专利名称：20(R)－人参皂苷Rh的制作方法
技术领域：
本发明涉及20(R)-人参皂苷Rh2的用途，尤其涉及其在制药领域中的用途。
背景技术：
现有技术中，人们对20(s)-人参皂苷Rh2的药效学进行过研究。但至今对20(R)-人参皂苷Rh2的药理及其用途，尚未见报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足和空白，对20(R)-人参皂苷Rh2进行深入细致的药理试验，提供20(R)-人参皂苷Rh2的新用途，即在制药中的新应用。
实际上，本发明涉及20(R)-人参皂苷Rh2作为制备治疗或预防癌症的药中的应用。
涉及20(R)-人参皂苷Rh2在制备预防癌细胞转移的药中的应用。
涉及20(R)-人参皂苷Rh2在制备对抗癌药起增效或减毒作用的药中的应用。
涉及20(R)-人参皂苷Rh2在作为制备治疗或预防化疗引起的白细胞降低的药中的应用。
涉及20(R)-人参皂苷Rh2在制备增强机体免疫功能的药中的应用。
本发明的目的通过下述药理试验予以实现。
除非另有说明，本发明中所采用的百分数均为重量百分数。
A.体外抗肿瘤活性及对小鼠脾细胞增殖影响的试验
1.试验目的测定20(R)人参皂苷5～6个浓度对7株人肿瘤细胞株增殖动力学的影响及对小鼠脾细胞增殖的影响。
2.材料和方法(1)样品的称量及配制见表1.
表1.
上述样品配成上表所示浓度后，样品1-2号用N.S(生理盐水)等比稀释成3×103～3μg/ml，其中1～103μg/ml和3×103μg/ml，两个浓度有白色絮状沉淀，加药时要混合均匀，顺铂用生理盐水倍比稀释成100μg/ml，10μg/ml，1μg/ml。
(2)细胞株HL-60(人早幼粒白血病细胞株)、CA(人肝癌细胞株)、Bcap-37(人乳腺癌细胞株)、HCT(人结肠癌细胞株)、SGC-7901(人胃腺癌细胞株)、A549(人非小细胞肺癌细胞株)、CNE(人鼻咽癌细胞株)。
(3)小鼠淋巴细胞健康成熟Balb/c小鼠，本实验室动物室提供，断颈椎处死后，无菌取脾脏，磨碎、过滤、离心洗涤两次，计数后制成T、B淋巴细胞悬液。
(4)测试方法改良MTT法及SRB法。
3.实验结果样品Rh2和Rg-3在3μg/ml-300μg/ml浓度范围内，用改良MTT法及SRB法对七种人肿瘤细胞株HL-60、CA、Bcap-37、HCT、SGC-7901、A549、CNE增殖的影响和样品Rh2和Rg-3在0.01μg/ml～100μg/ml浓度范围内，用改良MTT法对小鼠T、B淋巴细胞增殖的影响结果详见表2至表9。
表2～9的结果表明，样品Rh2和Rg-3对小鼠淋巴细胞的增殖有一定程度的抑制作用，样品Rh2在浓度为0.3μg/ml时对小鼠B淋巴细胞增殖抑制率28.15％；对小鼠T淋巴细胞增殖无抑制作用。当浓度为10μg/ml时，对小鼠T淋巴细胞增殖抑制率为36.77％，在3μg/ml～300μg/ml浓度范围内对小鼠B、T淋巴细胞增殖的抑制呈一定的剂量依赖关系。对小鼠B、T淋巴细胞增殖的IC50分别为20.807μg/ml、46.991μg/ml，样品Rg-3在浓度为0.3μg/ml时对小鼠B淋巴细胞增殖抑制率为18.65％，当浓度为100μg/ml时，对小鼠B淋巴细胞增殖抑制率为79.07％，且3μg/ml～300μg/ml浓度范围内对小鼠B淋巴细胞增殖的抑制呈一定的剂量依赖关系；样品Rg-3在浓度为0.3μg/ml时对小鼠T淋巴细胞增殖抑制率为36.00％，在3μg/ml～100μg/ml浓度范围内对小鼠T淋巴细胞增殖的抑制随浓度的增加而增高，但在最高浓度300μg/ml时抑制率下降，样品Rg-3对小鼠B、T淋巴细胞增殖的IC50分别为4.160μg/ml、0.358μg/ml。
按照中华人民共和国卫生部药政局制定的标准，当化合物的IC50＜10μg/ml时，即认为对肿瘤细胞的增殖有明显的抑制作用。上述结果说明，本发明的药物对HCT细胞的IC50为0.016μg/ml，显示对HCT肿瘤细胞株的增殖有明显抑制作用。
