专利名称：一种黄酮单体在制备抗病毒药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种黄酮单体在制备抗病毒药物中的应用，更具体地说是一种黄酮单体在制备抗小核糖核酸病毒如柯萨奇病毒的药物中的应用，属于医药领域。
背景技术：
鉴于近年来病毒性疾病如SARS、禽流感、疯牛病等的全球性流行，开发抗病毒药物成为了人们广泛关注的热点。目前，国际上抗病毒药物研究的主要策略包括阻断病毒与靶细胞的结合、抑制逆转录酶、抑制病毒蛋白翻译、抑制蛋白质修饰或病毒颗粒的出芽释出、以及切断病毒基因组等。通过对已知疗效化合物进行结构改造、计算机设计先导分子、反义寡核苷酸结构改造和组合化学合成、免疫功能调节剂的研制、以及从植物和微生物中筛选天然抗病毒先导化合物等，研究开发新的抗病毒药物。
在众多的病毒性疾病中，病毒性心肌炎是心血管系统的常见病与多发病，严重威胁人类的健康。目前，无论在发达国家还是在发展中国家，心肌炎的发病率较10年前均有显著增多，其主要原因是感染性心肌炎中病毒性心肌炎的发病率增高所致。根据世界卫生组织(WHO)全球病毒监测研究报导显示在新生儿、儿童突发死亡病例中，20％为病毒性心肌炎所致；病毒性心肌炎在新生儿、儿童中的发病率为360/10万，死亡率为8％；病毒性心肌炎的发病率为同期心血管疾病住院病人的8.69～20.8％；病毒感染侵入心肌以后，会引起局灶性或弥漫性心肌间质性渗出和心肌纤维变性、坏死。重症弥漫性心肌炎可出现严重心律不齐、心力衰竭、心源性休克、甚至猝死；也可迁延不愈，导致心脏肥大，并逐渐发展成扩张型心肌病。
国内外针对病毒性心肌炎的药物研究主要集中在下列几个方面柯萨奇病毒减毒活疫苗的开发、免疫调节剂的研制以及抗病毒药物的探索，而且针对病毒性心肌炎的基因治疗方兴未艾；但是在抗柯萨奇病毒药物的研发方面，一直没有重大进展，这就导致所有的治疗措施均难以将病毒性心肌炎控制在潜伏期和急性期。鉴于以上情况，进行针对病毒性心肌炎的新药开发研究对临床治疗意义重大。
准噶尔无叶豆(Eremosparton.songoricum(Litv)Vass.)产于新疆准噶尔盆地，生于流动或半固定的沙地，根茎延沙地浅层伸长，达20米；在根茎上萌发新株，为优良先锋固沙植物。柯伊利素(Chrysoeriol)，为准噶尔无叶豆中提取得到的一种黄酮类单体化合物，该化合物目前在国内外的研究方向主要集中在植物化学方面，在医学方面，还没有相关的论述。但是因为其属于黄酮类化合物，所以在一些文献中，认为其可能参与如下生理调节作用抗氧化、抗自由基、抗菌、降血压等作用，但是，还没有文献提到其与抗病毒药物之间存在任何关系。在非医药用途方面，目前尚无相关研究报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种黄酮单体在制备抗病毒药物中的应用。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案一种黄酮单体在制备抗病毒药物中的应用，该黄酮单体具有以下化学结构式 所述病毒为小核糖核酸病毒科病毒，包括柯萨奇病毒、肠道病毒、鼻病毒、脊髓灰质炎病毒和甲型肝炎病毒。
所述柯萨奇病毒为CVB病毒3型Nancy株。
本实验室通过对多种天然植物单体筛选发现，上述单体对病毒引起的凋亡以及病毒翻译过程中的病毒蛋白酶具有抑制作用。因为病毒在完成复制和翻译过程之后，必然要进行包装，病毒才能够成为完整的病毒颗粒，而病毒翻译产生的蛋白酶在小核糖核酸病毒科(包括柯萨奇病毒、肠道病毒、鼻病毒、脊髓灰质炎病毒、甲型肝炎病毒)中具有极高的同源性，并与真核细胞的蛋白酶差异明显。所以可以断定该单体对小核糖核酸病毒科在侵入细胞以后，均具有抑制病毒成熟的作用，从而发挥抑制病毒性疾病进展的作用。
