专利名称：溶菌酶、基因重组溶菌酶的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种溶菌酶、重组溶菌酶134纯品或原液在禽畜类制药中的应用，特别是涉及一种溶菌酶及重组溶菌酶134纯品或原液用于禽类包括鸡、鸭、鹅、鹌鹑、畜类包括猪、羊、牛、马、驴、兔和蜜蜂疾病的预防和治疗。
背景技术：
近些年来，由于抗菌药物的广泛使用，细菌耐药性不断加强，而且很多细菌已由单药耐药发展到多重耐药。饲料中添加抗菌药物，实际上等于持续低剂量用药。动物机体长期与药物接触，造成耐药菌不断增多，耐药性也不断增强。抗菌药物残留于动物性食品中，同样使人也长期与药物接触，导致人体内耐药菌的增加。现在人们很关注的一个问题是动物病原菌的耐药基因是否会传递给人类病原菌。但有一些实验已经证实了耐药基因是可以在人和动物之间相互传递的。Stuart Levy[8]用携带标记耐氯霉素和四环素类药物pSL222-6质粒的鸟源大肠杆菌菌株感染了两只母鸡，然后他对曾与这些鸡有接触的人进行了两个月的研究，结果在两人中发现了上述质粒，而且这些质粒可以相互传递。目前对我国禽、畜养殖业危害最大的病源菌是金黄色葡萄球菌、链球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、支原体、衣原体等。由于引起禽、畜病原菌种类较多，免疫预防困难，因此目前对禽、畜病的预防与治疗还是主要采用化学药物防治。其中最常用的方法是在禽、畜饲料中添加抗生素，该方法虽有效，长期使用，可在禽、畜体内产生耐药菌，耐药菌随食物链进入人体造成感染性疾病，抗生素难以治疗。动物用药以后，药物以原形或代谢物的形式随粪、尿等排泄物排除，残留于环境中。绝大多数兽药排入环境以后，仍然具有活性，会对土壤微生物、水生生物及昆虫等造成影响。Hamscher G[21]等报道，在用动物排泄物施肥的土壤的0~40cm的表层，检测到了土霉素和氯四环素的残留，其最大浓度竟分别高达32.3mg/kg和26.4mg/kg。Dijek P V等[23]发现，21种饲料添加的抗菌药物对土壤和水中的36种典型的微生物只有7种敏感，其他29种微生物对这些畜禽常用抗菌药都有天然的耐药性。低剂量的抗菌药长期排入环境中，会造成敏感菌耐药性的增加。耐药基因不但可以贮存于水环境中，而且可以通过水环境扩展和演化。利用酵母系统表达人溶菌酶该方法已申请专利(专利申请号00 110463.2)。但未见溶菌酶在禽畜类制药中的应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种溶菌酶、重组溶菌酶134纯品或原液在禽畜类制药中的应用实际上，本发明的目的涉及溶菌酶、重组溶菌酶134纯品或原液在在制备预防或治疗禽类包括鸡、鸭、鹅、鹌鹑、畜类包括猪、羊、牛、马、驴、兔和蜜蜂养殖中对大肠杆菌引起的疾病的药中的应用。
涉及溶菌酶、重组溶菌酶134纯品或原液在制备预防或治疗禽类包括鸡、鸭、鹅、鹌鹑、畜类包括猪、羊、牛、马、驴、兔和蜜蜂养殖中对金黄色葡萄球菌引起的疾病的药中的应用。
涉及溶菌酶、重组溶菌酶134纯品或原液在制备预防或治疗禽类包括鸡、鸭、鹅、鹌鹑、畜类包括猪、羊、牛、马、驴、兔和蜜蜂养殖中对链球菌引起的疾病的药中的应用。
涉及溶菌酶、重组溶菌酶134纯品或原液在制备预防或治疗禽类包括鸡、鸭、鹅、鹌鹑、畜类包括猪、羊、牛、马、驴、兔和蜜蜂养殖中对沙门氏菌引起的疾病药中的应用。
涉及溶菌酶、重组溶菌酶134纯品或原液在制备预防或治疗禽类包括鸡、鸭、鹅、鹌鹑、畜类包括猪、羊、牛、马、驴、兔和蜜蜂养殖中对病毒引起的疾病药中的应用。