B.对免疫功能低下小鼠迟发型变态反应、胸腺指数和脾指数的影响1.健康ICR小鼠，雌雄各半，18-22g，清洁级，由昆明医学院省天然药物药理重点实验室动物室提供，合格证号滇实动证第2001035号2.试剂环磷酰胺(CTX)，江苏恒瑞医药股份有限公司生产，批号021008210二硝基氟苯(DNFB)，上海化学试剂公司产品，批号F20020726。
3.方法受试动物随机分为正常对照、CTX模型和受试药各剂量组。Rh2和Rg3组在给药的第4天于每鼠腹部去毛，约3×3cm范围大小，第5天将1％DNFB溶液均匀涂于脱毛处使皮肤致敏，第6天再涂抹1次以加强致敏，同时于给药的第6、7、8三天同时给予CTX，连续3d。CTX模型组与受试药各剂量组同步给予CTX。在给药的第10天每只小鼠右耳(两面)均匀涂抹10μL 1％ DNFB进行攻击，24h后处死动物，剪下左右耳壳，用打孔器取下直径8mm的耳片，称重，同时取小鼠胸腺及脾脏称重，按公式计算小鼠耳片肿胀度、脾指数和胸腺指数耳片肿胀度＝右耳片重量(mg)-左耳片重量(mg)脾(胸腺)指数＝脾(胸腺)重量(mg)/10g体重试验结果见表10。试验结果说明，在本实验条件下，本发明的药物能明显增强CTX模型小鼠低下的迟发型变态反应及明显提高CTX模型小鼠低下的胸腺指数，与对照组相比，统计学处理差异均有高度显著性，但对低下的脾指数无明显影响，且各观察指标均未显示出量效关系。以上结果提示本发明能显著增强机体的细胞免疫功能。
C.对小鼠移植性肝癌(HAC)生长影响的研究1.健康ICR小鼠，雌雄各半，18-22g，清洁级，由昆明医学院省天然药物药理重点实验室动物室提供，合格证号滇实动证第2001035号2.受试药用0.5％羧甲基纤维素钠制成混悬液，经灌胃给药，每天1次，灌胃体积为0.2ml/10g体重，连续给药10天，其中动物接种前给药3天，动物接种后给药7天。
按上述方案分组给药，于给药的第4天，无菌条件下，接种HAC腹水瘤后6～7天，取肿瘤生长良好的小鼠，瘤细胞用0.9％氯化钠溶液调成1.0×107个细胞/ml浓度的瘤细胞悬液，接种子小鼠右侧腋部皮下，每只0.2ml，含2×106个细胞。接种肿瘤继续给药7天。停药后24小时处死动物，称体重、瘤重、肝、脾、肾及胸腺重。试验结果见表11～13。
试验结果说明，在剂量为5.20～83.20mg/kg范围内，经灌胃连续给药10天，本发明的药物对荷瘤小鼠的肝脏、脾脏、肾脏、胸腺等主要脏器及骨髓细胞无毒性。在剂量为20.80mg/kg和83.20mg/kg时，对小鼠移植性肝癌(HAC)的生长有明显的抑制作用；在高剂量83.20mg/kg 时对荷瘤小鼠的生长及骨髓细胞具有一定的抑制作用，并明显抑制小鼠移植性肝癌(HAC)的生长。
D.对小鼠移植性肉瘤S180生长及荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响受试动物随机分为阴性对照、阳性对照、溶媒对照和受试药剂量组。溶媒对照及受试药组于肿瘤接种前按实验方案开始给药，连续4天。所有动物在溶媒对照和受试药组第4天给药后，取接种7天后生长良好的肿瘤细胞，用NS调成7.0×106/ml浓度的细胞悬液接种于小鼠右侧腋部皮下，0.2ml/只，再连续给药7天，即溶媒对照和受试药组共给药11天，阴性对照和阳性对照共给药7天。停药当天取鸡静脉血，加入肝素钠抗凝，用磷酸缓冲液(PBS)洗涤，1000rpm，5min离心，去上清，共三次，得鸡红细胞，用NS将鸡红细胞配成5％浓度的细胞悬液，每鼠腹腔注射0.5ml，12h即停药.次日处死动物，称体重后沿腹部正中剪开皮肤，经腹膜注入NS 2ml，轻柔小鼠腹部1min后，吸出腹腔洗液滴于载玻片上，置37℃孵箱温育30min后以NS漂洗，以除去未与玻片粘附的细胞，晾干，用1∶1丙酮-甲醇溶液固定2min，Giemsa-磷酸缓冲液染色8min，流水冲洗，晾干，油镜下记数200个巨噬细胞，并进行计算。试验结果见表14～15。
试验结果表明，本发明能明显抑制小鼠移植性肉瘤S180的生长及明显增强荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能，且未观察到明显的毒性反应。