本实验室目前成功建立了柯萨奇病毒感染的细胞及动物模型，通过一系列细胞学及动物实验确知，上述单体成分能够明显抑制柯萨奇病毒造成的病变。
本发明证实，该单体可用于制备抗病毒尤其是小核糖核酸类病毒的药物，即以该单体作为药物的有效成分，单独制成原料药、或者辅以药剂学可接受的辅料或载体制成可施用于生物体的制剂。其制剂可以是消化道给药制剂如片剂、丸剂、胶囊等；也可以是注射剂，如注射液、粉针等；还可以是透皮吸收给药制剂、粘膜给药制剂和呼吸道给药制剂，如鼻喷剂等。这里的生物体并不局限于人，也包括禽类和其他哺乳类动物等凡是能够被病毒尤其是小核糖核酸类病毒感染的生物。由于对药物剂型的选择属于本领域公知技术，因此任何依照本发明的指导对该单体的该药物用途所进行的剂型选择都属于本发明的保护范围。
本发明的有益效果是本发明提供了一种抗病毒单体化合物，经过一系列的抗病毒实验，证明这种单体对病毒引起的凋亡以及病毒翻译过程中的病毒蛋白酶具有抑制作用，提示该单体为一广谱抗病毒药物；该单体对柯萨奇病毒为代表的小核糖核酸病毒具有明显的抗病毒作用，为人们治愈病毒性心肌炎提供了新的选择方案。
图1为SGL-1的药物毒性测定结果图。
图2为CPE抑制实验的MTT染色结果图。
图3为CPE抑制实验的倒置显微镜下逐时观察结果图。
图4为病毒繁殖抑制试验的结果图。
图5为光学显微镜下观察发生深染的凋亡细胞图。
图6为流式细胞观察SGL-1对凋亡的抑制作用图。
图7为感染CVB3的Hela细胞经Annexin V-FITC/PI染色后可观察到早期凋亡及晚期凋亡现象图。
图8为RT-PCR法验证SGL-1下调柯萨奇病毒在心肌细胞的主要表面受体CAR表达的作用图。
图9为用Western blot方法检测心肌细胞dystrophin的断裂及合成情况结果图。
具体实施例方式
实施例1、药物单体的获得1、仪器和材料熔点用Boetius显微熔点测定仪测定；IR利用KBr压片法在IFS-120H型红外光谱仪(德国)上测试；FABMS在Autospec 3000质谱仪上测试；核磁共振用INOVA-400型(Varian公司)，TMS为内标；柱层析硅胶(200-300目)，薄层层析硅胶H均为青岛海洋化工厂生产。
准噶尔无叶豆(Eremosparton.songoricum(Litv)Vass.)于2002年9月采自新疆维吾尔自治区阜新县，由中国科学院新疆沙漠土壤研究所张立运研究员鉴定为准噶尔无叶豆(Eremosparton.Songoricum(Litv)Vass.)。
2、提取和分离准噶尔无叶豆(Eremosparton.songoricum(Litv)Vass.)全草干粉7.0kg，工业乙醇冷浸三次，每次7天。冷浸液经减压浓缩得浸膏555g，将浸膏分散于适量水中，分别用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇进行萃取，得乙酸乙酯部分120g，拌以160-200目硅胶，自然凉干，研细。用200-300目(1500g)硅胶湿法上柱，用氯仿-丙酮(100∶1～1∶1)为洗脱液进行梯度洗脱。TLC进行监测，相同组分合并，得柯伊利素500mg。