涉及溶菌酶、重组溶菌酶134纯品或原液在制备预防或治疗禽类包括鸡、鸭、鹅、鹌鹑、畜类包括猪、羊、牛、马、驴、兔和蜜蜂养殖中对支原体、衣原体引起的疾病药中的应用。
为了更好地理解本发明的实质，下面用溶菌酶、重组溶菌酶134纯品或原液的实验及结果来说明其在制药中的应用。
溶菌酶是人、动物类细胞产生的一种抗菌物质，因溶菌酶在动物体内本身即具有，所以使用溶菌酶代替常用的抗生素即解决了动物病的预防与治疗问题又避免了抗生素在动物体内的残留问题和使用抗生素带来的耐药菌诱生的问题。溶菌酶在体内、外均具有明显的杀灭细菌的活性，可单独使用，用于细菌感染的预防和治疗；也可以与抗生素合用，能明显降低抗生素的最低杀菌浓度，从而治疗细菌感染时与溶菌酶合用也可减低抗生素的用量，减低抗生素在动物体内的残留量。
基因重组溶菌酶134的材料基因重组溶菌酶134的表达系统特征是采用甲醇营养型酵母菌作为宿主菌“毕赤酵母菌属的菌株”。在甲醇利用的表型上既采用甲醇利用快速型(mut+)，也使用甲醇利用慢速型(muts或must-)。主要采用毕赤酵母的smd1165(his4.prb1)，smd1163(his.pep4.prb1)，smd1168(his4.prb1)Gs115、km71菌株。本发明基因重组溶菌酶134的质粒主要是以pPIC9k系列的质粒整合上述菌株染色体上。
1、基因来源用化学合成法合成重组溶菌酶134基因。(由上海博亚生物有限公司合成)再通过DNA重组技术，将基因克隆于pUC19质粒载体中，克隆株通过核苷酸DNA序列分析，证实为重组溶菌酶134基因。
2、重组溶菌酶134基因的制备重组溶菌酶134基因设计并用化学合成法合成寡聚核苷酸引物(p1-5’-CCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTAAGGTCTTTGAAAGGTG-3’P2-5’-GGAATTCTTACACTCCACAACCTTG-3’，由上海博亚生物有限公司合成)采用PCR方法(反应体系RT产物10μl，10×PCR缓冲液5μl，10mmol/L dNTP1μl，15Pmol/L P1引物1μl，15Pmol/L P2引物1μl，Taq酶1μl(5u)，重蒸水31μl，总体积50μl；反应条件94℃1分钟，55℃1分钟，72℃2分钟，35个循环)。用DNA胶回收试剂盒(上海华舜生物技术有限公司产品)纯化PCR产物约420bp的DNA片段。用EcoRI和SalI双酶切纯化的PCR产物DNA，并克隆到pUC19质粒中(转化方法为CaCl2法，宿主菌为大肠杆菌JM109)，得到重组质粒pUC19-LZ/JM109转化子，转化子经酶切和核苷酸序列分析证实为人溶菌酶基因并再N端多四个氨基酸A E A E。
3、表达载体的构建以1中所得到的重组溶菌酶134基因重组质粒pUC19-LZ为模板，通过PCR和DNA重组技术，将重组溶菌酶134基因插入到毕赤氏酵母(Pichiapastoris)分泌型表达载体pPIC9K中，得到重组溶菌酶134表达载体pPIC9K-LZ如
图1所示。
4、人溶菌酶基因表达载体构建步骤以1所得人溶菌酶基因并再N端多四个氨基酸A E A E。重组质粒pUC19-hLZ为模板，用引物(p1-5’-CCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTAAGGTCTTTGAAAGGTG-3’P2-5’-GGAATTCTTACACTCCACAACCTTG-3’，由上海博亚生物有限公司合成)，采用PCR方法扩增出重组溶菌酶134基因与α因子信号肽阅读框相应的XhoI与EcoRI酶切位点和TAA终止密码。