专利名称：一种重组人粒细胞集落刺激因子前体脂质体及其制法的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种药物剂型的制备方法，是关于一种重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)脂质体制剂的制备方法。
背景技术：
20世纪下半叶以来，癌症的发病率和死亡率均呈逐年上升的趋势，尤其是20世纪70年代以后，癌症的发病人数以每年3％-5％的速度递增。目前我国每年有肿瘤患者212.7万，即肿瘤的全国发病率约在1.65‰左右。癌症(肿瘤)成为继心脑血管疾病后的我国第二大疾病。
我国抗肿瘤药物产品已发展到7大类160多个品种，这些抗肿瘤药物在临床中使用，在治疗肿瘤的同时，绝大多数引起的骨髓移植和白细胞数目的下降。
重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)是目前升高白细胞效果最为确切的药物，并可用于外周血干细胞移植、骨髓移植等，其普通的注射剂已在临床上广泛应用。
rhG-CSF在临床使用中存在的主要问题是半衰期短，静脉注射后快速从体循环中消失，平均保留时间为1.34小时，其消除半衰期为1.3-4.2小时。国内外目前解决该问题的方法是将rhG-CSF皮下注射，使吸收相延长，以延长其在注射部位的滞留时间，但仍无法解决其消除半衰期过短的问题。
将rhG-CSF制成脂质体，将药物包裹在脂质双分子层中，药物受到脂质体双分子层的保护，可避免体内各种酶的破坏，提高了药物稳定性。rhG-CSF脂质体皮下注射后，能与细胞和组织结合，甚至被细胞内吞后，药物从脂质体中缓慢释放出来，在血液循环中的保留时间比游离药物长得多，提高了治疗指数，并具有长效的作用。
目前国内外在脂质体研制方面存在的主要问题是(1)脂质体制备工艺复杂，难以实现工业化大生产；(2)用常规方法制得的脂质体易于聚集和融合，有效期短；(3)包封率低。
目前文献报道制备脂质体的方法有多种，French加压挤出法、膜挤压法、乙醇(乙醚)注入法等方法，虽然有很多人作了积极的探索，但仅能在小试水平操作，其生产率水平和设备水平限制了工业化生产。近年报道较多的是采用超声波法和逆相蒸发法，这些工艺方法包封率低，对设备要求高，如超声波法，探头型超声波仪在使用的过程中，其探头磨损的金属屑会污染制剂，或导致类脂降解；而水浴型的超声波仪功率小、耗时长。逆向蒸发法的包封率只有50％左右，通常也需超声波处理，而且工艺中引入大量有机溶媒，不利于工业化生产。
本发明采用的制备工艺简单，不需要特殊的仪器设备，易于进行工业化生产；制得的脂质体包封率稳定保持在80％以上，达到《中国药典》2000年版的有关规定。
发明内容
本发明的目的在于提供一种稳定性好，并具有长效作用的重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)的注射制剂。
本发明的重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)前体脂质体，由以下处方组成重组人粒细胞集落刺激因子0.001-0.1％，卵磷脂0.5-5.0％，胆固醇0.1-1.0％，水溶性载体1.0-90.0％。
本发明中的水溶性载体可以是氯化钠、山梨醇、甘露醇、葡萄糖、乳糖或它们的混合物。
本发明优选的处方组成重组人粒细胞集落刺激因子0.005-0.045％，卵磷脂1.0-2.0％，胆固醇0.1-0.5％，水溶性载体5-20％。
本发明的另一个目的是提供一种重组人粒细胞集落刺激因子前体脂质体的制备方法。
本发明的制备方法包括以下步骤(1)按以下配比称量原辅料重组人粒细胞集落刺激因子 1-1000mg卵磷脂 5-50g胆固醇 1-10g水溶性载体 10-900g制成1000ml(2)将卵磷脂、胆固醇按处方比例溶解于有机溶剂中，形成澄明溶液；(3)在该溶液中加入水溶性载体粉末，该载体不溶于有机相，在有机溶液中呈极细的颗粒；(4)真空干燥，使有机溶液挥发完全，脂质均匀吸附于载体颗粒上；(5)将重组人粒细胞集落刺激因子溶于水中，加入到脂质—载体系统中，形成大小均一的脂质体混悬液。
本发明中的水溶性载体可以是氯化钠、山梨醇、甘露醇、葡萄糖、乳糖或它们的混合物；所说的有机溶剂为氯仿、乙醇、乙醚或它们的混合物。
所制得的重组人粒细胞集落刺激因子前体脂质体为微黄色混悬溶液。
在本发明中，重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)的规格剂量较低，在rhG-CSF前体脂质体混悬液中rhG-CSF的总含量(包括被脂质体包合部分和游离部分)约在1ug-1000ug/ml，游离rhG-CSF的含量非常低，需要灵敏度较高的方法测定其含量。本发明采用双抗体夹心ABC-ELISA法的定量EIA试剂盒，用酶标仪在492nm处测定OD值，计算rhG-CSF的含量。本方法灵敏度高，重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)在1000-2000pg/ml的范围内浓度与吸收度线性关系好，回收率高，精密度符合规定。以该种检测方法测定三批重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)前体脂质体的含量，见表1。
