专利名称：甘草甜素的新用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及甘草甜素的新用途。
背景技术：
恶性肿瘤已经成为危害人类健康最严重的一类疾病。目前，治疗恶性肿瘤的常用方法有外科手术、化学药物、放射治疗、生物疗法和中医中药，其中以外科手术、化学药物、放射治疗最为常用。化学药物和放射治疗在肿瘤的治疗方面应用广泛，主要是通过直接抑制或破坏肿瘤细胞生长或通过提高机体抗病能力而杀伤瘤细胞；但是这些治疗除对瘤细胞产生作用外，对人体正常细胞，特别是造血等生长活跃细胞也产生明显抑制作用，副作用很大。因此治疗期间病人常有血细胞降低、胃肠道出血、恶心、呕吐等症状，严重影响着抗肿瘤放化治疗的临床应用。
细胞保护剂是指选择性保护正常组织，使其免于化/放疗的毒性作用，而又不影响抗肿瘤作用的一类药物。它通过提高病人对化/放疗的耐受性而使治疗剂量强度加大，从而提高肿瘤治愈率，同时降低各种并发症的发生，改善病人生活质量，并减少用于支持治疗及并发症治疗的费用。目前，临床医学认可的细胞保护剂有三种美司钠、右雷佐生和氨磷汀。美司钠和右雷佐生是针对某类化疗药物，特异性保护某种器官的细胞保护剂，如美司钠用于异环磷酰胺以及大剂量环磷酰胺所致出血性膀胱炎。而氨磷汀则是迄今为止世界上第一个被承认的广谱细胞保护剂。氨磷汀最早是由美国WalterReed军事研究所从4400多种化学物质中筛选出来的最有效的防护核辐射的药物，为半胱胺酸衍生物硫磷酸盐，在体内可被碱性磷酸酶(ALP)催化成活性代谢物——含自由巯基的WR-1065，而后由细胞摄入发挥防止化疗药物或放疗引起的毒害的保护作用。另外，研究表明，氨磷汀的体内代谢产物还有二硫化合物WR-33278、半胱胺、左旋半胱氨酸、左旋谷胱甘肽及含琉基蛋白质，其中以WB-1605的细胞保护作用最为主要，其次为WR-33278、半胱胺酸。氨磷汀虽然是广谱细胞保护剂，但它并非对所有的抗肿瘤药物都有效。
作为中药的主要成份，甘草在临床上使用已有悠久的历史，以其用量大、范围广而被称为药王，具有清热解毒、调和诸药等功效。已有资料表明，甘草及各种制剂对多种药物中毒、食物中毒、体内代谢产物中毒及细菌毒素等均有一定的解毒能力，其解毒作用的有效成分主要为甘草甜素(glyCyrrhizic acid，GA)。甘草甜素(glycyrrhizin，glycyrrhizic tritepenoid compounds)是从中药甘草中提取的一类化合物的总称，是甘草酸铵、钙、钠和钾盐的混合物，经水解后可产生葡萄糖醛酸和甘草次酸(Glycyrrhetinic acid)，后者是甘草甜素的主要活性成分。甘草甜素的主要化合物包括甘草酸单钾盐、甘草酸二钾盐、甘草酸三钾盐、甘草酸单铵、甘草酸二铵、甘草酸三铵、甘草酸二钠、甘草酸三钠、甘草酸钙盐等。甘草酸母核化学名称为20b羧基-11-氧代正齐墩果烷-12-烯-3b基-2-O-b-D-葡萄吡喃糖苷醛酸基-a-D-葡萄吡喃糖苷醛酸，结构式如式I。甘草甜素具有抗炎、抗病毒、细胞免疫调节剂和保肝等多种功效。
发明内容本发明的目的是提供一种甘草甜素的新用途。