(反应体系为pUC19-hLZ DNA 1μl(50ng)，10XPCR缓冲液5μl，10mmol/L dNTP1μl，15Pmol/L P3引物1μl，15Pmol/L P4引物1μl，pfu taq酶1μl(5u上海博彩生物有限公司产品)，重蒸水40μl，总体积50μl)；94℃30秒，58℃30秒，72℃1分钟30个循环后，72℃10分钟，4℃2分钟。再用XhoI与EcoRI酶切纯化的PCR目的DNA片段并克隆到分泌型毕赤酵母表达载体pPIC9上，得到重组子质粒pPIC9-hLZ。将所得2910个转化子，分别点种于2mg/ml G418 YEPD培养皿中，30℃培养2天后，筛选到抗2mg/ml G418的转化子82个，再按上法，从MMD菌种取出相应的82个转化子点种3mg/ml G418 YEPD培养基平皿，30℃培养2天后，筛到26个抗3mg/ml转化子，抗4mg/ml G418转化子13个最后筛选到抗4mg/ml G41867个转化子。
5、重组溶菌酶134的制备过程步骤；1、摇瓶种子制备以配制200毫升培养基为基准，用H3PO4(磷酸)4-8毫升、MgSO4(硫酸镁)1-5克，K2SO4(硫酸钾)2-6克，KOH(氢氧化钾)1-3克，CaSO42H2O(硫酸钙)1-3.5克，加蒸馏水至200毫升，高压灭菌后接种甘油管种子，摇床转数为每分钟250转，培养温度为20-35℃，在恒温床上培养36-48小时。2、种子罐培养以种子罐最大体积1升为基准，配制培养基用H3PO4(磷酸)25-19毫升，MgSO4(硫酸镁)13-17克，CaSO42H2O(硫酸钙)0.4-0.8克，K2SO4(硫酸钾)16-20克，KOH(氢氧化钾)2.12-6.12克，加蒸馏水至500毫升，高压灭菌后接种摇床种子；发酵反应器操作参数温度为20-32℃，PH值为2.0-8.0；溶解氧浓度为10-60％，当培养液中的细胞密度提高至OD200左右，种子培养结束。3、生产罐培养以10升为生产罐配制培养基，用H3PO4(磷酸)93-97毫升，MgSO4(硫酸镁)51-55克，CaSO42H2O(硫酸钙)19-23克，K2SO4(硫酸钾)61-65克，KOH(氢氧化钾)13-17克加蒸馏水至7升，高压灭菌后接种种子罐种子，发酵反应器操作参数温度控制在25-32℃，PH值为4.0-8.0，溶解氧浓度为10-60％；当培养液中细胞达到一定密度后，向培养液中流加甲醇诱导，此阶段的持续时间50-60小时，然后放罐培养结束。
纯化工艺将含有基因工程表达的人溶菌酶的毕赤酵母菌培养液用10-50万截流分子量膜超滤，收集滤液；用5000截流分子量超滤，收集浓液；浓液上羧甲基纤维素，洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱液，过G-50柱除盐，冰冻干燥，测定蛋白量、纯度和溶菌酶活性。
本发明的溶菌酶、重组溶菌酶134纯品或原液按如下重量份数比加入饲料中，用于禽、畜养殖类疾病的预防和治疗是以药品、饲料或纯品经口途径或注射全身的方式给药；重组溶菌酶134纯品1万U-10万U/公斤体重。溶菌酶、重组溶菌酶134纯品0.1克～5克加入1000公斤重量饲料中经口服给药，将0.1～5份重量溶菌酶、重组溶菌酶134发酵液加入100份重量饲料中经口服给药；将0.1～5份溶菌酶、重组溶菌酶134纯品和0.0001～0.05份抗生素加入100份重量饲料中经口服给药，用于禽、畜养殖业的常见疫病金黄色葡萄球菌、链球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、支原体、衣原体等引起的疾病预防和治疗。重组溶菌酶134纯品5000U-10万U/ml以喷雾的方式给药。
