专利名称：一种引导硬组织再生修复的可降解材料及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种生物工程材料及其制备方法，尤其涉及一种硬组织修复再生的可降解材料，属于生物工程材料技术领域。
背景技术：
硬组织(骨、牙)修复在过去的几十年中，尽管提出了许多种修复途径，包括利用组织工程产品[Langer R，et al.Science，1993；260920-926]、基因治疗[Mulligan RC，et al.Science，1993；260-932]等。但临床上70％的骨替代材料仍然使用自体骨或异体骨，使病人面临高的手术综合症和感染率。而各种金属、陶瓷或聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥等在生物相容性、生物活性、生物可降解性及与宿主骨的力学匹配性等方面都有各自的缺点。
近年来，硬组织工程的应用研究已在矫形外科、口腔外科及颅面外科等多个领域篷勃展开。与硬组织工程相关的研究主要集中在三个方面信号分子(如骨生长因子、骨诱导因子)的基础研究，各种骨替代材料为载体的研究，涉及骨形成蛋白(BMP)的临床试验。其中设计制造新型骨替代材料是当前的关键。胶原是硬组织有机质的主要成分，高温会导致其变性。羟基磷灰石是硬组织无机质的主要成分，这两种材料已被广泛应用于硬组织的修复，参见[LIUS.New mineralized collagen membrane useful for guided tissue regeneration e.g.for covering bonedefects，for soft tissue flaps over bone grafts，for skin wound healing and for skin sealingWO200115711-A1]以及专利“纳米相钙磷盐/胶原/聚乳酸骨复合多孔材料的制备方法”(公开号CN1272383)。但上述材料的制备方法复杂，价格昂贵，不易被大众所接收。目前，全世界硬组织修复和替代材料的年交易额约为21亿美元[Suchanek W，et al.Processing and propertiesof hydroxyapatite-based biomaterials for use as hard tissue replacement implants.J Mater Res，1998；1394-117]。据美国估计，其国内每年涉及骨置换的外科治疗已超过100万人次，而对骨质疏松等症状的治疗仅限于服用钙片、维生素、激素等药物，治疗效果很差。因此对新型的或改进的硬组织修复材料的开发仍然是巨大市场的迫切要求。
壳聚糖是甲壳素脱乙酰后的一系列产物，是地球上仅次于纤维素的第二大类多糖。此碱性粘多糖具有独特的分子结构特征、化学性质及生物功能。如良好的生物相容性和生物可降解性，降解产物为对人体无毒的N-乙酰氨基葡萄糖和氨基葡萄糖，降解过程中产生的中间产物在体内不积累，无免疫源性[姜雪松，王勃生等.生物医学工程学杂志，199613(4)353.]，抗菌、消炎、止血、促进伤口愈合等。近年来，随着研究的深入和广泛，壳聚糖已经被广泛应用于生物医学领域，如透析膜、可吸收缝线、药物释放载体、固定化酶载体等。有些项目已具有生产价值和实用意义。而羧甲基壳聚糖、磷酸化壳聚糖为壳聚糖的衍生物，磷酸化甲壳素为甲壳素的衍生物。这几种衍生物对钙离子都有很强的螯合力，在诱导成骨方面具有独特的作用。
