Cdk抑制剂和米托蒽醌的联合的制作方法

专利名称：Cdk抑制剂和米托蒽醌的联合的制作方法
技术领域：
本发明涉及适于治疗癌症和其它增殖性疾病的药物联合。
背景技术：
哺乳动物细胞周期的启动、进行和结束受对细胞生长至关重要的各种细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)复合物的调控。这些复合物包括至少一种催化亚基(CDK自身)和一种调节亚基(细胞周期蛋白)。对细胞周期调控的一些比较重要的复合物包括细胞周期蛋白A(CDK1-也称为cdc2，和CDK2)、细胞周期蛋白B1-B3(CDK1)、细胞周期蛋白C(CDK8)、细胞周期蛋白D1-D3(CDK2，CDK4，CDK5，CDK6)、细胞周期蛋白E(CDK2)、细胞周期蛋白K和T(CDK9)和细胞周期蛋白H(CDK7)。这些复合物中的每一种涉及细胞周期的特定期。
通过与其它蛋白的短暂缔合以及它们细胞内定位的变化，CDK的活性在翻译后被调节。肿瘤发展与基因改变和CDK及其调节剂的下调密切相关，这表明CDK抑制剂可为有用的抗癌治疗药。实际上，早期结果表明转化细胞和正常细胞在它们对例如细胞周期蛋白A/CDK2的需求上有差别，因而有可能开发出新的抗肿瘤药，没有常规细胞毒性和细胞抑制药物所观察到的常见宿主毒性。
CDK的功能是磷酸化并因此激活或去激活特定蛋白，包括例如成视网膜细胞瘤蛋白、核纤层蛋白、组蛋白H1和有丝分裂纺锤体的成分。由CDK介导的催化步骤涉及从ATP到大分子酶底物的磷酰-转移反应。已发现几类化合物(在例如N.Gray，L.Détivaud，C.Doerig，L.Meijer，Cur.Med.Chem.1999，6，859中有总结)因由于CDK特异性ATP拮抗作用而具有抗增殖性能。
Roscovitine为化合物6-苄基氨基-2-[(R)-1-乙基-2-羟基乙基氨基]-9-异丙基嘌呤。Roscovitine已被证实为细胞周期蛋白依赖性激酶尤其是CDK2的有效抑制剂。这种化合物当前正被开发成抗癌药。CDK抑制剂被认为阻断了细胞周期G2/M期的细胞途径。
众所周知，本领域中经常联合给予活性药剂以使治疗方案最佳。本发明因此设法提供已知药剂的新型联合，该联合尤其适于治疗增殖性疾病，尤其是癌症。更具体地，本发明集中于与联合使用特定药剂有关的令人惊奇和出乎意料的效果。
发明概述第一方面，本发明提供包括CDK抑制剂和米托蒽醌或其衍生物或前体药物的联合。
第二方面提供包括根据本发明的联合与药物可接受载体、稀释剂或赋形剂混合的药物组合物。
第三方面涉及根据本发明的联合在制备治疗增殖性疾病的药物中的用途。
第四方面涉及包括CDK抑制剂和米托蒽醌或其衍生物或前体药物的药物制品，作为在治疗中同时、依次或分别使用的联合制剂。
第五方面涉及治疗增殖性疾病的方法，所述方法包括同时、依次或分别对患者给药CDK抑制剂和米托蒽醌或其衍生物或前体药物。
第六方面涉及CDK抑制剂在制备治疗增殖性疾病的药物中的用途，其中所述治疗包括同时、依次或分别对患者给药CDK抑制剂和米托蒽醌或其衍生物或前体药物。
第七方面涉及CDK抑制剂和米托蒽醌或其衍生物或前体药物在制备治疗增殖性疾病的药物中的用途。
第八方面涉及CDK抑制剂在制备治疗增殖性疾病的药物中的用途，其中所述药物用于与米托蒽醌或其衍生物或前体药物的联合治疗。
第九方面涉及米托蒽醌或其衍生物或前体药物在制备治疗增殖性疾病的药物中的用途，其中所述药物用于与CDK抑制剂的联合治疗。
详细描述药物联合的效果本质上是不可预料的，经常存在一种药物部分或完全抑制另一种药物的效果的倾向。本发明基于令人惊奇的发现，即同时、分别或依次联合给药米托蒽醌和roscovitine不会导致两种药剂之间的任何有害相互作用。出人意料的这种拮抗相互作用的缺乏对临床应用至关重要。
在优选的实施方案中，与分别给药的任何一种药物相比，米托蒽醌和roscovitine的联合能产生增强的效果。这种发现的令人惊奇特性与根据现有技术预料的大不相同。
