高纯度蛇毒纤溶酶的制备方法及其药物制剂的制作方法

专利名称：高纯度蛇毒纤溶酶的制备方法及其药物制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及高纯度的蛇毒纤溶酶的制备方法，更具体地说是涉及采用免疫层析法制备高纯度的蛇毒纤溶酶。
本发明还涉及用本发明方法制备的蛇毒纤溶酶及其制剂。
背景技术：
在当前人类疾病中，心血管疾病的发生率和死亡率均占首位，而其中血栓栓塞性疾病可使患者生命质量下降或死亡。血栓栓塞性疾病主要包括三种类型导致心肌梗塞的冠状动脉疾病，引起中风的脑血管疾病和易于引起肺栓塞的静脉血栓疾病。这些疾病都是由关键部位的血管里的血栓导致重要器官缺血引起的。溶栓性药物是治疗这些疾病的首选药物。
溶栓药经过几十年的的研究，大致可以分为三个阶段。
第一代PgA(纤维蛋白溶酶原激活剂)主要由链激酶SK和尿激酶u-PA组成。第一代PgA虽然具有一定的溶栓效应，但存在着很多缺陷。表现为1)在体内半衰期很短，需要连续注射方可达到治疗目的。因此，具有较多副作用，如使用u-PA进行治疗时，几乎无一例外地导致了抗凝状态的形成。
2)注入体内后易产生抗体，成为药物本身的抑制剂，限制了溶栓作用的发挥，甚至导致出血综合症和促发SK介导的血小板凝集。
3)纤维蛋白选择性差，除激活血栓中的Pg(纤维蛋白原)外，还同样激活血液中的Pg，从而激活了纤溶系统，使得凝血系统严重受损。
第二代PgA以组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)、单链尿激酶型纤溶酶原激活剂(scu-PA)和甲酰化纤溶酶原一链激酶复合物(APSAC)为代表。与第一代PgA显著不同的是，第二代PgA具有很高的纤维蛋白选择性。因此，它在血栓中的局部纤溶作用强。但第二代PgA仍然存在着一些缺点和不足1)t-PA和scu-PA在体内的半衰期很短，只有连续注射方可达到治疗目的。为尽快溶解冠状动脉血栓所需的剂量，足以引起Pg及Fg的大量损耗，从而导致出血倾向。
2)临床观察，治疗后疏通的血管易出现再次堵塞。
3)APSAC半衰期虽较长，但如果给药太快会引起低血压和系统性纤溶系统的激活。
近年来，在上述溶栓剂的基础上，针对其不足加以改进，用分子生物学和化学方法研制了一些PgA的突变体、嵌合体、单抗和PgA的结合体，取得了一定的效果，但价格昂贵，而溶栓治疗中仍会碰到以下一些问题1)20％-30％的急性心肌梗塞病人对溶栓药物无反应，且对于陈旧性血栓的治疗效果均不理想。
2)5％的病人出现急性再堵塞。
3)死亡率仍然很高，达10％。
4)颅内出血的发生率为1％。
5)对于半衰期短的溶栓剂，治疗时需要频繁给药，使治疗成本较高。
第三代溶栓剂——纤溶酶二十世纪五十年代中期Didisheim和Lewis报道了在许多蛇毒中发现纤溶活性，第一次提出蛇毒纤维蛋白溶解酶对人血清蛋白酶抑制因子是不敏感的理论，为用纯化蛇毒酶来溶解病理条件下的人血凝块奠定基础。
在人体内注射纤溶酶后，它专一地裂解纤维蛋白Aα-链的lys113-leu114键，从而起到溶栓的作用，试验证明，纤溶酶在体外或体内都有良好的溶栓效果。同时，在临床上，至今未发现其有出血现象，这是因为纤溶酶具有高度的底物专一性。应用胰岛素氧化β链和人工合成的八肽查明了决定这些酶对lys113-leu114键专一裂解的原因。结果表明，与其它酶一样，决定其裂解位点的是序列决定性，而非键决定性。至少与lys113-leu114周围的八个氨基酸顺序有关。

发明内容
本发明的一个目的在于提供一种高纯度蛇毒纤溶酶的制备方法，利用免疫亲和层析法制备得到了高纯度的蛇毒纤溶酶。
本发明的另一目的在于提供使用本发明方法制备的高纯度蛇毒纤溶酶。
本发明的再一目的在于提供含有本发明的高纯度蛇毒纤溶酶的药物制剂。
根据本发明的一方面，制备高纯度的蛇毒纤溶酶的方法，包括以下的步骤1)含有蛇毒纤溶酶的蛇毒原料初步纯化、分离，获得主要成分为蛇毒纤溶酶的活性组分1；2)将所述的活性组分1进一步纯化，得到活性组分2；3)将所述的活性组分2作为抗原，制备抗蛇毒纤溶酶特异性抗体；4)将所述制备得到的蛇毒纤溶酶特异性抗体与亲和层析载体结合，制备抗体亲和层析柱；5)以所述的抗体亲和层析柱纯化步骤1)的活性组份1，获得高纯度蛇毒纤溶酶。
