化学上定义的非聚合价平台分子和其偶联物的制作方法

专利名称：化学上定义的非聚合价平台分子和其偶联物的制作方法
本申请是申请日为1994年9月8日，申请号为94193993.6，发明名称为“化学上定义的非聚合价平台分子和其偶联物”的中国发明专利申请的分案申请。
本发明涉及用于治疗诸如自身免疫疾病全身性红斑狼疮(SLE或“狼疮”)的含有与生物或合成分子如多核苷酸偶联的化学上定义的非聚合价平台分子(valency platform molecule)的偶联物。本发明还涉及这种化学上定义的非聚合价平台分子。
已有多种化合物作为生物有用分子的载体用于制备被认为是致免疫耐受的偶联物。例如，Benacerraf、katz和他们的同事研究并介绍了D-谷氨酸/D-赖氨酸无规共聚物与半抗原和各种抗原的偶联物用于诱导特异的免疫耐受性，这种无规共聚物在早期文献中称为D-GL(以下称为D-EK)。见美国专利4,191,668和4,220,565。
其他研究者已研究了核苷或DNA与其他载体的偶联物。 Borel等(Science(1973)18276)在年青NZB系小鼠中评价了同源鼠IgG-核苷偶联物降低对变性DNA抗体反应的能力。Parker(J.Im-munol.(1974)113292)等独立研究评价了与聚-D-赖氨酸和/或环磷酰胺偶联的变性DNA对上述综合症在NZB小鼠中发展的作用。
在后期的文章(Ann NY Acad.Sci.(1986)475296-306)中，Borel等描述了寡核苷酸-免疫球蛋白偶联物。Borel等(J.Clin.In-vest.(1988)821901-1907或美国专利4,650,675)描述了使用人免疫球蛋白与DNA偶联物的体外研究。美国专利5,126,131(Dintzis等)还涉及包含载体和免疫应答中所涉及分子的偶联物。
其他文献描述了非免疫原性聚合物和免疫原的偶联物(Saski等，Scand.J.Immun.(1982)16191-200；Sehon，Prog.Allergy(1982)32161-202；Wilkinson等，J.Immunol.(1987)139326-331，和Borel等，J.Immunol.Methods(1990)126159-168)。
公有的美国专利流水号07/914 869，美国专利5,162,515和07/652,658中描述了含聚合载体如D-EK、聚乙二醇、聚-D-赖氨酸、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮以及免疫球蛋白的偶联物。
总之，申请人相信现有技术中显示的只是具有许多非特异性结合位点的定义不清的化学化合物用作偶联物中的价平台分子。因为这种化合物的价、结合位点的具体位置、和结合位点的数目都是不可预测的并且变化范围宽，所以含有这种化合物的现有技术偶联物不能重现，并且报导的活性范围宽。
与上述的现有技术不同，申请人开发了含化学上定义的、非聚合的价平台分子的偶联物，其中价平台分子的价是预先确定的，而且其中每个结合位点可供结合生物或合成分子。在本发明中用化学结构、价、均一性和适于与适当生物和/或合成分子有效偶联的确定的化学特性来定义价平台分子。
因此，本发明的一个方面涉及含有这种化学上定义的非聚合价平台分子和生物和/或合成分子的偶联物。适于与化学上定义的非聚合价平台分子偶联形成本发明偶联物的生物和/或合成分子的例子为糖、药物、脂类、脂多糖、肽、蛋白、糖蛋白、单链或双链寡核苷酸和其化学类似物、免疫原类似物、半抗原、拟表位(mimotope)、ap-tamer等。在本发明中适用的化学上定义的非聚合价平台分子包括但不限于下式的生物相容的非免疫原性碳基化合物的衍生物G[1]{T[1].}n[1]]]>式1或G[2]{L[2]-J[2]-Z[2](T[2])p[2]}n[2]]]>式2其中每个G[1]和G[2]存在时独立地为含有1-2000(更优选1-1000)个选自C、N、O、Si、P和S的链原子的线性、支化或多支化链；更优选，G[2]存在时为从聚醇、聚胺或聚酯衍生的残基；最优选G[2]选自-(CH2)q-(其中q＝0到20)、-CH2(CH2OCH2)rCH2-(其中r＝0到300)和C(CH2OCH2CH2-)s(OH)4-s(其中s＝1到4，更优选s＝3到4)；n[1]个T[1]所示残基和p[2]×n[2]个T[2]所示残基中每个独立地选自NHRSUB(胺)，C(＝O)NHNHRSUB(酰肼)，NHNHRSUB(肼)，C(＝O)OH(羧酸)，C(＝O)ORESTER(活化酯)，C(＝O)OC(＝O)RB(酸酐)，C(＝O)X(羧酰卤)，S(＝O)2X(磺酰卤)，C(＝NRSUB)ORSUB(亚氨酸酯)，NCO(异氰酸酯)，NCS(异硫氰酸酯)，OC(＝O)X(卤代甲酸酯)，C(＝O)OC(＝NRSUB)NHRSUB(碳化二亚胺加成物)，C(＝O)H(醛)，C(＝O)RB(酮)，SH(巯基或硫醇)、OH(醇)，C(＝O)CH2X(卤代乙酰基)，RAlkX(卤代烷)，S(＝O)2ORAlkX(磺酸烷酯)，其中R1R2为-C(＝O)CH＝CHC(＝O)-的NR1R2(马来酰亚胺)，C(＝O)CRB＝CR2B(α，β-不饱和羰基)，RAlk-Hg-X(烷基汞化合物)和S(＝O)CRB＝CR2B(α，β-不饱和砜)；更优选，n[1]个T[1]所示残基和p[2]×n[2]个T[2]所示残基中每个独立地选自NHRSUB(胺)，C(＝O)CH2X(卤代乙酰)，RAlkX(卤代烷)，S(＝O)2ORAlkX(磺酸烷酯)，其中R1R2为-C(＝O)CH＝CHC(＝O)-的NR1R2(马来酰亚胺)，C(＝O)CRB＝CR2B(α，β-不饱和羰基)，RAlk-Hg-X(烷基汞化合物)，和S(＝O)CRB＝CR2B(α，β-不饱和砜)；更优选，n[1]个T[1]所示残基和p[2]×n[2]个T[2]所示残基中，每个独立地选自NHRSUB(胺)，C(＝O)CH2X(卤代乙酰)，其中R1R2为-C(＝O)CH＝CHC(＝O)-的NR1R2(马来酰亚胺)和C(＝O)CRB＝CR2B(α，β-不饱和羰基)；最优选，n[1]个T[1]所示残基和p[2]×n[2]个T[2]所示残基均相同；其中每个X独立地为原子序数大于16而小于54的卤素或其他好的离去基团(即，在此情形中与卤素作用相似的弱碱，如烷基或烷基取代的磺酸酯或硫酸酯和类似物，芳基或芳基取代的磺酸酯或硫酸酯和类似物)；每个RAlk独立地为H，线性、支化或环形烷基(1-20C)；
每个RSUB独立地为H，线性、支化或环形烷基(1-20C)，芳基(6-20C)，或烷芳基(7-30C)；每个RESTER独立地为N-琥珀酰亚氨基，对硝基苯基，五氟苯基，四氟苯基，五氯苯基，2，4，5-三氯苯基，2，4-二硝基苯基，氰基甲基等，或其他活化基团如5-氯-8-喹诺酮-1-基，1-哌啶基，1-苯并三唑基等；每个RB独立地为含1-50个选自C、H、N、O、Si、P和S的原子的基团；n[2]个L[2]所示残基，存在时每个独立地选自O、NRSUB和S；n[2]个J[2]所示残基，存在时每个独立地选自C(＝O)和C(＝S)；n[1]＝1-32，更优选n[1]＝2-16，更优选n[1]＝2-8，最优选n[1]＝2-4；n[2]＝1-32，更优选n[2]＝1-16，更优选n[2]＝1-8，更优选n[2]＝1-4，最优选n[1]＝1-2；p[2]＝1-8，更优选p[2]＝1-4，最优选p[2]＝1-2；条件是n[2]×p[2]的值大于1而小于33；n[2]个Z[2]所示残基每个独立地为包含1-200个选自C、H、N、O、Si、P和S的原子的基团，并在烷基、链烯基、或芳香碳原子上，含有供至少p[2]个功能团结合的位点；更优n[2]个Z[2]所示残基都相同；更优选，n[2]个Z[2]所示残基每个独立地由选自下组的化学式表示
Z[2]为W[3]-Y[3](结合位点)p[2]式3Z[2]为W[4]-N{Y[4](结合位点)p[2]/2}2式4Z[2]为W[5]-CH{Y[5](结合位点)p[2]/2}2式5其中n[2]个W[3]、W[4]或W[5]所示残基，存在时每个独立地为包含1-100个选自C、H、N、O、Si、P和S的原子的基团；n[2]个Y[3]所示残基、2×n[2]个Y[4]所示残基和2×n[2]个Y[5]所示残基，每个独立地为包含选自C、H、N、O、Si、P和S的1-100个原子的基团，并在烷基、链烯基、或芳香碳原子上含有供至少p[2](对Y[3]而言)或p[2]/2(对Y[4]和Y[5]而言，其中p[2]/2为整数)个功能团结合的位点；更优选，n[2]个W[3]所示残基存在时每个独立地选自(CH2)r，(CH2CH2O)r，NRSUB(CH2CH2O)rCH2CH2，和NRSUB(CH2)rNRSUBC(＝O)，中r＝1-10；更优选，n[2]个Y[3]所示残基每个独立地为线性、支化或环形烷基(1-20C)，芳基(6-20C)，或烷芳基(7-30C)；最优选n[2]个Y[3]表示的残基每个独立地选自C6H4(苯-1，4-二基)，C6H3(苯-1，3，5-三基)和(CH2)r，其中r＝1-10；更优选，n[2]个W[4]所示残基每个存在时独立地选自(CH2)rC(＝O)和(CH2)rNRSUBC(＝O)，其中r＝1-10；更优选，2×n[2]个Y[4]所示残基独立地选自(CH2)r，
