专利名称：水溶性粘结剂及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及材料领域，更具体地涉及可用于制备组织工程三维支架的水溶性粘结剂及其用途。
背景技术：
生物可降解细胞支架材料是组织工程研究的重要领域之一[Grande D.A，evaluation of matrix scaffolds for tissue engineering of articular cartilage grafts，JBiomed Mater Res，1997，34211]，是组织工程的重要组成部分。作为种植细胞的生物可降解三维细胞支架，是对于细胞外基质的仿生，是保证组织工程化组织形成的前提。
组织工程用细胞支架除了必须具有生物可降解性和生物相容性外，支架的物理性质也非常重要，如支架必须具有足够大的表面积，以利于细胞的粘附、分化和增殖；具有足够大的孔隙，以利于细胞的迁移；具有良好的孔隙间连通性，以利于营养物的进入和细胞分泌的废物扩散排出；具有足够的体积，以利于将来临床修复组织或器官的缺损。然而支架的物理性质与制备支架的技术密切相关[Mikos，A G.，Bao，Y.，Cima，L G.，Ingber D E，Vacati，J P，and Langer，R，Preparation of Poly(glycolic acid)bonded fiber structures for cell attachment andtransplantation.J Biomed Mat Res，1993，27183-189；Mikos，A G.，Thorsen，A J，Czerwonka，L A，Bao，Y.，Langer，R，Winslow，D N，and Vacati，J P，Preparationand characterization of poly(L-lactic acid)foams，Polymer，1994，351068-1077；Mooney，D J，Baldwin，D F，Suh，N P，Vacanti，J P，and Langer，R，Noval approachto fabricate porous sponges of poly(D，L-lcatic-co-glycolic acid)without the use oforganic solvents，Biomaterials，1996，171417-1422；Nam，Y S，and Park，T G，Porous biodegradable polymeric scaffolds prepared by thermally induced phaseseparation，J Biomed Mat Res，1999，478-17；Nam Y S，Yoon J J and Park T G，A novel fabrication method of macroporous biodegradable polymer scaffolds usinggas foaming salt as a porogen additive，J Biomed Mat Res(AppliedBiomaterials)，2000，531-7]。
常用的三维细胞支架制备方法包括(a)纤维粘结法这是最早使用的一种方法，利用热处理或溶液粘结无纺纤维网状物形成三维多孔支架[Mikos，A G.，Bao，Y.，Cima，L G.，Ingber D E，Vacati，J P，and Langer，R，Preparation of Poly(glycolic acid)bonded fiberstructures for cell attachment and transplantation.J Biomed Mat Res，1993，27183-189；Freed，L E，Marquis，J C，Nohria A，Emmanual，J，Mikos，A G andLanger R，Neocartilage formation in vitro and in vivo using cells cultured onsynthetic biodegradable polymers，J Biomed Mat Res，1993，2711-23；Mooney D J，Mazzoni C L，Breuer C，McNamara，K，Hem D and Vacanti J P，Stablizedpolyglycolic acid fiber-based tubes for tissue engineering，Biomaterials，1996，17115-124]。该支架的孔隙率可高达81％，孔径达到500μm，孔隙间连通性良好，但是机械强度低、孔隙形态难控制而限制了其应用范围。