发明内容
本发明的目的是以可降解的生物材料胶原、壳聚糖、磷酸钙(或羟基磷灰石)为主要原料，制备一种引导硬组织修复或再生的块状、管状、棒状、膜状或凝胶状材料，该材料不仅制备工艺简单，成本低，而且所制备的生物材料与创伤组织的相容性好，具有优良抗菌性能和诱导成骨活性，且使用方便，便于推广和应用。
本发明的技术方案如下一种引导硬组织再生修复的可降解材料，其特征在于该材料可按下述步骤制备得到(1)将胶原和壳聚糖或羧甲基壳聚糖分别溶于酸性溶液中，配成浓度为1～5％的溶液；将磷酸钙、磷酸氢钙、磷酸二氢钙、缺钙磷灰石或羟基磷灰石粉末加到酸性溶液中，制成浓度为10～200％的悬浮液；(2)将悬浮液按1～10％的体积比加入到胶原与壳聚糖溶液或胶原与羧甲基壳聚糖的混合溶液中，均匀混合，制得凝胶状混合物；其中胶原与壳聚糖溶液或胶原与羧甲基壳聚糖溶液的混合体积比为1～100∶100～1；(3)将上述凝胶状混合物用碳酸氢钠调节pH值到5～8，消毒后备用；或将凝胶状混合物倒入容器中凉干或冻干，制成块状、棒状、管状或膜状材料，然后放入交联剂1-乙基-(二甲基氨丙基)-碳二亚胺盐酸盐缓冲液中，或用氨水、氨水/乙醇、氨水/丙酮、氨水/甲醇混合液作凝固液进行处理，水冲后，再凉干或冻干，消毒后备用。
本发明还可在所述步骤(2)中的凝胶状混合物中按1～10％体积比加入浓度为0.5～10％透明质酸钠、浓度为0.5～10％的骨形成蛋白水或生理盐水悬浮液或浓度为0.5～10％的甲状旁腺素生理盐水悬浮液，其中透明质酸钠的溶液的pH值可用盐酸调节在1～4范围内。
在上述方案的基础上，本发明还可在上述步骤(3)中二次凉干或冻干前的样品中再复合磷酸化甲壳素或磷酸化壳聚糖，其方法是将磷酸化甲壳素或磷酸化壳聚糖溶于蒸馏水或酸性溶液中，制成浓度为0.1～10％的水溶液或酸溶液，将用水冲后的样品放入其中，吸附2分钟至2小时，然后凉干或冻干。
本发明中所述的酸溶液采用稀盐酸、醋酸、甲酸、丙酸、乳酸或马来酸中的任一种。
本发明制备的膜材料的厚度为0.1～5毫米；棒状材料的直径为0.1～10厘米；管状材料的内径为0.1～5厘米，外径0.2～10厘米。
本发明所提供的一种引导硬组织再生修复的可降解材料的制备方法，该方法按如下步骤进行(1)将胶原和壳聚糖或羧甲基壳聚糖分别溶于酸性溶液中，配成浓度为1～5％的溶液；将磷酸钙、磷酸氢钙、磷酸二氢钙、缺钙磷灰石或羟基磷灰石粉末加到酸性溶液中，制成浓度为10～200％的悬浮液；(2)将悬浮液按1～10％的体积比加入到胶原与壳聚糖溶液或胶原与羧甲基壳聚糖的混合溶液中，均匀混合，制得凝胶状混合物；其中胶原与壳聚糖溶液或胶原与羧甲基壳聚糖溶液的混合体积比为1～100∶100～1；(3)将上述凝胶状混合物用碳酸氢钠调节pH值到5～8，消毒后备用；或将凝胶状混合物倒入容器中凉干或冻干，制成块状、棒状、管状或膜状材料，然后放入交联剂1-乙基-(二甲基氨丙基)-碳二亚胺盐酸盐缓冲液中，或用氨水、氨水/乙醇、氨水/丙酮、氨水/甲醇混合液作凝固液进行处理，水冲后，再凉干或冻干，消毒后备用。