本发明的方法中，将抗原抗体反应与亲和层析技术结合，从含蛇毒纤溶酶的原料蛇毒中将蛇毒纤溶酶分离纯化，制备得到纯度高的蛇毒纤溶酶。该方法中，首先需制备获得针对蛇毒纤溶酶的特异性抗体，再将该特异性抗体与适宜的亲和层析载体结合，制备成抗体亲和层析柱，利用该抗体亲和层析柱可对原料进行纯化，制备高纯度的蛇毒纤溶酶。
在本发明方法中，针对蛇毒纤溶酶的特异性抗体可以采用多种方法制备，在本发明的一个具体实施方案中，首先以蛇毒纤溶酶为抗原免疫小鼠，获得含抗蛇毒纤溶酶抗体的小鼠抗血清，同时将该蛇毒纤溶酶与亲和层析载体结合，制备成抗原亲和层析柱，将小鼠抗血清上抗原亲和层析柱，利用结合于亲和层析载体上的抗原蛋白与血清中的抗体特异结合，获得纯化的特异性抗体。此外，也可以采用单克隆抗体技术来制备本发明的蛇毒纤溶酶的特异性抗体，例如，将经蛇毒纤溶酶免疫后的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合，获得杂交瘤细胞，筛选分泌蛇毒纤溶酶抗体的杂交瘤细胞建株，由此可获得稳定的蛇毒纤溶酶的特异性抗体。
将制备获得的抗蛇毒纤溶酶特异性抗体与适宜的亲和层析载体结合，制备成抗体亲和层析柱，使用该抗体亲和层析柱即可对原料进行分离纯化，制备高纯度的蛇毒纤溶酶。
在本发明方法中，为了获得高纯度的蛇毒纤溶酶，可以采用对原料进行分步纯化的方法，例如，在本发明的一个具体实施方案中，首先将原料蛇毒进行透析截留一定分子量的成分，然后将获得的样品通过离子交换层析进行初步纯化，获得活性组分1，该活性组分1再经本发明的抗体亲和层析柱纯化，即可获得高纯度的蛇毒纤溶酶。
用作抗原的蛇毒纤溶酶最好使用纯度较高的蛇毒纤溶酶，在本发明方法中，该用作抗原的蛇毒纤溶酶可以通过将上述初步纯化的活性组分1进一步经过制备型高效液相色谱的分离而获得，这样获得的蛇毒纤溶酶(活性组分2)可以用作免疫小鼠的抗原和制备抗原亲和层析柱的抗原使用。
本发明方法中用作亲和层析柱的载体的材料可以使用各种适宜的载体材料，优选的载体材料可以使用多糖基质，例如Sepharose 4B琼脂糖凝胶、二乙氨基葡聚糖凝胶或羧甲基葡聚糖凝胶，在使用前可以先将载体活化，本发明的实施方案中，使用溴化氰作为活化剂，将制备得到的抗原或特异性抗体偶联到活化了的载体上，即可制备抗原亲和层析柱与抗体亲和层析柱。
按照本发明的另一方面，提供通过本发明方法制备的高纯度蛇毒纤溶酶，其具有以下的特性比活性为每毫克蛋白5000单位以上；高效液相色谱法分析，单组分图谱，主峰面积大于95％，保留时间为8.3±0.5min；SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳显示一条带，分子量为31000±2000道尔顿；根据本发明的再一方面，提供本发明高纯度的蛇毒纤溶酶药物制剂，按照药品管理办法和药品生产质量管理规范的要求，由蛇毒纤溶酶为药效成份，添加药学上可接受的药用辅料制备得到适于临床应用各种药物制剂，这些制剂的剂型包括但不限于纤溶酶注射液、注射用纤溶酶、静脉注射用纤溶酶注射液、冻干静脉注射用纤溶酶等。
本发明将传统的提纯工艺和免疫亲和层析技术相结合，从蝮蛇蛇毒中纯化出一种纤溶酶。并利用该原料药做成可供肌注、静脉注射及静脉输液等多种途径给药的制剂。该项技术的特点是酶的专一性强，经高效液相色谱检查为单一组分，在SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳上显示一条带，经临床实验证明，该产品在溶栓治疗中有着独特的疗效，克服了第一代和第二代PgA存在的缺点和不足，是溶栓药物的一个新的里程碑。表现为1)可以直接作用于形成血栓的纤维蛋白，将其降解，并对陈旧性血栓有独特的疗效。
2)在体内可降解血浆纤维蛋白原，降低血液粘度，拮抗凝血酶，从而降低高血压、动脉粥样硬化、缺血性心脏病的发病率。
3)在体内的半衰期较长，实验证明，给药24小时取血，血液学指标(如血浆纤维蛋白原含量、血浆粘度等)仍可明显改变。
