抗促性腺激素释放激素核酸疫苗及制备方法

专利名称：抗促性腺激素释放激素核酸疫苗及制备方法
技术领域：
在医学的肿瘤领域中，通常可以用肿瘤疫苗来治疗肿瘤。本发明提供的抗促性腺激素释放激素的核酸疫苗能用于治疗性激素依赖型肿瘤。
背景技术：
促性腺激素释放激素(Gonadotrophin Releasing Hormone，GnRH)是下丘脑分泌的一不含游离氨基和羧基的10肽激素，它由下丘脑腹侧的弓状核、腹内侧核的多个核团的多肽能神经元合成，通过下丘脑正中隆起的门脉系统运送至垂体前叶，刺激黄体生成素(LH)和促卵泡激素(FSH)的合成和释放，这两种促性腺激素又能促进性腺细胞的正常发育和性激素的分泌。通过这种级联作用，GnRH在垂体-性腺轴系统中发挥着巨大的功能，成为生物体内性激素的产生、性器官的发育以及生殖的主要调控分子。
GnRH除影响垂体外，还可能影响别的各种组织，直接或间接的导致疾病的发生。前列腺增生时，前列腺二氢睾酮的含量急剧升高，增生的前列腺中5-α还原酶活性的升高以及阉割以后前列腺的萎缩都显示二氢睾酮在前列腺增生中所起的重要作用。在老年人中发病极高的前列腺癌已成为男性癌死亡的主要原因之一，研究表明前列腺癌病人体内雄激素分泌过多是致癌因素，癌细胞的代谢大多依赖于雄激素，降低雄激素的水平，可干扰癌细胞内的DNA合成，抑制肿瘤的生长。因此，前列腺癌的致病机理与性激素的分泌密切相关。其它的研究也表明乳腺癌、结肠癌等癌症都与性激素的分泌有关。最近已经发现前列腺癌、乳腺癌、结肠癌等肿瘤上存在GnRH的特异性结合位点。这些研究成果显示通过阻断GnRH的作用，降低体内性激素的水平，能抑制上述激素依赖型肿瘤的生长。目前，用于治疗这些肿瘤的已上市或正处于临床实验的药物如Buserelin(布舍瑞林)、Lupron(醋酸亮丙瑞林)、Zoladex(醋酸戈舍瑞林)、Synarel(醋酸那法瑞林)、Abarelix等都为GnRH的类似物或拮抗剂，这些药物通过阻断GnRH与其特异性结合位点的结合，实现对肿瘤的治疗。
同样，用抗促性腺激素释放激素疫苗诱导机体产生抗促性腺激素释放激素抗体，也能阻断GnRH发挥作用，进而治疗相关疾病。由于GnRH是自身抗原，免疫原性很弱，在体内不易产生抗体，一般将GnRH与白喉毒素、破伤风毒素或卵清蛋白等大分子载体物质相偶联，增强其免疫原性，以诱导机体产生高滴度的抗GnRH特异性抗体，显示能用于前列腺癌、乳腺癌等肿瘤的治疗。GnRH疫苗不仅可以用于人类，还可以用于多种动物，由于阻断GnRH能抑制促性腺激素合成和释放，进而抑制性激素合成、精子产生、卵泡发育和排卵。因此，在畜牧业上，GnRH疫苗广泛用来代替手术阉割对牲畜和家禽的生殖进行控制。总之，开发GnRH疫苗是具有广泛意义的，研制有效的GnRH疫苗已成为许多疫苗研究人员追求的目标。
随着90年代初核酸疫苗技术的诞生，其作为一种新的免疫接种手段在短短的十多年里已经获得了很大发展，至今已广泛用于病毒性疾病、细菌性疾病、寄生虫感染性疾病、肿瘤以及自身免疫性疾病的预防和治疗研究。核酸疫苗，又称DNA疫苗、基因疫苗，就是把外源基因克隆到真核质粒表达载体上，然后将重组的质粒DNA直接注射到动物体内，使外源基因在活体内表达，产生的抗原激活机体的免疫系统，引发免疫反应。相比减毒、灭活疫苗(称为第一代疫苗)和亚单位疫苗(称为第二代疫苗)，核酸疫苗作为第三代疫苗具有如下优势(1)诱导机体产生全面的免疫应答，其保护性免疫应答对不同亚型的病原体具有交叉抵御作用；(2)无减毒、灭活疫苗可能引起的致病作用，具有可靠的安全性；(3)能表达经修饰的天然抗原，具有与天然抗原相同的构象和抗原性；(4)与亚单位疫苗共有的高产性；(5)可将编码不同抗原的基因构建在同一个质粒中，或将不同抗原基因的多种重组质粒联合应用，制备多价核酸疫苗；(6)核酸疫苗既有预防作用，也有治疗作用；(7)生产简便，成本低廉，稳定性好，贮运方便。因此，在不久的将来，核酸疫苗有望成为人类防治疾病的重要手段。