本发明发明人的研究表明，甘草甜素具有细胞保护作用，可以作为细胞保护剂与抗肿瘤药物联合应用，在提高或不影响抗肿瘤药物疗效的基础上，以降低抗肿瘤药物的毒副作用。
在应用时，甘草甜素可单独配制或同时与抗肿瘤药组合配制，制成复方药物制剂，与抗肿瘤药物一起使用，抗肿瘤药物包括但不限于环磷酰胺、丝裂霉素、甲氨喋呤、羟基喜树碱、紫杉醇、顺铂、卡铂、异环磷酰胺、表柔比星、依托泊甙、替尼泊甙等，需要的时候还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。常用剂型有片剂、胶囊、软胶囊、滴丸、注射液、冻干粉针、口服液、分散片等，均可以按照药学领域的常规方法制备。使用剂量为10mg-2.0g甘草甜素/人·天。当甘草甜素独立使用时，患者既可以在同一时间内同时使用甘草甜素和抗肿瘤药物，也可以先使用甘草甜素，待达到有效血药浓度时，再同时使用甘草甜素和抗肿瘤药物，还可以在停用抗肿瘤药物后，再使用一定时间的甘草甜素。
在实际应用中，还可以将独立包装的甘草甜素和至少一种抗肿瘤药物制剂共同包装制成具有细胞保护作用的抗肿瘤药物制剂盒。为了方便使用，制剂盒中还可以包括稀释剂和使用说明书。
本发明证实甘草甜素可降低多种抗肿瘤药物的毒副作用，同时提高或不影响抗肿瘤药物的抗肿瘤效果，如环磷酰胺(英文名Cyclophosphamide，化学名P-[N，N-双(β-氯乙基)]-1-氧-3-氮-2-磷杂环己烷-P-氧化物-水合物)、丝裂霉素(英文名Mitomycin，化学名5-氨基-3-氨基甲酰氧甲基-2-甲氧基-2，3-二氢-4，7-吲哚醌骈(1，2)-吡咯烷骈-(9，10)-氮丙啶)、甲氨喋呤(英文名Methotrexate，化学名L-(+)-N-[4-[[(2，4-二氨基-6-蝶啶基]甲基]甲氨基]苯甲酰基)谷氨酸)、羟基喜树碱(英文名Hydroxycamptothecin，化学名10-羟基喜树碱)、紫杉醇(英文名Paclitaxel，化学名5β，20-环氧-1，2α，4，7β，10β，13α-六羟基紫杉醇烷-11-烯-9-酮-4，10-二乙酸酯-2-苯甲酸酯-13-[(2’R.3’S)-N-苯甲酰-3-苯基异丝氨酸酯)、顺铂(英文名Cisplatin，化学名(Z)-二氨二氯铂)、卡铂(英文名Carboplatin，化学名顺式-1，1-环丁烷二羧酸二氨铂)、异环磷酰胺(英文名Ifosfamide，化学名3-(2-氯乙基)-2-[(2-氯乙基)氨基]四氢2H-1-氧-3-氮-2-磷杂环己烷-2-氧化物)、表柔比星(又名表阿霉素，英文名Epirubicin、4-Epidoxorubicin，化学名(7S9S)-9-羟乙酰基-4-甲氧基-7，8，9，10-四氢-6，7，9，11-四羟基-7-O-(2，3，6-三去氧-3-氨基α-L-阿拉伯吡喃糖基)-5，12-萘二酮盐酸盐)、依托泊甙(英文名Etopside，化学名4’-去甲基表鬼臼毒素-β-D-乙叉吡喃葡萄糖甙)、替尼泊甙(英文名Teniposide，化学名4′-去甲基表鬼臼毒素-b-D-噻吩亚甲基吡喃葡萄糖甙)等。