E.与顺铂联合用药对小鼠移植性肉瘤s180生长的影响将受试ICR小鼠随机分为阴性对照、阳性对照、溶媒对照和受试药各剂量组后给药。取接种7天后生长良好肿瘤细胞，用生理盐水调成7.0×106/ml浓度的细胞悬浮液接种于小鼠右侧腋部皮下，0.2ml/只。按试验方案连续给药7天，停药一天后处死动物，分别称体重和瘤重。计算各组平均瘤重，计算对肿瘤生长的抑制率。试验结果见表16。
表16的数据表明，阴性对照(生理盐水)组的平均瘤重达1.35g/只小鼠，表明肿瘤生长良好，试验模型的建立是成功的。阳性对照组(DDP 1mg/kg)的平均瘤重减至0.29g/只小鼠，抑瘤率达78.52％，显示出明显抑制肿瘤生长的作用，表明本评价系统是可靠的。与生理盐水对照组相比，溶媒对照组的平均瘤重几无差异，说明溶媒对肿瘤生长无影响。与溶媒对照组相比，试验药物的各剂量组与DDP联用均显示出明显的抑瘤作用。由于联合用药中所选择的DDP的剂量对肿瘤的生长几无疗效，说明疗效是本发明和顺铂联用所产生的。上述结果说明，本发明能明显增强抗癌药顺铂的疗效，显示出减毒增效的作用。
从以上结果，可以得出本发明的优点在于1.本发明对已知化合物20(R)-人参皂苷Rh2发掘了新的医疗用途，开拓一个新的应用领域。
2.本发明的20(R)-人参皂苷Rh2安全无毒，药理作用强，取得了令人鼓舞的结果，预示着很好的药用前景。
3.本发明的物质原料来源丰富，制备工艺简单，并可做成口服剂型、注射剂型、片剂等，使用方便。
具体实施例方式
通过下面给出的具体实施例，可以进一步清楚地了解本发明。但它们不是对本发明的限定。
实施例1配制60％的醋酸水溶液100毫升，加入人参二醇组皂苷干粉20克，在0.1兆帕压力下，搅拌加热，在100℃下进行水解反应2小时，反应完成后，用水将反应混合物洗至中性，过滤，滤物在100℃干燥，得水解产物12克。以硅胶柱层析法，洗脱液为氯仿∶甲醇∶乙酸乙酯∶水＝2∶2∶4∶1(体积比)层析纯化，收集洗脱物于甲醇-水中重结晶，得到20(R)-人参皂苷Rh2的白色结晶体983毫克，收率4.92％。其纯度经HPLC法测定为97.6％。经TLC、MS、13C-NMR、1H-NMR、13C-1H COSY、1H-1H COSY、比旋光度及熔点测定，并与20(R)-人参皂苷Rh2的文献数据核实，确认该白色晶体为20(R)-人参皂苷Rh2。
实施例2将60毫升冰醋酸加入40毫升95％的乙醇中，加入人参二醇组皂苷干粉20克，在0.1兆帕压力下，搅拌加热，在75℃下进行水解反应1.5小时，反应完成后，趁热倒入400毫升25℃水中稀释，减压回收乙醇。反应物继续用水洗至中性，过滤，滤物在80℃下干燥，得水解产物13.6克。以硅胶柱层析法，洗脱液为氯仿∶甲醇∶乙酸乙酯∶水＝2∶2∶4∶1(体积比)层析纯化，收集洗脱物于甲醇-水中重结晶，得到20(R)-人参皂苷Rh2的白色结晶体1082毫克，收率7.95％。其纯度经HPLC法测定为95.3％。经TLC、MS、13C-NMR、1H-NMR、13C-1H COSY、1H-1H COSY.比旋光度及熔点测定，并与20(R)-人参皂苷Rh2的文献数据核实，确认该白色晶体为20(R)-人参皂苷Rh2。
实施例3将10毫升36％的盐酸溶入水中，使呈100毫升，加入人参二醇组皂苷干粉20克，在0.1兆帕压力下，搅拌加热，在100℃下进行水解反应1.5小时，反应完成后，用水将反应混合物洗至中性，过滤，滤物在100℃干燥，得水解产物11.4克。以硅胶柱层析法，洗脱液为氯仿∶甲醇∶乙酸乙酯∶水＝2∶2∶4∶1(体积比)层析纯化，收集洗脱物于甲醇-水中重结晶，得到20(R)-人参皂苷Rh2的白色结晶体869毫克，收率4.35％。其纯度经HPLC法测定为96.2％。经TLC、MS、13C-NMR、1H-NMR、13C-1H COSY、1H-1H COSY.比旋光度及熔点测定，并与20(R)-人参皂苷Rh2的文献数据核实，确认该白色晶体为20(R)-人参皂苷Rh2。