发明内容
本发明的目的是提供一种抗GnRH的核酸疫苗。
本发明的另一目的是提供生产该抗GnRH核酸疫苗的方法。
本发明的还有一个目的是该抗GnRH核酸疫苗的用途。
在本发明的第一个方面，提供了一种抗GnRH的核酸疫苗。该核酸疫苗所用的真核质粒载体框架结构如图1所示，除具有真核表达载体基本元件外，还包含有编码乙肝核心抗原(HBcAg)全基因的核苷酸序列，并在HBcAg的序列中引入一个限制性内切酶的识别位点，在此位点插入了编码3段GnRH重复序列的基因片段，以GnRH3表示。另外，在质粒载体的非编码区域中，插入了含有8个CpG基元的免疫刺激序列，简称(CpG)8，以增强该核酸疫苗的免疫原性。
GnRH为自身抗原，单纯的引入GnRH基因在体内表达并不能刺激机体产生相应的抗体。所以，同蛋白疫苗一样，其也必须与大分子载体物质相偶联，在体内一同表达，以增强GnRH的免疫原性，打破免疫耐受。因此，我们采用HBcAg作为GnRH的免疫载体。HBcAg分子可自动装配成正二十面对称结构的颗粒，该颗粒由240个HBcAg单体组成，表面呈现有120个刺突，HBcAg主要的B细胞抗原决定簇即位于HBcAg颗粒刺突的尖部，称为主要免疫优势区(Maior Immunodominant Region，MIR)。在所有的HBV蛋白成分中，HBcAg颗粒具有很强的免疫原性，可诱导强烈的B细胞、T辅助细胞和细胞毒T细胞(CTL)免疫反应。乙肝核心抗原独特的空间结构和免疫学性质是其作为免疫载体的重要因素，并且在没有其它病毒成份的情况下，能够于外源表达系统中高效表达并正确折叠成自然的颗粒状。异源表位插入分子的主要免疫优势区可使其暴露在颗粒表面，大大增加异源表位局部空间的密度，通过致敏T细胞、抗原递呈和Th细胞激活功能来增强弱免疫原的免疫反应，产生相应的免疫应答，同时也能降低HBcAg自身的免疫原性。因此，HBcAg可作为理想的免疫载体应用于核酸疫苗的研制中。由于HBcAg分子的第80-81位氨基酸位于其颗粒表面刺突的尖部，故在本质粒载体中利用DNA重组技术将编码HBcAg分子的第80-81位氨基酸的核苷酸序列突变为一限制性内切酶(AgeI)位点，便可将编码GnRH的基因序列方便的插入到HBcAg载体中，使得表达后目的多肽理想的呈现于颗粒表面。
研究表明，细菌DNA中含有比例较高的由胞嘧啶核苷酸和鸟嘌呤核苷酸(CpG)为基元组成的免疫刺激序列(immunostimulatory sequences，ISS)，而在脊椎动物DNA中ISS的比例较低，并且，哺乳动物中80％以上的CpG均被甲基化。哺乳动物DNA和细菌DNA的这种显著差别可能是使CpG成为免疫刺激信号的基础。通过对CpG序列的识别，哺乳动物区别于自身DNA把CpG作为一种“危险信号”，激活防御机制，在感染组织中激活淋巴细胞。实验证明，CpG不仅能调节B细胞和T细胞的功能，而且能激活单核细胞(monocytes)、巨噬细胞(macrophages)、树突状细胞(dendritic cells)和NK细胞等多种免疫细胞，并刺激IL-12、TNF-α、IL-6、IFN-γ等多种细胞因子的产生，非特异性的激活免疫系统。CpG的免疫学特性已使其在疫苗和基因治疗方面得到广泛的应用，其可以作为一种有效的佐剂与抗原或质粒载体一同免疫，产生强烈的免疫应答。利用这一原理，可在真核质粒载体中增加CpG以提高核酸疫苗的诱导效率。本核酸疫苗选用了六碱基序列GACGTT作为CpG基元，通过PCR的方法获得了含有8个GACGTT碱基序列的DNA片段，即(CpG)8，插入到真核质粒载体的非编码区域内，以增强GnRH在体内的免疫应答。