(b)溶液浇铸/颗粒沥取法将聚合物溶液与NaCl等水溶性致孔剂颗粒混合后，浇铸于模具中，待有机溶剂挥发后，用水溶解出聚合物/颗粒复合物中的颗粒，即可获得多孔聚合物支架[Mikos A G，Sarakinos G，Vacanti J P，Langer R S，Cima L G，US5514378；Levene H B，Lhommeau C M，Kohn J B，US6103255；Mikos A G，Sarakinos，G，Leite S M，Vacanti J P，and Langer R，Laminated three-dimensional biodegradable foams for use in tissueengineering，biomaterials，1993，14323-330；Mikos，A G.，Thorsen，A J，Czerwonka，L A，Bao，Y.，Langer，R，Winslow，D N，and Vacati，J P，Preparationand characterization of poly(L-lactic acid)foams，Polymer，1994，351068-1077；]。颗粒沥取法的优点是可以根据所用盐粒的颗粒尺寸控制支架的孔隙大小，但是孔隙之间的连通性较差、盐会保留在支架中、孔隙的形态粗糙，不利于细胞的生长。
(c)气体发泡技术利用高压二氧化碳发泡技术[Mooney，D J，Baldwin，D F，Suh，N P，Vacanti，J P，and Langer，R，Noval approach to fabricate porous spongesof poly(D，L-lcatic-co-glycolic acid)without the use of organic solvents，Biomaterials，1996，171417-1422；]和气体致孔剂技术[伊准镇，朴泰宽，CN1297042A；Nam Y S，YoonJ J and Park T G，A novel fabrication method ofmacroporous biodegradable polymer scaffolds using gas foaming salt as a porogenadditive，J Biomed Mat Res(Applied Biomaterials)，2000，531-7]，该方法能制备出大体积的多孔支架，孔隙率高达90％以上。其中，高压二氧化碳发泡技术获得的孔径为100μm以下，但是大多数孔隙不连通；气体致孔剂技术获得的孔径为200-500μm，具有较高的孔隙间连通性，但是，封闭孔隙中的致孔剂不能完全去除，不能控制孔隙间连通通道形态和尺寸。
(d)液-液相分离技术。利用热动力学原理，在聚合物溶液中形成聚合物富相和贫相，通过升华等方式去掉聚合物贫相后，即可获得多孔的聚合物支架[LoH，Kadiyala，S，Guggino S E，and Leong K W，Poly(L-lactic acid)foams with cellseeding and controlled-release capacity，J Biomed Mat Res，1996，30475-484；LoH，Ponticiello M S，and Leong K W，fabrication of controlled releasebiodegradable foams by phase separation，Tissue Engineering，1995，115-28；Schugens C，Maquet V，Grandfils C，Jerome R and Teyssie P，Polylactidemacroporous biodegradable implants for cell transplantation II Preparation ofpolylactide foams for liquid-liquid phase separation，J Biomed Mat Res1996，30449-461；Nam Y S and Park T G，Biodegradable polymeric microcellularfoams by modified thermally induced phase separation method，Biomaterials，1999，201783-1790；Nam Y S and Park T G，Porous biodegradablepolymeric scaffolds prepared by thermally induced phase separation，J Biomed MatRes 1999，478-17]获得的支架孔隙率高达90％，但是孔径在100μm以下，并且孔隙形态、孔径分布、连通性与聚合物浓度、冷冻速度和方式、溶剂/非溶剂比例以及表面活性剂存在与否有关，孔隙间的连通性不够，孔隙形态和结构难以控制。
