专利名称：哈维氏弧菌外膜蛋白Ompk抗原的表达和作为疫苗组份的应用的制作方法
技术领域：
本发明属生物工程技术领域，具体涉及一种DNA片段及其表达产物蛋白质。该DNA片段在大肠杆菌中重组表达，该重组DNA分子及其表达产物能够作为抗弧菌病的疫苗组份。
背景技术：
弧菌是一类革兰氏阴性、具极生鞭毛、能运动、无芽胞的短杆状或弧形细菌，分布于近岸、河口海水和海洋生物体中，是海洋环境中最常见的细菌类群之一，其中部分种类为海洋生物的病原菌。作为致病菌，弧菌可感染多种养殖动物，如虾、蛤、鲍、鱼等，常造成大量死亡，带来巨大的经济损失。由于它们广泛存在于自然海区和海水养殖区，弧菌病在世界范围内流行，是海水养殖中常见且危害最严重的病害之一。传统的抗生素治疗在防治海水养殖对象细菌性弧菌中发挥了重要的作用，但长期用药引起细菌的耐药性，使用药的剂量越来越大，造成药物残留，严重影响水产品的质量，甚至威胁人类健康。近年来，海水鱼弧菌疫苗发展很快，在防治细菌性弧菌病方面发挥越来越重要的作用，但主要是灭活疫苗，由于灭活疫苗制备中存在复杂的微生物代谢产物，可能出现副作用，且保护性抗原可能在灭活过程被破坏而影响其免疫效果，不同的血清型缺乏交叉保护作用，这些严重影响它的应用。
而新一代的基因工程亚单位疫苗则能解决以上问题，进行基因下程亚单位疫苗研究首先要解决的问题是寻找有效的保护性抗原基因，外膜蛋白是革兰氏阴性菌细胞壁的特有结构，位于细菌最外层，具有与机体免疫系统广泛接触的机会，因此，成为细菌保护性抗原研究的热点，弧菌的Ompk是一类宽宿主的弧菌噬菌体受体蛋白，在保护弧菌免受噬菌体侵袭方面发挥着重要作用(FEMS Microbiology Letters 125(1995)101-106)，但对其作为保护性抗原未见相关报道，本发明将Ompk基因进行重组表达，研究发现其蛋白具有较好的保护性抗原特性，可作为疫苗组份来抵抗弧菌的侵袭。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够有效抵抗海水鱼弧菌病的基因工程亚单位疫苗。
本发明提出的哈维氏弧菌外膜蛋白Ompk抗原的表达纯化方法是以哈维氏弧菌株EcGS020802 DNA为模板，用PCR法克隆抗原Ompk编码的基因，将该基因重组到表达型质粒pBV220中，表达的重组蛋白形成包涵体，包涵体经洗涤纯化后，重组蛋白纯度好，得率高。用此方法生产重组蛋白，操作简便，成本低廉。
本发明的另一目的是提供一种制备弧菌基因工程亚单位疫苗的方法。制备方法是利用聚合酶链反应克隆抗原Ompk编码的基因，将其重组至表达型质粒pBV220，在大肠杆菌宿主中表达后纯化，加上合适佐剂即可得到稳定剂型的弧菌基因工程亚单位疫苗。
具体实施例方式
实施例1 Ompk基因的克隆PCR引物根据已发表的弧菌种类外膜蛋白Ompk基因保守序列设计引物，引物1为5’ATG CGT AAA TCACTT TTA GCT CTT AGC C 3’；引物2为5’TTA CTG CGA TGT AGT GAC CGA AGC 3’，由上海生物工程有限公司合成.Ompk基因的制备以哈维氏弧菌EcGS020802基因组DNA为模板，用PCR技术获得目的基因。PCR循环反应条件为94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 90s 30循环。PCR产物的克隆和鉴定纯化的外源基因与pGEM T载体连接，转化宿主大肠杆菌，在含氨苄青霉素的LB固体培养基上通过蓝白斑法筛选阳性克隆，用酶切方法进一步鉴定。以上操作均按常规方法进行。用ABI377自动测序仪对阳性克隆进行序列分析以鉴定重组质粒。
PCR扩增产物的长度为801个碱基，琼脂糖电泳结果如
图1所示。图中(M)为200bp的DNA分子量标准，(1)为PCR扩增产物。
实施例2重组Ompk基因的表达和纯化在Ompk基因成熟肽两端分别加上EcoRI和BamHI酶切位点，用PCR方法对基因进行改造，用EcoRI和BamHI分别酶切基因和载体pBV220，4℃连接16h，转化大肠杆菌DH5α，在含氨苄青霉素的LB平板上筛选阳性菌落，提取质粒进一步酶切鉴定。将鉴定后的阳性克隆于液体LB培养基中30℃培养，当OD值达到0.4-0.6时，立即42℃热诱导，诱导4h后离心集菌，超声波破碎，收集包涵体。包涵体经2-4M的脲素洗涤后，用8M脲素裂解，经水透析除去残余脲素后，得到纯度较高的重组蛋白。如图2所示。图中(1)纯化的重组蛋白Ompk，(2)为不含重组质粒的大肠杆菌DH5α，(3)为含重组质粒的大肠杆菌DH5α，(4)、(5)均为未经纯化的包涵体，(M)为低分子量蛋白标准。
实施例3重组蛋白对石斑鱼哈维氏弧菌病的免疫防治效果未发过病的健康石斑鱼150尾，体重25-30g，随机分为三个组，每组50尾。Ompk重组蛋白免疫组以50ug/尾抗原加等体积的弗氏不完全佐剂(FCA)腹腔注射。全菌组每尾注射哈维氏弧菌EcGS020802菌苗0.1ml。对照组每尾注射生理盐水0.1ml。免疫28天后，用LD50剂量哈维氏弧菌哈维氏弧菌EcGS020802对三个实验组进行攻击感染，分别计算其免疫保护率。经单因素方差分析，Ompk重组蛋白免疫组相对免疫保护率为100％，全菌组免疫保护率为100％，均与对照组差异极显著(P＜0.01)。
表1.重组外膜蛋白Ompk对石斑鱼哈维氏弧菌病的免疫保护率。
组别攻毒尾数死亡尾数保护率相对保护率重组蛋白组30 0 100％100％全菌组30 0 100％100％对照组30 2420％ 0
序列表珠江水产研究所哈维氏弧菌外膜蛋白Ompk抗原的表达和作为疫苗组份的应用序列1.
