专利名称：用于治疗银屑病的凉血活血复方及其制备方法
技术领域：
本发明属于中药方剂的筛选及制备技术领域。
本发明采用现代药效学研究所用的先进技术和方法，对所有治疗银屑病的中药进行筛选并按中医治则优化组方，经反复实验筛试及临床验证，最后得出临床治疗银屑病有效的凉血活血复方。验证了所用实验模型和检测指标的可行性。研究获得的凉血活血复方作用温和，未见毒副作用可广泛应用于各级各类医院。进一步制成冲剂、丸剂也可用于药店。进一步开发也可进入国际市场。该研究确定的实验模型和检测指标可用于中药开发。
背景技术：
银屑病为常见病，多发病。我国发病率为0.12％，欧美发病率可达1-3％。银屑病的治疗目前尚无有效药物，50年代以来西医治疗银屑病内用药物方面的进展包括细胞毒药物、维甲酸类药物和免疫抑制-调节剂，但这些药物中疗效较强者均可能发生严重副反应。另一项重要的治疗进展是光-化学疗法，其疗效显著，但存在潜在的致癌危险。银屑病的病因尚未完全明了，本病易复发，固需重复甚至长期治疗。银屑病又是一种良性皮肤病，治疗中不应为暂时的缓解而冒发生严重副作用的危险。银屑病治疗研究的近期目标是根据对发病机理的了解，寻求疗效确实而无严重副作用、复发较少而缓解时间长的药物和疗法。中药作用温和，无毒副作用，适合长期应用。多年来中医治疗银屑病积累了丰富经验，应该加以整理和研究。探索科学检测手段判定中药药效及不同中药治则及方剂与实验药效的关系是中药开发的一个突破点。以此为基础可进一步开发临床治疗银屑病的更有效的方剂。也为中药打入国际市场奠定基础。
中医中药为中国特色，以往中医药研究多用传统方法，以辨证、治则为主要的治疗依据，疗效观察局限于临床指标，缺乏科学的检测手段。近年来国内已有人用ET-1、IL-8、血栓素B2、6-酮-前列腺素F2a等血清学指标检测中药治疗银屑病的疗效。但仅为数例临床疗效的观察，样本不大，多为单个指标，无动物实验依据。
银屑病的主要病理变化为表皮过度增生和分化不全。Bonder和Van Scott的雌激素期增生的小鼠阴道上皮模型可模拟银屑病的表皮过度增殖。Jarrett的鼠尾鳞片表皮模型可模拟银屑病的表皮分化不全。是目前国内外公认且应用较多的银屑病实验模型。多用于药物疗效的研究。但用于中药筛试国内外尚未见报告。PCNA是当今反映增殖的最好指标，多用于肿瘤的研究，但引入动物模型作为药效学筛试的指标国内外尚未见报告。现代概念认为银屑病的表皮过度增殖和分化异常和炎症等疾病现象涉及到细胞和分子水平的异常调控，表现为皮损及血液异常表达的细胞因子、免疫分子及炎症介子，某些与疾病的严重程度密切相关。国外该方面研究较多，目前认为与银屑病病情有关的指标有IL-8、ET-1、Se-selectin、NO、新喋呤等。这些研究多为临床观察，Se-selectin作为检测指标引入实验模型国内外尚未见报告。
发明内容
本发明的目的就是提供一种能够有效治疗银屑病、无毒副作用、适合长期使用的用于治疗银屑病的凉血活血复方及其制备方法。
本发明的技术构思是，从现代药效学入手开发和研究中药治疗银屑病。研究采用动物模型、免疫组化、血液学检测、体外细胞培养多项指标相结合，大量动物实验筛试和临床疗效观察相结合，科学检测手段和中医理法治则相结合开发出治疗银屑病的中药方剂。
首先将文献报告治疗银屑病的中药方剂拆方分析，挑选出出现频率高的中药。利用小鼠阴道上皮和鼠尾鳞片表皮模型、增殖细胞核抗原表达、细胞因子及炎症介质检测和细胞学实验等方法对这些中药进行反复筛试，得到紫草、大青叶、荆芥等20种中药能不同程度地抑制上皮细胞增殖、促进表皮细胞分化和降低血浆内皮素-1(ET-1)水平。在此基础上我们又将20味中药按中医治则组成6个方剂进一步筛试，得到由凉血、活血、清热、养血、祛风、理湿为治则的方剂可显著抑制增殖、促进分化和降低ET-1水平。之后又将这些方剂进一步优化组成两个中药方剂，分别进行动物实验和临床观察，最后得到一临床和实验效果均最为明显的凉血活血复方，再将该方用于临床观察治疗银屑病的疗效，通过上述实验，利用科学的检测手段开发出临床治疗银屑病有效的中药方剂。