最新的研究显示含有线性连接的自身肽多拷贝序列的免疫原能够极大的提高免疫原性，由此受到启发，在研制GnRH的核酸疫苗中，把编码有3段GnRH重复序列的基因插入到所用的真核质粒载体内，以进一步提高GnRH的免疫原性。
综上所述，我们以HBcAg为免疫载体，插入3段GnRH重复序列，整合到真核质粒载体中的编码区域，配以CpG的佐剂效应，提供了一种抗GnRH核酸疫苗。
在本发明的第二方面，提供生产抗GnRH核酸疫苗的方法，其技术路线详述如下1.含有HBcAg全基因和8个CpG基元的真核质粒载体pCR3.1-C-CpG的构建从乙肝病人血样中通过聚合酶链反应(PCR)扩增获得编码HBcAg全长183个氨基酸的基因片段，插入市售的真核表达载体pCR3.1-Uni(Invitrogen，USA)的多克隆位点中，并在HBcAg序列中引入限制性内切酶AgeI的识别位点，以供异源表位的插入。通过重组PCR扩增获得含有8个CpG基元的DNA片段，即(CpG)8，并将其插入pCR3.1-Uni的骨架的非编码区域中，8个CpG基元之间可直接相连，也可以间隔有若干个脱氧核苷酸序列，且由于CpG无位置限制性，故可以插入质粒骨架非编码区的任意位置。由此构建成质粒载体pCR3.1-C-CpG。
2.抗GnRH核酸疫苗真核质粒pCR3.1-C-CpG-GnRH3及相应基因工程菌的构建根据GnRH氨基酸的组成设计引物，通过PCR的方法扩增获得编码3段GnRH重复序列的基因片段，插入到上述所构建的质粒载体的AgeI酶切位点中，组成融合表达的重组质粒pCR3.1-C-CpG-GnRH3，将其转化大肠杆菌DH-5α，筛选后获得重组基因工程菌。
3.基因工程菌的发酵及抗GnRH核酸疫苗真核质粒的大量分离纯化以LB培养基为种子和发酵培养基，于37℃，PH6.8-7.2下进行菌体发酵，结束后离心收集工程菌，用SDS碱裂解法对工程菌中的质粒DNA进行粗提。粗品采用阴离子交换树脂DEAE纤维素DE52纯化，将质粒DNA粗品进样后，以NaCl进行阶段洗脱，先用0.3mol/L NaCl将杂质(少量蛋白质、基因组DNA、低分子量RNA)洗脱除去，再用0.6mol/L NaCl将质粒DNA洗脱收集，所得的收集液用两倍乙醇沉淀，离心去上清后得沉淀即为纯化的质粒DNA。用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测纯化的质粒纯度。
在本发明的第三方面是抗GnRH核酸疫苗的用途。将纯化的抗GnRH核酸疫苗真核质粒直接免疫动物，通过宿主细胞的转译系统在机体内表达出表面呈现有3段GnRH重复多肽的重组HBcAg病毒样颗粒，激发机体的免疫应答，产生GnRH的特异性抗体。抗GnRH抗体能与体内内源的GnRH相结合，阻断GnRH的生理作用。因此，在畜牧业上，GnRH核酸疫苗可以用来代替手术阉割对牲畜和家禽的生殖进行控制；在医学上，该疫苗能用于前列腺癌、乳腺癌、结肠癌等性激素依赖型肿瘤的治疗。另外，质粒DNA骨架上的CpG序列一方面作为佐剂能增强由GnRH引发的体液免疫，提高抗体的水平；另一方面能诱发机体分泌一系列的细胞因子(如IL-12、TNF-α、IL-6等)，作用于肿瘤，抑制肿瘤的生长。本核酸疫苗两个方面发挥作用，共同起到抗肿瘤的作用。


图1.真核表达质粒载体pCR3.1-C-CpG的结构框架图(图A)和抗GnRH核酸疫苗真核质粒pCR3.1-C-CpG-GnRH3(图B)的结构框架图。
