专利名称：一种海藻抗氧化活性成分的制备方法
技术领域：
本发明一种海藻抗氧化活性成分的制备方法，属于海洋生物技术，用于研制开发医药保健品和功能食品的基料。
二技术背景海洋生物活性物质结构新颖、功能独特是新药研究开发和现代医药保健品开发的当今世界科学研究的活跃领域。
从对海洋藻类生物活性物质研究取得的许多成果来看，海洋药物在实现这一伟大目标具有重要的潜力和优势。利用海洋生物活性物质开发独特的功能食品，这些是从陆生生物体内难以发现的，如海洋中的EPA，DHA在陆生生物中就很少有。当前癌症、心血管病、艾滋病等各种免疫性疾病及流行性疾病对人类的生存构成很大威胁，现存的陆生天然药物及化学合成药物的抗癌、抗病毒、抗真菌及免疫调节作用的效果不理想，且副作用很多，甚至导致死亡。海洋是一个蕴藏许多药理活性物质的宝库。开发有效的保健品及功能食品，可以减少社会巨大的医药费用，可以通过食品预防疾病。
海洋生物中含有丰富的抗氧化成分，有显著的抗氧化作用。
海洋生物活性物质研究过程中，分离提取是最关键的步骤之一。海洋生物种类繁多，但生物活性物质含量低微，经典的沉淀、结晶、吸附、萃取、离子交换技术等提取技术对于海洋活性物质的提取和纯化存在较大的困难和局限性。海洋生物活性物质的提取大都采用有机溶剂萃取的方法，存在着溶剂回收困难，工序繁琐，对环境污染严重等缺点。
超临界液体技术已经成功地用来从海洋生物中分离提取EPA和DHA等海洋生物活性物质。该方法与常规地分离过程相比，具有操作简单，萃取效率高，产品中无有毒溶剂残留，没有废物排放不会造成环境污染，萃取中通常使用二氧化碳作萃取剂，价廉，易得，无毒，安全，还可以循环使用，特别适合分离热敏性和易氧化的物质。
现代分离技术如超临界流体萃取技术在海洋活性物质的提取、分离和纯化中有重要的应用前景。超临界流体技术是利用超临界流体在超过气液共存状态时的温度、压力时，来溶解某种固体、液体或它们中的某些组分，并且利用这种能力从原料中提取有用成分或脱除有害的成分，从而达到分离提纯的目的。超临界流体技术能够从天然物质中选择性地提取、分离和纯化所需组分，CO2不与生理活性物质发生化学反应，无毒，无污染，易于从产品中清除，并且可以循环使用。
目前已利用牡蛎、海藻、海参、海胆、海星、贻贝、海马等海洋动物研制开发具有降低胆固醇含量、防癌、抗癌和增强免疫功能，改善肠胃功能、抗辐射损伤等功能食品，研究水平都只停留在第二代功能食品上，缺乏实施国际标准，功能食品的功能因子明确和量化、作用机理清楚的第三代功能食品。虽然国内外对海洋生物活性物质的研究投入了大量的人力物力，但是在海洋药物开发方面真正达到临床应用和产业化的却很少，能获得一类新药证书的更是寥寥无几，在海洋保健品和功能食品的研究与开发方面大都集中在抗癌和防治心脑血管方面。
三
发明内容
技术问题本发明的目的是提供一种海藻抗氧化活性成分的制备方法，提取高纯度海藻抗氧化活性成分。提取得率达到7％以上，所提取的海藻抗氧化活性成分清除自由基的能力高，抑制亚油酸过氧化活性强。方法简便，成本低廉，易得，无毒，安全。
技术方案1、一种海藻抗氧化活性成分的制备方法，其特征在于(1)将100克蛋白核小球藻粉装入超临界CO2萃取罐，封闭好萃取釜；(2)设定超临界二氧化碳萃取工艺参数压力35-40MPa、温度32-47℃、夹带剂用量为1.0-1.5ml乙醇/g物料、CO2流量为20-30L/h、提取时间为1.5-2.5h；(3)达到设定的萃取时间后，将萃取物收集，合并第一分离釜和第二釜中的萃取物；(4)真空浓缩萃取物得油状提取物或冷冻干燥得粉末状提取物。
有益效果1、本发明所用原料蛋白核小球藻是海藻中绿藻类的一种，成本低廉，易得，无毒，安全。在生物学分类中，蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)属于真核生物界(Eukaryota)绿藻门(Chlorophyta)绿藻纲(Chlorophyceae)绿球藻目(Chlorococcales)卵囊藻科(Oocystaceae)小球藻属(Chlorella)。早在上世纪60年代起，日本、美国、前苏联、德国、捷克、印度、埃及和我国等国家和地区都开展了小球藻的培养条件、营养成分、生理活性物质、食品应用、废水(发酵生产废水、养猪场废水、城市污水)处理等方面的研究；小球藻已被FAO列为二十一世纪人类的绿色营养源健康食品。
