专利名称：具有免疫调节作用的药物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种以天然植物提取物成分作为有效药物成分的具有免疫调节作用的药物。
背景技术：
山葵(Wasabia japonica Matsum)又名山嵛菜，为十字花科山葵属多年生草本植物，地下茎肥大，圆柱形，皮绿色，髓部偏白，肉质坚硬，磨碎后具有挥发性芒香辣味。山葵原产日本，是一种经济价值很高的蔬菜兼药用植物。数百年来作为传统的调味品辛辣料。现在已知，山葵中的葡糖异氰酸酯(Glucosinolate)及其分解产物是特殊辛辣味的来源，这是一类含硫的化合物，其共同的基本结构是一个β-D-硫葡糖基团和一个可变的侧链(可衍生自蛋氨酸、色氨酸、苯丙氨酸和某些分支氨基酸)。其中不同的侧链R使它们具有各自不同的特性。葡糖异硫氰酸酯存在于细胞器中，本身化学性质稳定，并无生物活性。只有当植物组织遭到损害细胞崩解时，在内源性黑芥子硫苷酸酶的作用下，水解生成葡萄糖和各种挥发性产物，异硫氰酸酯可能是其中最重要和研究最充分的分解产物。其葡糖异硫氰酸酯、异硫氰酸酯的相互转换过程如下 Sultana，Tamanna；McNeil，David L.；Porter，Noel G.；Savage，Geoffrey P.Investigationof isothiocyanate yield from flowering and non-flowering tissues of wasabi grown in aflooded system.Journal of Food Composition and Analysis Volume16，Issue6，December，2003，pp 637-646中报道，在山葵的所有异硫氰酸酯类化合物中，烯丙基异硫氰酸酯(Allyl Isothiocyanate)的含量约为89-94％，是其中含量最高的一种成分，在叶柄、茎和根部尤为丰富。辛辣物质中另一含量较高的成分是3-丁烯基异硫氰酸酯(3-Butenyl Isothiocyanate)，其他如4-戊烯基(4-pentenyl)、异丙基(iso-propyl)、二丁基(sec-butyl)、异丁基(iso-butyl)异硫氰酸酯等仅占异硫氰酸酯总含量的1.4-3.5％。山葵各部分挥发性含硫化合物及含量如表1所示。
表1 山葵各部分挥发性含硫化合物及含量 在A.Depree，J.；M.Howard，T.；P.Savage，G.Flavour and pharmaceutical properties ofthe volatile sulphur compounds of Wasabi(Wasabia japonica)Food ResearchInternational.Volume31，Issue5，June，1998，pp329-337中，Kumagai等人也证实，山葵根部富含6-甲硫基己基(6-methylthiohexyl)和7-甲硫基庚基(7-methylthioheptyl)异硫氰酸酯，茎部6-甲硫基己基异硫氰酸酯含量较高，而叶柄部7-甲硫基庚基异硫氰酸酯含量较高，叶片中各化合物的浓度相对较低。以上化合物中，甲亚硫化物是山葵和辣根均含有的，而甲硫化物是山葵所特有的辛辣成分，其含量是辣根的200-400倍。
近来研究发现其不仅可作为食品，现已研究发现并报道，其中的主要辛辣成分——异硫氰酸酯(Isothiocyanate)更具有抗菌、抗癌、抗氧化等多种药理作用。如，Hecht等人在Tanida N.Kawaura A.Takahashi A.Sawada K.Shimoyama T.Suppressive effect ofwasabi(pungent Japanese spice)on gastric carcinogenesis induced by MNNG in rats.[Journal Article] Nutrition & Cancer.16(1)53-8，1991.，以及黄建，孙静在“葡糖异硫氰酸酯的生物利用率及对人体健康的意义”(《国外医学卫生学分册》2003，30(2).-94-97)中分别报道，苯乙基异硫氰酸酯(PEITC)、异硫氰酸苄酯(BITC)和sulforaphane等异硫氰酸酯可改变肝脏和上皮细胞中表达的I相和II相外源性致癌物相关代谢酶的平衡。异硫氰酸酯能够阻抑I期代谢中的细胞色素P450酶，促进II期代谢中的NADPH(包括醌还原酶QR，UDP-glucronyl转移酶)，其结果是增加致癌物质解毒和排泄，继而减少致癌物质对DNA的损伤作用。