下面阐述的优选实施方案适用于本发明的所有上述方面。
米托蒽醌或1，4-二羟基-5，8-双[{2-[(2-羟基乙基)氨基]乙基}氨基]-9，10-蒽二酮为对以下病症尤其有效的抗肿瘤药晚期乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、急性骨髓性白血病、急性淋巴细胞性白血病和恶性淋巴瘤。最近，米托蒽醌还用于治疗多发性硬化。尽管作用的确切机理是未知的，但米托蒽醌被认为与DNA嵌合以引起链间交联或链内交联，并已知为细胞周期期非特异性的。米托蒽醌还通过与DNA的磷酸骨架结合造成DNA链断裂。
尽管药物本身不会与DNA共价相互作用，但它可容易地被氧化成形成DNA加合物的物种。但是，目前有关DNA加合物形成对哺乳动物细胞诱变效应至关重要的证据很少。实际上，哺乳动物中的大多数效应是因为米托蒽醌为一种有效的DNA拓扑异构酶II型酶的毒药而产生。迄今观察到的主要效应包括DNA大片段的缺失和/或交换。另外，米托蒽醌诱导多倍性。
CDK抑制剂优选为CDK2和/或CDK4的抑制剂。CDK抑制剂更优选选自Roscovitine、Purvalanol A、Purvalanol B、奥罗莫星和其它2，6，9-三取代的嘌呤，如WO 97/20842、WO 98/05335(CV Therapeutics)、WO99/07705(Regents of the University of California)中所述。CDK抑制剂甚至更优选选自Roscovitine和Purvalanol A。还更优选地，CDK抑制剂为Roscovitine。
本文使用的术语“增殖性疾病”在广泛意义上包括任何需要控制细胞周期的疾病，例如心血管疾病如再狭窄和心脏病、自身免疫性疾病如肾小球肾炎和类风湿性关节炎、皮肤病如牛皮癣、抗炎性、抗真菌、抗寄生虫疾病如疟疾、气肿和脱发病。在这些疾病中，本发明的化合物可按照需要在所需的细胞内诱导凋亡或保持停滞。优选地，增殖性疾病为癌症或白血病，更优选为癌症。
在一种优选实施方案中，癌症为前列腺癌，在另一种优选的实施方案中，所述的癌症为急性白血病。
在尤其优选的实施方案中，本发明涉及上文所述的联合在治疗CDK依赖性或敏感性疾病中的应用。CDK依赖性疾病与一种或多种CDK酶的超过正常活性水平有关。这类疾病优选与CDK2和/或CDK4的异常活性水平有关。CDK敏感性疾病为CDK水平的失常不是主因而是下游初级异谢失常导致的疾病。在这种情况下，CDK2和/或CDK4被认为是敏感性代谢途径的一部分，CDK抑制剂可因此在治疗这类疾病中有活性。这类疾病优选癌症或白血病。
本文使用的术语“药物制备”包括本发明的成分除了用于这类药物制备的任意阶段外还有直接作为药物的应用。
如上所述，本发明的一个方面涉及包括CDK抑制剂和米托蒽醌的药物制品，作为在治疗中同时、依次或分别使用的联合制剂。
本文中使用的“同时”是指同时地给药两种药剂。
本文中使用的术语“依次”是指在时限内在为患者给药联合制剂中的一种成分后为其给药另一种成分，以致于它们均在同一时限内起治疗作用。因此，依次给药可允许在一种药剂后5分钟、10分钟或大约几小时内给药另一种药剂，只要第一种给药药剂的循环半衰期能使二者同时以治疗有效量存在即可。给药成分间的延时依成分的确切性质、它们之间的相互作用和它们各自的半衰期而改变。
本文使用的术语“分别”是指给药一种药剂和另一种药剂之间的间隔是明显的，即当给药第二种药剂时，在血流中可不再存在治疗有效量的第一种给药药剂。
在本发明的一种优选实施方案中，CDK抑制剂与米托蒽醌同时给药。
在本发明的一种优选实施方案中，在米托蒽醌前依次或分别地给药CDK抑制剂。优选地，在米托蒽醌前至少4小时给药CDK抑制剂，更优选地在米托蒽醌前至少72小时。
在尤其优选的实施方案中，在CDK抑制剂前依次或分别地给药米托蒽醌。优选地，在CDK抑制剂前至少1小时给药米托蒽醌，更优选地在CDK抑制剂前至少24小时。