4)对体内纤溶系统无明显激活作用，因此不具有出血倾向，避免了并发症的发生。
5)由于该品纯度高，因此毒副作用大大降低，使用更安全。
6)有很强的底物专一性，作用迅速，疗效好。
综上所述，本发明提供的蛇毒纤溶酶是集选择性适度，半衰期长，抗抑制，效力高，无毒副作用于一体的理想溶栓剂。
附图的简要说明

图1为本发明方法中制备活性组分1的阴离子交换柱层析紫外吸收图谱；图2为本发明方法中抗蛇毒纤溶酶特异性抗体纯化过程记录仪图谱；图3为本发明方法中制备高纯度蛇毒纤溶酶的亲和层析流程记录仪图谱；图4为本发明高纯度蛇毒纤溶酶SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱；图中泳道1、2、4、5、6、7、9、10为蛇毒纤溶酶；其中，1、4、9为纤溶酶样品0403122、5、10为纤溶酶样品0403156、7为纤溶酶样品040317泳道3、8为低分子量标准蛋白(其组成为兔磷酸化酶B 97400，牛血清白蛋白66200，兔激动蛋白43000，牛碳酸酐酶31000，胰蛋白酶抑制剂20100，鸡蛋清溶菌酶14400)图5为本发明制备的高纯度蛇毒纤溶酶高效液相色谱图谱；图6为本发明制备的另一批次的高纯度蛇毒纤溶酶高效液相色谱图谱；图7为本发明制备的又一批次的高纯度蛇毒纤溶酶高效液相色谱图谱。
发明的
具体实施例方式
高纯度的蛇毒纤溶酶的制备1.蛇毒粗品的处理准确称取蝮蛇蛇毒(辽宁清源蛇厂生产)，用0.02mol/L pH7.8的Tris-HCl缓中液将其充溶解，然后以4000r/min离心20分钟取上清，沉淀用少量的缓冲液再次离心取上清，合并上清液装透析袋(截留分子量为10000以上的组分)对0.02mol/L pH7.8的Tris-HCl缓中液透析12小时备用。
2.离子交换层析纯化透析过的样品以6.0ml/min的流速上阴离子交换柱(DEAE-Sepharose)，然后用0.02mol/L pH7.8的Tris-HCL缓冲液洗脱未吸附的杂蛋白，透过峰下到基线时，用含0.05mol/L和0.2mol/L氯化钠的0.02mol/L Tris-HCL缓冲液进行梯度洗脱，收集活性峰，制得活性组分1。活性组分1的主要成分为蛇毒纤溶酶，具蛇毒纤溶酶活性，根据SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的主要条带计算的分子量与蛇毒纤溶酶吻合；此流程用280nm紫外检测仪检测，同时用记录仪记录，如图1所示。
3.用作抗原的蛇毒纤溶酶的制备将离子交换层析收集的活性组分1浓缩用截留分子量为10000的透析袋对聚乙二醇浓缩，用制备型高效液相色谱分离，分别收集活性组分，并定性，得纤溶酶(活性组分2)，其具蛇毒纤溶酶活性，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳显示为一条带，计算的分子量与蛇毒纤溶酶标准品吻合；HPLC检测为单一组分，保留时间与蛇毒纤溶酶标准品吻合。
4.抗原亲和层析的制备称2g经溴化氰活化的Sepharose-4B，加300ml 1mol/L的HCL充分搅拌使之膨胀，另取30mg上述活性组分2溶于0.1mol/L Na2CO3(含0.5mol/lNaCL)pH8.3缓冲液中。将上述Sepharose-4B与活性组分2溶液混合，在室温搅拌2h，用0.1mol/L pH8.3Na2CO3(含0.5mol/lNaCL)缓冲液充分洗涤后，再用0.1mol/LTris-HCL缓冲液(pH8.30)再洗一次，加同一缓冲液，于室温搅拌过夜。装柱，制备得到抗原亲和层析柱。
5.小鼠抗血清制备用上述活性组分2(50～500μg/ml)与等体积完全佐剂混合乳化作为刺激物，对7周龄的BALB/c小鼠(中检所实验动物中心)皮下注射免疫，每次0.2ml，每周1次，共免疫4～6次。在采集血亲前3天取0.2ml刺激物小鼠尾静脉注射加强免疫。