在发明的制备方法中，所述步骤(2)中的凝胶状混合物中按1～10％体积比加入浓度为0.5～10％透明质酸钠、浓度为0.5～10％的骨形成蛋白水或生理盐水悬浮液或浓度为0.5～10％的甲状旁腺素生理盐水悬浮液，其中透明质酸钠的溶液的pH值可用盐酸调节在1～4范围内。
在上述的制备方法中，本发明在所述的步骤(3)中二次凉干或冻干前的样品中还可再复合磷酸化甲壳素或磷酸化壳聚糖，其方法是将磷酸化甲壳素或磷酸化壳聚糖溶于蒸馏水或酸性溶液中，制成浓度为0.1～10％的水溶液或酸溶液，将用水冲后的样品放入其中，吸附2分钟至2小时，然后凉干或冻于。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和突出性效果本发明采用组织相容性好的可降解生物材料胶原、壳聚糖、磷酸钙(或羟基磷灰石)或透明质酸钠为基本原料，也可加入骨形成蛋白等生长因子。制备工艺简单，成本低；所制备的硬组织修材料不仅可作为凝胶态直接注射到病变或缺损部位，还可做成膜状、块状、管状、棒状等形状作为填充物或引导膜促进硬组织修复。经细胞实验和动物实验表明该材料可在体内(包括牙科、骨科手术等)普遍使用，是一种促进并诱导硬组织修复的、抗菌的、在体内降解速度可调的多功能材料，在外科手术中具有广泛的应用价值。
具体实施例方式
本发明中所使用的磷酸钙(包括α型、β型或不定型)、磷酸氢钙、磷酸二氢钙、缺钙磷灰石或羟基磷灰石其粒径由纳米到微米级。其中羟基磷灰石与磷酸钙，可由高温烧结而成，也可由常温反应而得。
下面的实施例将对本发明做进一步说明。
实施例1将胶原与脱乙酰度为70％的、分子量为200000道尔顿的壳聚糖分别溶解在2％的冰醋酸溶液中，制成浓度为1％的胶原、壳聚糖溶液，静止脱泡，两者按1∶1比例混合均匀。将磷酸钙粉末加到2％的冰醋酸溶液中，制成浓度为10％的悬浮液；然后按1％体积比将磷酸钙悬浮液加入到胶原/壳聚糖混合液中，混合均匀。此凝胶态混合物可用碳酸氢钠(NaHCO3)调节pH值到5，Co60消毒后备用。该凝胶状材料可用针管直接注射到需要修复的部位。
实施例2将胶原与脱乙酰度为80％的、分子量为100000道尔顿的羧甲基壳聚糖分别溶解在乳酸溶液中，制成浓度为2％的胶原、羧甲基壳聚糖溶液，静止脱泡，胶原与羧甲基壳聚糖溶液两者按100∶1的体积比混合均匀。将羟基磷灰石粉末加到乳酸溶液中，制成浓度为100％的悬浮液；然后按10％体积比将羟基磷灰石悬浮液加入到胶原/羧甲基壳聚糖混合液中，混合均匀。再按1％的体积比加入浓度为0.5％透明质酸钠酸溶液。其中透明质酸钠溶液用盐酸调节pH值为1，以便与胶原/羧甲基壳聚糖溶液充分混合。然后用碳酸氢钠(NaHCO3)调节pH值到8，用臭氧消毒、备用。
实施例3将胶原与脱乙酰度为80％的、分子量为100000道尔顿的壳聚糖分别溶解在乳酸溶液中，制成浓度为2％的胶原、壳聚糖溶液，静止脱泡，胶原与壳聚糖溶液两者按100∶1的体积比混合均匀。将磷酸氢钙粉末溶于水中，制成浓度为200％的悬浮液；然后按10％体积比将磷酸氢钙悬浮液加入到胶原/壳聚糖混合液中，混合均匀。再按1％的体积比加入浓度为1％的骨形成蛋白水的悬浮液。然后用碳酸氢钠(NaHCO3)调节pH值到6，γ-射线消毒、备用。