在一种优选实施方案中，相对于单独成分，分别给药治疗有效量的CDK抑制剂和米托蒽醌；换句话说，即使不是以联合给药的方式，CDK抑制剂和米托蒽醌也是以治疗有效量给药。
在另一种优选实施方案中，相对于单独成分，分别给药亚治疗量(sub-therapeutic amount)的CDK抑制剂和米托蒽醌；换句话说，如果不是联合给药给药，CDK抑制剂和米托蒽醌不是以治疗有效量给药。
优选地，米托蒽醌和CDK抑制剂以协同方式相互作用。本文使用的术语“协同”是指米托蒽醌和CDK抑制剂在联合使用时能产生比由两种组分的单独效应相加预料到的效应更大的效应。有利地，协同相互作用可允许每种组分以较低剂量给药于患者，从而降低化疗的毒性，同时产生和/或保持相同的疗效。因此，在尤其优选的实施方案中，可以亚治疗量给药每种组分。
在所附实施例中详细描述了支持协同相互作用的证据。
盐/酯本发明的药剂可以盐或酯尤其是药物可接受的盐或酯的形式提供。
本发明药剂的药物可接受盐包括它们合适的酸加成盐或碱加成盐。合适药物盐的综述可见Berge等人的J.Pharm Sci，66，1-19(1977)。盐为与例如以下酸形成的盐强无机酸，如矿物酸，例如硫酸、磷酸或氢卤酸；强有机羧酸，如未取代或取代(如被卤代)的1至4个碳原子的链烷羧酸，例如乙酸；饱和或不饱和的二元羧酸，例如草酸、丙二酸、丁二酸、马来酸、富马酸、邻苯二甲酸或四邻苯二甲酸(tetraphthalic)；羟基羧酸，例如抗坏血酸、羟基乙酸、乳酸、苹果酸、酒石酸或柠檬酸；氨基酸，例如天冬氨酸或谷氨酸；苯甲酸；或与有机磺酸，如未取代或取代(如被卤代)的(C1-C4)烷基磺酸或芳基磺酸，如甲磺酸或对甲苯磺酸。
取决于被酯化的官能团，使用有机酸或醇/氢氧化物形成酯。有机酸包括羧酸，如未取代或取代(如被卤代)的1至12个碳原子的链烷羧酸，例如乙酸；饱和或不饱和的二元羧酸，例如草酸、丙二酸、丁二酸、马来酸、富马酸、邻苯二甲酸或四邻苯二甲酸；羟基羧酸，例如抗坏血酸、羟基乙酸、乳酸、苹果酸、酒石酸或柠檬酸；氨基酸，例如天冬氨酸或谷氨酸；苯甲酸；或与有机磺酸，如未取代或取代(如被卤代)的(C1-C4)烷基磺酸或芳基磺酸，如甲磺酸或对甲苯磺酸。合适的氢氧化物包括无机氢氧化物，如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化铝。醇包括未取代或取代(如被卤代)的1至12个碳原子的链烷醇。
对映异构体/互变异构体本发明还适当地包括药剂的全部对映异构体和互变异构体。本领域的技术人员能认识到具有光学性质(一个或多个手性碳原子)或互变异构特征的化合物。可通过本领域中已知的方法分离/制备相应的对映异构体和/或互变异构体。
立体异构体和几何异构体本发明的一些药剂可以立体异构体和/或几何异构体的形式存在，例如它们可具有一个或多个不对称和/或几何中心，并因此可以二种或多种立体异构和/或几何形式存在。本发明包括这些抑制剂药剂所有的单独立体异构体和几何异构体及它们的混合物的使用。权利要求中使用的术语包括这些形式，只要所述形式保留适当的功能活性(但不必到相同程度)。
本发明还包括药剂或其药物可接受盐的所有合适的同位素变体。本发明药剂或其药物可接受盐的同位素变体定义为其中至少一个原子被具有相同原子序数但原子质量与自然界中通常发现的原子质量不同的原子取代的物质。可被掺入到药剂和其药物可接受盐的同位素的例子包括氢、碳、氮、氧、磷、硫、氟和氯的同位素，分别如2H、3H、13C、14C、15N、17O、18O、31P、32P、35S、18F和36Cl。药剂和其药物可接受盐的一些同位素变体，例如结合放射性同位素如3H或14C的那些化合物，在药物和/或底物组织分布研究中是有用的。含氚的即3H和碳-14即14C同位素因其容易制备和可检测性而特别优选。此外，用同位素如氘即2H的取代可因较大的代谢稳定性而提供特定的治疗益处，例如体内半衰期增加或剂量要求降低，并因此可在一些情况下被优选。通常可使用合适试剂的适当同位素变体通过常规过程制备本发明药剂和其药物可接受盐的同位素变体。