ATGCGTAAATCACTTTTAGCTCTTAGCCTTCTAGCGGCTACTTCAGCTCCTGTAATGGCTGCTGACTACTCAGACGGCGACATCCACAAGAACGATTACAAGTGGATGCAATTCAACCTAATGGGTGCATTTGACGAACTTCCAGGTGAGTCTTCACACGACTACCtAGAAATGGAATTTGGCGGTCGCTCTGGTATCTTCGACCTATACGGTTACGTTGACGTATTCAACCTAGCGTCAGACAAAGGCAGCGACAAAGTTGGCGATCCTAAGATCTTCATGAAGTTTGCTCCACGTATGTCTATCGACGGTCTAACTGGTAAAGACTTGTCTTTCGGTCCAGTTCAAGAACTTTACGTTGCAACACTATTTGAGTGGGATGGTACTGATTACAAAACGAACAAATTCTCAGTAAACAACCAAAAAGTTGGTATCGGTTCTGACGTAATGGTTCCATGGTTTGGTAAAGTAGGTGTTAACCTATACGGTACTTACCAAGGTAACCAAAAAGATTGGAACGGTTTCCAAATCTCGACTAACTGGTTCAAACCATTCTACTTCTTCGAGAACGGTTCTTTCATTTCTTACCAAGGTTACATCGATTACCAATTTGGTATGAAAGAGAAATACTCAAGTGCTAGCAACGGTGGCGCAATGTTCAACGGTATCTACTGGCACTCTGACCGCTTCGCAGTGGGTTACGGTCTAAAAGGCTACAAAGACGTTTACGGTATCAAAGACTCTGACGCACTTAAGTCAACTGGCTTCGGTCACTACATCGCAGTAACTTACAAGTTCTAA序列2.
mrksllalsllaatsapvmaadysdgdihkndykwmqfnlmgafdelpgesshdylemefggrsgifdlygyvdvfnlasdkgsdkvgdpkifmkfaprmsidgltgkdlsfgpvqelyvatlfewdgtdyktnkfsvnnqkvgigsdvmvpwfgkvgvnlygtyqgnqkdwngfqistnwfkpfyffengsfisyqgyidyqfgmkekyssasnggamfngiywhsdrfavgyglkgykdvygikdsdalkstgfghyiavtykf
权利要求
1.一种具有保护性抗原特性的核苷酸序列，其特征是选自以下几种中的任何一种(A)与序列1有至少70％的同源性的核苷酸序列(B)与序列1的核苷酸序列杂交或互补的核苷酸序列(C)(A)或(B)核苷酸序列的片段
2.如权利要求1所述的核苷酸序列，其特征在于具有序列1的核苷酸序列
3.具有序列2所述的氨基酸序列的多肽，或其片段、类似物或衍生物作为疫苗在防治弧菌疾病中的应用。
4.如权利要求3所要求的多肽，其特征在于具有序列2的氨基酸序列作为疫苗在预防弧菌疾病中的应用。
5.含有权利要求3或4的多肽的药物组合物。
6.抗权利要求3或4所述多肽的抗体。
7.权利要求6的抗体在免疫学领域的应用。
全文摘要
本发明涉及在大肠杆菌中重组表达哈维氏弧菌外膜蛋白Ompk抗原及重组外膜蛋白Ompk作为疫苗组份在预防海水鱼弧菌病方面的应用。以哈维氏弧菌株EcGS020802 DNA为模板，用PCR法克隆抗原Ompk的编码基因，将该基因重组到原核表达载体pBV220中，表达的重组蛋白分子量约为28kDa，重组蛋白在大肠杆菌中高效表达形成包涵体。包涵体经洗涤、变性复性后获得重组蛋白纯度好，产量高。哈维氏弧菌Ompk重组蛋白免疫实验鱼后，对攻击感染产生有效的免疫保护性。
文档编号A61K39/395GK1626544SQ200310112479
公开日2005年6月15日 申请日期2003年12月8日 优先权日2003年12月8日
发明者李宁求, 吴淑勤, 白俊杰, 劳海华, 石存斌, 叶星, 简清, 潘厚军, 陶家发 申请人:中国水产科学研究院珠江水产研究所