中药药效学检测指标的开发本研究应用Bonder和Van Scott的雌激素期增生的小鼠阴道上皮模型，Jarrett和Spearman的鼠尾鳞片表皮模型作为银屑病药效学筛试的综合指标(曾获1990年国家教委科技进步三3等奖)，证明了上述实验模型用于中药的药效筛试是可行的，并引入先进的实验指标进行创新。PCNA存在于增生活跃的细胞中，是石蜡切片上反映细胞增殖的最好指标。本研究首次将PCNA用作银屑病实验模型的指标，以观察药物对细胞增殖的影响。结果表明雌激素化的小鼠阴道上皮处于增殖状态，用PCNA标记可从分子水平真实反映其增殖程度的变化。作为药效学研究的指标可能比常规组织学方法更直观和可靠。血浆内皮素-1(ET-1)在银屑病发病中具有促表皮增殖、促新生血管形成和炎症细胞趋化的作用。被认为是一种致病因子，是反映银屑病病情的一项体液指标。本研究用放免法检测了中药对血浆ET-1水平的影响。结果表明这些中药可显著降低小鼠血浆ET-1水平。内皮-白细胞粘附因子-E(sE-selectin)是内皮细胞活化的最直接指标，对循环白细胞的粘附及向炎症部位游走发挥重要作用。银屑病患者血清sE-selectin显著增高，本实验首次将sE-selectin水平检测作为一个指标引入动物模型，结果表明该指标作为一种检测手段是稳定可靠的，且操作简便。本研究通过对上述指标的应用和观察，探索出可应用于判定中药药效的检测指标。使原有实验模型更具科学性和先进性。
本发明的技术解决方案是，用于治疗银屑病的凉血活血复方，按重量百分比，组成是大青叶6～12％，生地6～22％，黄芩4～10％，紫草3～9％，丹参5～11％，赤勺3～7％，丹皮4～8％，当归4～16％，土茯苓14～22％，白藓皮4～8％，荆芥2～8％，双花8～14％。
用于治疗银屑病的凉血活血复方，按重量百分比，组成是大青叶9％，生地18％，黄芩7％，紫草5％，丹参7％，赤勺4％，丹皮5％，当归7％，土茯苓18％，白藓皮5％，荆芥4％，双花12％。
制备用于治疗银屑病的凉血活血复方的方法，步骤是a.单味中药的筛选对治疗银屑病的中药方剂进行拆方分析，得到出现频次较高的中药，选出对银屑病治疗有效的20味中药。
应用可模拟银屑病的小鼠阴道上皮和鼠尾鳞片表皮模型、血浆内皮素-1同位素检测、PCNA免疫组化染色、血清sE-selectin检测等方法，筛选出对银屑病治疗有效的20位中药。20种中药为生地、赤芍、丹皮、紫草、金银花、大青叶、土茯苓、黄芩、苦参、白鲜皮、荆芥、丹参、黄芪、当归、鸡血藤、川芎、桃仁、红花、三棱、莪术；b.对上述20味中药按照中医理法和治则，组成6种单方。各方的功能为I号方凉血、清热II号方凉血、活血、养血III号方活血、破瘀IV号方破瘀、清热V号方清热、祛风、理湿VI号方清热、理湿、凉血、活血、补气各方组成如下I号方大青叶16～50％、生地16～50％、黄芩9～26％、紫草9～26％，II号方丹参16～50％、赤勺8～25％g、丹皮8～25％、当归8～24％，III号方丹参20～60％、当归10～30％、莪术10～30％、川芎10～30％，IV号方桃仁10～30％、三棱10～30％、大青叶20～60％、红花10～30％，V号方土茯苓33～83％、白藓皮6～18％、荆芥6～18％、双花8～32％，VI号方苦参8～23％、黄芪15～60％、紫草8～22％、鸡血藤16～46％；c.组成凉血活血复方应用银屑病模型分别观察上述6种方剂对小鼠阴道上皮细胞有丝分裂和鼠尾部鳞片表皮颗粒层形成的影响；应用放免法检测6种中药方剂对小鼠血浆内皮素-1的影响；将上述实验中对表皮增殖、分化和下调血浆ET-1水平均有较好作用的I、II、V方按中医理法组成凉血活血复方。