溶菌酶包括鸡溶菌酶、基因工程表达的人溶菌酶、基因工程表达的N端氨基酸带有(谷氨酸-丙氨酸)2或(谷氨酸-丙氨酸)3修饰的人溶菌酶134、基因工程表达或化学合成突变体人溶菌酶和生产溶菌酶过程中形成的富含溶菌酶的酵母细胞或大肠杆菌细胞裂解物原液。
本发明的积极效果是解决了禽、畜养殖疾病的预防和治疗中抗生素在动物体内的残留和使用抗生素带来的耐药菌诱生的问题，减少禽类包括鸡、鸭、鹅，鹌鹑畜类包括猪、羊、牛、马、驴、兔和蜜蜂等养殖过程中的病原菌感染率，降低抗生素在禽类、畜类体内的存留，增强养殖禽类包括鸡、鸭、鹅、鹌鹑畜类包括猪、羊、牛、马、驴、兔和蜜蜂等的品质，提高养殖鸡、鸭、鹅，鹌鹑猪、羊、牛、马、驴、兔和蜜蜂类的经济效益。
重组溶菌酶134的体内杀菌实验一、材料1.菌株金黄色葡萄球菌、2.动物BALB/c小鼠二、方法金黄色葡萄球菌、感染BALB/c小鼠实验将105～109CFU(菌落形成单位)的对数生长期的金黄色葡萄球菌、分别经腹腔接种于6周龄的BALB/c小鼠，观察结果，计算死亡率。
重组溶菌酶134保护活性的鉴定 将1×109对数生长期的金黄色葡萄球菌、腹腔接种于6周龄的BALB/c小鼠作为感染对照，溶菌酶保护组在接种细菌同时，注入不同剂量的重组溶菌酶134，观察7天结果，计算保护力，保护率％＝[(实验组成活率-对照组成活率)/对照组死亡率]×100％。
三、结果金黄色葡萄球菌、感染BALB/c小鼠的致死实验用105～109CFU金黄色葡萄球菌、感染BALB/c小鼠，结果从106～109CFU感染BALB/c均可造成死亡，而且死亡多发生在3天之内，4天以后基本稳定，不再死亡。其中108CFU金黄色葡萄球菌、感染BALB/c小鼠死亡较为规律，109CFU金黄色葡萄球菌、感染BALB/c小鼠3天内全部死亡。我们采用109CFU金黄色葡萄球菌、进行溶菌酶抗金黄色葡萄球菌、感染BALB/c小鼠被动保护实验。
用四个不同剂量重组溶菌酶134对BALB/c小鼠进行金黄色葡萄球菌、感染的保护鉴定，连续观察7天，结果对照组BALB/c小鼠2天内全部死亡，保护组死亡时间略有推迟，在2-3天。3天不死亡的BALB/c小鼠在7天内不再死亡。四个不同剂量重组溶菌酶134均具有被动保护抵抗金黄色葡萄球菌、感染的活性，其中30万单位/公斤时保护率达80％。
表2.抗金黄色葡萄球菌单克隆抗体免疫保护实验结果Tab2.protertion of lysozyme against StaphylococcusDose(u/kg)NO.test No.death Protective rate(％)30×10420 4 8015×10420 5 757.5×10420 7 653.75×10420 11450 15 150
具体实施例方式
下面结合实验例对本发明做进一步的描述实验例1重组溶菌酶134的保护杜洛克猪的抗感染实验一、材料1.菌株沙门氏菌、2.动物杜洛克猪二、方法重组溶菌酶134保护杜洛克猪的抗感染实验用重组溶菌酶134灌胃喂养杜洛克猪，正常饲料喂养作对照组。将1×109对数生长期的沙门氏菌灌胃分别接种于保护组和对照组杜洛克猪。观察结果，计算保护力。免疫保护率％＝[(实验组成活率-对照组成活率)/对照组死亡率]×100％三、结果重组溶菌酶134保护杜洛克猪的抗感染保护实验结果表明用沙门氏菌感染杜洛克猪后，用重组溶菌酶134灌胃喂养杜洛克猪组保护率可达65％。正常饲料喂养的对照组全部死亡。
实验例2重组溶菌酶134与抗生素的协同抗菌作用一、材料1.菌株临床分离株400余株，由成都抗生素工业研究所提供。
2.缓冲液pH7.2 10mMTris-Cl缓冲液3.LB培养基4.克拉霉素，罗红霉素二、方法重组溶菌酶134与克拉霉素、罗红霉素分别(1∶1)联合使用，方法一(试管法)