甘草甜素作为甘草的一种提取物，毒副作用很低，与氨磷汀相比，甘草甜素的细胞保护作用的作用谱更广，具有重要的临床意义和良好的应用前景。
图1为甘草甜素对HCPT(羟基喜树碱)的细胞毒性影响曲线图2为甘草甜素对MTX(甲氨喋呤)的细胞毒性影响曲线图3为甘草甜素对ISM(异环磷酰胺)的细胞毒性影响曲线
具体实施例方式
实施例1、甘草甜素对体外培养血管内皮细胞的保护作用EVC304细胞株购自解放军军事医学科学院；RPMI-1640培养基、胎牛血清、胰蛋白酶购自Hyclone公司，其他试剂均购自Sigma公司，甘草甜素购自宁夏灵武药业有限公司，抗肿瘤药为市售注射液或粉针。
ECV304细胞按内皮细胞常规法进行培养，将培养的生长正常的ECV304细胞按每孔5*104细胞分别接种于96孔板，37℃培养12小时后換含有甘草甜素100μg/ml的新鲜培养液，空白对照換含有等体积生理盐水的新鲜培养液，37℃培养1小时，然后加入不同浓度的抗肿瘤药物(羟基喜树碱(HCPT)、甲氨喋呤(MTX)、异环磷酰胺αISM))，继续培养24小时，用MTT法测定细胞增殖状态。取出96孔培养板，每孔加入MTT溶液(5mg/ml)20μl，37℃继续培养4小时后终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，每孔加入150μl DMSO，振荡10分钟，使结晶物充分溶解，选择490nm波长，在酶标仪上测定各孔的吸光值。绘制甘草甜素对抗肿瘤药物的细胞毒性影响增殖曲线，结果分别如图1、图2、图3所示。
从图1可以看出，与生理盐水对照相比，100μg/ml甘草甜素无明显的细胞毒性，6-56μg/ml羟基喜树碱(HCPT)呈现明显的细胞毒性，加入甘草甜素可保护由羟基喜树碱所致的细胞毒性，使细胞增殖曲线右移。图2、图3结果表明，甘草甜素对甲氨喋呤、异环磷酰胺也呈现相似的细胞保护作用0.5-12μg/ml甲氨喋呤呈现明显的细胞毒性，甘草甜素使细胞增殖曲线右移；20-7680μg/ml异环磷酰胺也呈现比较明显的细胞毒性，甘草甜素也使细胞增殖曲线右移。
实施例2、甘草甜素对抗肿瘤药物所致小鼠骨髓毒性作用的影响1、实验材料甘草甜素购自宁夏灵武药业有限公司，抗肿瘤药为市售注射液或粉针，药物名称列于表1。
实验选用昆明种小鼠，体重18-22克，雄雌兼用，由军事医学科学院动物中心提供。
2、实验方法取小鼠230只，雄雌各半，随机分成23组，即抗肿瘤药若干组、抗肿瘤药加甘草若干组和生理盐水组，腹腔注射给药，抗肿瘤药每天一次，甘草甜素或生理盐水每天两次，连续给药7天。停药后次日，眼底取血，按常规检验方法测定白细胞计数，结果如表1所示。
结果表明，甘草甜素能对抗环磷酰胺、丝裂霉素、甲氨喋呤、羟基喜树碱、紫杉醇、顺铂、卡铂、异环磷酰胺、依托泊甙、替尼泊甙等对小鼠造血功能的抑制作用，可以显著减轻所引起的白细胞减少。
表1.甘草甜素对抗肿瘤药所致小鼠骨髓毒性作用的影响
*p＜0.05(与单用抗肿瘤药组比较)实施例3、甘草甜素对抗肿瘤药物小鼠体内抑瘤作用的影响实验材料与实施例2相同，选用实体肉瘤是s-180细胞株，接种及疗效评价按“抗肿瘤药物体内筛选规程”进行。