d.凉血活血复方功效的进一步验证应用银屑病模型分别观察凉血、活血复方对小鼠阴道上皮细胞有丝分裂和鼠尾部鳞片表皮颗粒层形成的影响。应用放免法检测凉血、活血复方对小鼠血浆内皮素-1的影响。应用ELISA双抗夹心法测凉血、活血复方对血清sE-selectin水平的影响。将凉血、活血复方用于200例银屑病病人验证其临床疗效。
e.完成以上3步所用的药物、试剂、仪器如下1.昆明种远交系小鼠
2.注射用己烯雌酚(上海第六制药厂)3.注射用氨甲蝶呤(MTX)1.0mg/kg(上海华联制药有限公司)4.秋水仙碱2.0mg/kg(上海卫辉化学试剂厂)5.PCNA单克隆抗体及HRP/DAB检测盒(美国NEOMARKERS公司)6.ET-1放免检测盒(解放军总院放免室)7.ET-1放免试剂盒(解放军总院放免室)8.DDL-低温离心机(上海安亨科学仪器厂)9.γ-12计数器(DPC公司)本发明的有益效果是，能够有效治疗银屑病、无毒副作用、适合长期使用。本发明从现代药效学入手开发和研究中药治疗银屑病。研究采用动物模型、免疫组化、血液学检测、体外细胞培养多项指标相结合，大量动物实验筛试和临床疗效观察相结合，科学检测手段和中医理法治则相结合开发出治疗银屑病的中药方剂，确定了一种用于开发的、科学的、与国外接轨的行之有效的技术。
具体实施例方式
一、凉血活血复方的制备a.选出对银屑病治疗有效的20位中药生地、赤芍、丹皮、紫草、金银花、大青叶、土茯苓、黄芩、苦参、白鲜皮、荆芥、丹参、黄芪、当归、鸡血藤、川芎、桃仁、红花、三棱、莪术；b.组成6种单方I号方大青叶2.5g、生地2.5g、黄芩1.5g、紫草1.5g，II号方丹参2.5g、赤勺2.0g、丹皮2.0g、当归1.5g，III号方丹参2.5g、当归1.5g、莪术1.5g、川芎1.5g，IV号方桃仁1.5g、三棱1.5g、大青叶2.5g、红花1.5g，V号方土茯苓10g、白藓皮1.5g、荆芥1.5g、双花2.5g，VI号方苦参1.5g、黄芪5.0g、紫草1.5g、鸡血藤2.5g；c.组成凉血活血复方大青叶15g、生地15-35g、黄芩9-18g、紫草6-12g、丹参12g、赤勺6g、丹皮9g、当归6-16g、土茯苓30g、白藓皮9g、荆芥6g、双花15-25g。
用法每日一付水煎服治疗寻常性和红皮病型银屑病。
二、检测(1)药物对小鼠阴道上皮细胞有丝分裂的影响取雌性小鼠，随机分组，每组10只，其中为实验组和阴阳性对照组。所有小鼠腹腔注射己烯雌酚0.2mg/日/只，连续雌激素化3日，使得所有小鼠阴道上皮处于增殖状态。实验组于雌化同时予中药灌胃，分别为单味中药、I、II、III、IV、V、VI号方剂和复方茯苓汤组，连续6日，每日2次。阴性对照组予生理盐水腹腔注射。阳性对照组于雌激素化3日后腹腔注射MTX，每日2次，连续3日。为避免细胞有丝分裂的日夜节律对实验结果的影响，所有实验小鼠末次给药时间统一定于上午8时，上午9时腹腔注射秋水仙碱2.0mg/kg体重。秋水仙碱使纺锤体无法形成，有丝分裂停止于M期中期以便于计数。下午2时处死小鼠，取阴道标本以10％福尔马林固定，制成HE切片，光镜下计数500个基底细胞中的有丝分裂数(有丝分裂指数)，与对照组比较。
(2)药物对小鼠尾部鳞片表皮颗粒层形成的影响取雄性小鼠，避免雌性内分泌对表皮分化的影响，随机分组，每组10只，分别为实验组和阴、阳性对照组。实验组以中药煎剂灌胃，每日2次，连续14天；阴性对照组以生理盐水腹腔注射；阳性对照组每周前三天予MTX腹腔注射，每日2次，连续2周。第15天处死小鼠，取鼠尾距根部1.5cm处背侧皮肤，大小约0.3cm×1.0cm的一长条，以10％的福尔马林固定，制成HE切片，光镜下逐个观察每个标本的鳞片表皮有无颗粒层形成。凡是有连续成行的颗粒层细胞的鳞片，判定为有颗粒层形成的鳞片。计数每100个鳞片中有颗粒层的鳞片数，与对照组比较。