6.制备抗蛇毒纤溶酶特异性抗体取上述免疫小鼠血清，将血清样品上抗原亲和层析柱，用结合在凝胶上的抗原蛋白与样品中的抗体特异性结合，纯化得到特异性抗体。具体步骤为用平衡液(0.05MTris-HCL缓冲液，pH＝7.8)平衡抗原亲和层析柱后，将血清样品上抗原亲和层析柱，用平衡液平衡至流出液在蛋白检测仪上绘出稳定的基线后，用洗脱液(0.02MTris-HCL缓冲液，pH＝7.8，含0.5M Nacl，7％Arg)洗脱，收集活性组分，如图2所示。将收集到的活性组分用透析袋(截留分子量为10000，对聚乙二醇浓缩)浓缩后，冷冻干燥，即为抗蛇毒激肽原酶特异性抗体。
7.抗体亲和层析柱的制备以Sepharose 4B琼脂糖凝胶、二乙氨基葡聚糖凝胶或羧甲基葡聚糖凝胶作为亲和层析的载体，用溴化氰活化该载体；取100mg上述制备的特异性抗体溶于20ml硼酸缓冲液中，过滤，滤液加至活化的载体中，在10℃下搅拌反应18小时，次日装柱，用10倍柱体积的pH 10.2硼酸缓冲液以5～6ml/min流速洗涤柱体，收集流出液，然后再依次用5倍柱体积的pH 10.0 0.1mol/L的乙醇胺溶液及0.1mol/L的硼酸缓冲液(pH 8.0)充分洗涤，最后用pH 7.4的0.1mol/L磷酸缓冲液洗涤平衡，即得到抗体亲和层析柱。该柱可重复使用200次以上，用20％的乙醇可长期保存。
8、高纯度蛇毒纤溶酶的制备将上述离子交换层析得到的活性组分1用亲和层析平衡缓冲液(0.05MTris-HCL缓冲液，pH＝7.8，含0.5M Nacl)溶解，上抗体亲和层析柱，用该缓冲液平衡至流出液在蛋白检测仪上绘出稳定的基线后，用含有洗脱剂的亲和层析洗脱液洗脱(0.05MTris-HCL缓冲液，pH＝7.8，含0.5M Nacl，7％Arg)。收集活性峰，如图3所示，并测定效价，冷冻干燥后即为蛇毒纤溶酶原料药。满足高纯度纤溶酶性能评定标准。
实施例1免疫抗体亲和层析柱的制备用高效液相色谱纯化并经定性的蛇毒纤溶酶(活性组分2)100μg/ml与等体积完全佐剂混合乳化作为刺激物，对7周龄的BALB/c小鼠皮下注射免疫，每次0.2ml，每周1次，共免疫5次。在采集血清前3天取0.2ml刺激物小鼠尾静脉注射加强免疫。用抗原亲和层析柱纯化抗体。
用溴化氰活化4B-Sepharose琼脂糖凝胶，把得到的蛇毒纤溶酶抗体偶联到多糖基质上，从而制成免疫亲和层析柱。
实施例2免疫抗体亲和层析柱的制备用高效液相色谱纯化并经定性的蛇毒激肽原酶(活性组分2)200μg/ml与等体积完全佐剂混合乳化作为刺激物，对7周龄的BALB/c小鼠皮下注射免疫，每次0.2ml，每周1次，共免疫5次。在采集血清前3天取0.2ml刺激物小鼠尾静脉注射加强免疫。用抗体亲和层析柱纯化蛇毒纤溶酶抗体。
用溴化氰活化二乙氨基葡聚糖凝胶，把得到的蛇毒激肽原酶抗体偶联到多糖基质上，从而制成免疫亲和层析柱。
实施例3免疫抗体亲和层析柱的制备用高效液相色谱纯化并经定性的蛇毒纤溶酶(活性组分2)400μg/ml与等体积完全佐剂混合乳化作为刺激物，对7周龄的BALB/c小鼠皮下注射免疫，每次0.2ml，每周1次，共免疫5次。在采集血清前前3天取0.2ml刺激物小鼠尾静脉注射加强免疫。用抗体亲和层析柱纯化蛇毒激肽原酶抗体。
用溴化氰活化羧甲基葡聚糖凝胶，把得到的蛇毒激肽原酶抗体偶联到多糖基质上，从而制成免疫亲和层析柱。
实施例4高纯度蛇毒纤溶酶原料药制备准确称取蝮蛇蛇毒15g，用0.02mol/L PH7.8的Tris-HCl缓中液60ml将其溶解提取，然后以4000r/min离心20分钟取上清，沉淀用少量的缓冲液再次离心取上清，合并上清液装透析袋对0.02mol/L PH7.8的Tris-HCl缓中液透析12小时待上样。样品透析完以后以6.0ml/min的流速上阴离子交换柱(DEAE-Sepharose)，上样完毕后用0.02mol/L PH7.8的Tris-HCL缓冲液洗脱未吸附的杂蛋白待透过峰下到基线时，分别用0.02mol/L Tris-HCL含0.05mol/L和0.115mol/L氯化钠的缓冲液进行梯度洗脱收集活性峰(活性组分1)。将上述经离子交换纯化的活性组分1用平衡液(0.05MTris-HCL缓冲液，pH＝7.8，含0.5M Nacl)透析，上抗体亲和层析柱。用亲和层析平衡液平衡，待流出液在蛋白检测仪上绘出稳定的基线后，改用亲和层析洗脱液(0.05MTris-HCL缓冲液，pH＝7.8，含0.5M Nacl，7％Arg)洗脱。收集洗脱峰，测定其酶的活性。