用pH7.2 10mM Tris-Cl缓冲液将金黄色葡萄球菌(或大肠杆菌)配成107-108CFU/mL左右浓度的菌液分别加入到不同的2mL华试管中，不同华试管中分别加入不同剂量的人溶菌酶(100μg-1mg)37C°过夜，每管取20μL以10倍稀释法稀释，每管加入100μL 10％SDS(终浓度0.5％)，摇匀后取100μL涂于LB培养基，肉眼观察浊度变化或用分光度计37C°培养过夜进行比浊(640)，观察结果，计算原始管中细菌总数；溶菌酶134溶菌效果＝(对照管中细菌总数-实验管中细菌总数)/对照管中细菌总数×100％。
方法二(平板法)用pH7.2 10mM Tris-Cl缓冲液配制1％的琼脂糖高压灭菌后，冷却至40℃，加入细菌至106倾倒平板，用打孔器在平板上打孔后加入不同浓度的溶菌酶溶液(0-100mg/ml)，进行37℃孵箱孵育4-6小时，LB营养琼脂高压灭菌后，冷却至40℃，覆盖于上述琼脂糖平板上，将该平板至于紫外灯下照射20分钟(LB营养琼脂覆盖于含菌的琼脂糖平板过程中，琼脂糖表面的游离细菌会混入营养琼脂中，其中冲到营养琼脂表面的细菌，由于氧气的作用，生长速度非常快，形成菌膜，影响琼脂糖与营养琼脂层之间细菌生长情况的观察，故用紫外灯照射杀死营养琼脂表面的细菌)。37℃孵箱培养过夜，观察琼脂糖与营养琼脂层之间细菌生长情况，测量不同浓度溶菌酶形成的抑菌圈的直径，抑菌圈的直径》加样孔直径4mm者为最低有效杀菌浓度。(对于有鞭毛，运动活跃的细菌，会影响抑菌圈的形成，可考虑加入0.01％石炭酸抑制其运动。)三、结果重组溶菌酶134与克拉霉素、罗红霉素分别(1∶1)联合使用，可使克拉霉素、罗红霉素对其抗菌活性增效2-16倍以上，个别菌株增效倍数在1000倍。本研究所用的临床分离耐药株共30株，分别为金黄色葡萄球菌8株、绿脓假单胞杆菌3株、大肠杆菌7株、鲍鳗杆菌1株、粘质沙雷氏菌1株、变形杆菌3株、甲型链球菌1株。抑菌实验结果表明本研究所用的动物30株动物耐药菌，均对基因工程表达的重组溶菌酶134敏感，基因工程表达的重组溶菌酶134对实验菌株的最低抑菌浓度针对不同菌存在差异，有效抑菌浓度范围在50μg-1mg/ml之间。同时发现基因工程表达的重组溶菌酶134对不同菌的最低抑菌浓度之间的差异主要存在于相同菌的不同菌株之间，而对不同菌之间以及革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌之间，由于实验菌株数量较少，未发现存在明显差异。
实验例3重组溶菌酶134的体内杀菌实验(一)一、材料1.菌株大肠杆菌2.动物BALB/c小鼠二、方法大肠杆菌感染BALB/c小鼠实验将105～109CFU(菌落形成单位)的对数生长期的大肠杆菌分别经腹腔接种于6周龄的BALB/c小鼠，观察结果，计算死亡率。重组溶菌酶134保护活性的鉴定将1×109对数生长期的大肠杆菌腹腔接种于6周龄的BALB/c小鼠作为感染对照，重组溶菌酶134保护组在接种细菌同时，注入不同剂量的重组溶菌酶134，观察7天结果，计算保护力，保护率％＝[(实验组成活率-对照组成活率)/对照组死亡率]×100％。
三、结果大肠杆菌感染BALB/c小鼠的致死实验用105～109CFU大肠杆菌感染BALB/c小鼠，结果从106～109CFU感染BALB/c均可造成死亡，而且死亡多发生在3天之内，4天以后基本稳定，不再死亡。其中108CFU大肠杆菌感染BALB/c小鼠死亡较为规律，109CFU大肠杆菌感染BALB/c小鼠3天内全部死亡。我们采用109CFU大肠杆菌进行重组溶菌酶134抗大肠杆菌感染BALB/c小鼠被动保护实验。