(e)快速成型技术快速成型技术是一种非常有前途的技术，可以加工内部结构十分复杂的制件，有着其它传统工艺不可比拟的优势[Vozzi G，Previti A，De Rossi D，and Ahluwalia A.Microsyring-Based deposition of two-dimensionaland three-dimensional polymer scaffolds with well-defined geometry forapplication to tissue engineering.Tissue Engineering，8(6)1089-1098，2002]，但是，快速成型技术在组织工程细胞支架制备方面尚存在一定的缺陷[Yang S，Leong K F，Du Z，Chua C K.The design of scaffolds for use in tissue engineering.Part 2，Rapid prototyping techniques.Tissue Engineering，8(1)1-11，2002]，如1)每一类快速成型技术都是基于所加工的材料的特殊性质，没有通用性；2)现有的商业化快速成型设备不能加工组织工程需要的生物可降解和生物相容性材料；3)加工过程可能导致组织工程常用材料的降解；4)尚不能满足组织工程要求三维支架既具有足够大体积，有具有精确的微观结构。
上述各方法中，溶液浇铸/颗粒沥取法是最简便和研究最广泛的技术之一。经典的制备过程是通过筛分获得需要尺寸(氯化钠、糖类晶体等不溶于有机溶剂)的致孔剂颗粒；将致孔剂颗粒均匀地分散在PLLA的氯仿溶液中，然后浇铸在适当的模具中，待大量氯仿挥发后，真空干燥去除混合物中的残余溶剂，即可获得干燥的PLLA/致孔剂复合物。用去离子水浸出复合物中的水溶性致孔剂，真空干燥后，即可获得不同PLLA多孔细胞支架。用该技术可以制备出孔隙率高达93％，孔隙相互通透的多孔膜。其孔隙率可以通过致孔剂与聚合物溶液的比例调节，而孔隙的大小由致孔剂的几何尺寸控制，比表面积由膜的孔隙率和致孔剂的几何尺寸调节。经典的溶液浇铸/粒子沥滤技术也有明显的不足，如不能直接制备出多孔大体积三维细胞支架(只能制备出厚度不超过2mm的多孔膜)；孔隙为粗糙的立方体状；孔隙间的相互连通程度不高，并且连通通道大小和形态不规则、不可控制；有机溶剂残余可能影响细胞的生长。
为了制备出孔隙相互连通的大体积三维细胞支架，各国科学家对溶液浇铸/粒子沥滤技术作了大量的改进，开发出溶剂浇铸/粒子沥滤改进技术。早期，有人利用多层多孔膜重叠大体积三维细胞支架[Mikos A G，Sarakinos G，Leite SM，Vacanti J P，and Langer R.Laminated three-dimensional biodegradable foamsfor use in tissue engineering.Biomaterials，14323-330，1993；Mooney D J，Kaufmann P M，Sano K，et al.Transplantation of hepatocytes using porousbiodegradable sponges.Transplant Proc，26，3425-3426，1994]，膜与膜之间的粘结区与膜内部结构有显著差异，且根本无法保证孔隙间的连通性。Shastri等人[Shastri V P，Martin I and Langer R.Macroporous polymer foams by hydrocarbontemplating.Proceedings of the National Academy of Sciences USA，97(5)1970-1975，2000]则利用固态烃类致孔剂与PLLA或PLGA的溶液(二氯甲烷或三氯甲烷溶液)制备成均匀的混合物，利用正戊烷或正己烷等有机溶剂(能够与二氯甲烷或三氯甲烷混溶，而不溶解PLLA或PLGA)浸溶出固态烃类致孔剂，同时使混合物中的PLLA或PLGA沉积固化，形成厚度可达2.5cm多孔三维支架。但是，实验中很难保证将烃类致孔剂从支架中完全去除，也很难保证所有孔隙有适当的连通通道。
此外，还有一些改进方法，例如，溶剂混合/粒子沥滤技术[Liao C J，ChenJ H，Chiang S F，et al.Fabrication of porous biodegradable polymer scaffoldsusing a solvent merging/particulate leaching method.J Biomed Mater Res，59(4)676-81，2002]、相分离技术结合溶剂浇铸/粒子沥滤技术[Levene H B，Lhommeau C M，Kohn J B.Porous polymer scaffolds for tissue engineering.US6103255，2000；Chen G，Ushida T，Tateishi T.Preparation of and poly(DL-lactic-co-glycolic acid)foams by use ice microparticulates.Biomaterials，22(18)2563-7，2001；De Groot J H，Zijlstra F M，Kuipers H W，et al.Meniscaltissue regeneration in porous 50/50 copoly(L-lactic/ε-caprolactone)implants.Biomaterials，18613-622，1997]、溶剂浇铸/粒子沥滤结合气体发泡技术[Nam YS，Yoon J J，Park T G. A novel fabrication method of macroporous biodegradablrpolymer scaffolds using gas foaming salt as a porogen additive.J Biomed MaterRes，531-7，2000；尹准镇，朴泰宽。