小球藻主要生理功能有提高免疫力和机体防御能力，能抑制胃癌手术切除患者的白血球减少、增加食欲，能使长期远洋航海者的感冒患病率下降；改善贫血，能使贫血孕妇的血红蛋白值和血清铁增加，能使贫血女性的血红蛋白值提高，能使因化疗引起的低血色素贫血患者的红血球数和血红蛋白值上升；促进肠蠕动、减轻便秘；经动物试验表明，口服小球藻干粉可抑制血压上升，抑制大动脉弹性蛋白质的减少，预防脑中风，对糖尿病患者也起保健作用，还能促进皮肤伤口的愈合；小球藻粉能抑制胆固醇的吸收并促进胆固醇的排泄，抑制由食物引起的动脉硬化，降低高胆固醇患者的血清胆固醇值；小球藻热水浸提物能减轻轻症慢性肝炎患者的GOT(Glutamic Oxalocacetic Transaminase enzyme，谷氨酸草酰乙酸转氨酶)和GPT(Glutamic Pyruvic Transaminase enzyme，谷氨酸丙酮酸转氨酶)的活性；小球藻具抗氧化作用，热水浸出物采用硫氰酸铁薄层色谱分析，确认含有两种具有很高抗氧化活性物质的组分。
2、本发明方法简便，萃取效率高。超临界CO2萃取过程是利用处于临界压力7.39MPa和临界温度31.06℃以上具有较强溶解能力的CO2流体来提取原料中弱极性或非极性物质的化工分离新技术，分离过程中利用的二氧化碳为萃取溶剂，其具有无毒、惰性、无残留、能循环利用等优点；且此法萃取效率高，过程易于调节。超临界CO2萃取对热敏性物质和不挥发性物质的提取和分离更具特色。超临界CO2兼具气体和液体特性，既有液体的溶解能力，又有气体良好的流动和传递性能，且随着压力和温度等相关提取因素的变化其溶解能力有显著改变，以此可寻找出提取的最佳工艺参数，并可研究粗提取物的分离、纯化工艺参数。本发明方法提供的最佳工艺参数简便，提取得率达到7％。
3、本发明海藻提取物抗氧化活性高。通过正交试验确定优化最佳工艺参数萃取温度、压力、CO2流量、夹带剂量、提取时间，按正交表L16(45)进行试验(表1)。
表1L16(45)正交试验固素—参数表水平 A 温度 B 压力C CO2流量 D 夹带剂量 E 提取时间(℃) (MPa) (L/h) (ml乙醇/g物料)(h)1 324020 1.0 32 403515 0 1.53 473030 0.5 2.54 552525 1.5 2水平范围32-55 25-40 15-300-1.5 1.5-3选择粗提取物得率为考核指标，以获取最佳提取工艺参数。提取物的抗氧化活性，作为最终的考核指标。用DPPH(1，1-二苯基-2-苦肼基)法和亚油酸法检测提取物的抗氧化活性。所提取的海藻抗氧化活性成分清除自由基的能力(抑制率最高达49.23-54.16％)显著高于BHT(抑制率达23.99％)、Trolox(抑制率达25.41％)、α-生育酚(抑制率达7.90％)(表2)。
粗提取物抑制亚油酸过氧化能力(第六天，最低氧化份额2.0-3.6％)，显著高于BHT(第六天，12.8％)、Trolox(第六天，13.9％)、α-生育酚(第六天，111.3％，已没有抗氧化效果)(表3)。
四
图1超临界CO2萃取工艺流程。
五
具体实施例方式
实施例1(1)称取100克蛋白核小球藻粉末装入超临界CO2萃取罐，封闭好萃取釜；(2)超临界二氧化碳萃取工艺参数压力35MPa、温度40℃、夹带剂用量为1.5ml乙醇/g物料、CO2流量为20L/h，其中压力、流量通过调节节流阀开启度和二氧化碳高压泵转速达到预定值；(3)达到设定的萃取时间2.5h后，将萃取物收集，合并第一分离釜和第二釜中的萃取物；(4)真空浓缩(水浴40℃)萃取物得油状提取物或冷冻干燥得粉末状提取物即为海藻抗氧化活性成分。
将超临界二氧化碳萃取所收集的物质进行真空低温浓缩，测定提取物的重量，萃取得率达到3.5％。所提取的海藻抗氧化活性成分清除自由基的能力(抑制率最高达54.16％)，显著高于BHT(抑制率达23.99％)、Trolox(抑制率达25.41％)、α-生育酚(抑制率达7.90％)。
粗提取物抑制亚油酸过氧化能力(第六天，最低氧化份额3.6％)，显著高于BHT(第六天，12.8％)、Trolox(第六天，13.9％)、α-生育酚(第六天，111.3％，已没有抗氧化效果)。