用四个不同剂量重组溶菌酶134对BALB/c小鼠进行大肠杆菌感染的保护鉴定，连续观察7天，结果对照组BALB/c小鼠2天内全部死亡，保护组死亡时间略有推迟，在2-3天。3天不死亡的BALB/c小鼠在7天内不再死亡。四个不同剂量重组溶菌酶134均具有被动保护抵抗大肠杆菌感染的活性，其中30万单位/公斤时保护率达80％。
表1.抗大肠杆菌单克隆抗体免疫保护实验结果Tab2.protertion of lysozyme against V.E.coliDose(u/kg)NO.test No.death Protective rate(％)30×10420 4 8015×10420 5 757.5×10420 7 653.75×10420 11450 15 150实验例4重组溶菌酶134的体内杀菌实验(二)一、材料1.菌株链球菌2.动物BALB/c小鼠二、方法链球菌感染BALB/c小鼠实验将105～109CFU(菌落形成单位)的对数生长期的溶藻弧菌分别经腹腔接种于6周龄的BALB/c小鼠，观察结果，计算死亡率。重组溶菌酶134保护活性的鉴定将2×108对数生长期的链球菌腹腔接种于6周龄的BALB/c小鼠作为感染对照，重组溶菌酶134保护组在接种链球菌同时，注入不同剂量的重组溶菌酶134，观察7天结果，计算保护力，保护率％＝[(实验组成活率-对照组成活率)/对照组死亡率]×100％。
三、结果链球菌感染BALB/c小鼠的致死实验用105～109CFU链球菌感染BALB/c小鼠，结果从106～109CFU感染BALB/c均可造成死亡，而且死亡多发生在3天之内，4天以后基本稳定，不再死亡。其中5×107～5×108CFU链球菌感染BALB/c小鼠死亡较为规律，109CFU链球菌感染BALB/c小鼠3天内全部死亡。我们采用2×108CFU链球菌进行重组溶菌酶134抗链球菌感染BALB/c小鼠被动保护实验。
用四个不同剂量重组溶菌酶134对BALB/c小鼠进行链球菌感染的保护鉴定，连续观察7天，结果对照组BALB/c小鼠3天内全部死亡，保护组死亡时间略有推迟，在3-5天。5天不死亡的BALB/c小鼠在7天内不再死亡。四个不同剂量重组溶菌酶134均具有被动保护抵抗链球菌感染的活性，其中30万单位/公斤时保护率达85％。
表2.抗链球菌单克隆抗体免疫保护实验结果Tab2.protertion of lysozyme against StreptococcusDose(u/kg) NO.testNo.death Protective rate(％)30×10420 3 8515×10420 5 75
7.5×10420 10 503.75×10420 11 450 15 15 0实验例5重组溶菌酶134的保护双A鸡的抗感染实验(一)一、材料菌株支原体、2.动物双A鸡二、方法重组溶菌酶134保护双A鸡的抗感染实验用重组溶菌酶134灌胃喂养或喷雾给药双A鸡，正常饲料喂养作对照组。将1×109对数生长期的支原体灌胃喂养分别接种于保护组和对照组双A鸡。观察结果，计算保护力。免疫保护率％＝[(实验组成活率-对照组成活率)/对照组死亡率]×100％三、结果重组溶菌酶134保护双A鸡的抗感染保护实验结果表明用支原体感染双A鸡后，用重组溶菌酶134灌胃喂养双A鸡组保护率可达65％。正常饲料喂养的对照组全部死亡。
实验例6重组溶菌酶134保护爱维茵鸡的抗感染实验(二)一、材料1.菌株衣原体2.动物爱维茵鸡二、方法重组溶菌酶134保护爱维茵鸡的抗感染实验用重组溶菌酶134灌胃喂养爱维茵鸡，正常饲料喂养作对照组。将5×108对数生长期的衣原体灌胃分别接种于保护组和对照组爱维茵鸡。观察结果，计算保护力。免疫保护率％＝[(实验组成活率-对照组成活率)/对照组死亡率]×100％三、结果重组溶菌酶134保护爱维茵鸡的抗感染保护实验结果表明用衣原体灌胃感染爱维茵鸡，用重组溶菌酶134灌胃喂养爱维茵鸡组保护率可达80％。正常饲料喂养的对照组全部死亡。