经活性检测，收集到的组分具有很高的纤溶活性，取该组分适当稀释，用高效液相色谱法检测，获得单组分图谱，其保留时间为8.477，用SDS聚丙烯酰胺测定分子量为30800道尔顿。热原、出血毒、神经毒、过敏检查，均符合规定。
实施例5高纯度蛇毒纤溶酶原料药制备准确称取蝮蛇蛇毒30g，用0.02mol/L PH7.8的Tris-HCl缓中液100ml将其溶解提取，然后以4000r/min离心20分钟取上清，沉淀用少量的缓冲液再次离心取上清，合并上清液装透析袋对0.02mol/L PH7.8的Tris-HCl缓中液透析10小时待上样。样品透析完以后以8.0ml/min的流速上阴离子交换柱(DEAE-Sepharose)，上样完毕后用0.02mol/L PH7.8的Tris-HCL缓冲液洗脱未吸附的杂蛋白待透过峰下到基线时，分别用0.02mol/L Tris-HCL含0.05mol/L和0.110mol/L氯化钠的缓冲液进行梯度洗脱收集活性峰(活性组分1)。将上述经离子交换纯化的活性组分1用平衡液(0.05MTris-HCL缓冲液，pH＝7.8，含0.5M Nacl)透析，上抗体亲和层析柱。用亲和层析平衡液平衡，待流出液在蛋白检测仪上绘出稳定的基线后，改用亲和层析洗脱液(0.05MTris-HCL缓冲液，pH＝7.8，含0.5M Nacl，7％Arg)洗脱。收集洗脱峰，测定其酶的活性。
经活性检测，收集到的组分具有很高的纤溶活性，取该组分适当稀释，用高效液相色谱法检测，获得单组分图谱，其保留时间为8.482，用SDS聚丙烯酰胺测定分子量为30500道尔顿。热原、出血毒、神经毒、过敏检查，均符合规定。
实施例6高纯度蛇毒激肽原酶原料药制备准确称取蝮蛇蛇毒20g，用0.02mol/L PH7.8的Tris-HCl缓中液100ml将其溶解提取，然后以4000r/min离心20分钟取上清，沉淀用少量的缓冲液再次离心取上清，合并上清液装透析袋对0.02mol/L PH7.8的Tris-HCl缓中液透析10小时待上样。样品透析完以后以8.0ml/min的流速上阴离子交换柱(DEAE-Sepharose)，上样完毕后用0.02mol/L PH7.8的Tris-HCL缓冲液洗脱未吸附的杂蛋白待透过峰下到基线时，分别用0.02mol/L Tris-HCL含0.05mol/L和0.115mol/L氯化钠的缓冲液进行梯度洗脱收集活性峰(活性组分1)。将上述经离子交换纯化的活性组分1用平衡液透析，上抗体亲和层析柱。用亲和层析平衡液(0.05MTris-HCL缓冲液，pH＝7.8，含0.5M Nacl)平衡，待流出液在蛋白检测仪上绘出稳定的基线后，改用亲和层析洗脱液(0.05MTris-HCL缓冲液，pH＝7.8，含0.5M Nacl，7％Arg)洗脱，收集洗脱峰，测定其酶的活性。
经活性检测，收集到的组分具有很高的纤溶活性，取该组分适当稀释，用高效液相色谱法检测，获得单组分图谱，其保留时间为8.498，用SDS聚丙烯酰胺测定分子量为30150道尔顿。
热原、出血毒、神经毒、过敏检查，均符合规定。
高纯度蛇毒纤溶酶的性能评定1.比活力的测定(1)试剂的配制三羟甲基氨基甲烷缓冲液(PH7.8)取三羟甲基氨基甲烷2.42g，氯化钠4.06g，加水400ml溶解，用4mol/l盐酸溶液调ph至7.8，加水至500ml。
实验缓冲液 取三羟基甲基氨基甲烷缓冲液(PH7.8)、0.7％氯化钙溶液和0.9％氯化钠溶液以1∶2∶4体积混匀即得。
凝血酶溶液 取凝血酶(中国药品生物制品检定所)，加三羟基甲基氨基甲烷缓冲液(PH7.8)溶解并稀释至每1ml中含5单位的溶液。
纤维蛋白原溶液取纤维蛋白原(中国药品生物制品检定所)，加三羟基甲基氨基甲烷缓冲液(PH7.8)溶解并定量稀释至每1ml中含可凝固蛋白约5mg的溶液。
(2)供试品溶液的制备取供试品(依前述实施例4～6制备的高纯度蛇毒纤溶酶，批号为040312、040315和040317，下同)适量，加三羟基甲基氨基甲烷缓冲液(PH7.8)溶解并定量稀释至每1ml中含15单位的溶液。