生物相容的支架的制备方法及由该方法制备的支架。CN1297042A，2001]。但是，这类方法的共同缺点是三维支架的孔隙间不完全连通、致孔剂不能够完全被去除，以及三维支架结构的均匀性差，更无法控制连通通道的形态和大小。
研究孔隙间连通尺寸可控的全连通多孔细胞支架制备技术，为细胞提供适当的迁移和营养成分以及分泌物传递空间，是组织工程用三维细胞支架制备技术的又一难题。有人[Ma P X，Choi J W.Biodegradable polymer scaffolds withwell-defined interconnected spherical pore network.Tissue Engineering，7(1)23-33，2001，Ma，Peter X.Reverse fabrication of porous materials，United States Patent，Application number20020005600]利用石蜡微球致孔剂的热粘结性质，在33-34℃的烘箱中，将石蜡微球粘结成型，浇铸PLLA的吡啶溶液，真空干燥后，用环己烷和正己烷浸取出石蜡，获得空隙率高达96％、孔隙间相互连通、且连通通道尺寸可人为控制的三维支架。但是，石蜡颗粒为非水溶性致孔剂，限制了高聚物的溶剂选择范围，而且实验中采用了气味让人难以接受的吡啶作为高聚物的溶剂。吸潮性盐类在高湿度下溶解，造成支架孔隙直径在空间分布不均匀。另一方面，热熔粘结方法中存在温度梯度、吸潮粘结方法中存在湿度梯度，两者均会使致孔剂粘结程度在空间分布上的不均匀，即支架孔隙的连同通道尺寸在空间分布不均匀；当制备的三维支架体积增大时，支架内部结构不均匀性尤为突出。
因此，本领域迫切需要开发新的致孔剂粘结剂，以及支架制备方法，以便制备出孔隙间完全连通的，内部结构均匀、可控的大体积三维细胞支架。
发明内容
本发明的目的就是提供一种致孔剂粘结剂，该粘结剂用于制备孔隙间完全连通的、内部结构均匀的、可控的大体积三维细胞支架。
本发明的另一目的是提供所述粘结剂和三维支架的制备方法。
在本发明的第一方面，提供了一种一种用于制备组织工程三维支架的粘结剂，它含有水和溶解于水的以下成分(a)5-600克/升(较佳地10-500克/升)粘结成分，所述的粘结成分选自下组明胶、糊精、羧甲基纤维素钠、聚乙烯醇、或其组合；(b)饱和浓度的致孔剂保护成分，所述的致孔剂保护成分选自下组氯酸钠、氯酸钾、丁二酰亚胺、尿素、硫氰酸钠、硫氰酸钾(c)饱和浓度的胶体破坏成分，所述的胶体破坏成分选自下组氯化钠、氯化钾、硝酸钠、硝酸钾、氯酸钠、或其组合。
在另一优选例中，粘结成分是明胶，含量50-600克/升，更佳地为100-500克/升。
在另一优选例中，粘结成分是羧甲基纤维素钠，含量5-40克/升，更佳地为10-30克/升。
在另一优选例中，粘结成分是糊精，含量50-500克/升，更佳地为100-400克/升。
在另一优选例中，致孔剂保护成分是氯酸钠，而所述的胶体破坏成分是氯酸钠。
在另一优选例中，致孔剂保护成分是丁二酰亚胺，且所述的胶体破坏成分是氯化钠、氯化钾、或其组合。
在本发明的第二方面，提供了一种用于制备组织工程三维支架的试剂盒，它包含(a)本发明所述的用于制备组织工程三维支架的粘结剂；以及(b)选自下组的致孔剂氯酸钠、丁二酰亚胺、尿素、硫氰酸钠、硫氰酸钾，或其混合物，
附加条件是粘结剂中的致孔剂保护成分与致孔剂相同。
在本发明的第三方面，提供了本发明所述的粘结剂的用途，它被用于制备组织工程三维支架。
在本发明的第四方面，提供了一种组织工程三维支架的制备方法，包括以下步骤(a)将球形致孔剂颗粒与本发明所述的粘结剂混合均匀，形成致孔剂颗粒与粘结剂的混合物，然后将混合物置于底部有孔的模具中，其中孔径小于致孔剂颗粒平均直径，致孔剂成分选自下组氯酸钠、丁二酰亚胺、尿素、硫氰酸钠、硫氰酸钾，或其混合物，并且粘结剂中的致孔剂保护成分与致孔剂相同；(b)将盛有混合物的模具，在20-1500g(更佳地100-1500g)离心力作用下，离心去除多余的粘结剂；(c)干燥离心后的混合物，获得致孔剂粘结块；(d)用溶液浇铸法将聚合物溶液浇铸到致孔剂粘结块上，所述的聚合物溶液由有机溶剂和溶解于有机溶剂中的聚合物构成，其中所述的聚合物选自下组聚乳酸、聚羟基乙酸、聚(D，L-乳酸-共聚-乙醇酸)、聚己内酯、聚β-羟基丁酯、聚二氧六环酮及其组合，然后挥发去除有机溶剂，形成致孔剂粘结块-聚合物构成的复合物；(d)切去复合物表层后，将复合物浸泡于水中，从而溶解去除致孔剂；(e)干燥，获得结构可控的大体积三维组织工程支架。