实施例4将5％的壳聚糖(脱乙酰度为98％)甲酸溶液与5％的胶原甲酸溶液按1∶100比例混匀，将羟基磷灰石按粉末加到甲酸溶液中，制成浓度为10％的悬浮液；然后按1％体积比将10％的羟基磷灰石悬浮液加入到胶原/壳聚糖混合液中，混合均匀。将制备的壳聚糖/胶原/羟基磷灰石混合物脱去气泡分装在容器中冻干成膜，膜的厚度为0.1毫米。用25％的氨水浸泡5分钟后，蒸馏水冲洗干净，再冻干、Co60消毒、备用。
实施例5将胶原、脱乙酰度为50％的、分子量为300000道尔顿的壳聚糖分别溶解在0.5M的盐酸溶液中，制成1％的溶液，并按2∶1的体积比混合均匀，将0.5％的透明质酸钠的盐酸(0.5M)溶液以1％的体积比加入到上述胶原和壳聚糖的混合溶液中；再加入体积比为1％的纳米晶羟基磷灰石浓度为100％的悬浮液，混合均匀装入同心环形模具中，迅速冷冻结冰、冻干，制成内径为0.1厘米，外径0.2厘米管状材料。用氨水/丙酮(9∶1)浸泡20分钟后，蒸馏水冲洗干净，再冻干、Co60消毒、备用。
实施例6将胶原、脱乙酰度为90％的、分子量为为80000道尔顿的壳聚糖、透明质酸钠分别溶解在0.1M的醋酸溶液中，制成5％的胶原和壳聚糖溶液以及10％的透明质酸钠溶液，按1∶20的体积比将胶原和壳聚糖溶液混合均匀，再加入体积比10％的透明质酸钠溶液，然后加入体积比为10％的浓度为200％的磷酸氢钙悬浮液，混合均匀后装入同心环形模具中，迅速冷冻结冰、冻干，制成内径为0.2厘米，外径10厘米管状材料。用氨水/乙醇(10∶1)浸泡20分钟后，蒸馏水冲洗干净。将磷酸化甲壳素溶于蒸馏水，制成浓度为0.1的水溶液，以上水冲后的样品放入其中，吸附30分钟，再冻干、Co60消毒、备用。
实施例7将胶原、脱乙酰度为80％的、分子量为150000道尔顿的壳聚糖分别溶解在0.5M的马来酸溶液中，制成3％的溶液，并按2∶1混合均匀，再加入1％的缺钙磷石悬浮液，倒入模具中凉干成棒状。棒的直径为棒状材料的直径为0.1厘米用1-乙基-(二甲基氨丙基)-碳二亚胺盐酸盐/羧基琥珀酰亚胺/2-吗啉乙基磺酸缓冲液浸泡浸泡2小时分钟后，蒸馏水冲洗干净，再凉干、Co60消毒、备用。
附，1-乙基-(二甲基氨丙基)-碳二亚胺盐酸盐/羧基琥珀酰亚胺/2-吗啉乙基磺酸缓冲液的配制取0.533克单水合2-吗啉-乙基磺酸(MEC)溶于50毫升去离子水中，加入0.4克1-乙基-(二甲基氨丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)和0.096克羟基琥珀酰亚胺，混合均匀。
实施例8将胶原、脱乙酰度为80％的、分子量为为150000道尔顿的壳聚糖分别溶解在0.5M的马来酸溶液中，制成4％的溶液，并按1∶2混合均匀，再加入10％的缺钙磷石悬浮液，倒入模具中凉干成棒状。棒状材料的直径为10厘米。用1-乙基-(二甲基氨丙基)-碳二亚胺盐酸盐/羧基琥珀酰亚胺/2-吗啉乙基磺酸缓冲液浸泡2分钟后，蒸馏水冲洗干净，将以上水冲后的样品放入浓度为1％的磷酸化壳聚糖水溶液，吸附4小时，再冻干、Co60消毒、备用。
实施例9将胶原、脱乙酰度为85％的、分子量为为200000道尔顿的壳聚糖分别溶解在乳酸中，制成5％的溶液，并按1∶100混合均匀，再加入体积比为5％的纳米羟基磷灰石悬浮液及1％的骨形成蛋白悬浮液，混合均匀后装入模具中迅速冷冻结冰、冻干，制成块状样品。用30％的氨水浸泡5分钟后，蒸馏水冲洗干净。将磷酸化壳聚糖溶于1％的醋酸溶液，制成浓度为10％酸溶液，将以上水冲后的样品放入其中，吸附30分钟，再冻干、Co60消毒、备用。
