抗结核分枝杆菌的10-23脱氧核酶的制作方法

文档序号:1080780阅读:313来源:国知局
专利名称:抗结核分枝杆菌的10-23脱氧核酶的制作方法
技术领域
本发明涉及抗结核分枝杆菌的10-23脱氧核酶,及其在制备用于结核病治疗,特别是结核病潜伏感染治疗的药物的用途。
背景技术
结核病位于单一病原菌疾病死因的第一位,全球每年有900万人发病,约300万人死于结核病。虽然结核病的现代化疗已获得巨大成功,但由于涂阳肺结核病的疗程仍很难缩短到6个月以下,很多疫情严重的发展中国家仍不能负担所需的医疗费用,而且疗程过长也使病人的依从性降低,易造成患者的不充分化疗,而不充分的化疗常造成治后的高复发率,并有利于耐药菌株的产生和流行。现有的抗结核化疗药物都是针对繁殖状态的结核分枝杆菌起作用,而对处于潜伏状态下的MTB效果微弱甚至没有效果(Parrish NM,Dick JD,Bishai WR.Mechanisms of latency in Mycobacterium tuberculosis.TrendsMicrobiol,1998,6107-112.)。因此,目前认为结核病化疗疗程过长及疗效不佳可能与结核分枝杆菌进入潜伏期,代谢率低,药物对这类的“持留菌”杀灭能力弱有关。因此若能同时对处于繁殖阶段和潜伏状态的MTB采取治疗措施,有望提高抗结核病的化疗效果,缩短疗程及减少化疗后结核病的复发。
而且,随着耐药性结核病的出现及流行,研究者纷纷希望能有一种全新抗结核治疗药物以绕过结核分枝杆菌的耐药性问题。Harth G等报道应用经硫代修饰的反义寡聚脱氧核糖核酸(PS-ODNs)可特异地抑制结核分枝杆菌30/32-KDa Ag85复合物的表达。但PS-ODNs存在的一个较大的缺陷是其抑制效率较低,达到抑制效果所需的最低PS-ODNs浓度为10μmmol/L。这样高的浓度要应用于临床是不现实的,不仅副作用大,且费用高昂。另外,Harth G等选择的这几个作用靶点同传统抗结核药物一样,都是针对繁殖状态下的结核杆菌起效,不能解决潜伏感染的问题,且效果远不及传统的抗结核药物(Harth G,et al.Targeting the Mycobacterium tuberculosis 30/32-KDa mycolyltransferase complex as a therapeutic strategy against tuberculosisProof ofprinciple by using antisense technology.Proc Natl Acad Sci USA,November26,2002,Vol.99,No.2415614-15619)。
MTB一般通过三羧酸循环代谢糖类生存,而处在潜伏状态下时主要通过乙醛酸循环途径代谢脂肪酸维持生存。ICL为乙醛酸代谢途径的关键酶之一。研究表明,当MTB处于潜伏状态时,其ICL的表达水平升高(Granam JE,Clark-Curtiss JE.Indentification of Mycobacterium tuberculosis RNAssynthesized in response to phagocytosis by human macrophages by selectivecapture of transcribed sequence(SCOTS).Proc Natl Acad Sci USA,1999,9611554-11559)。Icl缺陷型MTB在感染小鼠两周后能被机体进行性清除,与野生型MTB感染相比,小鼠肺及和肺外组织的荷菌量显著降低。用质粒外源导入icl后,该缺陷型MTB又恢复野生型的表型。因此,icl可能是治疗结核分枝杆菌潜伏感染的一个极佳靶点(Mckinney JD,Zu Bentrup KH,Munoz-EliasEJ,et al.Persistence of Mycobacterium tuberculosis in macrophages and micerequires the glyoxylate shunt enzyme isocitrate lyase.Nature,2000,406735-738)。