在另一优选例中，制得的所述的三维组织工程支架的体积为5立方毫米-500立方厘米，更佳地为10立方毫米-100立方厘米。
图1是大体积粘结块及观测断面(粘结剂40％，离心力161g)。
图2是各断面的粘结情况显微照片，显示各断面粘结程度均匀(粘结剂40％，离心力161g)。
图3显示了大体积三维细胞支架(粘结剂40％，离心力161g；12.5％PDLLD溶液浇注三次)。
图4是三维支架孔隙结构的显微照片，显示了致孔剂的球形孔隙和球形孔隙间的连通性。其中图4A粘结剂40％，离心力161g；图4B粘结剂40％，离心力40g。
图5是三维支架孔隙结构的扫描电镜照片，显示了致孔剂的球形孔隙和球形孔隙间的圆形连通通道(粘结剂20％，离心力161g)。
具体实施例方式
本发明人通过深入而广泛的研究，开发了水溶性致孔剂。并针对这些新型的水溶性致孔剂，开发了新的水溶性粘结剂。利用本发明人发明的水溶性粘结剂和球形致孔剂，建立了一种制备内部孔隙结构可控的大体积生物可降解组织工程用细胞支架的方法。
球形致孔剂适用于本发明的致孔剂没有特别限制，然而优选的致孔剂是球形水溶性致孔剂。尤其是发明名称为“水溶性球形致孔剂及其制法和用途”，申请号为CN02158989.5，申请日为2002年12月27日的专利申请中所述的球形水溶性致孔剂。这种水溶性球形致孔剂的直径大小为100-1000微米(较佳地100-600微米)，且由选自下组的组分构成氯酸钠、丁二酰亚胺、尿素、硫氰酸钠、硫氰酸钾，或其混合物。
通常，球形水溶性致孔剂制备方法包括如下步骤(a)将致孔剂原料加入到分散剂中可用于本发明的致孔剂原料的选择标准是致孔剂原料具有结晶性质、良好的水溶性、适当的吸潮性、适当的熔点(最好低于260度)、无毒性或低毒性、来源广泛、成本低廉、不溶于有机溶剂、化学性质比较稳定。合适的致孔剂原料是选自下组的化合物氯酸钠、丁二酰亚胺、尿素、硫氰酸钠、硫氰酸钾，或其混合物。致孔剂原料的熔点为T1。
可用于本发明的分散剂是闪点T2比致孔剂熔点T1高出50-100℃(或更高)的有机溶剂，较佳地T2高于300℃的有机溶剂，代表性的例子包括(但并不限于)甲基硅油、硅油、硅酮。
(b)形成液态微球通常，将步骤(a)的混合物，在搅拌下加热至大于T1且小于T2的温度范围；例如，当分散剂为甲基硅油，致孔剂原料为氯酸钠时，加热至260-270℃，时间约30±10分钟；当分散剂为甲基硅油，致孔剂原料为丁二酰亚胺时，加热至130-140℃，时间约20±10分钟；当分散剂为甲基硅油，致孔剂原料为硫氰酸钾时，加热至180-190℃，时间约20±10分钟。
(c)形成固态微球在搅拌下，将用冰-水冷却的分散剂，倾入步骤(b)的液态微球与分散剂的混合液中，使混合物迅速降温至T1温度之下，形成固态微球；(d)分离获得球形致孔剂用常规方法(抽滤等)，分离出步骤(d)的固态微球，洗涤、干燥后得到球形致孔剂。
(e)筛分不同大小的球形致孔剂用不同孔径的分样筛进行筛分，即可获得不同大小的球形致孔剂。
水溶性粘结剂本发明用于制备组织工程三维支架的粘结剂含有水(或水性溶剂)和溶解于水的以下成分(a)5-600克/升粘结成分，所述的粘结成分选自下组明胶、糊精、羧甲基纤维素钠、聚乙烯醇、或其组合；(b)饱和浓度的致孔剂保护成分，所述的致孔剂保护成分选自下组氯酸钠、氯酸钾、丁二酰亚胺、尿素、硫氰酸钠、硫氰酸钾；(c)饱和浓度的胶体破坏成分，所述的胶体破坏成分选自下组氯化钠、氯化钾、硝酸钠、硝酸钾、氯酸钠、或其组合。
就粘合成分而言，其作用是将致孔剂颗粒粘在一起。可以采用常用的一些粘结成分，然而优选例子如下粘结成分是明胶，含量为50-600克/升，更佳地为200-500克/升。
粘结成分是羧甲基纤维素钠，含量为5-40克/升，更佳地为1-30克/升。
粘结成分是糊精，含量为50-500克/升，更佳地为100-400克/升。
通常，致孔剂保护成分与致孔剂的成分相同。
就致孔剂保护成分而言，其通常与致孔剂相同。例如，当致孔剂是氯酸钠时，致孔剂保护成分也宜是氯酸钠；当致孔剂是丁二酰亚胺时，致孔剂保护成分也宜是丁二酰亚胺。
就胶体破坏成分而言，其作用是防止粘结成分形成胶体。强电解质诸如氯化钠、氯化钾、硝酸钠、硝酸钾、氯酸钠等都可用于防止形成胶体。一些优选的例子如下(a)当致孔剂保护成分是氯酸钠，所述的胶体破坏成分是氯酸钠。(b)当致孔剂保护成分是丁二酰亚胺，且所述的胶体破坏成分是氯化钠、氯化钾、或其组合。
水溶性粘结剂的制备方法很简便，将致孔剂保护成分和胶体破坏成分溶解于水中，形成饱和溶液，然后将粘合成分溶解于该饱和溶液即可。
三维支架制备本发明还提供了三维支架制备方法，它包括以下步骤1)水溶性粘结剂的配制，2)将球形致孔剂颗粒与水溶性粘结剂混合均匀，并置于底部有微孔的模具中；3)利用离心力，将混合物中多余的粘结剂从模具底部的微孔中排除，使致孔剂颗粒相互接触发生粘结。离心力大小以可以去除多余粘结剂为准，通常为20-1500g，更佳地为100-1500g；4)干燥离心后的混合物，获得致孔剂粘结块；5)在一种有机溶剂中溶解一种聚合物以制备聚合物溶液；6)利用溶液浇铸技术将聚合物溶液浇铸到粘结好的致孔剂上，待有机溶剂挥发后；7)用刀片切去表层后，将其浸泡于去离子水中，待致孔剂完全溶解后，去离子水洗涤、真空干燥即可获得结构可控的大体积三维组织工程。