(CH2)rNRSUBC(＝O)(CH2)q，(CH2)rC(＝O)NRSUB(CH2)q，(CH2)rNRSUBC(＝O)(CH2)qNRSUBC(＝O)(CH2)r，(CH2)rC(＝O)NRSUB(CH2)qNRSUBC(＝O)(CH2)r，(CH2)rNRSUBC(＝O)(CH2CH2O)qCH2CH2，和(CH2)rC(＝O)NRSUB(CH2CH2O)qCH2CH2，其中r＝1-10，更优选r＝2-6，及q＝1-10，更优选q＝1-3；更优选，n[2]个W[5]表示的残基每个存在时独立地选自(CH2)rC(＝O)NRSUB和(CH2)rNRSUBC(＝O)NRSUB，其中r＝1-10；更优选2×n[2]个Y[5]所示残基每个独立地选自(CH2)r和(CH2)rC(＝O)NRSUB(CH2)q，其中r＝1-10，q＝1-10。
在治疗狼疮的另一优选实施方案中，偶联物包括化学上定义的非聚合价平台分子和各自与此平台分子结合的至少约20个碱基对、并对人SLE抗dsDNA自身抗体有显著的结合活性的多个多核苷酸双链体。这些优选实施方案中，多核苷酸双链体在长度上是基本均一的，双链体的一条链直接或通过一接头分子与价平台分子偶联。通常在偶联到价平台分子上之前，合成多核苷酸与一接头分子偶联。含接头的双链体链通常在或接近(即，约5个bp内)其一个末端处偶联，使每个链形成一个至少约20个bp的侧链，从该链与接头分子的结合位点起算。然后将第二条链退火至第一条链上形成双链体。因此，本发明的一类偶联物可由下式综合表示[(PN)n-接头]m-价平台分子其中PN＝具有n个核苷酸的双链多核苷酸，其中n至少为约20，m＝2-8。
本发明的适宜接头分子的例子为六碳硫醇如HAD，硫代六碳链磷酸酯和HADPS，即硫代六碳链硫代磷酸酯。本发明的化学上定义的价平台分子例如通过氨基修饰的PEG与下列物质反应制得3，5-二-(碘代乙酰氨基)苯甲酰氯(以下称为“IA-DABA”)；3-羧基丙酰胺-N，N-二-[(6’-N’-苄氧羰基氨基己基)乙酰胺]4”-硝基苯酯(以下称为“BAHA”)；3-羧基丙酰胺-N，N-二-[(8’-N’-苄氧羰基氨基-3’，6’-二氧杂辛基)乙酰胺]4”-硝基苯酯(以下称为“BAHAox”)；或通过PEG-二-氯代甲酸酯与N，N-二(2-[6’-N’-苄氧羰基氨基己酰氨基]乙基)胺(以下称为“AHAB”)反应形成化学上定义的价平台分子。
当与现有技术中描述的聚合载体相比时，令人惊异地发现使用含本发明的化学上定义的非聚合价平台分子和生物或合成分子(不是半抗原)的偶联物，获得的免疫抑制结果提高了至少约10倍到100倍以上。例如与含现有技术限定不明的载体的偶联物相比，使用含化学定义的非聚合价平台分子的本发明偶联物，如本文所述抗dsDNA自体抗体的免疫抑制提高了至少100倍。
本发明的另一方面是具有(a)和(b)的偶联物，(a)化学定义的非聚合价平台分子，(b)多个多核苷酸双链体，其中每个通过双链体一条链末端或近末端的功能团与价平台分子结合，所述偶联物为人SLE耐受原。
含有上述偶联物和药学上可接受载体的药物组合物是本发明的另一方面。
本发明的又一方面是在需要治疗的个体上治疗SLE的方法，包括给予该个体有效量的上述偶联物。
本发明的再一方面是诱导个体中特异B细胞对免疫原无反应的方法，其包括给予该个体有效量的上述偶联物。
本发明的另一方面是治疗个体中抗体所介导的病理过程的方法，该病理过程中对一种免疫原应答产生了不良的抗体，该方法包括给予所述个体有效量的上述偶联物。
本发明的又一方面是上述治疗SLE的偶联物的制备方法，包括将各自长至少为约20个核苷酸并在或接近其一个末端处带有功能团的多个单链多核苷酸，与化学定义的价平台分子上的功能团反应以形成偶联物，并将互补的单链多核苷酸退火到与化学定义的价平台分子偶联的单链多核苷酸上，以形成双链DNA侧链。
本发明的再一方面涉及下式的化学定义的非聚合新价平台分子G[6]{O-C(=O)-NRSUB-Q[6](T[6])p[6]}n[6]]]>式6或G[7]{O-C(=O)-N[Q[7](T[7])p[7]/2]2}n[7]]]>式7其中每个G[6]和G[7]存在时独立地为含有1-2000(更优选1-1000)个选自C、N、O、Si、P和S的链原子的线性、支化或多支化链；更优选，G[6]和G[7]各自为从聚醇、聚胺或聚二醇衍生的残基；最优选G[6]和G[7]各自选自-(CH2)q-(其中q＝0到20)、-CH2(CH2OCH2)rCH2-(其中r＝0到300)和C(CH2OCH2CH2-)s(OH)4-s(其中s＝1到4，更优选s＝3到4)；
n[6]×p[6]个T[6]所示残基和n[7]×p[7]个T[7]所示残基中每个独立地选自NHRSUB(胺)，C(＝O)NHNHRSUB(酰肼)，NHNHRSUB(肼)，C(＝O)OH(羧酸)，C(＝O)ORESTER(活化酯)，C(＝O)OC(＝O)RB(酸酐)，C(＝O)X(羧酰卤)，S(＝O)2X(磺酰卤)，C(＝NRSUB)ORSUB(亚氨酸酯)，NCO(异氰酸酯)，NCS(异硫氰酸酯)，OC(＝O)X(卤代甲酸酯)，C(＝O)OC(＝NRSUB)NHRSUB(碳化二亚胺加成物)，C(＝O)H(醛)，C(＝O)RB(酮)，SH(巯基或硫醇)、OH(醇)，C(＝O)CH2X(卤代乙酰基)，RAlkX(卤代烷)，S(＝O)2ORAlkX(磺酸烷酯)，其中R1R2为-C(＝O)CH＝CHC(＝O)-的NR1R2(马来酰亚胺)，C(＝O)CRB＝C2B(α，β-不饱和羰基)，RAlk-Hg-X(烷基汞化合物)和S(＝O)CRB＝CR2B(α，β-不饱和砜)；更优选，n[6]×p[6]个T[6]所示残基和n[7]×p[7]个T[7]所示残基中每个独立地选自NHRSUB(胺)，C(＝O)CH2X(卤代乙酰)，RAlkX(卤代烷)、S(＝O)2ORAlkX(磺酸烷酯)，其中R1R2为-C(＝O)CH＝CHC(＝O)-的NR1R2(马来酰亚胺)，C(＝O)CRB＝CR2B(α，β-不饱和羰基)，RAlk-Hg-X(烷基汞化合物)，和S(＝O)CRB＝CR2B(α，β-不饱和砜)；更优选，n[6]×p[6]个T[6]所示残基和n[7]×p[7]个T[7]所示残基中，每个独立地选自NHRSUB(胺)，C(＝O)CH2X(卤代乙酰)，其中R1R2为-C(＝O)CH＝CHC(＝O)-的NR1R2(马来酰亚胺)和C(＝O)CRB＝CR2B(α，β-不饱和羰基)；最优选，n[6]×p[6]个T[6]所示残基和n[7]×p[7]个T[7]所示残基均相同；
其中每个X独立地为原子序数大于16而小于54的卤素或其他好的离去基团；每个RAlk独立地为H，线性、支化或环形烷基(1-20C)；每个RSUB独立地为H，线性、支化或环形烷基(1-20C)，芳基(6-20C)，或烷芳基(7-30C)；每个RESTER独立地为N-琥珀酰亚氨蜞，对硝基苯基，五氟苯基，四氟苯基，五氯苯基，2，4，5-三氯苯基，2，4-二硝基苯基，氰基甲基等；每个RB独立地为含1-50个选自C、H、N、O、Si、P和S的原子的基团；n[6]＝1-32，优选n[6]＝1-16，更优选n[6]＝1-8，更优选n[6]＝1-4，最优选n[6]＝1-2；p[6]＝1-8，更优选p[6]＝1-4，最优选p[6]＝1-2；条件是n[6]×p[6]的值大于1而小于33；n[7]＝1-32，更优选n[7]＝1-16，更优选n[7]＝1-8，更优选n[7]＝1-4，最优选n[7]＝1-2；p[7]＝1-8，更优选p[7]＝1-4，最优选p[7]＝1-2；条件是，n[7]×p[7]的值大于1而小于33；n[6]个Q[6]所示残基和2×n[7]个Q[7]所示残基每个独立地为包含1-100个选自C、H、N、O、Si、P和S的原子的基团，并在烷基、链烯基、或芳香碳原子上含有供至少p[6]个(对Q[6]而言)或p[7]/2个(对Q[7]而言，其中p[7]/2为整数)功能团结合的位点；更优选，n[6]个Q[6]所示残基相同；
更优选，2×n[7]个Z[7]所示残基都相同；更优选，n[6]个Q[6]所示残基每个独立地选自CH[(CH2)r(结合位点)]2和CH[(CH2)rC(＝O)NRSUB(CH2)q(结合位点)]2，其中r＝1-10，q＝1-10；更优选，2×n[7]个Q[7]所示基团每个独立地选自(CH2)r，(CH2)rNRSUBC(＝O)(CH2)q，(CH2)rC(＝O)NRSUB(CH2)q，(CH2)rNRSUBC(＝O)(CH2)qNRSUBC(＝O)(CH2)r，(CH2)rC(＝O)NRSUB(CH2)qNRSUBC(＝O)(CH2)r，(CH2)rNRSUBC(＝O)(CH2CH2O)qCH2CH2，和(CH2)rC(＝O)NRSUB(CH2CH2O)qCH2CH2，其中r＝1-10，更优选r＝2-6，q＝1-10，更优选q＝1-3。
附图的简要说明

图1表示用PN-KLH致敏的小鼠中抗PN的应答，小鼠用所示剂量的偶联物17-II-[(PN)20-BAHA]-EDDA-处理，或用盐水处理并注射加强剂量的PN-KLH，5天后放血。按Farr检测法用10-8M的放射标记PN检测血清的3个稀释度，结果用抗PN抗体的降低百分数来表示。每组5只小鼠。
图2表示用PN-KLH致敏的小鼠中抗KLH的应答，小鼠用所示剂量的偶联物17-II-[(PN)20-BAHA]-EDDA-处理，并注射加强剂量的的PN-KLH，5天后放血。通过酶联免疫吸附实验(ELISA，检测抗KLH的抗体。结果用抗血清标准品的百分数表示。每组5只小鼠。
图3表示用PN-KLH致敏的小鼠中抗PN的应答，小鼠用所示剂量的[(PN)16-BAHAOX]-EDDA(偶联物11-IV)、[(PN)20-BAHAOX]-EDDA(偶联物11-II)、[(PN)24-BAHAOX]-EDDA(偶联物11-VI)或[(PN)32-BAHAOX]-EDDA(偶联物11-VIII)处理，并注射加强剂量的PN-KLH，5天后放血。按Farr检测法，用10-8放射标记PN检测血清。每组5只小鼠。