取昆明种小鼠230只，雄雌各半，体重18-22克，颈部接种瘤细胞，随机分成23组，即抗肿瘤药若干组、抗肿瘤药加甘草若干组和生理盐水组，24小时后，腹腔注射给药，抗肿瘤药每天一次，甘草甜素或生理盐水每天两次，连续给药7天。停药后次日处死，剥离出瘤体称重，并计算瘤体抑制率，结果如表2所示。
结果表明，与单用抗肿瘤药组比较，加入甘草甜素联合使用，可增强环磷酰胺的抗肿瘤效果，对丝裂霉素、甲氨喋呤、羟基喜树碱、紫杉醇、顺铂、卡铂、异环磷酰胺、表柔比星、依托泊甙、替尼泊甙的小鼠体内抑瘤作用未见显著影响。
表2.甘草甜素对抗肿瘤药小鼠体内抑瘤作用的影响
*p＜0.05(与单用抗肿瘤药组比较)实施例4、甘草甜素对抗肿瘤药物所致小鼠死亡率的影响1、材料甘草甜素购自宁夏灵武药业有限公司，抗肿瘤药为市售注射液或粉针，药物名称列于表3。
实验选用昆明种小鼠，体重18-22克，雄雌兼用，由军事医学科学院动物中心提供。
2、方法取小鼠230只，雄雌各半，即抗肿瘤药若干组、抗肿瘤药加甘草若干组和生理盐水组，腹腔注射给药，抗肿瘤药每天一次，甘草甜素或生理盐水每天两次，连续给药7天，同时记录小鼠的死亡及死亡时间，结果如表3所示。停药后次日，处死剩余小鼠，记录168小时为被处死小鼠的死亡时间。
结果表明，甘草甜素可明显降低多种抗肿瘤药物所致的小鼠死亡数或延长平均死亡时间。
表3.甘草甜素对抗肿瘤药物所致小鼠死亡时间的影响
实施例5、甘草甜素与抗肿瘤药物复方制剂的制备1、复方甘草甜素环磷酰胺胶囊取甘草甜素10克、环磷酰胺10克、淀粉4克、微晶纤维素1克。将淀粉先进行干燥，过120目筛，然后与甘草甜素、环磷酰胺、微晶纤维素混合均匀，过两次120目筛，填入硬胶囊中，每粒内含环磷酰胺100毫克、甘草甜素100毫克。
2、复方甘草甜素甲氨喋呤胶囊取甘草甜素10克、甲氨喋呤1克、淀粉13克、微晶纤维素1克。将淀粉先进行干燥，过120目筛，然后与甘草甜素、甲氨喋呤、微晶纤维素混合均匀，过两次120目筛，填入硬胶囊中，每粒内含甲氨喋呤10毫克、甘草甜素100毫克。
3、复方甘草甜素丝裂霉素冻干粉针取甘草甜素10克、丝裂霉素0.5克、甘露醇5克。将甘露醇加入150ml去离子水中溶解，同时将丝裂霉素加入100ml无水乙醇中溶解，合并两溶液，加入甘草甜素，加去离子水至300ml，过滤除菌，以3ml每瓶灌装，冷冻干燥，制成冻干粉针，每瓶内含丝裂霉素5毫克、甘草甜素100毫克。
4、复方甘草甜素羟基喜树碱冻干粉针取甘草甜素10克、羟基喜树碱0.2克、甘露醇1克。将甘露醇加入150ml去离子水中溶解，同时将羟基喜树碱加入10ml 5.6％的碳酸氢钠溶液中溶解，合并两溶液，加入甘草甜素，加去离子水至300ml，过滤除菌，以3ml每瓶灌装，冷冻干燥，制成冻干粉针，每瓶内含羟基喜树碱2毫克、甘草甜素100毫克。
5、复方甘草甜素紫杉醇注射液取甘草甜素10克、紫杉醇1克、蓖麻油88克、149.1ml无水乙醇。先将紫杉醇加入149.1ml无水乙醇中溶解，再加入蓖麻油，缓慢加去离子水至250ml，加入甘草甜素，加去离子水至300ml，过滤除菌，以3ml每瓶灌装，制成注射液，每瓶内含紫杉醇10毫克、甘草甜素100毫克。