表1重组人粒细胞集落刺激因子前体脂质体的含量测定结果
在含量测定方法准确可靠的基础上，测定脂质体的包封率。
本发明制成的脂质体直径较小，故采用凝聚法测定，即在rhG-CSF前体脂质体混悬液中加入适量鱼精蛋白，使rhG-CSF前体脂质体聚集成团，离心，可获得上清液，测定游离rhG-CSF的浓度，计算脂质体的包封率。经测定，三批rhG-CSF前体脂质体的包封率，平均为81.2％，见表2。
表2三批重组人粒细胞集落刺激因子前体脂质体包封率的测定
为考察本发明所制备脂质体的质量，对制得的脂质体进行了稳定性研究。
取批号为030605样品，置光照(3000LX)、高温(40℃)、高湿(RH92.5％)的条件下放置10天，于5天、10天取样，测定各项质量指标，测定结果见表3。
表3rhG-CSF前体脂质体(030605批)影响因素试验结果
从表3可以看出，样品在光照(3000LX)、高温(40℃)、高湿(RH92.5％)条件下放置10天，产品的外观性状除在高温(40℃)10天有脂质析出外，其他条件下均无明显变化；但在各种条件下含量均有所下降，原因可能是重组人粒细胞集落刺激因子的贮存条件为2～8℃避光保存，在常温下不稳定；在各种条件下，包封率均有所下降，在高温(40℃)的条件下下降较明显，而在光照和高湿条件下有较小的下降幅度。
为此，又进行了2-8℃的条件下的稳定性研究。
取三批样品(批号为030603、030604、030605)，置2-8℃的条件下放置，于1、2、3、6、9、12个月取样，测定各项质量指标，测定结果见表4。
表4rhG-CSF前体脂质体2-8℃的稳定性试验结果
结果表明本品在2-8℃的条件下放置9个月，各项质量指标与0月比较均无明显变化，说明本发明所制备的重组人粒细胞集落刺激因子前体脂质体在一定的贮存条件下质量稳定。
具体实施例方式下面再以实施例方式对本发明作进一步说明，给出本发明的实施细节，但是并不是旨在限定本发明的保护范围。
重组人粒细胞集落刺激因子 150mg卵磷脂15g胆固醇5g山梨醇90g制成1000ml先将卵磷脂、胆固醇按处方比例溶解于氯仿中，形成澄明溶液；在该溶液中加入山梨醇粉末，山梨醇不溶于氯仿，在氯仿溶液中呈极细的颗粒；真空干燥，使氯仿挥发完全，脂质均匀吸附于载体颗粒上；将重组人粒细胞集落刺激因子溶于水中，加入到脂质—载体系统中，形成大小均一的脂质体混悬液。
经测定，包封率为82.2％。
下面再用几个实例进一步说明本发明，下述实例是以生产1000毫升重组人粒细胞集落刺激因子前体脂质体的配方例。
实施例12 3组分重组人粒细胞集落刺激因子 50mg 150mg 450mg卵磷脂10g 20g 50g胆固醇1g 6g10g山梨醇200g甘露醇 900g氯化钠 50g性能含量(标示量％)102.1％ 99.8％98.7％包封率(％)82.5％ 81.0％81.6％
权利要求
1.一种重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)前体脂质体，其特征在于所说的脂质体混悬液的组成含量，以重量体积百分数计为重组人粒细胞集落刺激因子0.001-0.1％，卵磷脂0.5-5.0％，胆固醇0.1-1.0％，水溶性载体1.0-90.0％。
2.依照权利要求1所述的脂质体，其特征在于其水溶性载体可以是氯化钠、山梨醇、甘露醇、葡萄糖、乳糖或它们的混合物。
3.依照权利要求1所述的脂质体，其特征在于包括以下主要配制步骤(1)将卵磷脂、胆固醇按处方比例溶解于有机溶剂中，形成澄明溶液；(2)在该溶液中加入水溶性载体粉末，该载体不溶于有机相，在有机溶液中呈极细的颗粒；(3)真空干燥，使有机溶液挥发完全，脂质均匀吸附于载体颗粒上；(4)将重组人粒细胞集落刺激因子溶于水中，加入到脂质-载体系统中，形成大小均一的脂质体混悬液。
4.依照权利要求1所述的前体脂质体，其特征在于所说的有机溶剂为氯仿、乙醇、乙醚或它们的混合物。
全文摘要
一种重组人粒细胞集落刺激因子(rhG－CSF)前体脂质体，是将脂质均匀吸附于极细的水溶性载体上，以增加脂质分散的表面积。当这种前体脂质体与水溶液接触时，脂质溶胀而载体迅速溶解，在水中形成大小均一的脂质体。前体脂质体在水化前便于贮存，重新混悬时易于分散，包封率高，该工艺过程不需要特殊设备，可规模化生产。
文档编号A61K9/127GK1683005SQ20041002401
公开日2005年10月19日 申请日期2004年4月13日 优先权日2004年4月13日
发明者马晶 申请人:马晶