图4表示在用PN-KLH致敏的小鼠中抗PN的应答，小鼠用所示剂量的(PN)20-HAD-AHAB-TEG(偶联物20-II)、或仅用HAD-AHAB、或仅用PN、或用它们的混合物处理，然后加强注射PN-KLH，5天后放血。按Farr检测法，用10-8M浓度的放射标记PN检测血清。计算降低百分率并给出数据。每组5只小鼠。
图5表示PN-KLH致敏的小鼠中抗-PN的应答，小鼠用所示剂量的(PN)20-HADPS-TEG(偶联物20-IV)处理，然后用PN-KLH加强，5天后放血。按Farr检测法，用10-8M浓度的放射标记PN检测血清。每组5只小鼠。
图6A-B表示偶联物3-I、3-II、11-I、11-II、11-IV、11-VI、11-VIII、17-I、17-II、20-I、20-II、20-III和20-IV中，衍化的价平台分子和将多核苷酸偶联到平台分子上的接头的结构。
图7表示衍化的价平台分子“HAD-AHAD-TEG”的结构。
图8比较蜂毒蛋白(melittin)肽诱导的T细胞增殖水平。
图9比较用蜂毒蛋白肽偶联物2处理的小鼠产生的抗-蜂毒蛋白肽2抗体水平和用配制缓冲液处理的对照组小鼠的水平。
图10比较用蜂毒蛋白肽偶联物2处理的小鼠产生的抗蜂毒蛋白抗体水平和用配制缓冲液处理的对照组小鼠的水平。
图11比较用蜂毒蛋白肽偶联物2处理的小鼠中产生蜂毒蛋白肽2抗体的细胞水平和用配制缓冲液处理的对照小鼠的水平。
图12证明蜂毒蛋白肽偶联物4，即含T细胞表位的#5肽的偶联物不是耐受原。
图13阐明本发明的蜂毒肽偶联物。
图14证明用本发明的偶联物LJP-249 A和LJP-249B(均为偶联物3-II)与用含D-EK和(PN)50的现有技术偶联物(LJP-105)相比，提高了抗dsPN抗体的降低百分率。
图15表明用LJP-394(偶联物20-II)处理的雄性BXSB小鼠中循环血清IgG抗-DNA抗体的抑制。用ELISA试验测定抗与D-EK偶联的(PN)50的IgG抗体。分析了每组8只小鼠的每个血清。
本文中所用的“价平台分子”指含有预期数目生物和/或化学分子易于结合之位点的、化学定义的非聚合的非免疫原性分子。
“非免疫原性”用于描述价平台分子，指单独或作为偶联物平台部分给予个体时，价平台分子基本不激起免疫应答。
这里所用的“个体”指哺乳动物种类的成员，包括人、灵长类、小鼠和家养动物如牛和羊，运动动物如马，和宠物如狗和猫。
这里所用的术语“免疫原”指当注入动物时能激起体液免疫应答的化学单位。免疫原同时具有B细胞表位和T细胞表位。
免疫原的“类似物”指(a)与免疫原所特异性结合的抗体特异性结合，而(b)缺乏T细胞表位。虽然此类似物一般是免疫原的片段或衍生物，因而与免疫原具有相同的化学类别(如，免疫原为多肽，类似物也为多肽)，但化学相似性并不是必要的。因此，类似物可与免疫原具有不同的化学类别(如，免疫原为糖，而类似物为多肽)，只要它具有以上(a)和(b)的功能特征。类似物可为蛋白质、糖、脂、脂蛋白、糖蛋白、脂多糖、核酸或其他化学或生化单位。
免疫原类似物还可包括“拟表位”。术语“拟表位”指竞争性抑制抗体与免疫原结合的合成分子。因为它特异性地结合抗体，认为拟表位模拟了免疫原的抗原决定簇。类似免疫原类似物，拟表位(a)与免疫原所特异结合的抗体特异性结合，而(b)缺乏T细胞表位。
免疫原类似物还可包括“aptamer”。术语“aptamer”指竞争性抑制抗体与免疫原结合的合成寡核苷酸。正如免疫原类似物，aptamer(a)免疫原所特异地结合的抗体特异性结合，而(b)缺乏T细胞表位。
本文所用术语“B细胞无反应性”指那些要求T细胞辅助产生并分泌抗体的B细胞的无反应性，包括但不限于未成熟和/或成熟B细胞的克隆缺失，和/或B细胞不能产生抗体，和/或细胞程序死亡。“无反应性”指与免疫原的体液应答的治疗学上有效的降低。定量地讲，这种降低(按抗体产生的降低测得)为至少50％，优选至少75％，最优选100％。
“抗体”指那些其产生依赖于T细胞的抗体。
本发明的化学定义的价平台分子的价可通过加入平台分子的支化基团数目而预先确定。适宜的支化基团典型地衍生自二氨基酸、三胺和氨基二酸。本发明的偶联物是生物稳定的即显示体内分泌半寿期为几小时到几天到几个月，以提供治疗效力。本发明的化学定义的价平台分子是基本非免疫原性的(即，当给予动物时，它们不显示或仅显示轻微的免疫原性)，在给定剂量下为无毒的(即，它们足够无毒可用作治疗剂)，优选由确定的化学结构组成。它们提供了一种非免疫原性、无毒多功能团底物，多个生物或合成分子如多核苷酸双链体可与之共价结合。它们一般平均分子量范围为约200到约200,000，通常为约200到约20,000，与现有技术聚合物(分子量变化范围很大的化合物的混合物)相比是均一的。对本发明的均一的价平台分子，特别优选的例子是衍生化的2，2’-亚乙二氧基二乙基胺(EDDA)、三乙二醇(TEG)和分子量为约200-8,000的聚乙二醇(PEG)。
生物或合成分子与化学定义的平台分子的偶联可以任何途径进行，一般涉及一种或多种交联剂和生物或合成分子及价平台分子上的功能团。
与价平台分子偶联的合成多核苷酸双链体由至少约20pb，优选20-50bp组成。本文描述的多核苷酸除非另有说明外均为脱氧核苷酸，并以5’到3’的方向给出。双链体的长度优选是基本均一的；即，双链体群中长度差异一般不超过平均双链体长度碱基对的约±20％，优选±10％。它们还优选在核苷酸组成上是基本均一的；即，双链体间碱基组成和顺序的变化将不大于约10％。最优选它们的双链体核苷酸组成完全一致。
基于圆二色谱(CD)的解释，认为用于本发明的双链体具有B-DNA型螺旋结构。应认识到本发明无意限于这种认定，通过更确定性的分析可认定双链体可具有Z-DNA和/或A-DNA型螺旋结构。
这些多核苷酸双链体可从天然DNA合成或用化学或重组技术合成。具有较长长度的天然存在的或重组产生的dsDNA可经消化(如酶法、化学方法或机械切割)和分级分离(如经琼脂糖凝胶或Sephadex柱)得到目标长度的多核苷酸。
或者，用市场上可得到的DNA合成仪容易制得多达约70个碱基长的互补单链多核苷酸链对，然后按常规方法退火以形双链体。化学制备的短链经酶延伸(5’-磷酸化，然后连接)可获得更长的合成dsDNA。
还可通过分子克隆制备多核苷酸。例如，按如上方法合成目标长和序列的多核苷酸。可以设计这些多核苷酸使其具有适当的末端，以连接到特异的限制性位点上。多个重复的这些寡聚物可前后连接以提供多拷贝复制。将形成的构建物插入标准克隆载体中，经转化将载体引入适当的微生物/细胞中。用标准标记物鉴定转化子并在有利于DNA复制的条件下生长。用限制酶处理和常规的大小分级(如，琼脂糖凝胶，Sephadex柱)，可将此多核苷酸与细胞/微生物的其他DNA分离。
或者，可用聚合酶链反应(PCR)技术复制这些多核苷酸。Saiki，R.K.，等，Science(1985)2301350；Sacki等，Science(1988)239487；Sambrook等，In Molecular Coloning TechniguesA laboratoryManual，Vol.12，p14.1-14.35 Cold Spring Harbor Press(1989)。
按实施例中描述的检测方法用SLE抗血清筛选多核苷酸的结合活性。改良的Farr检测法是优选的检测方法，其中结合活性可用I50表示，即达到半数最大抑制时多核苷酸的摩尔浓度。I50小于约500nM，优选小于50nM的多核苷酸双链体视为具有显著的结合活性，从而可用于制备本发明的偶联物。
以适当的方式将这些多核苷酸偶联在化学定义的价平台分子上并保留其抗体结合活性。这可通过将多核苷酸以其链上预定位点与价平台分子偶联而实现，以使该多核苷酸形成至少约20个碱基对的侧链(从该链的偶联位点到游离末端计算)。
在一特别优选的实施方案中，本发明偶联物的多核苷酸在或接近其一个末端处与一接头分子偶联。然后接头分子与化学定义的价平台分子偶联。例如，可按如下方法将一确定的双链多核苷酸偶联到价平台分子上先制备由约20个交替的胞嘧啶(C)和腺嘌呤(A)核苷酸组成的单链。然后可将4条CA链通过接头如HAD(三苯甲基HAD或二甲基HAD一般用于描述反应路线11中所述的二硫化物接头)共价偶联到衍生化平台分子如三乙二醇的4个反应活性位点上。合成价平台分子使其包含诸如溴代乙酰的基团。在偶联过程中，离去基团被硫置换。然后可将由约20个交替的胸腺嘧啶(T)和鸟嘌呤(G)核苷酸组成的第二条单链多核苷酸退火至CA链上，形成下式的双链多核苷酸偶联物[(PN)20-接头]4-价平台分子。
或者，在另一优选实施方案中，多核苷酸可通过一吗啉代桥以3’-末端偶联到衍生化的价平台分子上，通过一个多核苷酸链的氧化的3’末端核糖与衍生化平台分子上的游离氨蜞缩合，然后将此加合物置于还原条件下形成吗啉代桥。这种偶联要求衍化的平台分子至少有与要结合到平台分子上的多核苷酸双链体数目相等的游离氨基。这种偶联物的合成分两步进行。第一步是将多核苷酸双链体的一条链通过上述缩合/还原反应偶联到衍生化的平台分子上。用高碘酸处理将3’末端核糖基转化为氧化的核糖基，从而在单多核苷酸链上形成氧化的3’-末端核糖。然后将单链多核苷酸慢慢加到衍生化的平台分子pH约6.0-8.0、2-8℃的水溶液中。在所有的偶联策略中，多核苷酸与平台分子的摩尔比范围一般为约2∶1到约30∶1，常常为2∶1到约8∶1，优选约4∶1到6∶1。关于这一点，优选偶联物的分子量不要过大，因为分子量大于200,000的大分子，特别是具有重复单元的大分子可能是非T细胞依赖性免疫原。见Dintzis等，J.Immun.(1983)1312196和J.Immun，(1989)1431239。在缩合反应过程中或以后(反应时间一般为24-48小时)，加入强还原剂，如氰基硼氢化钠，以形成吗啉代基团。然后向偶联物中加入双链体的互补链，加热混合物并慢慢冷却以使链退火。此偶联物可经凝胶渗透色谱纯化。