Watanabe M等在Watanabe M.Ohata M.Hayakawa S.Isemura M.Kumazawa S.Nakayama T.Furugori M.Kinae N.Identification of 6-methylsulfinylhexylisothiocyanate as an apoptosis-inducing component in wasabi.[Journal Article]Phytochemistry.62(5)733-9，2003 Mar.的报道中也证实，山葵乙醇提取液中的6-甲亚硫基己基异硫氰酸酯在体外可抑制单核细胞性白血病U937细胞和胃癌MKN45细胞的生长并诱导其凋亡、抑制细胞增殖。
此外，Pedras MS.Sorensen JL.Okanga FI.Zaharia IL.Wasalexins A and B，newphytoalexins from wasabiisolation，synthesis，and antifungal activity.[Journal Article]Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters.9(20)3015-20，1999 Oct18.和Ono H.TesakiS.Tanabe S.Watanabe M.6-Methylsulfinylhexyl isothiocyanate and its homologues asfood-originated compounds with antibacterial activity against Escherichia coli andStaphylococcus aureus.[Journal Article]Bioscience，Biotechnology & Biochemistry.62(2)363-5.1998 Feb.等一些文献还证实了异硫氰酸酯对大肠埃希氏菌属、沙门氏菌属、金黄色葡萄球菌等多种细菌都能具有很强的杀菌力。
山葵还具有抗血小板聚集的作用，虽然有报道达到其二分之一的药理效力所需的异硫氰酸酯浓度约为阿斯匹林的10倍，但其作用迅速，而阿斯匹林则需要30分钟才能起效。Morimitsu R进一步研究证实，山葵提取液在体内外均具有明显抗血小板聚集作用，其机理可能与6-HITC诱导谷胱甘肽转移酶活性有关。
目前对山葵等十字花科植物的抗氧化效果已得到广泛认同。这与其中的苯乙基异硫氰酸酯和sulforaphane密切相关。而氧化对组织器官造成的损伤在癌症、老化及一些慢性疾病中的作用已引起关注，抗氧化剂可在一定程度延缓甚至抑制这一过程的发生。
一些文献还报道，苄基(benzyl)和烯丙基异硫氰酸酯等含硫化合物还可具有抗哮喘的功效，及抗寄生虫等方面的作用。
发明内容
在上述内容的基础上，本发明将进一步提供以山葵提取物作为有效药物成分的具有免疫调节作用的药物。
本发明的具有免疫调节作用的药物，以由山葵为原料提取得到的油性混合物为有效药物成分，与药物中允许接受的辅助成分共同组成。其中，优选的是将其制备成为口服制剂型的药物。
希望本发明药物有效药物成分的山葵提取物成分，可以采用目前文献中已有报道的方法由山葵原料中提取得到。作为具体实例，也可以采用本发明提供的方法制备。
制备方法之一将山葵头粉200克与水1700毫升加入圆底烧瓶混合，加热并保持沸腾状态约1小时，减压过滤，得黄绿色悬浊液，有辛辣刺激味。将该油状物质浓缩成较为粘稠的油状液，必要时可再作过滤处理，即成为本发明所说的可作为有效药物成分使用的油性混合物提取成分。
制备方法之二将山葵粉25克加入乙酸乙酯250毫升进行加热回流萃取，得翠绿色混合液，有酯的香味。冷却过滤得翠绿色滤液。以分馏方式分离回收乙酸乙酯，即得到本发明所说的可作为有效药物成分使用的油性混合物提取成分。必要时可再加入乙酸乙酯作同样处理，进行纯化精制。