图2.抗GnRH核酸疫苗真核质粒pCR3.1-C-CpG-GnRH3中(CpG)8序列的测序结果。
图3.抗GnRH核酸疫苗真核质粒pCR3.1-C-CpG-GnRH3中编码区HBcAg-GnRH3序列的测序结果。
图4.各免疫组小鼠血清中抗GnRH抗体的ELISA检测结果。表明只有抗GnRH核酸疫苗pCR3.1-C-CpG-GnRH3实验组能诱发小鼠体内产生特异性的抗GnRH抗体，而PBS阴性对照组和pCR3.1-C-CpG载体对照组的小鼠体内均无抗GnRH抗体产生。图例*PBS阴性对照组；◇pCR3.1-C-CpG载体对照组；◆pCR3.1-C-CpG-GnRH3实验组图5.小鼠血清的Western检测结果。在硝酸纤维素膜与pCR3.1-C-CpG-GnRH3实验组小鼠的血清作用后，经DAB显色在膜上呈现相应的印迹带，表明pCR3.1-C-CpG-GnRH3实验组能诱发小鼠体内产生特异性的抗GnRH抗体。1.标准分子量蛋白；2.AnsB-GnRH显色条带。
图6.各免疫组小鼠体内肿瘤的平均大小(图A)及平均重量(图B)。以肿瘤与体重的质量比(即每克小鼠体重中肿瘤的毫克数mg/g)来表示肿瘤的重量。结果表明PBS阴性对照组和pCR3.1-C-CpG载体对照组的前列腺癌肿瘤大小无明显差异，而pCR3.1-C-CpG-GnRH3实验组肿瘤的生长得到了明显抑制，其肿瘤大小与pCR3.1-C-CpG载体对照组相比下降了38.1％，与PBS阴性对照组相比下降了38.8％。图例 PBS阴性对照组； pCR3.1-C-CpG载体对照组； pCR3.1-C-CpG-GnRH3实验组具体实施方式
材料(1)菌株和质粒宿主菌Escherichia coli DH-5a是基因工程常用工具菌种，与基因工程研究有关的实验室一般都有保存。
质粒pCR3.1-Uni购自Invitrogen公司。
质粒AnsB-GnRH3内含有编码3段GnRH重复序列的基因片段，由本实验室构建。
(2)乙肝病毒提取自南京市第二医院HBcAg阳性病人血清。
(3)酶和试剂分子克隆工具酶购自MBI公司。
PCR纯化试剂盒、胶回收试剂盒为Promega公司产品。
乙肝病毒基因组提取试剂盒为Qiagen公司产品。
其它试剂为上海生工生物工程有限公司订购。
(4)培养基LB培养基，配方见参考文献Sambrook J，Fristsh E F，Maniatis T.Molecular Cloning；ALaboratory Manual 2nd ed.NYCold Spring Harbor Laboratory Press，1989。该书是基因工程技术的经典著作，在许多高校图书馆都有收藏。
(5)DEAE-Cellulose DE52为Whatman公司产品。
(6)辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠IgG二抗为武汉博士德公司产品。
(7)3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)、二氨基联苯胺(DAB)、过氧化氢尿素和牛血清白蛋白(BSA)为美国西格马(Sigma)公司产品。
(8)96孔酶标板为美国康宁(Corning)公司产品。
(9)硝酸纤维素膜为美国Millipore公司产品。
方法质粒提取、聚合酶链反应、内切酶酶切、DNA片断的回收、连接和转化大肠杆菌在基因工程研究领域，这些都是常规操作方法，参见Sambrook J，Fristsh E F，Maniatis T.MolecularCloning；A Laboratory Manual 2nd ed.NYCold Spring Harbor Laboratory Press，1989，pp.16-340。