溶剂合物本发明还包括本发明药剂的溶剂合物形式。权利要求中使用的术语包括这些形式。
多晶型物本发明还涉及各种结晶形式、多晶型形式和无水/水合形式的本发明的药剂。众所周知，在药物工业中可通过稍微改变这种化合物合成制备中所用溶剂的纯化方法和或分离形式来分离得到化合物的任意这类形式。
前体药物本发明还包括前体药物形式的本发明的药剂。这种前体药物通常为一个或多个适当基团已被修饰以使在对人或哺乳动物对象给药后所述的修饰可被逆转的化合物。虽然为了实现体内逆转可与这种前体药物一起给药第二种药剂，但通常通过在这类对象中天然存在的酶实现这种逆转。这类修饰的例子包括酯(例如上述那些中的任一种)，其中可通过酯酶等进行逆转。其它这类系统为本领域中那些技术人员所熟知。
给药可使本发明的药物组合物适于口服、直肠、阴道、肠胃外、肌内、腹膜内、动脉内、鞘内、支气管内、皮下、皮内、静脉内、膀胱内、鼻、口腔或舌下给药途径。
对于口服给药，特别利用压缩片剂、药丸、片剂、凝胶(gellules)、滴剂和胶囊。优选地，这些组合物每剂包含1-2000mg和更优选50-1000mg的有效成分。
其它给药形式包括溶液或乳液，它们可经静脉内、动脉内、鞘内、皮下、皮内、腹膜内、膀胱内或肌内给药，并由无菌或可灭菌溶液制备。本发明的药物组合物还可为栓剂、阴道栓剂、混悬剂、乳液、洗液、软膏、乳膏剂、凝胶、喷雾剂、溶液或扑粉(dusting poeder)的形式。
经皮给药的替代方式是利用皮肤贴片。例如，可将有效成分掺入到由聚乙二醇含水乳液或液体石蜡组成的乳膏剂内。还可以1-10wt％的浓度将有效成分掺入到由白蜡或白色软石蜡基质与所需要的稳定剂和防腐剂共同组成的软膏内。
可注射形式每剂可包含10-1000mg、优选10-500mg的有效成分。
组合物可被配制成单元剂型，即包含单元剂量或单元剂量的多重单位或亚单位的形式的离散部分。
在一种特别优选的实施方案中，静脉内给药本发明的联合或药物组合物。
剂量本领域的普通技术人员不用额外试验就可容易地确定对患者给药的本发明的组合物的适宜剂量。典型地，医师会确定对个体患者最适合的实际剂量，并且根据各种因素进行调整，包括使用的具体化合物的活性、化合物的代谢稳定性和作用长短、年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、给药方式和时间、排泄速度、药物联合、特定病症的严重程度和个体正接受的治疗。本文公开的剂量为一般情况的示例。当然也可有有益的较高或较低剂量范围个别情况，这都在本发明的范围内。
根据需要，可以0.1-30mg/kg体重，如0.1-10mg/kg体重，更优选2-20mg/kg体重的剂量给药所述药剂。
指导性地，按照医师指导，米托蒽醌一般地在3-5分钟内静脉内给药，剂量在10和14mg/m2体表面积之间，一天一次，每21天持续1到5天。施用的剂量和给药频率一般根据患者的一般体格状况和引起的副作用的严重程度，尤其是引起造血、神经系统和肾系统的那些副作用的严重程度进行调整。
roscovitine一般以约0.05-约5g/天，优选约0.4-约3g/天给药。roscovitine优选以片剂或胶囊的形式口服给药。roscovitine的总日剂量可作为单次剂量给药，或以分散剂量每天给药2、3或4次。
优选地，以0.4-3g/天的剂量口服或静脉内给药roscovitine。然后，按认为最合适的方式以上述适宜剂量给药米托蒽醌。优选地，在给药roscovitine至少24小时后给药米托蒽醌。
通过实施例并结合以下图进一步描述本发明，其中

图1显示了roscovitine联合米托蒽醌在前列腺肿瘤细胞系PC3M中的抗癌效力(单层分析)。
图2显示了前列腺肿瘤细胞系PC-3预暴露于roscovitine 24小时然后暴露于米托蒽醌24小时的效应。