可用于制备组织工程三维支架的生物可降解材料材料没有特别限制。常用的生物可降解材料包括(但并不限于)聚乳酸(PLLA，PDLLA)、聚羟基乙酸(PGA)、聚(D，L-乳酸-共聚-乙醇酸)(PLGA)、聚己内酯(PCL)、聚β-羟基丁酯、聚二氧六环酮等。
用于形成的生物可降解材料溶液的溶剂没有特别限制。代表性的例子包括(但并不限于)二氯甲烷、氯仿、丙酮、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮、二氧六环、四氢呋喃、乙酸乙酯、甲乙酮等。
利用本发明的粘结剂和离心粘结方法，获得的大体积致孔剂粘结块，具有粘结时间短、粘结程度均匀、粘结强度高、容易获得大体积粘结块的优良性能；并且粘结程度随离心力增大而降低，随粘结剂浓度的升高而增大，即具有粘结程度可控的性质。应用该致孔剂粘结块制备的三维细胞支架，具有孔隙完全连通、结构均匀的特点；其孔径由致孔剂直径决定，孔隙间连通通道大小由粘结块的粘结程度决定。如直径为450-600μm的致孔剂，粘结剂浓度为20％，161g离心力作用下，其粘结直径为上表面151.51±28.09(45)，中央155.08±30.26(42)，下表面152.77±26.06(87)；粘结剂浓度为40％，161g离心力作用下，粘结直径为上表面176.93±27.16(66)，中央177.24±34.52(82)，下表面181.00±32.17(174)；粘结剂浓度为40％，1449g离心力作用下，粘结直径为上表面130.38±31.19(47)，中央130.73±17.77(37)，下表面128.68±27.41(51)。因此，本发明涉及的水溶性粘结剂和离心粘结技术，是制备内部结构可控的大体积细胞支架的优良技术之一。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1实验材料与方法一、主要实验试剂1.甲基硅油(methyl siloxane fluid)，H-201，杭州师范学院附属厂2.乙醚(diethyl ether)AR中国医药集团上海化学试剂公司3.氯酸钠(sodium chlorate)AR中国医药集团上海化学试剂公司4.三氯甲烷(chloroform)AR中国医药集团上海化学试剂公司5.氯化钠(sodium chloride)6.明胶(gelatin)Sigma公司7.聚乳酸(poly(D，L-lactide))(PDLA)Sigma公司(重均分子量90,000-120,000)二、主要仪器设备1.DW-2型多功能电动搅拌器，河南省巩义市英峪豫华仪器厂2.真空干燥箱DZF-6000型，上海一恒科技有限公司3.显微镜Nikon ECLIPSE E600W，JAPAN4.XZ型旋片式真空泵，河南省巩义市宏达精密仪器厂
5.分样筛浙江上虞市华美仪器纱筛厂6.电子天平PB303-S型，METTLER TOLDO，瑞士7.离心机ALC，PK110，ALC international srl，EC制造8.扫描电子显微镜scanning electron microscope，hitachi s-520，日本9.纯水装置Millipore，milli-Q型，法国实验方法一、球形致孔剂的制备利用[CN02158989.5]中所述的方法制备致孔剂，即在搅拌下，将少量氯酸钠置于硅油中，搅拌下，慢慢加热甲基硅油，使氯酸钠呈液态微球；维持搅拌速度不变情况下，倾入大量冷硅油使球形氯酸钠凝固，过滤、洗涤、筛分，即可获得球形致孔剂。
二、致孔剂的粘结1.粘结剂的配制在去离子水中加入过量的胶体破坏成分，如强电解质氯化钠(用氯酸钠为致孔剂时，不需要氯化钠)，制备常温饱和电解质溶液；再用致孔剂保护成分(致孔剂原料)饱和此电解质饱和溶液；最后，应用此饱和溶液溶解明胶形成不同浓度的粘结剂溶液。
2.致孔剂的粘结以致孔剂/粘结剂为2∶1(体积/体积)，将球形致孔剂与粘结剂混合均匀，将混合物置于底部有微孔的模具中，常温下，在不同的离心力下离心10分钟后，在干燥器内常温充分干燥，待用。
三、大体积三维细胞支架制备1.PDLA溶液配制(如12.5％的三氯甲烷溶液)取2.50g PDLA置于磨口三角瓶内，用移液管加入20ml三氯甲烷，盖好磨口玻璃塞，室稳下静置溶解即可。
2.三维支架制备用滴管吸取PDLA的三氯甲烷溶液，逐滴滴加到致孔剂粘结块上，至溶液刚好超过致孔剂表面，干燥12小时后，再次滴加PDLA的三氯甲烷溶液，共滴加三次。待三氯甲烷挥发完全后，置于真空干燥箱内充分干燥；从模具中取出浇铸了PDLA的致孔剂粘结块，用刀片切去上、下表面后，置于去离子水中，搅拌下溶解致孔剂，并用去离子水漂洗3次，真空干燥箱内充分干燥后，即可获得孔隙结构可控的三维PDLA支架。