3、结构鉴定柯伊利素C16H12O6；黄色粉末(甲醇)；m.p.320℃-322℃；FAB-MS m/z301(M+)；IRvmar cm-13420，3164，2996，2972，2843，1624，1572，1509，1471，1380，1314，1283，1243，1132，1099，1024，952，854；1H-NMR(DMSO-d6)δ12.98(1H，s，5-OH)，10.8(1H，s，7-OH)，9.98(1H，s，4′-OH)，7.56(2H，d，J＝8.8Hz，H-2′，H-6′)，6.92(2H，m，H-5′，H-3)，6.51(1H，d，J＝2.4Hz，H-8)，6.36(1H，d，J＝2.0Hz，H-6)，3.89(3H，s，1×CH3)；13C-NMR(DMSO-d6)δ164.13(C-2)，103.21(C-3)，181.82(C-4)，161.44(C-5)，98.84(C-6)，163.67(C-7)，94.07(C-8)，157.33(C-9)，103.71(C-10)，120.36(C-1′)，110.16(C-2′)，150.772(C-3′)，148.03(C-4′)，115.74(C-5′)，121.50(C-6′)，56.03(1×OMe)。并与文献对照，化合物鉴定为5，7，4′-三羟基-3′-甲氧基黄酮(柯伊利素，Chrysoeriol)。
在以下实施例中以该化合物单体在本实验室的编号SGL-1代替其名称，纯度＞99.99％。
实施例2、药物毒性测定(一)、SGL-1的药物毒性测定结果1、实验方法在96孔培养板中接种心肌细胞；用DMEM倍比稀释药物，形成6-10个梯度；每孔加入DMEM倍比稀释药物0.1mL，每个稀释度设置5个复孔；对照组细胞包括病毒感染细胞对照和空白处理对照(如有溶媒，则需仅加入溶媒作为对照)；置37℃、5％CO2培养箱中培养1周，逐日观察细胞病变(CPE)；结合MTT染色计算半数中毒剂量(TD50)，统计方法采用Bliss统计软件分析。
2、实验结果如图1所示，三次重复实验以后，应用Bliss统计分析软件，计算得出SGL-1的药物毒性结果如下TD50＝1.35mg/ml。
(二)、利巴韦林的药物毒性测定结果实验方法同上。实验结果为TD50＝2.34μg/ml。
通过对比SGL-1与利巴韦林的药物毒性，发现SGL-1的半数毒性剂量是利巴韦林的577倍，说明SGL-1的毒性远远低于利巴韦林。
实施例3、细胞病变(CPE)抑制实验(一)SGL-1的CPE抑制实验1、实验方法将2×105/ml浓度的Vero细胞接种于96孔板，0.1ml/孔；培养1-2天形成单层细胞后，感染柯萨奇病毒(该病毒由武汉医科大学协和医院病毒室提供，为CVB病毒3型Nancy株)10-100TCID50；将待测药物自最大无毒浓度开始稀释8个稀释度；感染后不同时间，将药物加入细胞；每天于显微镜下观察CPE进展情况，并记录结果；当病毒对照组的细胞接近于全部破坏时，停止细胞培养；此实验分组和在96孔板中的安排如表。
表2在96孔板进行的CPE抑制实验设计
2、结果分析及统计处理连续观察96孔板中各组细胞CPE出现情况，在病变最严重的实验组或对照组CPE不再进展时，开始做MTT染色；用无血清培养基将MTT稀释为10％浓度；吸去原培养基，并在每孔中加入100ul 10％MTT染液；37℃孵育4小时；吸去MTT染液，用PBS洗1-2遍，然后加入DMSO以终止显色反应；酶标仪测定OD值；数据分析采用Reed-Muench法。
3、实验结果(1)、按Reed-Muench法计算药物SGL-1对CVB3致CPE产生50％抑制的浓度，以下为倒置显微镜下检测结果统计数字(表3)表3倒置显微镜下检测结果统计CPE发生情况
根据计算公式(仅高于50％的感染百分率-50)/(仅高于50％的感染百分率-仅低于50％的感染百分率)＝(71.4-50)/(71.4-12.5)＝0.66；将0.66加到仅高于50％感染率的药物浓度稀释指数(本实验中为1ug/ml)；最后，得出该病毒的IC50为1.66μg/ml。