核酸的定量测定参见Sambrook J，Fristsh E F，Maniatis T.Molecular Cloning；A LaboratoryManual 2nd ed.NYCold Spring Harbor Laboratory Press，1989，方法进行。
实施例1含有HBcAg全基因和8个CpG基元的真核质粒载体pCR3.1-C-CpG的构建用QIAamp DNA Blood Mini kit从南京市第二医院乙肝阳性病人血清中提取乙肝病毒基因组RNA，并用市场销售的随机引物将RNA反转录为DNA。根据乙肝核心抗原核苷酸序列合成两条引物P1和P4，并以反转录获得的乙肝病毒DNA为模板进行PCR，经94℃预变性5min，然后以94℃变性40s、58℃复性40s、72℃延伸90s共进行30个循环后，再72℃保温10min，获得编码HBcAg全长183个氨基酸的基因片段。然后分两步在HBcAg序列中的第80、8l位氨基酸所对应的核苷酸处引入AgeI位点，为此再次合成两条引物P2和P3。引物P1、P2和P4的5’端分别含有HindIII、AgeI和XbaI酶切位点，引物P3的5’端依次含有PstI和AgeI两个酶切位点。第一步以P1和P3为引物，HBcAg全基因为模板进行PCR，经94℃预变性5min，然后以94℃变性40s、58℃复性40s、72℃延伸50s共进行30个循环后，再72℃保温10min，获得编码HBcAg N端第1-80个氨基酸的基因片段，将其和pCR3.1-Uni均用HindIII、PstI双酶切，用连接酶进行连接得含有HBcAg N端第1-80个氨基酸基因片段的重组质粒。第二步以P2和P4为引物，HBcAg全基因为模板进行PCR，经94℃预变性5min，然后以94℃变性40s、58℃复性40s、72℃延伸60s共进行30个循环后，再72℃保温10min，获得编码HBcAg C端第81-183氨基酸的基因片段，将其和上述含有HBcAg N端第1-80个氨基酸基因片段的重组质粒均用AgeI、XbaI双酶切，用连接酶进行连接得含有HBcAg全基因(第80、81位氨基酸所对应的核苷酸处引入AgeI位点)的真核质粒载体。
选取六碱基序列GACGTT为CpG基元，设计含有8个CpG基元的DNA片段，即(CpG)8，每个CpG基元之间相互插入1-5个寡核苷酸作为间隔。根据此DNA片段设计合成两条相互互补的引物P5和P6，5’端均含有DraIII酶切位点。以P5和P6互为引物和模板进行PCR，经94℃预变性5min，然后以94℃变性40s、58℃复性40s、72℃延伸30s共进行30个循环后，再72℃保温10min，获得(CpG)8的DNA片段，将其和上述构建的HBcAg全基因真核质粒均用DraIII单酶切，用连接酶进行连接使(CpG)8引入HBcAg全基因真核质粒，命名为pCR3.1-C-CpG，其结构框架见图1。将此重组质粒转化大肠杆菌E.coli DH-5α后筛选获得相应的基因工程菌DH-5α/pCR3.1-C-CpG，从该工程菌中抽提的质粒送至上海博亚生物技术有限公司DNA自动测序仪进行测序，以进一步验证CpG序列的正确性，(CpG)8序列测序结果见图2。