图3显示了前列腺肿瘤细胞系PC-3预暴露于米托蒽醌24小时然后暴露于roscovitine 24小时的效应。
图4显示了前列腺肿瘤细胞系PC-3同时暴露于roscovitine/米托蒽醌24小时的效应。
实施例使用单层分析和肿瘤干细胞分析测定roscovitine单独和联合米托蒽醌对PC-3前列腺细胞系的生长抑制活性。
方法和材料化合物在DMSO中制备CDK抑制剂(例如roscovitine)的储备溶液并在-20℃下储存等分试样。使用前即刻在培养基(Iscove′s Modified Dulbecco′s Medium；Life Technologies，Karlsruhe)中制备最终的稀释液。
产克隆分析由人肿瘤异种移植物制备单细胞悬浮液在无菌条件下切出胸腺发育不全的裸小鼠(NMRI，Naval MedicalResearch Institute，USA，nu/nu株，得自我们自己的饲养设施)中在皮下连续传代生长的固体人肿瘤异种移植物，机械分解，随后用酶混合物在37℃下孵育30分钟，其中酶混合物由胶原酶(41U/ml，Sigma)、DNAse I(125U/ml，Roche)、透明质酸酶(100U/ml，Sigma)和分散酶(Dispase)II(1.0U/ml，Roche)在RPMI 1640-培养基(Life Technologies)中组成。使细胞通过200μm和50μm筛的筛，并用无菌PBS缓冲液(Life Technologies)洗涤两次。利用台盼蓝排斥实验在Neubauer血细胞计数计上测定活细胞的百分比。
培养方法根据Hamburger&Salmon[Alley，M.C.，Uhi，C.B.&M.M.Lieber，1982]介绍的改性双层软琼脂分析以24孔形式上进行产克隆分析(clonogenicassay)。通过使用可代谢的四唑盐改进软琼脂集落形成分析中药物细胞毒性的检测。Life Sci.313071-3078]。底层由0.2ml/孔的Iscove′s ModifiedDulbecco′s Medium(补充有20％(v/v)胎牛血清和0.01％(v/v)庆大霉素)和0.75％(w/v)琼脂组成。向补充有0.4％(w/v)琼脂的0.2ml相同培养基中加入4·104-8·104个细胞，并以24多孔皿形式接种到底层上。通过在0.2ml培养基中连续暴露(药物覆层)施用细胞抑制药。每个皿包括含有溶媒的6个对照孔，和6个浓度的三重的药物处理组。在37℃下和有7.5％CO2的湿度气氛中孵育培养物8-20天，使用倒置显微镜密切监视集落生长。在此期间，体外肿瘤生长导致直径＞50μm的集落形成。在最大集落形成时，用自动图象分析系统(OMNICON FAS IV，Biosys GmbH)进行计数。在评价前24小时，用2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-苯基四唑氯化物的无菌水溶液(1mg/ml，100μl/孔)[i]染色活集落。
如果满足下面的质量控制标准，则认为分析完全可评价-24多孔板的对照组孔中的平均集落数≥20个集落且集落直径＞50μm-阳性参考化合物5-氟尿嘧啶(5-FU)(在1000μg/ml中毒剂量时)必须实现＜20％对照的集落存活率-第0或2天上的初始板计数＜20％的最终对照组计数-对照组中的变异系数≤50％数据评价用存活率百分数表示药物效应，通过比较处理板中的平均集落数和未处理对照的平均集落计数得到(相对集落计数用试验组对对照组值表示，T/C值[％]) IC50和IC70值，分别是抑制50％(T/C＝50％)和70％(T/C＝30％)集落形成需要的药物浓度，通过绘制化合物浓度对相对集落计数的曲线确定。根据下式计算平均IC50和IC70值；平均IC50,70=10[ΣX=1nlg(IC50,70)n]]]>其中x为特异性肿瘤模型，n为研究的肿瘤模型总数。如果在试验的剂量范围内不能确定IC50或IC70值，则使用研究的最低或最高浓度用于计算。