(3)测定法 取离心管，各精密加入实验缓冲液0.2ml，供试品溶液0.1ml，置37℃水浴预热2分钟，加凝血酶溶液0.1ml，纤维蛋白原溶液0.1ml，立即振摇数秒，混匀，置37℃水浴准确反应30分钟，置冰水浴中终止反应，离心(14000转/分钟)4分钟，同法操作3次，小心将液体吸干，在残留物中精密加入0.2mol/l氢氧化钠溶液3ml，水浴加热8分钟，待纤维蛋白完全溶解，冷却后，以0.2mol/l氢氧化钠溶液为空白，照分光光度法(中国药典2000年版二部附录IVA)，在280nm波长处测定吸收度A。同时以三羟甲基氨基甲烷缓冲液(PH7.8)0.1ml代替供试品溶液同法操作测得As，作为空白对照。按下式计算供试品的活力单位每1mg的供试品活力(单位)(As-A)×Ws×N/(As×0.1×30×W)式中As-空白对照的吸收度A-供试品溶液的吸收度Ws-纤维蛋白原溶液0.1mg中含可凝固蛋白的微克数N-供试品稀释倍数
0.1-供试品溶液体积，ml30-反应时间，分钟W-供试品取样量，mg纤溶酶活力单位定义在上述条件下，1分钟溶解1微克纤维蛋白(可凝固蛋白)为一个纤溶酶活力单位。
蛋白含量 取供试品适量，加水制成每1ml中约含0.15mg蛋白的溶液，作为供试品溶液，精密量取供试品溶液1.0ml，照“福林酚测定法”(见注)测定，计算每1mg供试品中的蛋白量(mg)。
注福林酚测定法试剂碱性铜试液取氢氧化钠10g，硫酸钠50g，加水400ml使其溶解，作为甲液；取酒石酸钾0.5g，加水50ml使其溶解，另取硫酸铜0.25g加水30ml使其溶解，将两液混合作为乙液。
临用前，合并甲、乙两液，并加水至500ml。
对照品溶液的制备取牛血清白蛋白对照品，加水制成每1ml中含0.3mg的溶液。
供试品溶液的制备 取供试品适量，精密称定，加水制成每1ml中约含0.15mg蛋白的溶液。
标准曲线的制备精密量取对照品溶液0.0ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml，分别置具塞试管中，各加水至1.0ml。再分别加碱性铜试液1.0ml，摇匀；各加入福林试液(中国药典2000年版二部附录XVB，取福林试液贮备液，按1∶15用水稀释)4.0ml，盖塞，立即混匀。置55℃水浴中准确反应5min，置冷水浴中10min，照分光光度法(中国药典2000年版二部附录IV B)以0号管为空白，在650nm波长处测定吸光度。以对照品溶液浓度与其相对应的吸收度A对照进行直线回归，求出回归方程。
测定法 精密量取供试品溶液1.0ml，照标准曲线制备项下的方法，自“加入碱性铜试液”起操作，测得其样品的吸光度A样品，从回归方程计算蛋白的含量，并乘以稀释倍数，即得。
比活 按下式计算
2.分子量测定取本品，照电泳法(中国药典2000年版二部附录VF第五法SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法)测定。
标准蛋白溶液的制备取分子量测定用标准蛋白(分子量范围1～10万)适量，加供试品(依前述实施例4～6制备的高纯度蛇毒纤溶酶，下同)缓冲液(取水4.8ml，三羟甲基氨基甲烷缓冲液pH6.8 1.2ml，甘油1.0ml，10％十二烷基硫酸钠2.0ml，0.5％溴酚蓝溶液0.5ml，β-巯基乙醇0.5ml，混匀)制成每1ml中含1μg蛋白的溶液。临用前置沸水浴中5min，冷却。
供试品溶液的制备 取供试品适量(按蛋白含量计算)，加供试品缓冲液制成每1μl中含2μg蛋白的溶液，临用前置沸水浴中5min，冷却。
测定法 照上述电泳法试验，采用垂直板电泳，每孔加5～10μl供试品溶液或标准蛋白溶液，考马斯亮蓝染色。以标准蛋白分子量的对数为纵坐标，以迁移率为横坐标进行直线回归，由回归方程计算供试品的分子量。
测定结果测定为一条带，分子量应为31000±2000道尔顿，结果见图4。
3.纯度检查(1)如上在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳上应显示一条带(详见分子量测定)。
(2)照高效液相色谱法测定(中国药典2000年版二部附录VI H)，供试品应为单一组分。