6条引物寡核苷酸序列如下P15’AAA AAG CTT ATG GAC ATT GAC ACG TAT AAA GAA 3’P25’ATC ACC GGT CGG GAA TTA GTA GTC GGT TAT GTC AAT G 3’P35’TTT TTC TGC AGA CCG GTT GGG TCT TCC AAA TTA CTT CC 3’P45’TTG TCT AGA CTA ACA TTG AGA TTC CCG AGA TTG3’P55’GGT CAC GTA GTG ACG TTC CTG ACG TTT CCA TGA CGT TCC TGA CGT TTAGAC GTT CTC TG 3’P65’TTT CAC TAC GTG GAT CCA ACG TCG AAC GTC AAA CGT CAG AGA ACGTCT AAA CGT CAG GA3’实施例2抗GnRH核酸疫苗真核质粒pCR3.1-C-CpG-GnRH3的构建根据GnRH多肽的氨基酸序列(EHWSYGLRPG)，设计合成两条引物Gl和G2，5’端均含有AgeI酶切位点。以G1和G2为引物，AnsB-GnRH3质粒为模板进行PCR，经94℃预变性5min，然后以94℃变性40s、58℃复性40s、72℃延伸35s共进行30个循环后，再72℃保温10min，获得编码3段GnRH重复序列的基因片段，将其和pCR3.1-C-CpG质粒均用AgeI单酶切，用连接酶进行连接使3段GnRH重复序列基因插入pCR3.1-C-CpG质粒中，即构建成质粒载体pCR3.1-C-CpG-GnRH3，其结构框架图见图1。将此重组质粒转化大肠杆菌E.coliDH-5α后筛选获得相应的基因工程菌DH-5α/pCR3.1-C-CpG-GnRH3，从该工程菌中抽提的质粒送至上海博亚生物技术有限公司DNA自动测序仪进行测序，以进一步验证HBcAg-GnRH3整个序列及其阅读框的正确性，测序结果图3。
2条引物寡核苷酸序列如下G15’AAG ATC TTC AAC CAG TAC ACC GGT CCG GAA CAT TGG AGC 3’G25’CTC CGG AGC AGG GCA CGG CGG ACC GGT ACC ACC CGG ACG CAG ACC 3’实施例3基因工程菌的发酵及抗GnRH核酸疫苗真核质粒的大量分离纯化从平皿中挑取工程菌的单菌落接入新鲜的LB液体培养基中，37℃振摇培养8h至对数期作为种子液，以1/250接种量接入到含250mlLB液体培养基的1000ml摇瓶中，37℃剧烈振摇培养12-16h。所得发酵液于5000rpm 4℃离心15min，然后将细菌沉淀物重悬于9ml溶液I[50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，10mmol/L EDTA(pH8.0)]中，再加入100μlRNaseA溶液[10mg/ml RNase A，10mmol/L Tris-HCl(pH7.5)，15mmol/L NaCl]，充分混匀后冰浴10min。缓慢加入20ml新配制的溶液II
，轻轻混匀后于室温放置5min。加入10ml用冰预冷的溶液III[5mol/L KAc 60ml，HAc 11.5ml，H2O 28.5ml]，充分混匀内容物，至不再出现分明的两个液相为止，然后冰浴10min。于4℃12000rpm离心30min，弃去沉淀物，上清液中加入0.6倍体积的异丙醇，充分混匀至不出现分层后室温放置10min。室温以12000rpm离心30min，弃上清，沉淀用70％乙醇洗涤，待乙醇挥发尽后用2ml的TE(pH8.0)缓冲液溶解沉淀，即得质粒DNA粗品。粗品采用阴离子交换树脂DEAE纤维素DE52纯化，将质粒DNA粗品进样后，以NaCl进行阶段洗脱，先用0.3mol/L NaCl将杂质(少量蛋白质、基因组DNA、低分子量RNA)洗脱除去，再用0.6mol/LNaCl将质粒DNA洗脱收集，所得的收集液用两倍乙醇沉淀，离心去上清后得沉淀即为纯化的质粒DNA。用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测纯化的质粒纯度并进行定量。