在均值图形分析(IC曲线)中，在个别肿瘤类型中得到的试验化合物的IC70值分布以相对于对全部试验肿瘤的得到的平均IC70值给出。个别IC70值表示为对数坐标轴中的条(bar)。条左边显示低于平均值的IC70值(代表较敏感的肿瘤模型)，条右边显示较高的值(代表有相当抗性的肿瘤模型)。因此IC曲线反映了化合物抗增殖图的指纹。
试验过程roscovitine与标准药剂的联合细胞系下面表1中显示了6种人肿瘤细胞系的特征。
表1用于试验roscovitine与标准药剂联合的细胞系
ud＝未分化，pd＝分化不足，md＝中度分化，wd＝充分分化，mm＝恶性黑素瘤；ND＝未测定肺癌细胞系LXFA 629L由人肿瘤异种移植物建立，如Roth等人1999年所述[Roth T，Burger AM，Dengler W，Willmann H，Fiebig HH.Human tumorcell lines demonstrating the characteristics of patient tumors as useful models foranticancer drug screening.InFiebig HH，Burger AM(eds)，Relevance of TumorModels forAnticancer Drug Development Contrib.Oncol.1999，54145-156]。Fiebig等人于1992年描述了供体异种移植物源[Fiebig HH，Dengler WA，Roth T.Human tumor xenograftsPredictivity，characterization，and discoveryof new anticancer agents.InFiebig HH，Burger AM(eds)，Relevance of TumorModels for Anticancer Drug Development Contrib. Oncol.1999，5429-50]。
细胞系DLD1和HT29(结肠)以及前列腺癌DU145和PC3M得自US-NCI(National Cancer Institute，USA)。
前列腺癌22RV 1购自American Type Culture Collection(ATCC)。
按常规每周传代细胞1次或2次。在培养物中保持它们不超过20次传代。在补充有10％胎牛血清(Sigma，Deisenhofen，Germany)和0.1％庆大霉素(Invitrogen)的RPMI 1640培养基(Invitrogen，Karlsruhe，Germany)中于37℃下和湿度气氛(95％空气，5％CO2)中培育所有细胞。
细胞增殖分析使用改性碘化丙啶(propidium iodide)分析评定roscovitine对人肿瘤细胞系生长的影响[Dengler WA，Schulte J，Berger DP等人(1995).Development ofa propidium iodide fluorescence assay for proliferation and cytotoxicity assay.Anti-Cancer Drugs 1995，6522-532]。简单地说，通过胰蛋白酶化从指数生长期培养物中富集细胞，计数并以与细胞系有关的细胞密度(5-12.000活细胞/孔)接种在96孔平底微量滴定板中。在24小时使细胞重新开始指数生长的恢复期后，向孔中加入20μl培养基(每板3个对照孔)或包含各种浓度的试验制品No.1(标准药剂)的培养基。每种浓度一式三份接种。在每个板上，在微量滴定板的4个区域4次施加5种浓度的试验制品No.1。区域1用于单独的试验制品No.1，在区域2-4，在3个不同的时间点分别施加试验制品No.2(roscovitine)。在试验制品连续暴露4天后，用200μl碘化丙啶(PI)水溶液(7μg/ml)代替有或没有药物的细胞培养基。由于PI只通过渗漏的或细胞溶解的细胞膜，因此可染色并测量死细胞的DNA，而活细胞不能被染色。为测量活细胞的比例，通过冷冻板引起全部细胞死亡使细胞透过。在解冻板后，然后使用Cytofluor 4000微量培养板读数器(激发530nm，发射620nm)测量荧光，给出与总细胞数的直接关系。生长抑制率表示为处理的/对照×100(％T/C)，通过绘制化合物浓度对细胞存活率的曲线确定每种联合的IC50、IC70和IC90值。