6、复方甘草甜素顺铂注射液取甘草甜素10克、顺铂0.5克、氯化钠4.5克。将甘草甜素、顺铂、氯化钠加入250ml去离子水中，用0.1M NaOH调pH至7.4，加去离子水至300ml，过滤除菌，以3ml每瓶灌装，冷冻干燥，制成注射液，每瓶内含顺铂5毫克、甘草甜素100毫克。
7、复方甘草甜素卡铂注射液取甘草甜素10克、卡铂3克、甘露醇3克。将甘露醇加入150ml去离子水中溶解，同时将卡铂加入100ml去离子水中溶解，合并两溶液，加入甘草甜素，加去离子水至300ml，过滤除菌，以3ml每瓶灌装，制成注射液，每瓶内含卡铂30毫克、甘草甜素100毫克。
8、复方甘草甜素异环磷酰胺冻干粉针取甘草甜素10克、异环磷酰胺60克。将甘草甜素、异环磷酰胺加入150ml去离子水中溶解，加去离子水至300ml，过滤除菌，以3ml每瓶灌装，冷冻干燥，制成冻干粉针，每瓶内含异环磷酰胺60毫克、甘草甜素100毫克。
9、复方甘草甜素表柔比星冻干粉针取甘草甜素10克、盐酸表柔比星5克、氯化钠4.5克。将甘草甜素、盐酸表柔比星、氯化钠加入250ml去离子水中，调pH至3.0，加去离子水至300ml，过滤除菌，以3ml每瓶灌装，冷冻干燥，制成冻干粉针，每瓶内含表柔比星5毫克、甘草甜素100毫克。
10、复方甘草甜素依托泊甙胶囊取甘草甜素10克、依托泊甙1克、淀粉13克、微晶纤维素1克。将淀粉先进行干燥，过120目筛，与甘草甜素、依托泊甙、微晶纤维素混合均匀，过两次120目筛，填入硬胶囊中，每粒内含依托泊甙10毫克、甘草甜素100毫克。
权利要求
1.甘草甜素作为细胞保护剂的应用。
2.甘草甜素在制备细胞保护剂中的应用。
3.具有细胞保护作用的抗肿瘤药物，是甘草甜素与至少一种抗肿瘤药物的复方组合物。
4.根据权利要求3所述的药物，其特征在于所述抗肿瘤药物选自环磷酰胺、丝裂霉素、甲氨喋呤、羟基喜树碱、紫杉醇、顺铂、卡铂、异环磷酰胺、表柔比星或依托泊甙。
5.根据权利要求3或4所述的药物，其特征在于所述药物的剂型是片剂、胶囊、软胶囊、滴丸、注射液、冻干粉针、口服液或分散片。
6.具有细胞保护作用的抗肿瘤药物制剂盒，它包括独立包装的甘草甜素和至少一种抗肿瘤药物制剂。
7.根据权利要求6所述的制剂盒，其特征在于所述制剂盒还包括稀释剂。
8.根据权利要求6或7所述的制剂盒，其特征在于所述制剂盒内还包括使用说明书。
全文摘要
本发明公开了甘草甜素的新用途。本发明发明人的研究表明，甘草甜素具有细胞保护作用，可以作为细胞保护剂与抗肿瘤药物联合应用，在提高或不影响抗肿瘤药物疗效的基础上，以降低抗肿瘤药物的毒副作用，有效剂量为10mg－2.0g甘草甜素/人·天。甘草甜素作为甘草的一种提取物，毒副作用很低；与氨磷汀相比，甘草甜素的细胞保护作用的作用谱更广，具有重要的临床意义和良好的应用前景。
文档编号A61K31/7028GK1712014SQ20041004804
公开日2005年12月28日 申请日期2004年6月14日 优先权日2004年6月14日
发明者马文·F·刘 申请人:马文·F·刘