实施例10将胶原与羧甲基壳聚糖分别溶解在乳酸溶液中，制成浓度为2％的胶原、壳聚糖溶液，静止脱泡，两者按1∶100比例混合均匀。将磷酸二氢钙粉末加到乳酸溶液中，制成浓度为10％的悬浮液；然后按10％体积比将磷酸二氢钙悬浮液加入到胶原/壳聚糖混合液中，混合均匀。再按体积比10％分别加入浓度为0.5％透明质酸钠和0.5％的骨形成蛋白悬浮液。其中透明质酸钠的溶液pH值可用盐酸调节在1，以便与胶原/壳聚糖溶液混合。然后用碳酸氢钠(NaHCO3)调节pH值到7.4，用臭氧消毒、备用。
实施例11将胶原、脱乙酰度为85％的、分子量为200000道尔顿的壳聚糖分别溶解在乳酸中，制成1％的溶液，并按100∶1混合均匀，再加入5％的纳米羟基磷灰石悬浮液及0.5％的甲状旁腺素的生理盐水溶液，混合均匀后迅速冷冻结冰、冻干。用30％的氨水浸泡5分钟后，蒸馏水冲洗干净，再冻干、Co60消毒、备用。
实施例12将胶原、脱乙酰度为85％的、分子量为200000道尔顿的壳聚糖分别溶解在乳酸中，制成2％的溶液，并按1∶1混合均匀，再加入5％的纳米羟基磷灰石悬浮液及10％的甲状旁腺素的生理盐水溶液，混合均匀后迅速冷冻结冰、冻干。用30％的氨水浸泡5分钟后，蒸馏水冲洗干净，将磷酸化甲壳素溶于蒸馏水，制成浓度为10％的水溶液，以上水冲后的样品放入其中，吸附2小时， 再冻干、Co60消毒、备用。
实施例13将2％的羧甲基壳聚糖(脱乙酰度为98％，分子量为100000)甲酸溶液与3％的胶原甲酸溶液按1∶2比例混匀，将羟基磷灰石按粉末加到甲酸溶液中，制成浓度为10％的悬浮液；然后按1％体积比将羟基磷灰石悬浮液加入到胶原/壳聚糖混合液中，混合均匀。再按10％的体积比加入浓度为10％的骨形成蛋白生理盐水悬浮液。将制备的壳聚糖/胶原/羟基磷灰石混合物脱去气泡分装在容器中冻干成膜，膜的厚度为5毫米。用25％的氨水浸泡5分钟后，蒸馏水冲洗干净，再冻干、Co60消毒、备用。
权利要求
1.一种引导硬组织再生修复的可降解材料，其特征在于该材料可按下述步骤制备得到(1)将胶原和壳聚糖或羧甲基壳聚糖分别溶于酸性溶液中，配成浓度为1～5％的溶液；将磷酸钙、磷酸氢钙、磷酸二氢钙、缺钙磷灰石或羟基磷灰石粉末加到酸性溶液中，制成浓度为10～200％的悬浮液；(2)将悬浮液按1～10％的体积比加入到胶原与壳聚糖溶液或胶原与羧甲基壳聚糖的混合溶液中，均匀混合，制得凝胶状混合物；其中胶原与壳聚糖溶液或胶原与羧甲基壳聚糖溶液的混合体积比为1～100∶100～1；(3)将上述凝胶状混合物用碳酸氢钠调节pH值到5～8，消毒后备用；或将凝胶状混合物倒入容器中凉干或冻干，制成块状、棒状、管状或膜状材料，然后放入交联剂1-乙基-(二甲基氨丙基)-碳二亚胺盐酸盐缓冲液中，或用氨水、氨水/乙醇、氨水/丙酮、氨水/甲醇混合液作凝固液进行处理，水冲后，再凉干或冻干，消毒后备用。
2.按照权利要求1所述的材料，其特征在于在所述步骤(2)中的凝胶状混合物中按1～10％体积比加入浓度为0.5～10％透明质酸钠、浓度为0.5～10％的骨形成蛋白水或生理盐水悬浮液或浓度为0.5～10％的甲状旁腺素生理盐水悬浮液，其中透明质酸钠的溶液的pH值可用盐酸调节在1～4范围内。