对此核糖策略的一种替代方法是在多核苷酸上形成醛功能团，并利用这些功能团和平台分子上的活性功能团将多核苷酸偶联到平台分子上。可有利地利用多核苷酸3’或5’末端的成对连二醇，可用过碘酸钠将其氧化成醛，醛再与平台分子上的功能氨基基团缩合。当此二醇在一环系中(如五元环)，则生成的缩合产物为含氮的杂环，如六元吗啉代或哌啶子环。亚氨基缩合产物可经还原稳定化，使用适当的还原剂，如硼氢化钠或氰基硼氢化钠。当二醇为非环状时，生成的氧化产物只含有一个醛，缩合产物为仲胺。
另一方法包括通过适当的核苷酸化学(如氨基亚磷酸酯化学)向多核苷酸的3’或5’末端引入烷氨基或烷硫基。然后这些亲核基团用于与双官能交联试剂反应对烷基胺衍生物而言，使用大大过量的同型双官能交联剂如庚二亚氨酸二甲酯；对烷基巯基衍生物而言，使用过量的异型双官能交联剂如间马来酰亚氨基苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)或4-(碘代乙酰)氨基苯甲酸琥珀酰亚胺酯。除去过量的交联剂后，多核苷酸衍生物即与平台分子上的氨基反应。或者，这种巯基可与平台上的亲电中心反应，如马来酰亚胺或α-卤代乙酰基团或其他适当的Michael受体。
还有一种使用经修饰核苷的策略。可通过标准的DNA合成化学将适当的脱氧核苷衍生物引入优选5’或3’末端的多核苷酸中的目标位点。然后这些核苷衍生物可直接特异性地与平台分子上的烷氨蜞反应。或者，上述二醛化学中见到的副反应如胺催化β-消除，可通过使用适当的核苷衍生物作为待接链的3’末端而防止。这样的实例如是核糖5’-亚甲基延伸，即用5’(2-羟乙基)基团代替5’-羟甲基基团。或者在 接到平台分子上的多核苷酸3’末端二核苷酸中使用膦酸酯或次膦酸酯桥。
免疫原类似物在抗体介导的病理中涉及的免疫原可是以外来的(对个体而言是外源的)免疫原，如变应原、与不育有关的精子、风湿热糖复合物、与新生儿溶血病有关的RBC Rh/D抗原、生物药，包括对个体外源的天然生物物质如治疗用蛋白、肽和抗体等等，或者自免疫原(自体免疫原)如与甲状腺炎(甲状腺球蛋白)、中风(心脂)和重症肌无力(乙酰胆碱受体)有关的那些。
通过筛选候选分子确定它们是否(a)与抗该抗原的血清抗体特异性结合，(b)缺乏T细胞表位，可鉴定这种免疫原的类似物。与血清抗体的特异性结合可用常规免疫检测法测定，T细胞的存在与否可经常规T细胞激活法来确定。此处，与抗此免疫原的抗血清特异性结合的类似物显示与此抗体的相当亲合力。此处还应认识到T细胞表位检测是在每个对象基础上用来自目标受者或代表受者靶人群的T细胞进行的。T细胞表位的存在与否可用实施例中描述的氚标胸苷掺入法来测定。还可按本领域熟知的方法测定T细胞衍生的淋巴因子来确定T细胞表位的存在与否。没能诱导背景以上统计学上显著的胸苷掺入的类似物视为缺乏T细胞表位。应认识到胸苷掺入量可与免疫原的不同。一般刺激指数低于约2-3，更优选约1-2时，说明缺乏T细胞表位。
一般鉴定有用类似物的第一步是制备一系列待选物或其文库。例如对蛋白或肽类似物而言，可用合成或重组技术制备文库，如Geysen等在Synthetic Peptides as Antigens；Ciba Symposium(1986)119131-149；Devlin等在Science(1990)249404-406；Scott等，Science(1990)249386-390；和Cwirla等，PNAS USA(1990)876378-6382中描述的方法。在一种合成技术中，按这样的方式合成约5-30个氨基酸的肽使每个肽与下一个重叠，且代表了所有的线性表位。这可通过羧基和氨基末端均重叠来完成，重叠残基数比B细胞表位所要求的少一个残基。例如，假定B细胞表位最低要求是6个氨基酸，则每个肽必须与相邻的肽重叠5个氨基酸。在此方案中，用抗天然免疫原产生的抗血清筛选每个肽以鉴定B细胞表位是否存在，抗血清是通过免疫接种动物或从病人中获得。具有抗体结合活性的那些分子再用于按实施例中所述筛选，以确定T细胞表位是否存在。缺如T细胞表位的分子可用作本发明的类似物。
如果免疫原的T细胞表位已知或可被鉴定，则不必进行候选类似物的T细胞随机筛选。在此情形下，可通过合成或重组方法改变T细胞表位(如通过化学衍生，或消除表位的一个或多个成分)以使其无作用或完全消除，如对肽的情况。
按常规方法合成拟表位和aptamers，并按其他免疫原类似物相同的方法筛选。
将这些类似物偶联在非免疫原性价平台分子上以制备本发明的偶联物。利用本文所例举的化学方法合成包含价平台分子和生物活性分子如糖、脂、脂多糖、蛋白、糖蛋白、药物、和有用类似物的偶联物。合成的一种优选方法是按已知方法在生物分子上引入接头分子，按具体情况选择不同的方法。
当向价平台分子上偶联药物如阿霉素(doxorubicin)时，糖环上的氨基可与含活性酯的平台分子反应。还可修饰阿霉素使含有硫醇基团，以与卤代乙酰化平台偶联(Kaneko，T，等，Bioconjugate Chem-istry，2133(1991))。
可修饰糖如寡糖使其含有含巯基的接头(Wood，S.J.和Wetzel，R.，Bioconjugate Chemistry，3391(1992))。巯基用于与卤代乙酰化平台的偶联。或者，可氧化糖生成醛，后者可在NaCNBH3存在下与氨基平台反应形成偶联物。
含乙醇胺基团的脂如糖脂与平台上的活化羧基反应。氧化含糖单位的脂多糖生成醛，醛再在NaCNBH3存在下与平台氨基反应还原胺化形成偶联物。
对于其他的蛋白如Fab’抗体片段，蛋白上的巯基通过卤代乙酰基与平台偶联。使用亚氨基硫醇盐，用硫醇接头修饰糖蛋白。该硫醇与含有卤代乙酰基的平台反应。
用实施例中描述的鼠模型评价偶联物作为耐受原和特异性抑制抗体产生的能力。
一般配制偶联物以适于注射给药(如腹膜内、肌内、静脉内等)。因此，它们一般与药学上可接受的水性载体如盐水、Ringer’s溶液、葡萄糖溶液等结合。偶联物一般占配方重的0.01％到10％。给个体注射一定量的偶联物，该量应足以至少部分重建对引起SLE自体抗原的耐受性。这种量文中有时称为“治疗有效”量。个别给药方案，即剂量、时间和重复次数，将依具体的个体和个体的病历来确定。一般给予约1-1000μg偶联物/kg体重的剂量。要获得和/或保持免疫耐受状态要求重复给药。
下列实施例进一步说明本发明和其对现有技术的非显而易见性。这些实施例决无意限制本发明。
实施例1下列反应方案说明本发明的衍生化化学定义的价平台分子的合成方法。在此实施例中，DMTr＝4，4’-二甲氧基三甲基苯基；Tr＝三苯甲基；Bz＝苯甲酰基；Cp＝脱氧胞苷单磷酸酯；CE＝氰基乙基，CPG＝可控泡玻璃DMF＝二甲基甲酰胺；DCC＝二环己基碳化二亚胺；TFA＝三氟乙酸；CDI＝羰基二咪唑；Ts＝对甲苯碘酰；DIPAT＝二异丙基铵四唑盐；TBMSCI＝叔丁基二甲基甲硅烷基氯；TBAF＝氟化四丁基铵；NMMO＝N-甲基吗啉氧化物。
反应方案1
反应方案2
反应方案3
反应方案4
反应方案5
反应方案6
反应方案7
反应方案8
方案9
反应方案10
在以下反应方案11中描述了用于以二硫醚接头修饰(CA)8、(CA)10、(CA)12和(CA)16的试剂的合成反应方案11
以下反应方案12中描述了用于以连位二醇接头修饰(CA)25的试剂的合成。
反应方案12
反应方案13
实施例2化学定义的价平台分子的合成化合物1[3，5-二-(碘代乙酰氨基)苯甲酸]将2.93g(8.28mmol，2.2eq)碘代乙酸酐于室温N2氛下加到572mg(3.76mmol)3，5-二氨基苯甲酸于19ml二噁烷中搅拌下的悬液中。搅拌混合物，用箔封口20小时，并在50ml乙酸乙酯和50ml 1N HCl溶液间分配。用盐水洗涤乙酸乙酯层，用MgSO4干燥，过滤，并在旋转蒸发器上浓缩，得到3.3g褐色固体。经硅胶层析(94/5/1的CH2Cl2/MeOH/HOAc)纯化此物，得到992mg(54％)化合物1，白色固体NMR(DMSO)3.84(s，4H)，7.91(s，2H)，8.14(s，1H)，10.56(s，2H)。
化合物2[3，5-二-(碘化乙酰氨基)苯甲酰氯]向390mg(0.8mmol)化合物1在34ml THF中的溶液中加入117μl(1.6mmol，190mg)SOCl2。将此混合物在N2氛下回流直到固体全部溶解(约30分钟)，形成一清澈的红棕色溶液。在旋转蒸发器上浓缩此混合物并置于真空下，得到化合物2粗产品-一泡沫状固体，它直接用于下一步。