色谱条件与系统适用性试验仪器型号 SHIMADZU(岛津)SPD-10A vp检测器SCL-10A vp控制器LC-AT vp输液泵FCV-10AL vp溶剂切换器PGU-14A脱气机Class-vp6.10色谱工作站TSK-2000(300×7.5mm，5μm)凝胶色谱柱；流动相0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.8)；检测波长280nm；流速1.0ml/min；温度25℃；理论板数按纤溶酶峰计算应不小于3000。
测定法取供试品(依前述实施例4～6制备的高纯度蛇毒纤溶酶)用流动相制成每1ml含100单位的溶液，取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，按面积归一化法计算，主峰面积应大于95％，保留时间应为8.3±0.5min；主峰之前不得有高分子量杂质，三个批次样品的HPLC测定结果见图5～7。
4.热原取供试品(依前述实施例4～6制备的高纯度蛇毒纤溶酶，下同)，用氯化钠注射液制成每1ml中含2单位的溶液，依法检查(中国药典2000年版二部附录XI D)，按家免体重每1kg注射10ml，应符合规定。
5.出血毒取供试品，加氯化钠注射液制成每1ml含4单位的溶液作为供试品溶液，取体重18～22g的小白鼠5只，背部皮下注射供试品溶液0.1ml，注射后24小时处死动物，剥皮观察，小鼠背部不得有出血现象。
6.神经毒取供试品，加氯化钠注射液制成每1ml中含100单位的溶液，作为供试品溶液，取体重300～500g的鸽3只，剂量按体重每1kg注射液注射供试品溶液0.5ml，静脉给药，观察24小时，动物不得出现抽搐、死亡，如3只鸽中有一只出现抽搐或死亡，应令取鸽5只复试，均不得出现死亡。
7.过敏试验 取供试品适量，用氯化钠注射液制成每1ml中含2单位的供试品溶液作为致敏液与攻击液。
取体重250-350g豚鼠6只，间日腹腔注射供试品溶液0.5ml，连续3次。然后将动物分成两组，每组3只，分别在第一次注射后第14日及第21曰静脉注射供试品溶液1.0ml进行攻击。仔细观察注射后15min内豚鼠的反应，均不得出现过敏性反应。如有竖毛、呼吸困难、喷嚏、干呕或咳嗽3声等现象中的两种或两种以上者；或啰音、抽搐、虚脱或死亡现象之一者，应判为阳性。三个批次样品的检定结果列表如下
由检定结果可以得出结论运用免疫亲和层析技术，从蛇毒中提取的纤溶酶纯度高，获得的产品比活高，达到每毫克蛋白5000单位以上，经HPLC检查为单一组分，在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳上显示一条带，分子量测定为29～33KD不含杂质，使用安全，能达到静脉给药的要求。
含高纯度蛇毒纤溶酶的药物制剂实施例7注射用纤溶酶与冻干静脉注射用纤溶酶制剂首先，在局部百级洁净区内按配制处方将纤溶酶原料药(按照本发明前述实施例制备，并经各项检测合格，下同)与白蛋白、氯化钠、右旋糖酐等辅料准确称量在配液容器内；加注射用水充分溶解或稀释，使磷酸盐的浓度为0.03mol/L，氯化钠浓度为0.9％，右旋糖苷浓度为3％，搅拌混匀后，得到制剂中间体；除菌过滤，其中过滤前后应对除菌过滤系统进行完整性测试。然后，将过滤后的中间体按装量装入抗生素瓶，在分装过程中应进行至少4次装量检查，保证每一只瓶内装入的药量准确。最后，将装入药品的抗生素瓶码在冻干箱各层的隔板上，按照品种冻干曲线进行速冻至零下20～30℃，维持8小时；然后抽真空，在真空状态下缓慢升温至35～40℃，保持一定时间，再降至室温后取出。压塞、轧盖得成品。经过成品质量检验合格后，进行包装，入库。
实施例8纤溶酶注射液与静脉注射用纤溶酶制剂首先，在局部百级洁净区内按配制处方将蚓激酶原料药与白蛋白、氯化钠等辅料准确称量在配液容器内；加注射用水充分溶解或稀释，使磷酸盐的浓度为0.03mol/L，氯化钠浓度为0.9％，右旋糖苷浓度为3％，搅拌混匀后，得到制剂中间体；除菌过滤，其中过滤前后应对除菌过滤系统进行完整性测试。然后，将过滤后的中间体按装量装入抗生素瓶同时压塞、轧盖即得成品，在分装过程中应进行至少4次装量检查，保证每一只瓶内装入的药量准确。最后，经过成品质量检验合格后，进行包装，入成品库存放。