3.按照权利要求1或2所述的材料，其特征在于步骤(3)中二次凉干或冻干前的样品中还可再复合磷酸化甲壳素或磷酸化壳聚糖，其方法是将磷酸化甲壳素或磷酸化壳聚糖溶于蒸馏水或酸性溶液中，制成浓度为0.1～10％的水溶液或酸溶液，将用水冲后的样品放入其中，吸附2分钟至2小时，然后凉干或冻干。
4.按照权利要求3任一权利要求所述的材料，其特征在于所述的酸溶液采用稀盐酸、醋酸、甲酸、丙酸、乳酸或马来酸中的任一种。
5.按照权利要求3任一权利要求所述的材料，其特征在于所述膜材料的厚度为0.1～5毫米；棒状材料的直径为0.1～10厘米；管状材料的内径为0.1～5厘米，外径0.2～10厘米。
6.一种引导硬组织再生修复的可降解材料的制备方法，其特征在于该方法按下述步骤进行(1)将胶原和壳聚糖或羧甲基壳聚糖分别溶于酸性溶液中，配成浓度为1～5％的溶液；将磷酸钙、磷酸氢钙、磷酸二氢钙、缺钙磷灰石或羟基磷灰石粉末加到酸性溶液中，制成浓度为10～200％的悬浮液；(2)将悬浮液按1～10％的体积比加入到胶原与壳聚糖溶液或胶原与羧甲基壳聚糖的混合溶液中，均匀混合，制得凝胶状混合物；其中胶原与壳聚糖溶液或胶原与羧甲基壳聚糖溶液的混合体积比为1～100∶100～1；(3)将上述凝胶状混合物用碳酸氢钠调节pH值到5～8，消毒后备用；或将凝胶状混合物倒入容器中凉干或冻干，制成块状、棒状、管状或膜状材料，然后放入交联剂1-乙基-(二甲基氨丙基)-碳二亚胺盐酸盐缓冲液中，或用氨水、氨水/乙醇、氨水/丙酮、氨水/甲醇混合液作凝固液进行处理，水冲后，再凉干或冻干，消毒后备用。
7.按照权利要求6所述的材料，其特征在于在所述步骤(2)中的凝胶状混合物中按1～10％体积比加入浓度为0.5～10％透明质酸钠、浓度为0.5～10％的骨形成蛋白水或生理盐水悬浮液或浓度为0.5～10％的甲状旁腺素生理盐水悬浮液，其中透明质酸钠的溶液的pH值可用盐酸调节在1～4范围内。
8.按照权利要求6或7所述的材料，其特征在于步骤(3)中二次凉干或冻干前的样品中还可再复合磷酸化甲壳素或磷酸化壳聚糖，其方法是将磷酸化甲壳素或磷酸化壳聚糖溶于蒸馏水或酸性溶液中，制成浓度为0.1～10％的水溶液或酸溶液，将用水冲后的样品放入其中，吸附2分钟至2小时，然后凉干或冻干。
9.按照权利要求8任一权利要求所述的材料，其特征在于所述的酸溶液采用稀盐酸、醋酸、甲酸、丙酸、乳酸或马来酸中的任一种。
全文摘要
一种引导硬组织再生修复的可降解材料及其制备方法，属于生物材料制备技术领域。本发明以可降解的生物材料胶原、壳聚糖或羟基壳聚糖、磷酸钙或羟基磷灰石等为主要原料，分别制备成酸溶液和悬浮液，混合后制备成硬组织填充物如块状、管状、棒状、膜状或凝胶状材料。该材料不仅制备工艺简单，成本低，而且所制备的生物材料与创伤组织的相容性好。经细胞实验和动物实验表明该材料可在体内(包括牙科、骨科手术等)普遍使用，是一种促进并诱导硬组织修复的、抗菌的、在体内降解速度可调的多功能材料，在外科手术中具有广泛的应用价值。
文档编号A61L31/04GK1546181SQ20031011738
公开日2004年11月17日 申请日期2003年12月12日 优先权日2003年12月12日
发明者王小红, 林峰, 颜永年, 熊卓, 吴任东, 张人佶, 卢清萍 申请人:清华大学