(2)MTT染色结果，见图2。
(3)倒置显微镜下逐时观察结果，见图3。
(二)、利巴韦林CPE抑制实验结果实验方法同上，IC50为0.24μg/ml。
(三)、SGL-1与利巴韦林药物治疗指数(TI)的比较1、按TI＝TD50/IC50进行计算得出，SGL-1的TI值为1350/1.66＝813.252、同样，利巴韦林的TI值为2.34/0.24＝9.75通过以上比较，能够明确SGL-1半数有效量要低于利巴韦林，但是SGL-1的安全性要明显高于利巴韦林。
实施例4、病毒繁殖抑制实验1、实验方法本实验的前提是CPE抑制实验显示药物具有抑制CVB3增殖的作用；收集实验组和对照组的细胞及培养液；经过反复冻融，使细胞充分裂解，释放出胞浆内的病毒颗粒；离心后取上清，作系列10倍稀释，共设8个梯度；将稀释后的病毒液接种于已培养好Vero细胞96孔板上；对比病毒感染组与病毒+药物组TCID50的差别。
2、结果分析以Reed-Muench法计算病毒感染组培养液上清接种后TCID50；以Reed-Muench法计算病毒+药物组组培养液上清接种后TCID50；以加药组比病毒对照组TCID50降低1个对数以上判定为有效。
3、实验结果应用Reed-Muench法计算各组TCID50值，结果如图4所示，可以看出两组的TCID50下降值均大于1。说明SGL-1的病毒繁殖抑制作用明显。
实施例5、在体动物模型死亡率比较1、实验分组及剂量确定(1)、实验动物采用Balb/C四周龄雄性小鼠，动物为清洁级，购自中国医学科学院动物所。
(2)、实验动物采用随机化分组原则进行，本实验设三个本发明药物实验组，另外设三个对照组，分别是空白对照组、假处理对照组和利巴韦林对照组，其中假处理对照组为腹腔注射同等量的病毒液，口服本发明药物溶酶。每组动物数安排依照预试验后的统计结果而定(按照预实验结果，每组动物数确定为18只)。
(2)、剂量确定本发明药物高剂量组给药量为1250mg/kg；中剂量组按照380mg/kg给药。低剂量组为126mg/kg，利巴韦林对照组为75mg/kg。假处理对照组腹腔注射同等浓度的病毒悬液，灌胃生理盐水。
2、实验结果见表4。
表4不同分组动物死亡率统计表
实施例6、不同时间各个分组取血后分离血清检测指标1、病毒在Vero细胞水平的TCID50值(1)、实验方法测定TCID50值的方法与病毒繁殖抑制实验相同。
(2)、实验结果各组TCID50值的测定结果如表5表5各组TCID50值的测定结果
在这项测定指标中，如果TCID50值能够在使用药物以后下降1个对数值以上，即可以认为有效。从上表的结果能够判定SGL-1具有抗病毒的作用。
2、血清中心肌酶含量测定(1)试验材料仪器为SABA18型生化分析仪，试剂购买自首都医科大学临床医学科技中心；
(2)试验方法按照生化分析仪及试剂盒说明书进行试验。
(3)试验结果心肌酶CK-MB和LDH含量在3～7天均有增加，但是增幅不同，具体统计数据如下表(表6和表7)表6CK-MB统计数据
表7LDH统计数据
通过实验结果，可以发现CK-MB和LDH在血清中的含量随着感染天数的增加，平均值也逐渐上升，但是其增长幅度均小于假处理组，而且3--7天之间均存在显著的统计学意义。
实施例7、SGL-1对病毒导致的凋亡存在抑制作用(一)、原位末端标记法(Tunnel)检测凋亡的发生情况1、实验方法取出六孔板于镜下观察，各组间形态出现明显差异；PBS洗三次，以去除死细胞及培养基血清；以冰冷新配制的4％多聚甲醛固定细胞30min；PBS洗三次；(可以用70、75、80、90、95、100％梯度酒精脱水，存于-20℃)；加入0.3％H2O甲醇溶液，室温放置30min，以阻断内源性过氧化物酶；PBS洗三次，加入0.1％TRITON x-100，冰浴2min；PBS洗三次，加入40ul TUNNEL反应混合液于每个盖玻片上；37℃孵浴60min；加入50ul试剂3(转化型POD)，37℃孵浴30min；PBS洗三次加入50-100ul DAB显影液，室温放置＜30min；PBS洗三次，空干，封片。