脱氧核酶是具有酶活性的DNA分子。10-23脱氧核酶是目前应用最为广泛的脱氧核酶,由酶活性中心域及底物结合域二部分组成(如图1)。该酶的活性中心为10-23基序(motif),由5’-GGCTAGCTACAACGA-3’共15个脱氧核糖核苷酸(nucleotide,nt)组成,序列高度保守。活性中心两侧的底物结合区(substrate-binding regions,SBR)是10-23脱氧核酶特异性的基础,底物结合区通过Watson-Crick碱基配对与靶RNA特异性结合后,活性中心才能发挥催化活性。10-23脱氧核酶切割的靶位为“5’---R↓Y---3’”序列(R=A/G,Y=U/C,其中R不与10-23脱氧核酶进行配对,Y须与10-23脱氧核酶配对(如图1)。此靶位包含所有mRNA的翻译起始密码子“AUG”序列。因此通过合理地设计两侧的底物结合域序列,10-23脱氧核酶可作用于几乎所有的mRNA序列,调控相应基因的表达(Santoro SW,Joyce CF.A general purposeRNA-cleaving DNA enzyme.Proc Natl Acad Sci USA,1997,944262-4266)。
同先前发现的核酶及相比,脱氧核酶具有明显的优越性稳定,在生理条件下的稳定性是核酶的100,000倍;活性中心序列较短,分子量较小,因此与底物RNA的趋近性更好;催化效率高,Kcat约为0.1~10min-1;DNA-RNA杂交分子较RNA-RNA杂交分子易于解离,故切割速率受剪切产物自10-23脱氧核酶上解离过程的影响更小;在技术上更易制备,经济上易于接受。
目前国内、外对10-23脱氧核酶的研究大多是应用于治疗肿瘤和病毒感染,尚未见任何以10-23脱氧核酶抗结核分枝杆菌(Mycobacterium tubetculosis,MTB)感染的报道。
10-23脱氧核酶的剪切活性受很多因素的影响,如反应体系的温度、PH值、二价阳离子浓度,底物RNA的二级结构,10-23脱氧核酶自身配对的能力、底物结合域的长度及碱基组成、脱氧核酶的修饰情况等。底物RNA的二级结构可能遮盖某些靶位,使脱氧核酶不能对其进行有效的切割。脱氧核酶的底物结合域的长度及碱基组成对其切割活性也有较大的影响。底物结合域过短、G/C含量过低不利于脱氧核酶与底物RNA的结合,特异性不好;底物结合域过长、G/C含量过高不利于发挥切割活性之后的脱氧核酶与底物RNA的解离,从而影响其切割效率。脱氧核酶的切割活性受其自身杂交能力的影响。若脱氧核酶自身形成较稳定的碱基配对则不利于其与靶RNA的结合,从而影响其功效的发挥。由于只有在反应体系的温度、PH值、二价阳离子浓度与生理条件一致或接近时有切割效果的10-23脱氧核酶才具有实际应用的价值。因此底物RNA的二级结构,脱氧核酶自身配对的能力、底物结合域的长度及碱基组成、脱氧核酶的修饰情况等才是设计10-23脱氧核酶时真正需要考虑的因素。如何使这些条件达到最佳化,是设计和应用10-23脱氧核酶的关键。
鉴于以上的原因,我们设想利用10-23脱氧核酶来作用于结核分枝杆菌的icl mRNA,以期能高效、稳定地杀灭潜伏状态下的结核分枝杆菌,以缩短结核病的治疗疗程、提高结核病治疗的疗效及防止或减少结核病治后的复发。

发明内容
本发明的目的是提供具有抗结核分枝杆菌活性的10-23脱氧核酶SEQ IDNO1,SEQ ID NO2,SEQ ID NO3,SEQ ID NO4,它们具有如下所示的DNA序列。该四条10-23脱氧核酶作用于结核分枝杆菌icl mRNA的不同部位,都能特异性地切断icl mRNA,抑制结核分枝杆菌icl基因的表达,使潜伏感染状态下的结核分枝杆菌无法利用脂肪酸作为碳源,从而杀灭潜伏状态下的结核分枝杆菌。
SEQ ID NO11 acatagacaa ggctagctac aacgatcctt aacgg 35
SEQ ID NO21 cgcggcgagg ctagctacaa cgacagggct tt 32SEQ ID NO31 tgaactggaa ggctagctac aacgattgaa gccc 34SEQ ID NO41 cgggtgaggc tagctacaac gagtccttcc 30本发明的两个及两个以上的上述10-23脱氧核酶联合应用较单独使用的效果更好,对icl mRNA的切割功效更大。
本发明提供的上述所有10-23脱氧核酶中,5’和3’末端的两个磷酸二脂键均进行了硫代修饰,以提高其稳定性。
本发明的另一个目的是提供了所发明的这四条10-23脱氧核酶在用于制备结核病治疗,特别是结核病潜伏感染的药物中的用途。
本发明的四条10-23脱氧核酶均可用现有的DNA合成仪进行方便的合成及修饰。