四、粘结块和支架的表征1.微观结构观测干燥后的粘结块，用刀片截取不同断面，在显微镜下观察其粘结均匀性，并测定致孔剂微球之间粘结面的直径，即粘结程度。
干燥后的三维PDLA支架，用显微镜观察孔隙结构；真空喷金后，用扫描电子显微镜观察三维支架的结构。
实验结果一、粘结剂性状表1粘结剂的组成和性状
使用的对照粘结剂如下
由粘结剂性状变化表明，胶体破坏成分的存在，可以保证粘结剂不会成为凝胶；而致孔剂保护成分的存在，可以保证致孔剂颗粒不会在粘结过程中发生形态和大小的明显变化。
二、致孔剂的粘结1.致孔剂大体观察和粘结均匀性粘结块的大体图片和观察粘结均匀性的取样断面如图1所示；各粘结断面的显微结构如图2。
由图可见，利用粘结剂离心粘结技术可以方便地获得大体积的致孔剂粘结块；且致孔剂形态保持不变、粘结块整体结构均匀。而且用粘合剂a-h所获得的结果基本上完全相同。
2.粘结程度及其控制条件表2粘结的均匀度和粘结程度统计表
统计分析结果表明，在同一粘结实验条件下，各粘结面的致孔剂之间的粘结程度不存在统计学差异(P＞0.05)；而不同实验条件之间，致孔剂之间的粘结程度有显著差异(P＜0.05)。当粘结剂浓度相同时，离心力越大，粘结程度越小(表3中B和C)；当离心力相同时，粘结剂浓度增大，粘结程度增加(表3中A和B)。即离心粘结技术能获得粘结程度均匀的大体积粘结块，并通过改变粘结剂浓度或离心力大小，能方便地控制致孔剂的粘结程度，即三维支架的孔隙之间连通通道尺寸。
三、支架结构1.支架外观图3显示的是一种直径约25mm，高约15mm大体积三维支架；即利用本发明技术，可以方便地制备出大体积三维细胞支架。
2.支架显微镜图4为三维支架的显微照片。照片中可以看出，由致孔剂微球所形成的球形大孔，各个大孔之间相互连通，且大孔之间由于致孔剂粘结形成的圆形连通通道。具备了理性细胞支架的结构特征。
3.支架扫描电镜图5为三维支架的的扫描电子显微镜图片。从图片中可以非常清晰的看到，由致孔剂微球所形成的球形大孔，以及各个大孔之间的圆形连通通道，且圆形通道大小均匀；具备了理性细胞支架的结构特征。
讨论三维细胞支架的孔隙为细胞提供粘附的表面，其孔隙率越高，支架能为细胞提供的粘附表面更大，越有利于细胞粘附、生长、细胞外基质沉积、营养和氧气进入及代谢产物交换，也有利于血管和神经的长入。因此，制备高孔隙率的三维细胞支架，成为组织工程用细胞支架的目标之一。另一方面，临床上缺损的组织、器官通常具有一定的形态和体积，应用组织工程技术修复这类缺损，需要相应的、具有一定形态和体积的三维细胞支架。所以，研究和开发易于工业化生产，且内部结构可控的大体积三维细胞支架制备技术，具有非常重大的意义。
致孔剂粘结与溶液浇注/沥滤技术结合，是制备组织工程用三维细胞支架的优良方法之一。该技术可以方便地利用致孔剂的形态和大小，控制支架孔隙形态和孔隙尺寸；利用致孔剂粘结和粘结程度，实现支架孔隙间完全连通、控制孔隙间通道的尺寸。目前的几种致孔剂粘结技术[Murphy W L，Dennis R G，Kileny J L，Mooney D J.Salt fusionan approach to improve poreinterconnectivity within tissue engineering scaffolds.TissueEngineering，8(1)43-52，2002；曹谊林，陈际达，崔磊，刘伟。水溶性球形致孔剂及其制法和用途，申请号02158989.5，2002.12.27；Ma P X，Choi JW.Biodegradable polymer scaffolds with well-defined interconnectedspherical pore network.Tissue Engineering，7(1)23-33，2001，Ma，PeterX.Reverse fabrication of porous materials，United States Patent，Application number20020005600]，可以在一定程度上控制支架的孔隙连通性和通道尺寸，但是，根本无法制备出结构均匀的大体积三维支架，也难以实现工业化生产。其根本原因是，无法实现大体积致孔剂的均匀粘结。如利用致孔剂吸潮性质的粘结技术，由于环境中的湿度向致孔剂内部逐渐扩散，表面致孔剂比内部致孔剂接触湿空气更早、吸潮更高，导致表面致孔剂粘结、溶蚀比中央致孔剂更快，使表面致孔剂形态和尺寸发生变化更显著，显然不能获得均匀的大体积粘结块，也无法获得大体积的三维细胞支架。利用热传导使石蜡致孔剂熔融粘结的方法，因热传导在致孔剂内部形成温度梯度，使表面致孔剂比中央致孔剂接触的温度更高，熔融粘结的程度也高，并且，随致孔剂体积增加，粘结的不均匀性更显著。本发明则根据，在恒定的温度下，粘结剂在致孔剂表面的剩余量(即粘结程度控制部分)与离心力和粘结剂浓度(粘结剂粘度)相关，而与其它因素(如致孔剂体积)无关；通过控制粘结剂浓度和离心力，实现内部结构可控的、结构均匀的大体积三维支架制备。