2、实验结果(图5)光学显微镜下观察发生深染的凋亡细胞A(4×10)、B(10×10)；CSGL-1干预以后，凋亡发生情况明显减少；D正常细胞对照。图中箭头所示为明显的凋亡细胞。
从Tunnel结果，能够明显观察到SGL-1对CVB引起凋亡有明显抑制作用。
(二)、流式细胞观察SGL-1对凋亡的抑制作用(图6，表8)如图6所示，A100TCID50病毒感染细胞对照；B100 TCID50病毒+SGL-1；CSGL-1药物对照；D正常细胞对照。
表8不同浓度病毒对细胞周期的影响及凋亡发生的比率
(三)、通过Annexin V-FITC/PI染色观察SGL-1对凋亡的抑制作用1、实验方法将Hela细胞接种于6孔板，调整盖玻片上的细胞数为5×105。24小时后分组为病毒感染对照组和药物+病毒实验组；12-18小时后，弃上清，用冷PBS洗三次；分别加Binding Buffer 200μl；加10μl异硫氰酸荧光素(FITC)标记的Annexin-V(Annexin-V-FITC)，轻轻混匀后，避光室温反应15分钟；再加入BindingBuffer 300ul，在1小时内应用激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)检测；检测前5分钟加入2.5μlPI染料；检测时将盖玻片取出，细胞向下置于载玻片上，检测时完成一个样本再制作下一个，以免涂片变干燥影响观察。
2、实验结果如图7所示，感染CVB3的Hela细胞经Annexin V-FITC/PI染色后可观察到早期凋亡及晚期凋亡现象。图中细胞膜荧光绿染以及细胞核荧光红染的细胞为发生凋亡的细胞，正常细胞没有任何荧光。图F即为受SGL-1保护而没有发生凋亡的细胞。
实施例8、SGL-1对心肌细胞表面受体表达的影响1、实验方法(1)、用TRIZOL提取细胞总RNA倾去细胞培养瓶中上清，并尽量吸除干净；加入TRIZOL1.5ml，吹吸使细胞溶于TRIZOL中；取0.5ml上述液体于1.5ml离心管中；加0.125ml氯仿，震荡混匀15min，室温放置3min；离心4℃，12000rpm，15min；取上清，并转移入另一只离心管；加入0.25ml异丙醇，室温放置10min；离心4℃，12000rpm，5min；去上清，加入1ml75％乙醇；离心4℃，7500rpm，5min。弃上清，室温干燥10min。加DEPC水溶解RNA。电泳鉴定RNA条带。
(2)、 表9、反应体系
(3) 表10、循环参数
2、实验结果见图8。
柯萨奇病毒在心肌细胞的表面受体主要是CAR，这种受体在正常情况下表达水平非常低。当CVB3病毒感染心肌细胞以后，CAR的表达水平明显上升，促进了病毒与心肌细胞之间的黏附。如果药物能够下调CAR的表达，将减少病毒的入侵。本实验通过RT-PCR方法充分说明SGL-1具有下调CAR表达的作用，进而证明SGL-1能够在病毒的穿入阶段发挥作用。
实施例9、SGL-1对病毒蛋白酶活性的影响1、实验方法(1)、采用Western blot方法检测心肌细胞dystrophin的断裂及合成情况，从而确定病毒protease 2A以及protease 3C的活性。