化合物3[α，ω-二-(N-2-氨基乙基氨基甲酰基)聚乙二醇的N，N’-二(3，5-二-(碘代乙酰氨基)苯甲酰)衍生物]将570mgα，ω-二-(N-2-氨基乙基氨基甲酰基)聚乙二醇(0.16mmol，3350g/mol，Sigma)置于一配衡烧瓶中。加入甲苯(20ml)并通过共沸蒸馏除去水。真空干燥残余物得549mg固体，将其溶于4ml含89μl(0.64mmol)二异丙基乙基胺的THF中。将酰氯粗品溶于4ml无水THF中并在N2下30秒内加到上述混合物中。此混合物在室温下搅拌16小时，并在25ml 0.1N HCl和25mlCH2Cl2间分配。水层再用CH2Cl2萃取，合并有机层，用25ml H2O，然后50mlNaHCO3水溶液洗涤。用Na2SO4干燥有机层，过滤并浓缩，得784mg橙色油。经硅胶层析(9/1的CH2Cl2/MeOH)得190mg无色油，在热EtOH/Et2O中结晶，并在N2下在烧结玻璃滤器上收集，真空干燥得到177mg白色固体化合物3。NMR(CDCl3)3.40(bdm，8H)，3.59(bd s，(CH2CH2O)n，因积分太大无法与其他积分一起积分)，3.91(s，8H)，4.21(m，4H)，6.04(bd m，2H)，7.55(bd m，2H)，7.78(bd s，4H)，8.10(bd s，2H)，9.30(bd m，4H)碘代乙酰的测定(European Journal of Biochemistry(1984)14063-71)计算值，0.92mmol/g；实测值，0.96mmol/g。
化合物4[单-N-苄氧羰基-3，6-二氧杂-1，8-二氨基辛烷]将14.3ml(17.1g，100mmol)氯甲酸苄酯在200ml CH2Cl2中的溶液在1小时内滴加到29.0ml(29.6g，200mmol)1，2-二-(2’-氨基乙氧基)乙烷(Fluka)在100mlCH2Cl2中的0℃溶液中。将混合物在室温下搅拌24小时，加入1N HCl直到水层保持为酸性(pH低于2)。水层用每份50ml CH2Cl2洗3次，用1N NaOH中和至pH 13以上。用每份75ml CH2Cl2萃取该碱性水层5次。合并CH2Cl2层并干燥(MgSO4)、过滤及浓缩，得12.7g(41％)化合物4，为粘稠油品。1H NMR(CDCl3)d 2.82(bd s，2H)，3.30-3.60(m，12H)，5.10(s，2H)，5.75(bd s，1H)，7.20-7.40(m，5H)；13C NMR(CDCl3)d 41.1，41.8，66.5，70.0，70.2，70.4，73.5，127.9，128.0，128.4，136.9.156.4.
化合5[N-叔丁氧羰基亚氨基二乙酸]按Garrigues，B.和Lazraq，E.M.在Tetrahedron Letters(1986)27，1685-1686中报道的相似方法合成该化合物。于室温、搅拌下向22.0g(169mmol)亚氨基二乙酸和36.8g(169mmol)二碳酸二叔丁酯在169ml 50/50二噁烷/H2O中的溶液中加入47ml(34.2g，338mmol)Et3N。搅拌该混合物24小时，在旋转蒸发器上除去大部分二噁烷。将混合物在350ml 1N HCl和每份100ml乙酸乙酯共5份间分配。合并有机层，用MgSO4干燥、过滤，并浓缩得一白色固体。在己烷/EtOAc中重结晶得35.3g(90％)晶状化合物5。m.p.131-132℃(熔化)。1H NMR(DMSO)d 1.35(s，9H)，3.87(s，2H)，3.91(s，2H)，12.6(bds，2H)；13C NMR(DMSO)d 27.9，49.6，79.6，154.8，171.2.
化合物6将9.99g(48.5mmol)二环己基碳化二亚胺加到4.52g 73(19.4mmol)化合物5和4.46g(38.8mmol)N-羟基琥珀酰亚胺于100mlTHF中的0℃溶液中。在0℃下搅拌此混合物3小时，加入5.39ml(3.92g，38.8mmol)Et3N和10.9g(38.7mmol)化合物4在83mlTHF中的溶液，于5℃搅拌混合物17小时。过滤此混合物除去固体，浓缩滤液成油状，在400ml EtOAc和2份100ml 1N HCl间分配。EtOAc层用3×100ml 1N Na2CO3、100ml盐水洗涤，干燥(MgSO4)、过滤并浓缩，得化合物6，为一粘稠油品。
1H NMR(CDCl3)d 1.41(s，9H)，3.30-3.70(m，24H)，3.70-3.90(m，4H)，5.10(s，4H)，5.50(bd s，2H)，7.12(bd s，1H)，7.30-7.40(m，10H)，8.24(bd s，1H).
化合物7向14.2g(18.6mmol)化合物6在111ml CH2Cl2中的溶液中加入26.3ml(38.9g，156mmol)三氟乙酸，于室温下搅拌混合物3小时。在旋转蒸发器上浓缩混合物得一粘性油，将此油溶于93ml THF中。将溶液冷却至0℃，加入3.72g(37.2mmol)琥珀酸酐，再加入5.18ml(3.76g，37.2mmol)Et3N。除去冷浴，于室温下搅拌混合物18小时。减压除去溶剂，生成的油在300ml CH2Cl2和3×100ml H2O之间分配。CH2Cl2层用MgSO4干燥，过滤，并浓缩，得一油品，在硅胶上层析(9/1/0.1 EtOAc/MeOH/乙酸)纯化之，得10.5g(74％)化合物7，为一粘性油。1H NMR(CDCl3)d 2.50-2.60(m，4H)，3.30-3.60(m，24H)，3.88(s，2H)，4.03(s，2H)，5.07(s，4H)，5.77(bd s，2H)，7.20-7.30(m 10H)，7.91(bd s，2H)，8.88(bd s，1H)；13C(CDCl3)d 27.7，29.0，39.4，41.0，52.9，53.8，66.5，69.3，69.8，70.0，70.1，127.8，128.1，128.3，136.7，156.6，169.1，169.6，173.3，174.5.
化合物8[化合物7的4-硝基苯酯]将1.61g(7.83mmol)二环己基碳化二亚胺加到3.98g(5.22mmol)化合物7和800mg(5.75mmol)4-硝基苯酚在26ml CH2Cl2中的0℃溶液中。N2下于室温搅拌混合物64小时。将此混合物冷却至0℃，加入1ml HOAc，保持在0℃ 2小时。过滤除去固体，浓缩滤液。在硅胶上层析(91/8/1到84/15/1 CH2Cl2/IPA/HOAc的梯度)纯化残余物，得粘性油状化合物8。
1H NMR(CDCl3)d 2.66(t，2H)，2.84(t，2H)，3.32-3.68(m，24H)，3.90(bd s，2H)，4.01(bd s，2H)，5.06(s，4H)，5.58(bd m，2H)，6.91(bd m，1H)，7.27(d，2H)，7.33(s，10H)，8.23(d，2H)，9.01(bd m，1H).
化合物10[溴代乙酸4-硝基苯酯]搅拌下于0℃将9.28g(45mmol)二环己基碳化二亚胺加到5.0g(35.9mmol)溴代乙酸和8.50g(61.1mmol)4-硝基苯酚在180ml E-tOAc中的溶液中。于5℃搅拌此混合物16小时，加入1ml乙酸。于室温搅拌混合物20分钟，然后置于冰箱中20分钟。滤出固体，浓缩滤液得一粘性油，在乙醚/己烷中结晶，得7.73g(83％)化合物10，絮片状。m.p.86-87℃；TLC Rf＝0.63(50/50/1己烷/乙酸乙酯/乙酸)。1H NMR(CDCl3)d 4.13(s，2H)，7.36(d，J＝12Hz，2H)，8.32(d，J＝12Hz，2H)；13C NMR(CDCl3)d24.9，122.1，125.3，155.5 164.9；Anal.calc’d forC2H6BrNO4C，36.95；H，2.33；N，5.39.FoundC，37.24；H，2.33；N，5.42.
化合物9向2.37g(2.68mmol)化合物8在15ml二噁烷和8ml水中的溶液中加入300mg(3.57mmol)NaHCO3，然后加入162ml(1.09mmol)2，2’-(亚乙二氧基)-二-乙基胺(Fluka)。于室温下搅拌混合物24小时，真空浓缩至大约原始体积的一半。将此浓缩物在40mlCH2Cl2和40ml饱和NaHCO3溶液之间分配。然后用40ml 0.5NHCl洗涤CH2Cl2层2次，再用NaCl溶液洗，干燥(MgSO4)，过滤，并浓缩得2.8g油。此粗产品在硅胶上层析(3/6/1 CH2Cl2/THF/MeOH)纯化，得940mg(59％)油状化合物9。TLC Rf＝0.21(3/6/1CH2Cl2/THF/MeOH)。1H NMR(CDCl3)d 2.45(m，4H)，2.59(m，4H)，3.25-3.55(m，60H)，3.87(s，4H)，4.05(s，4H)，5.07(s，8H)，5.62(bd s，4H)，6.78(bd s，2H)，7.34(bd s，20H)，8.56(bd s，2H)；13C NMR(CDCl3)d 28.1，30.3，31.1，39.4，41.1，52.9，53.9，66.5，69.4，69.7，69.9，70.2，128.3，127.8，128.3，136.8，156.5，168.8，169.4，172.1，173.5.
化合物34在氮气下向281mg(0.175mmol)化合物9在5ml乙醇中的溶液中加入110mg 10％Pd/碳，并在氮气下回流2小时。冷却后在硅藻土上过滤此混合物，并在真空下浓缩，得170mg(92％)油状化合物34，不经纯化直接用于下一步。
1H NMR数据如下(CDCl3)d 2.45(m，4H)，2.53(m，4H)，2.62(m，4H)，2.86(m，8H)，3.42-3.60(m，52H)，4.00(s，4H)，4.14(s，4H)；13C NMR(CDCl3)d 28.2，30.3，31.1，39.4，41.1，46.5，48.6，52.9，53.8，69.4，69.7，70.2，72.4，168.9，169.5，172.3，173.8.