实施例4抗GnRH核酸疫苗免疫动物用无菌的PBS(磷酸缓冲液)将核酸疫苗或载体质粒稀释至终浓度为1μg/μl。取5周龄C57BL/6雄性小鼠，pCR3.1-C-CpG-GnRH3实验组、pCR3.1-C-CpG载体对照组和PBS阴性对照组各12只。每次免疫前在每只小鼠的两侧胫骨前肌各注射50μl的0.25％布比卡因，共100μl，进行预处理，5天后于每只小鼠两侧胫骨前肌各注射50μl的PBS或相应组质粒溶液(1μg/μl)，共100μl，每隔2周加强免疫1次(免疫前5天仍注射布比卡因)，共3次，第2次免疫后1、2、4、6、8、10周眼底静脉丛取血，离心取血清-20℃冷冻保存，留待检测。
实施例5抗GnRH抗体的ELISA检测以纯化的AnsB-GnRH融合蛋白为包被抗原4℃过夜包被96孔ELISA酶标板，每孔100μg融合蛋白。包被后，用5％牛血清白蛋白(BSA)溶液在37℃满孔封闭1小时。实施例4中所得的抗血清用pH7.5的PBS(含5％BSA)稀释50倍，然后每孔加入100μl稀释后的抗血清于37℃作用1小时。用PBST(含0.05％Tween-20)洗涤6次后每孔加入100μl以1∶20000稀释的羊抗小鼠IgG二抗(辣根过氧化物酶标记)，37℃作用1小时。PBST洗涤6次后，每孔加入100μl过氧化氢尿素和3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)溶液于37℃显色20分钟后，加入50μl 2MH2SO4终止反应，并于450nm波长下，测定各孔吸光度值。小鼠血清的ELISA检测结果见图4，可以看出，只有核酸疫苗pCR3.1-C-CpG-GnRH3实验组的小鼠体内产生特异性的抗GnRH抗体。
实施例6抗GnRH抗体的Western检测将纯化的AnsB-GnRH融合蛋白与标准分子量蛋白经15％的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)后，于30V电压电泳过夜转印到硝酸纤维素膜上；用PBS漂洗膜数次后在室温下将膜放入5％BSA封闭液中搅动孵育2小时，再用PBS漂洗2次，每次5min；实施例4中所得的抗血清稀释10倍后与硝酸纤维素膜37℃下搅动孵育1小时，用PBS将膜漂洗4次，每次5min；加入稀释400倍的羊抗小鼠IgG-HRP(辣根过氧化物酶)二抗，再与硝酸纤维素膜37℃下搅动孵育1小时后，用PBS将膜漂洗4次，每次5min；最后加入DAB显色试剂显色10min。小鼠血清的Western检测结果见图5，在硝酸纤维素膜与pCR3.1-C-CpG-GnRH3实验组小鼠的血清作用后，经DAB显色在膜上呈现相应的印迹带，表明pCR3.1-C-CpG-GnRH3实验组能诱发小鼠体内产生特异性的抗GnRH抗体。
实施例7抗GnRH核酸疫苗的药效学研究用无菌的PBS将核酸疫苗或载体质粒稀释至终浓度为1μg/μl。取5周龄C57 BL/6雄性小鼠，pCR3.1-C-CpG-GnRH3实验组、pCR3.1-C-CpG载体对照组和PBS阴性对照组各7只。每次免疫前在每只小鼠的两侧胫骨前肌各注射50μl的0.25％布比卡因，共100μl，进行预处理，5天后于每只小鼠两侧胫骨前肌各注射50μl的PBS或相应组质粒溶液(1μg/μl)，共100μl，每隔2周加强免疫1次(免疫前5天仍注射布比卡因)，共3次。3次免疫结束后两周每只小鼠接种RM-1前列腺癌细胞。