发明的用途抗结核分枝杆菌,适用于制备结核病治疗,特别是结核病潜伏感染治疗的药物。
发明的优点本发明与传统的抗结核化疗药物及抗结核的反义寡聚脱氧核糖核酸相比有以下优点1、针对结核分枝杆菌的ICL起作用,有望解决传统抗结核药物所难以解决的结核病潜伏感染的问题。2、与其它基因治疗措施相比,10-23脱氧核酶具有稳定、特异、高效、价廉的特点。目前国内、外对10-23脱氧核酶的研究大多是应用于治疗肿瘤和病毒感染,尚未见任何以10-23脱氧核酶抗结核分枝杆菌(Mycobacterium tubetculosis,MTB)感染的报道。3、10-23脱氧核酶用于治疗结核病的思路提出了一种不同于抗生素作用机制的崭新抗痨措施,绕过了结核分枝杆菌耐药的障碍。


附图1为10-23脱氧核酶的结构及其作用的底物RNA;附图2为结核分枝杆菌icl mRNA二级结构的模拟图;附图3为icl的PCR扩增结果及重组质粒pET32-icl的双酶切鉴定电泳图;附图4为icl mRNA体外转录的结果的电泳图;附图5为SEQ ID NO1~SEQ ID NO4切割活性的体外筛选结果的电泳图;附图6为SEQ ID NO1和SEQ ID NO3联合应用对icl mRNA的切割效果的电泳图;附图7为不同Mg2+浓度对10-23脱氧核酶切割效率的影响的电泳图;附图8为不同特特异性的SEQ ID NO3对底物RNA的切割结果的电泳图。
具体实施例方式实施例1本发明的各10-23脱氧核酶的设计、合成从GenBank中检索到结核分枝杆菌H37Rv icl基因的序列,利用软件RNA Structrur3.7对icl mRNA的二级结构进行计算机模拟,根据模拟的结构图(图2)选择位于二级结构中易于与脱氧核酶结合的突出环部、符合10-23脱氧核酶靶位要求的部位作为切割的初定靶位。根据各靶位的序列设计与之互补的、不同底物结合域长度的10-23脱氧核酶。
按Naoki Sugimoto的方法(Naoki sugimoto etal.Thermodynamic parametersto predict stability of RNA/DNA hybrid duplexes.Biochemistry,1995,3411211-11216)分别计算针对各个初定靶位的、不同底物结合域长度的10-23脱氧核酶与底物RNA的总杂交自由能ΔG,选择针对不同初定靶位的、ΔG位于-20<ΔG<-25范围内的10-23脱氧核酶作为初定的10-23脱氧核酶。
利用Oligo5.0软件对各初定的10-23脱氧核酶的自身杂交情况进行模拟,并算出各10-23脱氧核酶自身杂交的杂交自由能,从中选择5条针对icl mRNA不同靶位的、自身杂交自由能最小的10-23脱氧核酶作为最终用于研究的10-23脱氧核酶,分别命名为SEQ ID NO1~SEQ ID NO4(见表1)。
利用上海生工司的DNA合成仪合成以上各10-23脱氧核酶,在合成的同时对各10-23脱氧核酶两末端的各二个磷酸二酯键进行硫代修饰。经高效液相色谱纯化后,经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。
表1设计、合成的四条10-23脱氧核酶10-23脱氧核酶靶位在icl mRNA与icl mRNA的自身杂交中的位置 总杂交自由能 自由能SEQ ID NO112 -20.6 -0.4SEQ ID NO2527-23.6 -2.1SEQ ID NO31043 -20.1 -2.1SEQ ID NO493 -20.3 -0.6实施例2结核分枝杆菌icl mRNA的获取按细菌基因组DNA抽提试剂盒(购自上海华舜公司,也可从大连TaKaRa公司,美国Promega公司购买)的说明书提取结核分枝杆菌H37Rv(购自中科院微生物研究所,也可从中国菌种保存中心、美国菌种保存中心购买。)的基因组DNA。根据GenBank登录的ICL编码序列设计P1、P2引物。
P11 gcggatccaccgttaaggagttgtct 26P21 gcaagcttctagtggaactggccct 25以结核分枝杆菌H37Rv的基因组DNA为模板进行PCR反应获取icl基因(图3A)。
PCR反应参数模板DNA2μl10×PCR缓冲液(含氯化镁)5μldNTP(10mmol/L)2μl引物P11μl引物P21μlTaq plus DNA聚合酶(5u/μl)1μl加灭菌去离子水至终体积50μlPCR反应条件95℃,3min;(94℃,1min;62℃,50sec;72℃,90sec;)×30循环;72℃,7min。