通过以上各实施例可见，本发明的方法从蛇毒原料中制备得到了高纯度的蛇毒纤溶酶，以该高纯度的蛇毒纤溶酶为原料，与各种药学上可接受的载体以及赋形剂等辅料配合，可制备得到适于临床应用的药物制剂。
以上对本发明的详细描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变和变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求所定义的范围。
权利要求
1.制备高纯度蛇毒纤溶酶的方法，包括下述步骤1)将含蛇毒纤溶酶的蛇毒原料初步纯化、分离获得主要成分为蛇毒纤溶酶的活性组分1；2)所述活性组分1进一步纯化获得活性组分2；3)将活性组分2作为抗原，制备抗蛇毒纤溶酶特异性抗体；4)将所述制备得到的抗蛇毒纤溶酶特异性抗体与亲和层析载体结合，制备抗体亲和层析柱；5)用所述抗体亲和层析柱分离纯化步骤1)中的活性组分1，获得高纯度蛇毒纤溶酶。
2.权利要求1所述的方法，其特征在于步骤3)中所述制备抗蛇毒纤溶酶特异性抗体包括下述步骤3a)以所述活性组分2作为抗原，免疫小鼠，制备抗血清；3b)将所述活性组分2与亲和层析载体结合，制备抗原亲和层析柱；3c)将所述抗血清上抗原亲和层析柱，分离得到抗蛇毒纤溶酶特异性抗体。
3.权利要求1所述的方法，其特征在于步骤3)中所述制备抗蛇毒纤溶酶特异性抗体包括下述步骤3i)以所述活性组分2作为抗原，免疫小鼠，制备免疫小鼠脾细胞；3ii)将所述免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，制备融合的杂交瘤细胞；3iii)筛选表达抗蛇毒纤溶酶抗体的杂交瘤细胞，建立细胞株；3iv)培养所述细胞株获得所述抗蛇毒纤溶酶特异性抗体。
4.权利要求1、2或3所述方法，其特征在于步骤1)所述蛇毒原料初步纯化、分离包括下述步骤1a)将蛇毒原料经透析，截留分子量10000以上部分；1b)将上述截留部分经DEAE-Sepharose离子交换柱吸附，以0.02mol/LpH7.8的Tris-HCl缓冲液洗脱未吸附的杂蛋白后，分别用0.02mol/L的Tris-HCl含0.05mol/L和0.115mol/L氯化钠的缓冲液进行梯度洗脱，收集活性峰，制备活性组分1。
5.权利要求1、2或3所述方法，其特征在于所述亲和层析载体为Sepharose4B琼脂糖凝胶、二乙氨基葡聚糖凝胶或羧甲基葡聚糖凝胶。
6.权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于所述步骤2)中进一步纯化活性组分1的方法为将活性组分1经制备型高效液相色谱分离，制备蛇毒纤溶酶，即为活性组分2。
7.权利要求1方法制各的高纯度蛇毒纤溶酶。
8.权利要求7所述的高纯度蛇毒纤溶酶，其特征在于所述高纯度蛇毒激肽原酶具有以下特性比活性为每毫克蛋白5000单位以上；高效液相色谱法检测，单组分图谱，主峰面积大于95％，保留时间为8.3±0.5min；SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳上显示一条带，分子量为31000±2000道尔顿；
9.一种药物制剂，含有权利要求7所述高纯度蛇毒纤溶酶以及药学上可接受的药用辅料。
10.权利要求9所述的药物制剂，其特征在于所述药物制剂为静脉给药剂型。
全文摘要
本发明涉及制备高纯度蛇毒纤溶酶的方法，将抗原抗体反应与亲和层析技术结合，从含蛇毒纤溶酶的原料蛇毒中将蛇毒纤溶酶分离纯化，制备得到纯度高的蛇毒纤溶酶。本发明还涉及通过本发明方法制备的高纯度蛇毒纤溶酶及其药物制剂，获得的产品是纯度高、集选择性适度，半衰期长，抗抑制，效力高，无毒副作用于一体的理想溶栓剂。
文档编号A61K38/48GK1737133SQ20041000943
公开日2006年2月22日 申请日期2004年8月16日 优先权日2004年8月16日
发明者马骉, 魏化伟, 宋梦薇 申请人:北京赛生药业有限公司