化合物11将128mg(1.4mmol)NaHCO3和200mg(0.85mmol)化合物10加至165mg(0.155mmol)化合物34在6ml二噁烷和3ml水中的溶液中。于室温下搅拌此混合物24小时。再真空浓缩。浓缩物在SephadexG-10(MeOH)上层析纯化，得114mg(46％)粘性油状化合物11。用制备性HPLC(C18；15/85/0.1到30/70/0.1 CH3CN/H2O/CF3CO2H的梯度，50分钟，225nm，)制备分析用样品。
1H NMR(CDCl3)d 2.58(m，4H)，2.65(m，4H)，3.43-3.62(m，60H)，3.92，(s，8H)，4.03(s，4H)，4.16(s，4H)；MS(FAB)m/e(relativeintensity)MNa+1605(100)，MH+1579(1)，1581(5)，1583(7)，1585(6)，1587(2).
化合物12[单-N-苄氧羰基-1，6-二氨基己烷]搅拌下0℃将21ml(25.7g，150mmol)氯甲酸苄酯在200ml二噁烷中的溶液滴加到17.49g(150mmol)1，6-己二胺和19.58g(196mmol)KHCO3在100ml二噁烷和300ml水中的溶液中。于室温搅拌此混合物18小时，然后冷却至0℃。用12N HCl酸化此混合物，并用2×100ml乙醚萃取。用10N NaOH中和水层并用8×100ml乙醚萃取。合并碱性萃取液，干燥(Na2SO4)并浓缩，得5.03g(13％)半固态残余物，即化合物12粗产品。
1H NMR(DMSO)d 1.22-1.51(m，8H)，2.54(t，2H)，3.02(dof t，2H)，5.05(s，2H)，7.30-7.48(m，5H).
化合物13于0℃下向417mg(1.78mmol)化合物5和409mg(3.56mmol)NHS在15ml THF中的溶液加入918mg(4.45mmol)二环己基碳化二亚胺。在0℃下搅拌混合物4.5小时，并加入1.02g(4.08mmol)化合物12在4ml THF中的溶液。N2下5℃搅拌此混合物18小时。浓缩物在30ml EtOAc和2×30ml 1N HCl间分配。合并的EtOAc层相继用30ml水和30ml饱和NaHCO3溶液洗涤，干燥(MgSO4)，过滤并浓缩，得1.48g粘性残余物。在硅胶上层析(5/95 MeOH/CH2Cl2纯化得1.04g(84％)化合物13，为粘稠固体。
1H NMR(CDCl3)d 1.33(m，8H)，1.43(s，9H)，1.51(m，8H)，3.18(m，4H)，3.26(m，4H)，3.81(s，2H)，3.85(s，2H)，4.90(bd s，2H)，5.10(s，4H)，6.81(bd s，1H)，7.28-7.40(m，10H)，8.05(bd s，1H).
化合物14向5.16g(7.45mmol)化合物13在14.9ml二氯甲烷中的溶液加入14.9ml三氟乙酸，于室温下搅拌混合物3小时。真空浓缩混合物，再溶于57ml THF中。加入2.07ml(1.51g，14.9mmol)三乙胺。再加入1.5g(14.9mmol)琥珀酸酐，然后搅拌混合物18小时。将此混合物在75ml 1N HCl和4×75ml CH2Cl2间分配。合并CH2Cl2层，干燥(MgSO4)，过滤并浓缩得一固体。在CH2Cl2/EtOAc/己烷中结晶得3.84g(24％)白色固体化合物14。
m.p.122°；1H NMR(MeoH)d 1.32(m，8H)，1.48(m，81)，2.56(m，4H)，3.10(t，4H)，3.23(m，4H)，4.00(s，2H)，4.18(s，2H)，5.05(s，4H)，7.33(m，10H).
化合物15[化合物14的N-硝基苯酯]0℃下向2.0g(2.87mmol)化合物14和438mg(3.15mmol)4-硝基苯酚在15ml THF中的溶液加入887mg(4.30mmol)二环己基碳化二亚胺。让混合物升至室温并搅拌18小时，然后冷却至0℃。然后加入200μl乙酸并在0℃搅拌混合物1小时。滤去固体，并将滤液浓缩成油。在硅胶上层析纯化(92/8 CH2Cl2/IPA)，并在CH2Cl2/乙烷中重结晶，得1.52g(64％)白色固体化合物15。
m.p.65-68°；1H NMR(CDCl3)d 1.30(m，8H)，1.47(m，8H)，2.71(t，2H)，2.90(t，2H)，3.17(m，4H)，3.25(m，4H)，3.92(s，2H)，4.08(s，2H)，4.86(bd t，1H)，4.95(bd t，1H)，5.09(s，4H)，6.28(bd t，1H)，7.23(d，J＝9Hz，2H)，7.32(m，10H)，8.22(d，J＝9Hz，2H)，8.95(bd t，1H).
化合物16将830mg(0.99mmol)化合物15在7.5ml二噁烷中的溶液加至58μl(59mg，0.40mmol)2，2’-(亚乙二氧基)-二-乙基胺(Fluka)和111mg(1.31mmol)NaHCO3在7.5ml H2O中的溶液中。室温下搅拌此混合物18小时。混合物在50ml 1N HCl和50ml CH2Cl2间分配。CH2Cl2层经干燥(Na2SO4)，过滤及浓缩，得1.28g粘性油。在硅胶上层析纯化(84/15/1 CH2Cl2/MeOH/HOAc)得670mg蜡状固体化合物16。1H NMR(CDCl3)d 1.32(m，16H)，1.49(m，16H)，2.46(m，4H)，2.58(m，4H)，3.10-3.23(m，16H)，3.34(m，4H)3.48(m，4H)，3.53(s，4H)，3.85(s，4H)，4.02(s，4H)，5.05(s，8H)，5.07(underlying bd t，2H)，5.15(bd t，2H)，7.30(m，20H)，7.40(bd t，2H)，8.60(bd t，2H).
化合物35搅拌613mg(0.41mmol)化合物16在20.3ml乙醇和10.1ml环己烯中的溶液，并用N2吹洗。加入20mg 10％Pd/C(Aldrich)，并在85℃油浴中加热1.5小时。冷却后，将混合物滤过硅藻土，并用50/50H2O/丙酮清洗烧瓶和滤器。真空浓缩滤液得448mg(114％)蜡状固体化合物35。1H NMR(D2O)d 1.39(m，16H)，1.59(m，16H)，2.57(t，4H)，2.65(t，4H)，2.88(t，8H)，3.23(t，4H)，3.29(t，4H)，3.42(t，4H)，3.65(t，4H)，3.71(s，4H)，4.06(s，4H)，4.30(s，4H).
化合物17向445mg(0.406mmol)化合物35在9.5ml水中的溶液加入546mg(6.50mmol)NaHCO3。向混合物中加入838mg(3.25mmol)化合物10于14.4ml二噁烷中的溶液。室温下搅拌此混合物7小时，并在50ml 0.1N H2SO4和50mg CH2Cl2之间分配。弃去CH2Cl2层，水相用2×50ml CH2Cl2、2×50ml 9/1 CH2Cl2/MeOH、50ml 4/1CH2Cl2/MeOH和50ml 3/2 CH2Cl2/MeOH萃取。合并萃取液，经干燥(Na2SO4)、过滤并浓缩，得282mg固体。在EtOH/EtOAc/EteO中结晶得143mg(24％)白然固体化合物17。
1H NMR(CDCl3/MeOH)d 1.33(m，16H)，1.55(m，16H)，2.55(m，8H)，3.21(m，16H)，3.39(m，4H)，3.55(m，4H)，3.81(s，8H)，3.95(s，4H)，4.12(s，4H).元素分析，计算C54H94N12O14Br4C，44.57；H，6.51；N，11.55；Br，21.97.实测C，45.85；H，6.49；N，11.37；Br，19.90.
化合物18[1，5-二(N-苄氧羰基-6-氨基己酰氨基)-3-氮杂戊烷]向5.05g(19.0mmol)N-苄氧羰基-6-氨基乙酸在25ml E-tOAc中的溶液中室温下加入3.09g(19.0mmol)羰基二咪唑。搅拌15分钟后加入1.02ml(982mg，19.52mmol)二亚乙基三胺，再加入2.65mg(1.93g，19.0mmol)三乙胺。搅拌混合物4小时，过滤收集固体产物。重结晶(MeOH/EtOAc)得4.27g化合物18，为一细粒状固体。m.p.132-133℃。
1H NMR(CDCl3)d 1.33(m，4H)，1.52(m，4H)，1.64(m，4H)，2.18(t，4H)，2.73(t，4H)，3.16(m，4H)，3.35(m，4H)，4.96(bd s，2H)，5.09(s，4H)，6.13(bd s，2H)，7.33(s，10H)；元素分析，计算C32H47N5O6C，64.29；H，7.50；N，11.72.实测C，63.54；H，7.75；N，11.91.
化合物19向20℃水浴中的4.86g(8.1mmol)化合物10在162ml吡啶中的溶液加入657μl(880mg，3.2mmol)三乙二醇-二-氯甲酸酯(Aldrich)。混合物中立即形成沉淀。搅拌混合物16小时，真空浓缩生成的混蚀黄色溶液。浓缩液在150ml EtOAc和2×150ml 1NHCl间分配(保证水层为酸性)。合并水层并再用150ml EtOAc萃取。合并EtOAc层，干燥(MgSO4)、过滤并浓缩。残余物结晶(EtOAc/己烷/CHCl3)得到1.92g化合物19，为细小的黄色结晶。m.p.86-91℃；1HNMR数据如下
(CDCl3)1.31(m，8H)，1.52(m，8H)，1.62(m，8H)，2.20(m，8H)，3.20(m，8H)，3.39(s，16H)，3.62(s，4H)，3.68(m，4H)，4.26(m，4H)，5.08(s，8H)，5.32(bd s，4H)，7.31(bd s，4H)，7.37(s，20H)；13C NMR(CDCl3)d 25.1，26.2，26.4，29.6，36.0，36.2，38.5，38.8，40.8，64.5，66.4，69.1，70.3，128.0，128.4，136.7，156.5，156.9，173.6；元素分析，计算C72H104N10O18C，61.87；H，7.50；N，10.02.实测C，61.68；H，7.63；N，9.95.