图1～图5，直观上完全证实了，大体积致孔剂粘结的均匀性和结构可控性，以及由此制备的大体积三维细胞支架的结构均匀性、孔隙连通性和孔隙结构可控性。表2则用统计的结构显示了大体积致孔剂粘结的均匀性和结构可控性，即致孔剂粒径为450-600μm范围，粘结剂浓度为20％、离心力为161g时，粘结块各断面的粘结程度无显著差异，其总体粘结程度为153.00±27.51(174)；粘结剂浓度为40％、离心力为161g时，粘结块各断面的粘结程度无显著差异，其总体粘结程度为179.21±31.81(322)；粘结剂浓度为40％、离心力为1449g时，粘结块各断面的粘结程度无显著差异，其总体粘结程度为129.83±26.46(135)。而不同条件下，粘结程度有非常显著的差异。表明利用粘结离心技术能获得粘结程度均匀的大体积粘结块，并通过改变粘结剂浓度或离心力大小，能方便地控制致孔剂的粘结程度，即三维支架的孔隙之间连通通道尺寸。
粘结剂的组成和性质可见(表1)，胶体破坏成分(强电解质)的存在，可以保证粘结剂不会成为凝胶，有利于提高粘结剂的浓度，增加粘结剂在致孔剂表面的附着量，即增大致孔剂之间的粘结程度；而致孔剂保护成分的存在，可以保证致孔剂颗粒不会在粘结过程中发生形态和大小的明显变化，有利于控制大体积三维细胞支架的孔隙大小、形态和连通结构。因此，该粘结剂的组成和配方，完全区别于一般用途的粘结剂，是专用于致孔剂粘结的一种试剂。
粘结剂与致孔剂混合/离心操作方式，具有操作简便、快速、重复性好、设备简便等优点，具有大工业化生产的潜在能力，是其它致孔剂粘结剂技术无法比拟的。因此，本发明既解决了内部结构可控的大体积三维细胞支架制备技术，又具有大规模工业化生产的潜力，对于促进组织工程产业化具有重要的意义。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
权利要求
1.一种用于制备组织工程三维支架的粘结剂，其特征在于，它含有水和溶解于水的以下成分(a)5-600克/升粘结成分，所述的粘结成分选自下组明胶、糊精、羧甲基纤维素钠、聚乙烯醇、或其组合；(b)饱和浓度的致孔剂保护成分，所述的致孔剂保护成分选自下组氯酸钠、氯酸钾、丁二酰亚胺、尿素、硫氰酸钠、硫氰酸钾；(c)饱和浓度的胶体破坏成分，所述的胶体破坏成分选自下组氯化钠、氯化钾、硝酸钠、硝酸钾、氯酸钠、或其组合。
2.如权利要求1所述的粘结剂，其特征在于，粘结成分是明胶，含量50-600克/升。
3.如权利要求1所述的粘结剂，其特征在于，粘结成分是羧甲基纤维素钠，含量5-40克/升。
4.如权利要求1所述的粘结剂，其特征在于，粘结成分是糊精，含量50-500克/升。
5.如权利要求1所述的粘结剂，其特征在于，致孔剂保护成分是氯酸钠，而所述的胶体破坏成分是氯酸钠。
6.如权利要求1所述的粘结剂，其特征在于，致孔剂保护成分是丁二酰亚胺，且所述的胶体破坏成分是氯化钠、氯化钾、或其组合。
7.一种用于制备组织工程三维支架的试剂盒，其特征在于，它包含(a)权利要求1所述的用于制备组织工程三维支架的粘结剂；以及(b)选自下组的致孔剂氯酸钠、丁二酰亚胺、尿素、硫氰酸钠、硫氰酸钾，或其混合物，附加条件是粘结剂中的致孔剂保护成分与致孔剂相同。
8.权利要求1所述的粘结剂的用途，其特征在于，用于制备组织工程三维支架。
9.一种组织工程三维支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤(a)将球形致孔剂颗粒与权利要求1所述的粘结剂混合均匀，形成致孔剂颗粒与粘结剂的混合物，然后将混合物置于底部有孔的模具中，其中孔径小于致孔剂颗粒平均直径，致孔剂成分选自下组氯酸钠、丁二酰亚胺、尿素、硫氰酸钠、硫氰酸钾，或其混合物，并且粘结剂中的致孔剂保护成分与致孔剂相同；(b)将盛有混合物的模具，在20-1500g离心力作用下，离心去除多余的粘结剂；(c)干燥离心后的混合物，获得致孔剂粘结块；(d)用溶液浇铸法将聚合物溶液浇铸到致孔剂粘结块上，所述的聚合物溶液由有机溶剂和溶解于有机溶剂中的聚合物构成，其中所述的聚合物选自下组聚乳酸、聚羟基乙酸、聚(D，L-乳酸-共聚-乙醇酸)、聚己内酯、聚β-羟基丁酯、聚二氧六环酮及其组合，然后挥发去除有机溶剂，形成致孔剂粘结块-聚合物构成的复合物；(d)切去复合物表层后，将复合物浸泡于水中，从而溶解去除致孔剂；(e)干燥，获得结构可控的三维组织工程支架。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的三维组织工程支架的体积为5立方毫米-500立方厘米。
全文摘要
本发明公开了一种用于制备组织工程三维支架的粘结剂和支架制备方法，所述的粘结剂含有水和溶解于水的以下成分(a)5－600克/升粘结成分，(b)饱和浓度的致孔剂保护成分，和(c)饱和浓度的胶体破坏成分。利用本发明的粘结剂和支架制备方法，可以简便高效地制得结构可控的大体积三维组织工程支架。
文档编号A61L24/00GK1651099SQ20041001613
公开日2005年8月10日 申请日期2004年2月6日 优先权日2004年2月6日
发明者曹谊林, 陈际达, 崔磊, 刘伟 申请人:上海组织工程研究与开发中心