PCR产物回收后用核酸内切酶BamH I、Hind III(购自大连TaKaRa公司,也可从深圳晶美公司、英国NEB公司、美国Promega公司购买)进行双酶切,克隆入载体pET32a(+)(购自Novagen公司),构建pET32a(+)-icl质粒。以上操作均按第三版Molecular Colnging的标准操作进行。双酶切鉴定无误(图3B)后送上海生工公司测序。双向测序结果表明扩增出的icl基因正确。
用核酸内切酶Hind III对重组质粒pET32a(+)-icl进行单酶切使之线性化,37℃反应4小时。用T7体外转录试剂盒(购自美国Promega公司,也可从Invitrogen公司,Novagen公司购买)进行体外转录反应制备icl mRNA。反应体系100μL,含线性化的重组质粒pET32a(+)-icl 4μgrNTP各0.125mMT7 RNA聚合酶40uDTT10mM,Rnase抑制剂100u5×转录缓冲液20μL37℃反应3小时。
反应产物按试剂盒说明书去DNA模板,纯化。
纯化产物经1.5%变性琼脂糖凝胶电泳证实成功获得了icl的全长mRNA(1.3Kb icl mRNA序列+0.5Kb载体序列)(图4)。经OD260、OD280测定,测得浓度为约700μg/ml。OD260/OD280=1.9,证明所获得的RNA纯度较高,可用于后续的切割实验。
结论成功获取结核分枝杆菌的全长icl mRNA。
实施例3各10-23脱氧核酶对icl mRNA切割效果的观察在5个EP管内按下表加入相应试剂(μL)12345Tris-Hcl(PH7.0,0.25mol/L)22222icl mRNA(700μg/ml) 22222Mgcl2(0.1mmol/L) 1.5 1.5 1.5 1.5 1.510-23脱氧核酶(1μmol/L) 2(SEQ ID NO1) 2(SEQ ID NO2) 2(SEQ ID NO3) 2(SEQ ID NO4) -DEPC处理的去离子水2.5 2.5 2.5 2.5 4.5
各EP管置37℃温育60分钟后取出,用3.5%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。再用核酸银染试剂盒(购自北京鼎国公司,也可从北京中山公司、上海生工公司购买)进行染色后用凝胶成像系统采集图象,测定各条带的光密度值,计算切割百分率。切割百分率(%)=切割产物条带的总光密度值/(未切割底物条带光密度值+切割产物条带的总光密度值)×100%。
结果SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3和SEQ ID NO4的切割体系在相应位置出现特异的切割产物条带(图5)。未加用10-23脱氧核酶的阴性对照反应后未见切割产物带。经密度扫描后,SEQ ID NO1、SEQ IDNO2、SEQ ID NO3和SEQ ID NO4对icl mRNA的切割百分率分别为51.2%,30.8%,64.5%和42.4%。
结论SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3和SEQ ID NO4均能不同程度地对icl mRNA产生切割作用,有望用于抑制结核分枝杆菌icl基因的表达,用于抗结核分枝杆菌的感染,特别是结核分枝杆菌的潜伏感染。
实施例4SEQ ID NO1和SEQ ID NO3联合应用的效果观察在2个EP管内按下表加入相应试剂(μL)1 2Tris-Hcl(PH7.0,0.25mol/L)2 2icl mRNA(700μg/ml) 2 2Mgcl2(0.1mmol/L) 1.51.5SEQ ID NO1(1μmol/L)- 2SEQ ID NO3(1μmol/L)2 2DEPC处理的去离子水2.50.5
各EP管置37℃温育60分钟后取出,用3.5%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。再用核酸银染试剂盒(购自北京鼎国公司,也可从北京中山公司、上海生工公司购买)进行染色后用凝胶成像系统采集图象,测定各条带的光密度值,计算切割百分率。切割百分率(%)=切割产物条带的总光密度值/(未切割底物条带光密度值+切割产物条带的总光密度值)×100%。