化合物36向800mg(0.57mmol)化合物19在5ml无水乙醇中的溶液加入3.5ml环己烯。将此溶液置于氮气下，加入500mg 10％Pd/C，搅拌下回流2小时。冷却后经硅藻土过滤并浓缩，得500mg(100％)化合物36，油状。
1H NMR(50/50 CDCl3/CD3OD)d 1.21(m，8H)，1.49(m，8H)，1.62(m，8H)，2.19(t，J＝7.4Hz，8H)，2.67(t，J＝7.4Hz，8H)，3.36(bd s，16H)，3.67(s，4H)，3.71(m，4H)，4.21(m，4H).
化合物20向5.0g(5.8mmol)化合物36在37.5ml二噁烷和12.5ml水中的溶液加入3.9g(46.4mmol)NaHCO3。在冰浴中冷却混合物至0℃，加入8.7g(34.8mmol)溴代乙酸4-硝基苯酯(化合物10)。于0℃搅拌混合物1小时，慢慢加入1N H2SO4。用3×50ml EtOAC萃取该混合物。弃去乙酸乙酯萃取物，水层用6×10ml 20/80甲醇/二氯甲烷萃取。合并的甲醇/二氯甲烷层用Na2SO4干燥，过滤并浓缩。残余物经硅胶层析(9/1 CH2Cl2/MeOH然后85/15/5 CH2Cl2/MeOH/THF的阶梯)得3.62g(46％)白色固体化合物20。熔点66.0-70.5℃。用制备性HPLC(C18反相柱，25/75/0.1到35/65/0.1 CH3CN/H2O/CF3COOH的50分钟梯度，225nm)制备分析用样品，得一清澈油，真空静置固化得一白色固体。熔点87-89℃。
1H NMR(CDCl3)d 1.35(m，8H)，1.55(m，8H)，1.64(m，8H)，2.26(m，8H)，3.28(m，8H)，3.42(bd s，16H)，3.66(s，4H)，3.70(m，4H)，3.89(s，8H)，4.19(m，4H)；13C NMR(CDCl3)d 25.1，26.2，28.8，29.0，38.5，39.1，40.0，47.8，48.3，64.7，69.1，70.3，157.0，166.3，174.9；MS(FAB)m/e(相对强度)MH+[1341(25)，1343(60)，1345(70)，1347(56)，1349(21)]，705.6(100)；元素分析，计算C48H84N10O14Br4C，42.86；H，6.29；N，9.27；Br，23.77.
实测C，42.15；H，6.28；N，9.87；Br，25.33.
化合物21[四-(2-氰基乙氧基甲基)甲烷]按Bruson，H.A.报道的相似方法(美国专利2,401,607；1946年6月4日)制备该化合物。向8.0g(58.8mmol)季戊四醇和1.76ml40％氢氧化苄基三甲基铵的水溶液在50ml水中的溶液加入27.3ml(21.8g，411mmol)丙烯腈。装一回流冷凝器，在N2氛下加热混合物至40℃16小时，然后60℃24小时。冷却后用1ml浓盐酸酸化并转移到分液漏斗中。收集沉底的油，水相用3×40ml CH2Cl2萃取。合并油和萃取液，用MgSO4干燥，过滤并浓缩，得23.5g油。在110℃和0.25托下Khugelrhor蒸馏除去二氰乙基醚。釜中残余物在1升水中结晶得8.43g(41％)白色针状化合物21。
m.p.42.5°[报道数据(Macromolecules1991，24，1443-1444.)39-40°]；1H NMR(CDCl3)d 2.61(t，J＝6Hz，8H)，3.50(s，8H)，3.6(t，J＝6Hz，8H).
化合物22[四-(2-羧基乙氧甲基)甲烷]将5.0g(14.35mmol)化合物21在21.5ml浓HCl中的溶液于75℃搅拌3小时，在此期间形成了白色沉淀。真空除去盐酸水溶液，将混合物在25ml水中浓缩2次。将生成的9.68g固体物质载于一含有16.5cm床的氢氧化形式DOW-1-X2树脂的45mm i.d.柱上，用200ml H2O，再用1N HCl洗脱此柱。用TLC(80/20/1CH3CN/H2O/HOAc)检测产品，浓缩含产品的流份得1.21g(21％)油状化合物22。1H NMR数据如下(D2O)d 2.46(t，J＝6Hz，8H)，3.22(s，8H)，3.55(t，J＝6Hz，8H).
化合物23向1.12g(2.85mmol)化合物22在7.0ml THF中的溶液加入3.71ml(6.06g，50.8mmol)亚硫酰氯。室温下搅拌混合物3小时，真空除去溶剂。残余的酰氯溶解在7ml THF中。然后向此溶液中加入2.12ml(1.54g，15.24mmol)三乙胺。在氮气下搅拌混合物并冷却至0℃。1分钟内加入3.60g(12.74mmol)化合物4在5ml THF中的溶液。撤掉冷浴，在室温下搅拌混合物5.5小时，然后在25ml1N盐酸和4×25ml乙酸乙酯之间分配。合并乙酸乙酯层，用盐水洗，干燥(MgSO4)，过滤并浓缩得到3.46g粘性油。在硅胶上层析纯化(95/5二氯甲烷/甲醇)得1.26g粘性油状化合物23。
1H NMR(CDCl3)d 2.40(t，8H)，3.29(s，8H)，3.35(m，16H)，3.48-3.77(m，48H)，5.12(s，8H)，5.60(bd，4H)，6.85(bd，4H)，7.34(s，20H).
化合物37向氮气下向142mg(0.093mmol)化合物23在8.4ml乙醇中的溶液加入4.0ml环己烯和83g 10％的Pd/C。在90℃油浴中搅拌下回流混合物3小时，冷却后经过硅藻土过滤用二氯甲烷洗涤滤器和烧瓶。浓缩滤液得70mg(78％)油状化合物37。1H NMR(CDCl3)d2.90(t，8H)，3.3(s，8H)，3.45(t，8H)，3.52-3.73(m，48H)。
化合物24向70mg(0.098mmol)化合物37在2ml二噁烷和0.67ml水中的溶液加入40mg(0.48mmol)碳酸氢钠和104mg(0.40mmol)化合物10。室温下搅拌混合物17小时，加入0.5ml 1N H2SO4调pH值至4。浓缩混合物并在G-10 Sephadex(MeOH)上层析纯化浓缩液。真空浓缩含产物的流份得91mg油。该粗产品36mg经HPLC(C18，20/80/0.1到35/65/0.1 CH3CN/H2O/CF3CO2H的梯度)纯化得到19mg(44％)的油状化合物24。1H NMR(CDCl3)d2.50(t，8H)，3.31(s，8H)，3.36-3.72(m，56H)，3.91(s，8H)；13C NMR(CDCl3)d 28.8，36.5，39.7，40.0，67.2，69.3，69.5，70.3，166.6，173.0.MS(FAB)m/e(相对强度)MH+[1425(15)，1427(63)，1429(75)，1431(64)，1433(12)]，577(100).
化合物25a[PEG3350的二-对甲苯磺酸酯]向16.75g(5.0mmol)聚乙二醇于40ml二氯甲烷中的溶液加入6.47ml吡啶，聚乙二醇(J.T.Baker，平均分子量为3350g/mol)已经共沸蒸馏(甲苯)干燥。将此溶液置于氮气下并冷却至0℃。25分钟内加入7.63g(40mmol)对甲苯磺酰氯在40ml二氯甲烷中的溶液。撤去冷浴在室温下搅拌混合物16小时。将混合物与80ml 1N HCl一起震摇，二氯甲烷层(含乳化物)用100ml水洗涤。用MgSO4干燥二氯甲烷层，过滤并浓缩。残余物在二氯甲烷/乙醚中结晶得16.82g(92％)白色固体化合物25a。1H NMR(CDCl3)d 2.50(s，6H)，3.48(t，J＝5Hz，4H)，3.55-3.77(m，大于600H，积分太大无法精确测定)，3.83(t，J＝5Hz，4H)，7.44(d，J＝7Hz，4H)，7.94(d，J＝7Hz，4H).
化合物26a二叠氮基-PEG3350将10.83g(2.96mmol)化合物25a和1.92g(29.6mmol)NaN3在30ml DMF中的溶液在120℃油浴中氮气下加热3小时。冷却后混合物在100ml水和100ml二氯甲烷间分配。二氯甲烷层用200ml二氯甲烷稀释并用100ml 1N HCl洗涤，Na2SO4干燥，过滤并浓缩。生成的蜡状固体在二氯甲烷/乙醚中重结晶，生成的固体再在硅胶上层析纯化(98/2到95/5 CH2Cl2/MeOH的梯度)得4.75g(47％)的蜡状固体化合物26a。TLC Rf 0.41(9/1 CH2Cl2/MeOH)。1H NMR(CDCl3)d 3.35(t，J＝5Hz，4H)，3.44(t，J＝5Hz，2H)，3.54-3.77(m，约300H，积分太大无法精确测定)，3.79(t，J＝5Hz，2H)。
化合物27a[二氨基-PEG3350]向4.75g(1.39mmol)化合物26a在140ml乙醇中的溶液加入473mg 10％的Pd/C(Aldrich)。在60psi H2下震摇混合物30小时。因为反应不完全(TLC，9/1 CH2Cl2/MeOH)，再加入473mg10％的Pd/C，混合物在60psi H2下再震摇5小时。然后混合物经硅藻土过滤，真空浓缩，浓缩物结晶(CH2Cl2/Et2O)得4.03g(86％)的白色固体化合物27a。1H NMR(CDCl3)d2.92(t，4H)， 3.49(t，2H)，3.66(t，4H)，3.67(m，约300H，积分太大无法精确测定)，3.86(t，2H)。
化合物28[化合物7的N-羟基琥珀酰亚胺基酯]向1.84g(2.41mmol)化合物7和278mg(2.41mmol)NHS在12ml THF中的溶液于0℃氮气下加入596mg(2.89mmol)二环己基碳化二亚胺。除去冷浴并在室温下搅拌混合物16小时，向混合物中加入250μl乙酸，在室温下继续搅拌1小时。然后将混合物置于冰箱中2小时。滤掉固体，浓缩滤液得2.27g(110％)粘性油状化合物28的粗品。化合物28难以在不分解的情况下纯化，所以直接用于酰化二氨基-PEG。
化合物29a将900mg(1.05mmol)化合物28在4.68ml二噁烷中的溶液加至877mg(0.26mmol)化合物27a和176mg(2.10mmol)NaHCO3在3.12ml水中的0℃溶液中。搅拌混合物2小时，然后在25ml 1NHCl和2×25ml二氯甲烷之间分配。合并二氯甲烷层，干燥(Na2SO4)、过滤并浓缩得一粘性油。经硅胶层析纯化(95/5到87/13CH2Cl2/MeOH的梯度)得695mg(55％)蜡状固体化合物29a。
1H NMR(CDCl3)d 2.55(bd，8H)，3.39(m，16H)，3.44-3.72(m，约432H，积分太大无法精确测定)3.89(s，4H)，4.03(s，4H)，5.09(s，8H)，7.36(s，20H).