(3)药物对小鼠血浆ET-1和血清sE-selectin水平的影响雄性小鼠在处死之前，用摘眼球法取血约1毫升，滴入预先加有EDTA二钠和抑肽酶的试管中，4℃离心，3000转/分，10分钟，取血浆放免法测ET-1含量。取血清ELISA法检测sE-selectin具体操作方法先将标准品及各待测标本内加入缓冲液和内皮素抗体，混匀，4℃孵育24小时。次日各管中加入125 I-内皮素，混匀，4℃过夜。第三天分别在各管中加入分离剂，使结合状态和游离状态的125 I-内皮素分离，在γ-计数仪上测定每管沉淀物的放射性强度，根据标准曲线计算出每管标本中内皮素的浓度，单位以pg/ml表示。
(4)药物对小鼠阴道上皮PCNA表达的影响取雌性小鼠，随机分组，实验方法同阴道模型，但末次给药不注射秋水仙碱。PCNA染色按试剂盒说明。阳性对照为已知表达阳性淋巴结，以PBS替代一抗作阴性对照。结果判定PCNA染色阳性物质呈棕黄色颗粒状，主要位于胞核，偶见胞浆。采用王宏伟参照Garcia[3]方法观察50个高倍视野，胞核棕黄色染色为阳性。每个视野观察两个指标。
a.阳性反应细胞比例＜20％为1；20-50％为2；＞50％为3。
b.阳性反应着色深度在阳性反应细胞中多数浅着色为1，多数深着色边界清楚为2。
以上两项相加＝2为(+)；＝3为(++)；≥4为(+++)。
权利要求
1.用于治疗银屑病的凉血活血复方，其特征在于，按重量百分比，组成是大青叶6～12％，生地6～22％，黄芩4～10％，紫草3～9％，丹参5～11％，赤勺3～7％，丹皮4～8％，当归4～16％，土茯苓14～22％，白藓皮4～8％，荆芥2～8％，双花8～14％。
2.根据权利要求1所述的用于治疗银屑病的凉血活血复方，其特征在于，按重量百分比，组成是大青叶9％，生地18％，黄芩7％，紫草5％，丹参7％，赤勺4％，丹皮5％，当归7％，土茯苓18％，白藓皮5％，荆芥4％，双花12％。
3.制备权利要求1所述的用于治疗银屑病的凉血活血复方的方法，其特征在于，步骤是a.单味中药的筛选对治疗银屑病的中药方剂进行拆方分析，得到出现频次较高的中药，应用动物模型及血清学检测方法对挑选出的中药进行筛选。得到对银屑病治疗有效的20味中药生地、赤芍、丹皮、紫草、金银花、大青叶、土茯苓、黄芩、苦参、白鲜皮、荆芥、丹参、黄芪、当归、鸡血藤、川芎、桃仁、红花、三棱、莪术；b.对上述20味中药按照中医理法和治则，组成6种单方I号方大青叶16～50％、生地16～50％、黄芩9～26％、紫草9～26％，II号方丹参16～50％、赤勺8～25％g、丹皮8～25％、当归8～24％，III号方丹参20～60％、当归10～30％、莪术10～30％、川芎10～30％，IV号方桃仁10～30％、三棱10～30％、大青叶20～60％、红花10～30％，V号方土茯苓33～83％、白藓皮6～18％、荆芥6～18％、双花8～32％，VI号方苦参8～23％、黄芪15～60％、紫草8～22％、鸡血藤16～46％；c.组成凉血活血复方应用银屑病模型分别观察上述6种方剂对小鼠阴道上皮细胞有丝分裂和鼠尾部鳞片表皮颗粒层形成的影响；应用放免法检测6种中药方剂对小鼠血浆内皮素-1的影响；将上述实验中对表皮增殖、分化和下调血浆ET-1水平均有较好作用的I、II、V方按中医理法组成凉血活血复方。
全文摘要
用于治疗银屑病的凉血活血复方及其制备方法属于中药方剂的筛选及制备技术领域。本发明从现代药效学入手开发和研究中药治疗银屑病。研究采用动物模型、免疫组化、血液学检测、体外细胞培养多项指标相结合，大量动物实验筛试和临床疗效观察相结合，科学检测手段和中医理法治则相结合开发出治疗银屑病的中药方剂。本发明的有益效果是，能够有效治疗银屑病、无毒副作用、适合长期使用。确定了一种用于开发的、科学的、与国外接轨的行之有效的技术。
文档编号A61P17/06GK1562168SQ200410021270
公开日2005年1月12日 申请日期2004年4月8日 优先权日2004年4月8日
发明者刘晓明 申请人:刘晓明