以上述得到的山葵油性混合物提取成分作为试验药物进行了下述对免疫调节作用影响的试验。
一、体外免疫调节的作用1.刺激小鼠巨噬细胞Ana-1产生NO的试验。
上述试验药物能够刺激小鼠巨噬细胞Ana-1产生NO(一氧化氮)，不同浓度山葵提取物试验药物刺激Ana-1产生NO能力不同，高浓度(C1组5mg生药/ml)大于中浓度(C2组0.5mg生药/ml)，大于低浓度(C3组0.05mg生药/ml)；C1浓度组刺激能力最强，随浓度降低刺能力下降，C3浓度组生长曲线趋于正常对照。不同浓度的山葵提取物刺激小鼠巨噬细胞Ana-1不同时间培养上清液中NO的OD值比较结果如图1所示。
2.刺激小鼠巨噬细胞Ana-1产生IL-12(白细胞介素-12)的试验。
上述试验药物能够刺激小鼠巨噬细胞Ana-1产生IL-12，不同浓度山葵提取物试验药物刺激Ana-1产生IL-12能力不同，高浓度(C1组5mg生药/ml)大于中浓度(C2组0.5mg生药/ml)。低浓度(C3组0.05mg生药/ml)无作用。不同浓度的山葵提取物试验药物刺激小鼠巨噬细胞Ana-1不同时间培养上清液中IL-12的OD值比较结果如图2所示。
3.刺激小鼠巨噬细胞Ana-1产生TNF-α(肿瘤坏死因子-α)的试验。
山葵提取物试验药物能够刺激小鼠巨噬细胞Ana-1产生TNF-α，不同浓度山葵提取物试验药物刺激Ana-1产生IL-12能力不同，高浓度(C15mg生药/ml)大于中浓度(C20.5mg生药/ml)。低浓度(C3 0.05mg)生药/ml)无作用。不同浓度的山葵提取物试验药物刺激小鼠巨噬细胞Ana-1不同时间培养上清液中TNF的OD值比较结果如图3所示。
二、体内免疫调节作用试验。
采用博莱霉素建立肺纤维化大鼠动物模型，研究本发明的山葵提取物试验药物对肺部炎症的调节作用。本发明山葵提取物试验药物与空白对照组对肺组织INF-γ(γ-干扰素)，IL-2(白细胞介素-2)及IL-12的表达的对比试验结果照片分别如图4、图5和图6所示。各图中的照片A分别均为空白对照组，照片B分别为本发明山葵提取物试验药物。各组照片B中的深色显示部分分别表明有INF-γ(γ-干扰素)、IL-2(白细胞介素-2)及IL-12(白细胞介素-12)的表达。由于INF-γ、IL-2及IL-12为参与免疫功能的细胞因子，因此该免疫组织化学结果的试验显示本发明山葵提取物具有显著的体内免疫调节作用和功能。
以该提取物成分为有效药物成分，与药物中允许接受的其它辅助添加成分，例如与口服制剂中可以被接受的崩解剂、赋形剂、润滑剂、粘合剂、填充剂等常用的辅助添加成份混合后，按相应的常规工艺方法处理，即可制成为如片剂、丸剂、胶囊剂等固体型口服药物制剂。或是与常用的增溶剂、乳化剂、润湿剂、起泡或消泡剂等表面活性剂、稀释剂、防腐剂、稳定剂、矫味剂、增稠剂等混合，按相应的常规工艺方法处理，即可制成为水剂、糖浆等液体制剂形式的口服药物。由于这些制剂的方式均属于目前的成熟技术，无需过多赘述。
图1是不同浓度的山葵提取物试验药物刺激小鼠巨噬细胞Ana-1不同时间培养上清液中NO的OD值比较结果图2是不同浓度的山葵提取物试验药物刺激小鼠巨噬细胞Ana-1不同时间培养上清液中IL-12的OD值比较结果。
图3是不同浓度的山葵提取物试验药物刺激小鼠巨噬细胞Ana-1不同时间培养上清液中TNF的OD值比较结果。
图4是发明山葵提取物试验药物增加肺组织INF-γ表达的对比试验结果。
图5是发明山葵提取物试验药物增加肺组织IL-2表达的对比试验结果。
图6是发明山葵提取物试验药物增加肺组织IL-12表达的对比试验结果。
权利要求
1.具有免疫调节作用的药物，其特征是以由山葵为原料提取得到的油性混合物为有效药物成分，与药物中允许接受的辅助成分共同组成。
2.如权利要求1所述的具有免疫调节作用的药物，其特征是该药物为口服制剂型药物。
全文摘要
本发明为一种具有免疫调节作用的药物，以由山葵为原料提取得到的油性混合物为有效药物成分，与药物中允许接受的辅助成分共同组成。
文档编号A61P37/02GK1593578SQ20041004020
公开日2005年3月16日 申请日期2004年7月13日 优先权日2004年7月13日
发明者黄素清, 李为民 申请人:台青(四川)食品有限公司