钟，取上清做0.45微米滤膜过滤。
2)侵染抑制实验a)于96孔板传Vero E6(2×103细胞/孔)，24小时后用于制备的假病毒侵染b)取制备的假病毒50微升与用3％DMEM倍比稀释的受试化合物50微升于37摄氏度孵育30分钟，然后于上述假病毒/受试化合物混合物中加入到96孔板中c)上述96孔板置CO2孵箱48小时后用Wallac Microbeta 1420 Counter作luciferase检测(Promega Luciferase Assay Kit)。
3.实验结果结果见附图4所示。得到受试化合物半数有效浓度为(EC50)为3.4微克/毫升，CC50为851.1微克/毫升。
根据以上所得受试化合物的CC50值和EC50值，计算出受试化合物药物筛选指数SI(selective index，CC50/EC50)为250.32。
实施例5对SARS真病毒的抑制实验1.实验材料细胞系Vero E6用DMEM+10％FBS培养受试式I化合物结构同实施例3对照药物甘草甜素2.实验方法1)从病人组织标本中分离SARS-CoVa)在细胞培养瓶中接种Vero E6细胞，于CO2孵箱培养24小时b)取SARS尸解肺组织标本，在预冷的乳钵中研成匀浆，加入适量的病毒稀释液(含500单位/毫升青霉素、500单位/毫升链霉素的DMEM培养基，pH7.2)，180g离心20分钟，取上清接种于1)步中已长成单层的VERO-E6，37℃吸附1小时，吸出标本液，加入含有2％胎牛血清的DMEM培养液，37摄氏度，CO2孵箱培养48小时至细胞出现典型细胞病变，收取细胞培养上清，180g离心20分钟，含病毒的上清培养液分装置-80摄氏度保存。
c)病毒滴度测定取100微升上述分离的含病毒培养上清用DMEM作10×连续稀释，加入到96孔板中长成单层的VERO E6细胞中，每个稀释度接种8个孔，CO2孵箱培养72小时，各孔加入MTT(5毫克/毫升)10微升，继续培养4小时，吸去培养基，于各孔中加入100微升DMSO，稍稍振荡，于570纳米(参考波长630纳米)波长测定OD值，用Reed andMuench法计算病毒滴度(TCID50)。
2)SARS-CoV活病毒入侵细胞抑制实验用DMEM+2％FBS将受试化合物进行连续倍比稀释，取经稀释的受试化合物50微升与200 TCID50的SARS-CoV活病毒混合，37摄氏度结合30分钟后加入到96孔板中长成单层的VERO E6细胞中，每个稀释度接种8个孔，37摄氏度CO2培养箱培养60-72小时后，各孔加入MTT(5毫克/毫升)10微升，继续培养4小时，吸去培养基，于各孔中加入100微升DMSO，稍稍振荡，于570纳米(参考波长630纳米)波长测定OD值。
用甘草甜素作为阳性对照药物同时进行如上抑制实验。
3.实验结果见下表。
讨论经用真病毒和假病毒进行药效学(二者的结果比较吻合)检测表明，本发明提供的式I化合物具有较好的对抗SARS-CoV的作用。与已报道的甘草甜素(EC50值和SI值分别为600微克/毫升和8.3，J Cinatl Lancet.2003 Jun 14；361(9374)2045-6)相比较，本发明的化合物的抗SARS-CoV的作用优于甘草甜素。
权利要求
1.用式I化合物制备抑制SARS冠状病毒感染的药物的用途， 式I其中， 式中m可以为0，1，2，3的任意整数，m＝0，表示O原子上接一个氢原子；m＝1，表示O原子上接一个棓酰基；m＝2表示O原子上接二个棓酰基，图示为GG；m＝3，表示O原子上接三个棓酰基，图示为GGG，R1，R2，R3，R4，R5，R6，R7，R8，R9，R10；R11，R12，R13，R14，R15，R16，R17，R18表示氢原子、1-20个碳原子的烷基羟基，1-8个碳原子的烷氧基，1-20个碳原子上的酰基；(-CAH2AO)B-H(A是2或3，B是1以上的整数)表示的聚亚氧烷基，或者以下述式II结构表示的的糖残基，它们可以相同，也可以不同；式I化合物还包括相邻的棓酰基通过脱氢形成的化合物。 式(II)
2.权利要求1所述的用途，其中式I化合物是
3.权利要求1所述的用途，其中式I化合物包括其水合物。
4.权利要求1或3所述的用途，其中式I化合物包括其可药用的盐。
5.一种利用固定化S2蛋白直接测定植物成分生物活性的方法，其特征是将S2蛋白偶联到甲基丙烯酸聚合物上制成亲和色谱柱，与质谱联机后利用前沿亲和色谱方法从植物中筛选能有效结合S2蛋白的化合物；根据化合物在亲和色谱柱上的保留时间判断抑制活性的高低，并通过质谱测定化合物的分子量。
全文摘要
本发明涉及一类从植物中分离出的抑制SARS冠状病毒侵染宿主细胞的有效成分，其结构母体为如通式I。本发明采用SARS假病毒侵染系统和真病毒侵染模型，对式I化合物进行了抗SARS冠状病毒研究，证实其对SARS冠状病毒具有抑制作用，可用于治疗和预防SARS病毒感染。本发明还涉及利用固定化S2蛋白直接测定植物成分生物活性的方法。
文档编号A61P11/00GK1602853SQ200310101980
公开日2005年4月6日 申请日期2003年10月20日 优先权日2003年10月20日
发明者徐筱杰, 邓宏魁, 陈丽蓉, 丁明孝, 段德良, 易凌, 李正全, 袁克湖, 骆宏鹏, 曲秀霞, 朱丽荔, 陈坚, 左国营, 江鹏斐, 庆婷婷, 胡建和, 聂玉春 申请人:北京大学