用戊巴比妥钠溶液麻醉小鼠，解剖，暴露前列腺，于每只小鼠前列腺内接种0.02ml(2×107个/ml)RM-1小鼠前列腺癌细胞后，用手术针线缝合小鼠。30天后，处死每组小鼠，剥离肿瘤，称重，用福尔马林溶液固定，比较各组肿瘤大小情况。
以肿瘤与体重的质量比(即每克小鼠体重中肿瘤的毫克数)来表示肿瘤的重量，经称量，每组肿瘤平均大小及平均重量见图6。可以看出，PBS阴性对照组和pCR3.1-C-CpG载体对照组的前列腺癌肿瘤大小无明显差异，而pCR3.1-C-CpG-GnRH3实验组肿瘤的生长得到了明显抑制，其肿瘤大小与pCR3.1-C-CpG载体对照组相比下降了38.1％，与PBS阴性对照组相比下降了38.8％。
权利要求
1.一种抗促性腺激素释放激素(GnRH)核酸疫苗，其特征为真核质粒载体内含有编码乙肝核心抗原(HBcAg)的DNA序列，并在该序列中插入编码3段GnRH多肽重复序列的基因片段。同时在该核酸疫苗真核质粒载体的非编码区域中引入具有免疫刺激作用的CpG序列。
2.权利要求2所述的核酸疫苗，其特征为HBcAg颗粒表面插入了3段GnRH重复多肽，以增强GnRH自身的免疫原性。GnRH为一10肽激素，因此插入的3段GnRH重复多肽的氨基酸序列为GluHisTrpSerTyrGlyLeuArgProGlyGluHisTrpSerTyrGlyLeuArgProGlyGluHisTrpSerTyrGlyLeuArgProGly。
3.权利要求1所述的核酸疫苗，其特征为用于核酸疫苗的真核质粒载体非编码区内插入了由8个CpG基元组成的免疫刺激序列，简称(CpG)8。该核酸疫苗选用了六碱基序列GACGTT作为CpG基元，每个CpG基元之间相互插入1-5个寡核苷酸作为间隔。由于CpG没有位置限制性，故可以插入质粒骨架非编码区内的任意位置，发挥其免疫刺激作用，增强GnRH在体内的免疫应答。
4.一种生产该抗GnRH核酸疫苗的方法，包括用化学合成法和PCR法合成编码3段GnRH重复序列、乙肝核心抗原及(CpG)8的DNA片段，将这些片段分步插入真核质粒载体，构建重组质粒，并转化大肠杆菌筛选获得相应的基因工程菌。工程菌经发酵后用SDS碱裂解法对质粒DNA进行粗提，得到的粗品经阴离子交换树脂DEAE纤维素DE52纯化后，用乙醇沉淀得质粒DNA纯品。
5.根据权利要求1所述的核酸疫苗，其特征在于免疫动物后能诱发机体产生特异性的抗GnRH抗体，该抗体与体内的GnRH结合，阻断GnRH发挥其生理作用，可用于前列腺癌、乳腺癌、结肠癌等性激素依赖型肿瘤的治疗，也可用于对牲畜和家禽进行生育控制。
6.根据权力要求1所述的抗GnRH核酸疫苗，其特征在于可与药物载体组合制成药物组合物。
7.根据权力要求1所述的抗GnRH核酸疫苗，其特征在于可与其他药物活性成分组合制成药物组合物。
全文摘要
本发明提供一种抗促性腺激素释放激素(GnRH)核酸疫苗及制备方法。该核酸疫苗以乙肝核心抗原为免疫载体，插入3段GnRH重复序列，以增强GnRH的免疫原性。同时在该核酸疫苗真核质粒载体的非编码区域内引入了多个未甲基化的胞嘧啶核苷酸和鸟嘌呤核苷酸(CpG)基元组成的免疫刺激序列。该核酸疫苗免疫机体后能诱发机体产生特异性的抗GnRH抗体，并能与体内内源的GnRH相结合，阻断GnRH发挥其生理作用，可用于前列腺癌、乳腺癌、结肠癌等性激素依赖型肿瘤的治疗，也可用于对牲畜和家禽进行生育控制。
文档编号A61P35/00GK1596977SQ20041004144
公开日2005年3月23日 申请日期2004年7月21日 优先权日2004年7月21日
发明者刘景晶, 朱政, 端鹏, 徐进署, 茅丹, 吴洁, 曹荣月 申请人:中国药科大学