MTT分析利用MTT分析系统评价有和没有米托蒽醌的roscovitine。MTT分析为基于活细胞将MTT转化成甲(formazan)的能力的分光光度分析。通过测量在测试波长570nm和参考波长630nm处的吸收度估计细胞浓度。使用自动过程测定这些研究中使用的所有药剂的IC50值(抑制50％对照物细胞生长的药物浓度)。考虑未来临床试验设计选择有特异性可能的细胞系。
开始时，分别试验一系列浓度的roscovitine和米托蒽醌。在初始IC50分析完成后，然后测试联合。对于联合研究，用于表征相互作用类型的浓度(表示为单独药剂IC50的百分数)图表示在下面药物浓度(表示为IC50的百分数)roscovitine米托蒽醌100075 2560 4050 5040 6025 750 1000 0联合研究的统计分析为了解释联合曲线，对每一测试联合(75∶25roscovitine/米托蒽醌)和端点(100∶0-roscovitine和0∶100-米托蒽醌)进行统计比较。在联合(roscovitine和米托蒽醌)吸光度值和两个端点值(单独roscovitine和米托蒽醌)之间存在差异，则认为统计学显著[Greco等人，The search for synergy；Acritical reviewfrom a response surface perspective。Pharmacol；Review 47331-385，1995；Laska等人，Simple designs and model-free tests for synergy；Biometrics 50834-841，1994]。如果大多数(≥3/5)的值在统计上超过或低于线(端点)，则分别描述拮抗作用或协同作用。否则，模式更与加和相互作用一致。
结果在加入米托蒽醌前(-6小时，-4小时，-2小时)、同时(0小时)或后(+2小时，+4小时，+6小时，+24小时)向细胞中加入roscovitine。Roscovitine联合米托蒽醌在PCM3中的抗肿瘤活性示于下面的表2。roscovitine以20μM的剂量水平加入。
表2
-没有协同作用；+弱协同作用；++协同作用；n.e.未评价Roscovitine联合米托蒽醌在前列腺肿瘤细胞系PC3M中的抗癌效力(单层分析)示于图1。
Roscovitine暴露然后是米托蒽醌暴露在这些研究中，前列腺肿瘤细胞(PC-3)在Roscovitine中预先暴露24小时，然后在米托蒽醌中暴露24小时(表3和4，图2)。对两种药剂的这种暴露顺序产生了表明这些药剂之间加和协同相互作用的模式。
表3
表4
米托蒽醌暴露然后是Roscovitine暴露在这些研究中，前列腺肿瘤细胞在米托蒽醌中预先暴露24小时，然后暴露于Roscovitine 24小时(表5和6，图3)。对两种药剂的这种暴露顺序产生了表明这些药剂之间相加协同相互作用的模式。
表5
表6
同时暴露于Roscovitine和米托蒽醌当人前列腺肿瘤细胞同时暴露于Roscovitine和米托蒽醌时，观察到加和的药物-药物相互作用(表7和8，图4)。
表7
表8
作为总结，结果表明，与单独或同时给药任何一种药物相比，联合给药米托蒽醌和Roscovitine能产生增强的效应。这种效应表明了两种成分之间的协同相互作用。