实施例4配制60％的醋酸水溶液10升，加入人参二醇组皂苷干粉2公斤，在0.1兆帕压力下，搅拌加热，在100℃下进行水解反应2小时，反应完成后，用水将反应混合物洗至中性，过滤，滤物在100℃干燥，得水解产物1.18公斤。以硅胶柱层析法，洗脱液为氯仿∶甲醇∶乙酸乙酯∶水＝2∶2∶4∶1(体积比)层析纯化，收集洗脱物于甲醇-水中重结晶，得到20(R)-人参皂苷Rh2的白色结晶体89克，收率4.45％。其纯度经HPLC法测定为95.8％。经TLC、MS、13C-NMR、1H-NMR、13C-1H COSY、1H-1H COSY.比旋光度及熔点测定，并与20(R)-人参皂苷Rh2的文献数据核实，确认该白色晶体为20(R)-人参皂苷Rh2。
表2
*样品Rh2和Rg-3的100.0μg/ml浓度以0.2％DMSO为阴性对照；300.0μg/ml浓度以0.6％DMSO为阴性对照，其余各浓度以生理盐水为阴性对照，ND＝Not Determined(在所测试的五个浓度范围内抑制率＜50％的样品未进行IC50及95％可信区间的计算)。
表3
*样品Rh2和Rg-3的100.0μg/ml浓度以0.2％DMSO为阴性对照；300.0μg/ml浓度以0.6％DMSO为阴性对照其余各浓度以生理盐水为阴性对照ND＝Not Determined(在所测试的五个浓度范围内抑制率＜50％的样品未进行IC50及95％可信区间的计算)。
表4
*样品Rh2和Rg-3的100.0μg/ml浓度以0.2％DMSO为阴性对照；300.0μg/ml浓度以0.6％DMSO为阴性对照，其余各浓度以生理盐水为阴性对照，ND＝Not Determined(在所测试的五个浓度范围内抑制率＜50％的样品未进行IC50及95％可信区间的计算)。
表5
*样品Rh2和Rg-3的100.0μg/ml浓度以0.2％DMSO为阴性对照；300.0μg/ml浓度以0.6％DMSO为阴性对照，其余各浓度以生理盐水为阴性对照ND＝Not Determined(在所测试的五个浓度范围内抑制率＜50％的样品未进行IC50及95％可信区间的计算)。
表6
*样品Rh2和Rg-3的100.0μg/ml浓度以0.2％DMSO为阴性对照；300.0μg/ml浓度以0.6％DMSO为阴性对照，其余各浓度以生理盐水为阴性对照ND＝Not Determined(在所测试的五个浓度范围内抑制率＜50％的样品未进行IC50及95％可信区间的计算)。
表7
*样品Rh2和Rg-3的100.0μg/ml浓度以0.2％DMSO为阴性对照；300.0μg/ml浓度以0.6％DMSO为阴性对照，其余各浓度以生理盐水为阴性对照ND＝Not Determined(在所测试的五个浓度范围内抑制率＜50％的样品未进行IC50及95％可信区间的计算)。
表8
*样品Rh2和Rg-3的100μg/ml浓度以0.2％DMSO为阴性对照；300μg/ml浓度以0.6％DMSO为阴性对照，其余各浓度以生理盐水为阴性对照ND＝Not Determined(在所测试的五个浓度范围内抑制率＜30％的样品未进行IC50及95％可信区间的计算)。
表9
表10
与正常对照组比较**P＜0.01.；与CTX模型组比较ΔΔP＜0.01表11
注*，与0.5％羧甲基纤维素钠组相比较，P＜0.01。
表12
注#，与0.5％羧甲基纤维素钠组相比较，P＜0.05。
表13
注*，与0.5％羧甲基纤维素钠组相比较，P＜0.01；#，与0.5％羧甲基纤维素钠组相比较，P＜0.05
表14
与NS对照组比较**P＜0.01；与0.5％CMC-Na溶媒对照组比较ΔΔP＜0.01表15
与NS对照组比较**P＜0.01；与0.5％CMC-Na溶媒对照组比较ΔΔP＜0.01
表16
权利要求
1. 20(R)-人参皂甙Rh2作为制备治疗或预防癌症的药中的应用。
2. 20(R)-人参皂甙Rh2在制备预防癌细胞转移的药中的应用。
3. 20(R)-人参皂甙Rh2在制备对抗癌药起增效或减毒作用的药中的应用。
4. 20(R)-人参皂甙Rh2在作为制备治疗或预防化疗引起的白细胞降低的药中的应用。
5. 20(R)-人参皂甙Rh2在制备增强机体免疫功能的药中的应用。
全文摘要
本发明公开了20(R)－人参皂甙Rh
文档编号A61K31/7028GK1557328SQ200410021838
公开日2004年12月29日 申请日期2004年2月13日 优先权日2004年2月13日
发明者高崇昆, 杨晓源, 董汛, 唐文旭 申请人:云南白药集团天然药物研究院