结果SEQ ID NO1和SEQ ID NO3联合应用较单用SEQ ID NO3的效果好,其对icl mRNA的切割率达到76.2%。(图6)。
结论本发明的10-23脱氧核酶两两联用较单独使用的效果更好,可提高其抑制靶基因表达的效力。
由于本发明的各10-23脱氧核酶的切割机制、切割条件一致,作用的是iclmRNA不同的位点,且本发明的各10-23脱氧核酶单独应用均能对icl mRNA进行有效的切割。而无论从哪个部位将icl mRNA切断都可起到抑制icl基因表达的作用,因此我们推测两个以上的本发明的10-23脱氧核酶联合应用效果会更好。
实施例5不同Mg2+浓度对10-23脱氧核酶切割效率的影响观察在含Tris-cl(PH7.0)50mM,icl mRNA1.5μg,SEQID NO4 0.2μM的各反应体系(10μl)中分别加入2、5、10、15、20、30μM的Mgcl2。37℃温育60分钟后,3.5%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,银染后观察。
结果可见当Mg2+浓度为2μM,相当于机体生理条件下的Mg2+浓度时,即可观察到明显的切割产物条带。当Mg2+浓度在2~20μM范围内时,SEQ IDNO4的切割效率与Mg2+浓度成正相关(图7)。
结论本发明的10-23脱氧核酶在机体生理条件下的Mg2+浓度下即可发挥对结核分枝杆菌icl mRNA的显著切割功能。具有临床应用的前景。
实施例610-23脱氧核酶切割icl mRNA的特异性观察作为对照,本研究还设计了三条对照脱氧核酶,分别为SEQ ID NO3-C1,即在SEQ ID NO3的一侧底物结合域序列中设计一个不与靶mRNA配对的碱基;SEQ ID NO3-C2,即在SEQ ID NO3两侧的结合域序列中各设计一个不与靶mRNA配对的碱基;SEQ ID NO3-C3,即在SEQ ID NO3的活性中心域设计一个突变碱基。
结果在含Tris-cl(PH7.0)50mM,Mgcl215μM,icl mRNA1.5μg的各反应体系中分别加入0.2μM的SEQ ID NO4,SEQ ID NO4-C1,SEQ IDNO4-C2及SEQ ID NO4-C3,终反应体系为10μl。37℃温育60min后终止反应,3.5%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,银染后观察。
结果当SEQ ID NO4的一侧结合域上存在一个不与靶RNA配对的碱基时,其切割活性大大降低,但仍具有一定的活性。而当其两侧结合域上各存在一个不与靶RNA配对的碱基或其活性中心域出现一个碱基突变时,SEQ IDNO4均完全丧失切割活性(图8)。
结论本发明的10-23脱氧核酶具有高度的特异性。
权利要求
1.抗结核分枝杆菌的10-23脱氧核酶,其特征是它具有序列表中SEQID NO1、或SEQ ID NO2、或SEQ ID NO3或SEQ ID NO4所述的脱氧核苷酸序列。
2.10-23脱氧核酶在制备用于结核病治疗,特别是结核病潜伏感染的治疗药物的用途,所述10-23脱氧核酶具有序列表中SEQ ID NO1、SEQ IDNO2、SEQ ID NO3及SEQ ID NO4所述的脱氧核苷酸序列中的至少一种。
3.10-23脱氧核酶在制备用于结核病治疗,特别是结核病潜伏感染的治疗药物的用途,所述10-23脱氧核酶具有序列表中SEQ ID NO1、SEQ IDNO2、SEQ ID NO3及SEQ ID NO4所述的脱氧核苷酸序列中的至少两种的联用。
全文摘要
本发明提供的四条具有抗结核分枝杆菌活性的10-23脱氧核酶SEQ IDNO1,SEQ ID NO2,SEQ ID NO3,SEQ ID NO4作用于结核分枝杆菌iclmRNA的不同部位,都能特异性地切断icl mRNA,抑制结核分枝杆菌icl基因的表达,使潜伏感染状态下的结核分枝杆菌无法利用脂肪酸作为碳源,从而杀灭潜伏状态下的结核分枝杆菌。为此,提出了所述脱氧核酶在制备用于结核病治疗,特别是结核病潜伏感染的治疗药物的用途。
文档编号A61P31/06GK1597941SQ20041004039
公开日2005年3月23日 申请日期2004年8月4日 优先权日2004年8月4日
发明者朱道银, 李俊明 申请人:朱道银, 李俊明
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