Western blot方法采用常规实验操作方法心肌细胞裂解→蛋白质的电转移→封闭→靶蛋白与第一抗体反应→与第二抗体反应→显色。
(2)、直接检测病毒蛋白酶protease 2A活性培养原代乳鼠心肌细胞，分组为病毒感染对照组、正常细胞对照组和病毒+药物实验组。当观察到病毒对照组与正常细胞对照组之间出现形态学改变时，终止细胞培养，取感染对照组细胞和病毒+药物实验组细胞，进行病毒蛋白酶protease 2A活性检测，实验方法及操作步骤由合作实验室完成。
2、实验结果(1)、Western blot实验结果，见图9。
心肌细胞的dystrophin蛋白具有一个与病毒衣壳蛋白相似的蛋白酶切割位点，当病毒感染进入心肌细胞以后，能够将dystrophin蛋白切割为220kDa的蛋白片段。通过以上实验发现，加入药物以后，dystrophin没有发现被切割的现象，从而证实SGL-1对病毒的蛋白酶具有抑制作用。
(2)、病毒蛋白酶protease 2A活性分析
表11蛋白酶活性分析
通过酶活性分析，能够明显观察到当SGL-1干预以后，病毒的蛋白酶KCAT/Km指数明显降低，说明SGL-1对病毒的蛋白酶具有抑制作用。实验选用的CVB3Nancy株具有普遍性，而且是病毒性心肌炎的主要致病毒株。其翻译产生的蛋白酶在小核糖核酸病毒科中具有很高的同源性，故而在本研究中以柯萨奇病毒作为代表进行研究。
本发明提供了一种抗病毒单体化合物，其来源充足，提取工艺简单。经一系列的抗病毒实验，证明这种单体对CVB3病毒具有明显的抗病毒作用。病毒在完成复制和翻译过程之后，必须要进行包装，才能够成为完整的病毒颗粒，而病毒翻译产生的蛋白酶在小核糖核酸病毒科(包括肠道病毒、鼻病毒、脊髓灰质炎病毒、甲型肝炎病毒)中具有极高的同源性，并与真核细胞的蛋白酶差异明显。所以本发明单体对小核糖核酸病毒科在侵入细胞以后，均具有抑制病毒成熟的作用，从而发挥抑制病毒性疾病进展的作用。
权利要求
1.一种黄酮单体在制备抗病毒药物中的应用，其特征在于该黄酮单体具有以下化学结构式
2.根据权利要求1所述的一种黄酮单体在制备抗病毒药物中的应用，其特征在于所述应用是指该黄酮单体用于制备抗病毒的原料药。
3.根据权利要求1所述的一种黄酮单体在制备抗病毒药物中的应用，其特征在于所述应用是指该黄酮单体添加药剂学可接受的辅料或载体，用于制备抗病毒的制剂。
4.根据权利要求3所述的一种黄酮单体在制备抗病毒药物中的应用，其特征在于所述制剂包括消化道给药制剂、注射剂、透皮吸收给药制剂、粘膜给药制剂和呼吸道给药制剂。
5.根据权利要求1至4中任何一项所述的一种黄酮单体在制备抗病毒药物中的应用，其特征在于所述病毒为小核糖核酸病毒科病毒，包括柯萨奇病毒、肠道病毒、鼻病毒、脊髓灰质炎病毒和甲型肝炎病毒。
6.根据权利要求5所述的一种黄酮单体在制备抗病毒药物中的应用，其特征在于所述病毒为柯萨奇病毒。
7.根据权利要求6所述的一种黄酮单体在制备抗病毒药物中的应用，其特征在于所述柯萨奇病毒为CVB病毒3型Nancy株。
全文摘要
本发明公开了一种黄酮单体在制备抗病毒药物中的应用，该黄酮单体具有以下化学结构式，属于医药领域。本发明的有益效果是本发明提供了一种抗病毒单体化合物，经过一系列的抗病毒实验，证明这种单体对病毒引起的凋亡以及病毒翻译过程中的病毒蛋白酶具有抑制作用，提示该单体为一广谱抗病毒药物；该单体对以柯萨奇病毒为代表的小核糖核酸病毒具有明显的抗病毒作用，为人们治愈病毒性心肌炎提供了新的选择方案。
文档编号A61P31/00GK1663562SQ20041000476
公开日2005年9月7日 申请日期2004年3月5日 优先权日2004年3月5日
发明者惠汝太, 宋晓东, 汪汉卿, 陈敬洲, 甄一松, 马平 申请人:惠汝太