在不脱离本发明的范围和精神的情况下，本发明的各种改变和变化对本领域的那些技术人员来说是显而易见的。尽管已结合具体的优选实施方案描述了本发明，但应该认识到要求的本发明不应该不适当地限制至这种具体实施方案。事实上，对相关领域那些技术人员明显的用于实施本发明上述方式的各种改变都被本发明覆盖。
权利要求
1.一种联合，包括CDK抑制剂和米托蒽醌。
2.根据权利要求1所述的联合，其中CDK抑制剂为CDK2或CDK4的抑制剂。
3.根据权利要求1或2所述的联合，其中CDK抑制剂选自roscovitine、purvalanol A、purvalanol B和奥罗莫星。
4.根据任一前述权利要求所述的联合，其中CDK抑制剂为roscovitine。
5.一种药物组合物，包括根据任一前述权利要求所述的联合和药物可接受载体、稀释剂或赋形剂。
6.根据权利要求1至4中任一项所述的联合在制备治疗增殖性疾病的药物中的用途。
7.一种药物制品，包括CDK抑制剂和米托蒽醌，作为在治疗中同时、依次或分别使用的联合制剂。
8.根据权利要求7所述的药物制品，其中CDK抑制剂为CDK2或CDK4的抑制剂。
9.根据权利要求7或8所述的药物制品，其中CDK抑制剂选自roscovitine、purvalanol A、purvalanol B和奥罗莫星。
10.根据权利要求7至9中任一项所述的药物制品，其中CDK抑制剂为roscovitine。
11.根据权利要求7至10中任一项所述的药物制品，以包括药物可接受载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物的形式存在。
12.根据权利要求7至11中任一项所述的药物制品，用于治疗增殖性疾病。
13.根据权利要求12所述的药物制品，其中增殖性疾病为癌症。
14.根据权利要求13所述的药物制品，其中癌症为前列腺癌。
15.一种治疗增殖性疾病的方法，所述方法包括同时、依次或分别地对患者给药米托蒽醌和CDK抑制剂。
16.根据权利要求15所述的方法，包括在对患者依次或分别地给药米托蒽醌前对所述患者给药所述CDK抑制剂。
17.根据权利要求15所述的方法，包括在对患者依次或分别地给药CDK抑制剂前对所述患者给药米托蒽醌。
18.根据权利要求15至17中任一项所述的方法，其中CDK抑制剂为CDK2或CDK4的抑制剂。
19.根据权利要求18所述的方法，其中CDK抑制剂选自roscovitine、purvalanol A、purvalanol B和奥罗莫星。
20.根据权利要求19所述的方法，其中CDK抑制剂为roscovitine。
21.根据权利要求15至20中任一项所述的方法，其中相对于单独成分，分别以治疗有效量给药CDK抑制剂和米托蒽醌。
22.根据权利要求15至20中任一项所述的方法，其中相对于单独成分，分别以亚治疗量给药CDK抑制剂和米托蒽醌。
23.根据权利要求15至22中任一项所述的方法，其中增殖性疾病为癌症。
24.根据权利要求23所述的方法，其中癌症为前列腺癌。
25.CDK抑制剂在制备治疗增殖性疾病的药物中的用途，其中所述治疗包括同时、依次或分别地对患者给药米托蒽醌和CDK抑制剂。
26.CDK抑制剂和米托蒽醌在制备治疗增殖性疾病的药物中的用途。
27.CDK抑制剂在制备治疗增殖性疾病的药物中的用途，其中所述药物用于与米托蒽醌的联合治疗。
28.米托蒽醌在制备治疗增殖性疾病的药物中的用途，其中所述药物用于与CDK抑制剂的联合治疗。
全文摘要
本发明的第一方面涉及包括CDK抑制剂和米托蒽醌的联合。本发明的第二方面涉及包括CDK抑制剂和米托蒽醌的药物制品，作为在治疗中同时、依次或分别使用的联合制剂。本发明的第三方面涉及治疗增殖性疾病的方法，所述方法包括同时、依次或分别地对患者给药CDK抑制剂和米托蒽醌。
文档编号A61P35/00GK1708294SQ200380102234
公开日2005年12月14日 申请日期2003年11月5日 优先权日2002年11月6日
发明者阿索斯·贾内拉－博尔－拉多里 申请人:西克拉塞尔有限公司