实验例7重组溶菌酶134保护蜜蜂的抗感染实验一、材料1.菌株金黄色葡萄球菌、链球菌、大肠杆菌、2.动物蜜蜂二、方法重组溶菌酶134保护蜜蜂的抗感染实验用重组溶菌酶134用喷雾的方式喂养蜜蜂，正常饲料喂养作对照组。将1×109对数生长期的金黄色葡萄球菌、链球菌、大肠杆菌喷雾的方式分别接种于保护组和对照组蜜蜂。观察结果，计算保护力。免疫保护率％＝[(实验组成活率-对照组成活率)/对照组死亡率]×100％三、结果重组溶菌酶134保护蜜蜂的抗感染保护实验结果表明用金黄色葡萄球菌、链球菌、大肠杆菌喷雾的方式分别感染蜜蜂后，用重组溶菌酶134喷雾喂养蜜蜂组保护率可达85％。正常饲料喂养的对照组全部死亡。
权利要求
1.溶菌酶、重组溶菌酶134纯品或原液在制备预防或治疗禽类包括鸡、鸭、鹅、鹌鹑、畜类包括猪、羊、牛、马、驴、兔和蜜蜂养殖中对大肠杆菌引起的疾病的药中的应用。
2.溶菌酶、重组溶菌酶134纯品或原液在制备预防或治疗禽类包括鸡、鸭、鹅、鹌鹑、畜类包括猪、羊、牛、马、驴、兔和蜜蜂养殖中对金黄色葡萄球菌引起的疾病的药中的应用。
3.溶菌酶、重组溶菌酶134纯品或原液在制备预防或治疗禽类包括鸡、鸭、鹅、鹌鹑、畜类包括猪、羊、牛、马、驴、兔和蜜蜂养殖中对链球菌引起的疾病的药中的应用。
4.溶菌酶、重组溶菌酶134纯品或原液在制备预防或治疗禽类包括鸡、鸭、鹅、鹌鹑、畜类包括猪、羊、牛、马、驴、兔和蜜蜂养殖中对沙门氏菌引起的疾病药中的应用。
5.溶菌酶、重组溶菌酶134纯品或原液在制备预防或治疗禽类包括鸡、鸭、鹅、鹌鹑、畜类包括猪、羊、牛、马、驴、兔和蜜蜂养殖中对病毒引起的疾病药中的应用。
6.溶菌酶、重组溶菌酶134纯品或原液在制备预防或治疗禽类包括鸡、鸭、鹅、鹌鹑、畜类包括猪、羊、牛、马、驴、兔和蜜蜂养殖中对支原体、衣原体引起的疾病药中的应用。
7.溶菌酶、重组溶菌酶134纯品或原液的给药方式包括以药品、饲料或纯品经口途径或注射全身的方式给药；重组溶菌酶134纯品1万U-10万U/公斤体重，以饲料经口途径的方式给药；将重组溶菌酶134纯品0.1克～5克加入1000公斤重量饲料中经口服给药，将0.1～5份重量重组溶菌酶134发酵液加入100份重量饲料中经口服给药；将0.1～5份溶菌酶及其衍生物纯品和0.0001～0.05份抗生素加入100份重量饲料中经口服给药，溶菌酶100毫克～500毫克/吨水的比例进行浸泡法预防和治疗疾病；重组溶菌酶134纯品5000U-10万U/ml以喷雾的方式给药。
8.根据权利要求7所述的溶菌酶、重组溶菌酶134纯品或原液在制备预防或治疗禽类、畜类和蜜蜂由细菌、病毒、衣原体、支原体疾病的药用组合物。
9.根据权利要求8所述的溶菌酶、重组溶菌酶134纯品或原液在制备预防或治疗禽类、畜类和蜜蜂疾病的药用组合物可以协同一种有效剂量的抗生素包括氨基糖苷类、大环内酯类、头胞菌素类。
10.根据权利要求1、2、3、4所述的溶菌酶包括鸡溶菌酶、基因工程表达的人溶菌酶、基因工程表达人溶菌酶的氨基端带有(谷氨酸-丙氨酸)2或(谷氨酸-丙氨酸)3修饰的人溶菌酶、基因工程表达或化学合成突变体人溶菌酶和生产溶菌酶过程中形成的富含溶菌酶和酵母细胞或大肠杆菌细胞裂解物原液。
全文摘要
本发明涉及溶菌酶、重组溶菌酶
文档编号A61P31/00GK1544087SQ200310110020
公开日2004年11月10日 申请日期2003年11月14日 优先权日2003年11月14日
发明者张华 , 安米, 安献禄, 张 华 申请人:长春奇龙生物技术研究所