表2海藻提取物的清除自由基活性样品 提取物得率(％) 抑制率(％)1 7.78 42.03±0.51c2 2.15 17.35±0.13i3 3.97 30.38±2.29f，g4 4.95 41.98±0.20c5 3.25 37.67±1.10d6 3.50 54.16±4.49a7 3.31 33.77±0.43e，f8 2.49 30.35±0.92f，g9 7.54 49.23±1.98b10 3.84 29.67±0.29g11 3.52 29.69±2.22g12 3.17 37.00±6.83d，e13 3.54 42.38±0.40c14 3.28 31.59±2.36f，g15 2.45 46.92±0.00b16 2.58 31.36±0.37f，gBHT /23.99±1.91hTrolox /25.41±0.03hα-生育酚 /7.90±0.49j注在本表抑制率纵列中，不同字母标注的数据间有显著差异(p＜0.05)组6和9抑制率高，表明这两组的粗提取物清除自由基能力强表3海藻提取物的抑制亚油酸过氧化活性样品 第一天第二天第三天第四天第五天 第六天176.6％50.0％25.4％13.2％8.3％5.8％280.5％51.6％24.5％14.4％8.8％7.4％398.7％51.6％24.4％12.7％8.9％6.5％488.5％30.9％13.0％8.2％ 7.4％7.6％558.4％43.7％18.2％10.6％7.0％4.6％659.7％47.9％15.9％7.2％ 6.9％3.6％751.9％36.8％16.4％7.5％ 5.8％4.1％866.2％41.1％18.9％10.2％6.9％5.8％933.8％29.5％6.7％ 4.4％ 3.8％2.0％10 88.3％50.5％17.2％11.4％8.3％5.8％11 / 17.9％11.1％7.3％ 1.5％0.8％12 108.3％ 6.4％ 4.7％ 4.7％ 4.7％4.4％13 77.8％8.1％ 4.6％ 4.4％ 5.2％4.6％14 102.8％ 10.4％5.8％ 6.5％ 6.5％5.9％15 / 2.0％ 1.8％ 2.2％ 2.4％3.2％16 119.4％ 11.1％6.5％ 6.0％ 6.9％6.3％BHT 433.2％ 29.7％14.9％13.4％14.5％ 12.8％Trolox 38.9％30.6％14.8％14.5％14.9％ 13.9％α-生育酚322.2％ 35.8％20.8％32.5％80.5％ 111.3％注表中的数值(百分数)是试验指标当天氧化份额，其计算方法是(加抗氧化剂亚油酸氧化程度/未加抗氧化剂亚油酸氧化程度)*100％，数值越小，亚油酸氧化过程抑制得越好，抗氧化活性越强实施例2(1)将100克蛋白核小球藻粉装入超临界CO2萃取罐，封闭好萃取釜；(2)设定超临界二氧化碳萃取工艺参数压力40MPa、温度47℃、夹带剂用量为1.5ml乙醇/g物料、CO2流量为30L/h，其中压力、流量通过调节节流阀开启度和二氧化碳高压泵转速达到预定值；(3)达到设定的萃取时间1.5h后，将萃取物收集，合并第一分离釜和第二釜中的萃取物；(4)真空浓缩(水浴40℃)萃取物得油状提取物或冷冻干燥得粉末状提取物即为海藻抗氧化活性成分。
将超临界二氧化碳萃取所收集的物质进行真空低温浓缩，测定提取物的重量，萃取得率达到7.54％，所提取的海藻抗氧化活性成分清除自由基的能力(抑制率最高达49.23％)，显著高于BHT(抑制率达23.99％)、Trolox(抑制率达25.41％)、α-生育酚(抑制率达7.90％)。
粗提取物抑制亚油酸过氧化能力(第六天，最低氧化份额2.0％)，显著高于BHT(第六天，12.8％)、Trolox(第六天，13.9％)、α-生育酚(第六天，111.3％，已没有抗氧化效果)。
权利要求
1.一种海藻抗氧化活性成分的制备方法，其特征在于(1)将100克蛋白核小球藻粉装入超临界CO2萃取罐，封闭好萃取釜；(2)设定超临界二氧化碳萃取工艺参数压力35-40MPa、温度32-47℃、夹带剂用量为1.0-1.5ml乙醇/g物料、CO2流量为20-30L/h、提取时间为1.5-2.5h；(3)达到设定的萃取时间后，将萃取物收集，合并第一分离釜和第二釜中的萃取物；(4)真空浓缩萃取物得油状提取物或冷冻干燥得粉末状提取物即为海藻抗氧化活性成分。
全文摘要
本发明一种海藻抗氧化活性成分的制备方法，属于海洋生物技术，用于研制开发医药保健品和功能食品的基料。将小球藻用超临界CO
文档编号A61P39/06GK1559647SQ20041001427
公开日2005年1月5日 申请日期2004年3月11日 优先权日2004年3月11日
发明者胡秋辉, 杨方美, 潘碧枢, 施瑛, 黄媛媛, 徐娟, 安辛欣 申请人:南京农业大学