化合物38a向688mg(0.142mmol)化合物29a在14.2ml乙醇中的溶液在N2下加入7.1ml环己烯。加入284mg(10％Pd/C，回流混合物2小时。冷却后将混合物通过硅藻土过滤，用乙醇洗，真空浓缩滤液得550mg(90％)蜡状固体化合物38a。
1H NMR(CDCl3)d 2.58(m，8H)，2.93(m，8H)，3.38-376(m，约550H)，4.00(s，4H)，4.13，(s，4H).
化合物30a向550mg(0.13mmol)化合物38a和175mg(2.08mmol)NaH-CO3在3.11ml水中的0℃溶液中加入268mg(1.04mmol)化合物10在4.65ml二噁烷中的溶液。搅拌混合物20小时，并在50ml 1N硫酸和2×50ml CH2Cl2之间分配。合并CH2Cl2层并用Na2SO4干燥，过滤并浓缩成油。在G-10 Sephadex上层纯化(MeOH)得一无定形固体，在乙醇/乙醚中结晶，得378mg(61％)白色固体化合物30a。1H NMR(CDCl3)d 2.59(bd S，8H)，3.38-3.82(m，约500H，积分太大无法准确测定)，3.88(s，8H)，3.98(s，4H)，4.10(S，4H)；溴化乙酰测定(European Journal of Biochemistry，1984，140，63-71)计算值0.84mmol/g；实测值0.50mmol/g。
化合物25b[PEG8000的二-对甲苯磺酸酯]向12.0g(1.5mmol)PEG8000(Aldrich，平均分子量8000g/mmol)(已用甲苯共沸蒸馏干燥过)在30ml CH2Cl2中的溶液中加入2.3ml(16.5mmol)三乙胺，再加入3.15g(16.5mmol)TsCl。室温下搅拌混合物18小时，并用4×50ml 1N HCl，再用50ml饱和NaCl2溶液萃取。CH2Cl2层经干燥(Na2SO4)、过滤并真空浓缩，得一蜡状固体。在CH2Cl2/Et2O中重结晶得11.0g(92％)白色固体化合物25b。
1H NMR(CDCl3)d 2.38(s，6H)，3.40-3.89(m.约800H，积分太大无法准确测定)，4.14(m，4H)，7.34(d，J＝8.2Hz，4H)，7.79(d，J＝8.2Hz，4H).
化合物26b[二叠氮基-PEG8000]向10.8g(1.3mmol)化合物25b在30ml无水DMF中的溶液加入1.86g(28.6mmol)NaN3。在N2下120℃加热混合物2.5小时。冷却后混合物在240ml CH2Cl2和3×50ml 0.5N HCl间分配。CH2Cl2层用50ml饱和NaCl溶液洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤并浓缩，得到一固体。在硅胶上层析(2/98到6/94 MeOH/CH2Cl2梯度)纯化，纯化产物在MeOH/Et2O中重结晶得6.95(66％)白色固体化合物26b。TLC(Rf＝0.33，12/88 MeOH/CH2Cl2)；1H NMR(CDCl3)3.39-3.86(m)。
化合物27b[二氨基-PEG8000]用氮气吹洗6.9g(0.86mmol)化合物26b在150ml氨饱和甲醇中的溶液。加入1.5g 10％Pd/C，在65psi H2下振动混合物。20小时后，TLC分析表明反应不完全。因而加入200mg 10％Pd/C并在65psi H2下继续振动20小时。将混合物滤过硅藻土，真空浓缩滤液。生成的蜡状固体在MeOH/Et2O中重结晶得6.0g(89％)白色固体化合物27b。1H NMR (CDCl3)d 2.96(t，J＝5.1Hz，4H)，3.40-3.89(m，约700H，积分太大无法精确测定)。
化合物29b向3.0g(0.375mmol)化合物27b在10ml水和3ml二噁烷中的溶液中加入221mg(2.63mmol)NaHCO3。加入溶于10ml二噁烷中的1.3(1.51mmol)化合物28。搅拌混合物24小时，然后加入40ml0.5N HCl。用4×25ml CH2Cl2萃取混合物。合并的CH2Cl2层经干燥(MgSO4)，过滤和浓缩成为油。在MeOH/Et2O中结晶，得2.0g(58％)化合物29b。1H NMR(CDCl3)d 2.52(m，8H)，3.40-3.64(m，约700H，积分太大无法精确测定)，3.89(s，4H)，4.02(s，4H)，5.09(s，8H)，7.35(s，20H).
化合物38b向600mg(0.063mmol)化合物29b在5ml无水乙醇和2.5ml环己烯中的溶液在N2下加入123mg 10％Pd/C。在N2下回流混合物2小时。将混合物滤过硅藻土并蒸发，得549mg(97％)化合物38b，白色固体。1H NNR(CDCl3)d 2.58(m，8H)，2.90(m，8H)，3.39-3.70(m，约700H，积分太大无法精确测定)4.05(s，4H)，4.15(s，4H).
化合物30b向529mg(0.059mmol)化合物38b在2ml二噁烷和5ml水中的溶液加入100mg(1.2mmol)NaHCO3，再加入84mg(0.32mmol)化合物10。搅拌12小时后，用1N硫酸酸化反应混合物，用4×40mlCHCl3萃取。合并CHCl3层，干燥(MgSO4)、过滤并浓缩得503mg半固态残余物。残余物经G-10 Sephadex(MeOH)层析纯化，在MeOH/Et2O/己烷中结晶得215mg(39％)白色固体化合物30b。1HNMR(CDCl3)d 2.58(m，8H，3.35-3.70(m，约700H，积分太大无法精确测定)，3.89(s，8H)，4.01(s，4H)，4.16(s，4H)；溴代乙酰测定(European Journal of Biochemistry 1984，140，63-71)计算值0.42mmol/g，实测值0.27mmol/g。
化合物31[PEG3350-二-氯代甲酸酯]向1.0g(0.249mmol)聚乙二醇(J.T.Baker，平均分子量为3350g/mol)(已用甲苯共沸蒸馏干燥)在12ml CH2Cl2中的溶液加入2滴无水吡啶，再加入125mg(0.418mmol)三光气。在室温下搅拌混合物20小时，真空蒸去溶剂，得到1.0g白色固体1.0g(100％)化合物31。1H NMR(CDCl3)d 3.40-3.65(m，约300H，积分太大无法精确测定)，3.77(m，4H)，4.46(m，4H)。
化合物32向600mg(1.0mmol)化合物18在10ml二噁烷和1.5ml吡啶中的50℃溶液中滴加1.0g(0.25mmol)化合物31在12ml 5∶1 CH2Cl2/二噁烷中的溶液。搅拌此浑浊溶液72小时。加入25ml CH2Cl2，然后过滤。蒸发滤液，半固态残余物在G-10 Sephadex上层析纯化。形成的固体在CH2Cl2/Et2O中结晶，得829mg(75％)浅黄色固体化合物32。1H NMR(CDCl3)d1.30(m，8H)，1.40(m，8H)，1.61(m，8H)，2.18(m，8H)，3.17(m，8H)，3.40(m，16H)，3.62(m，约300H，积分太大无法精确测定)，4.15(m，4H)，5.07(s，8H)，7.33(m，20H).
化合物39氮气下向300mg(0.065mmol)化合物32在5ml无水乙醇和2ml环己烯中的溶液加入100ml 10％Pd/C。在N2下回流该混合物2小时。将混合物滤过硅藻土并蒸去溶剂，得237mg(90％)白色固态化合物39。
1H NMR(CDCl3)d 1.37(m，8H)，1.48(m，8H)，1.65(m，8H)，2.21(m，8H)，2.50(m，8H)，3.39(m，16H)，3.64(m，约300H，积分太大无法精确测定)，4.19(m，4H).
化合物33向225mg(0.055mmol)化合物39在5ml二噁烷和5ml水中的溶液加入125mg(0.67mmol)NaHCO3和115mg(0.44mmol)化合物10。生成的黄色溶液在室温下搅拌12小时。然后用3×30mlCH2Cl2萃取该溶液。用1N硫酸酸化水层，用3×30ml CH2Cl2萃取。合并CH2Cl2层，干燥(MgSO4)，过滤，并浓缩得一黄色油。在G-10 Sephadex(MeOH)上层析纯化并将形成的油在EtOH/Et2O中重结晶，得182mg(73％)白色固态化合物33。1H NMR(CD-Cl3)d 1.55(m，8H)，1.55(m，8H)，1.65(m，8H)，2.22(m，8H)，3.28(m，8H)，3.42(m，16H)，3.50-3.64(m，约300H，积分太大无法精确测定)，3.87(s，8H)，4.18(m，4H)；溴代乙酰测定(Europeon Jour-nal of Biochemistry 1984，140，63-71)计算值，0.87mmol/g；实测值，0.73mmol/g。元素分析，C191H375O87N10Br4的计算值C，50.84；H，8.33；N，3.09；Br，7.05。实测值C，51.98；H，8.34；N，2.45；Br，10.19。
化合物40[碘代乙酸4-硝基苯酯]向3.72g(200mmol)碘代乙酸的0℃溶液中加入100ml EtOAc中的5.15g(25mmol)二环己基碳化二亚胺和2.92g(2.92mmol)4-硝基苯酚。0℃下搅拌混合物1小时。于室温下搅拌2小时。滤去固体，真空浓缩滤液。形成的黄色固体在EtOAc/己烷/痕量HOAc中重结晶，得4.82g(78％)黄棕色固态化合物40。1H NMR(CDCl3)d 4.00(s，2H)，7.39(d，2H)，8.40(m，2H)。
化合物41向110mg(0.104mmol)化合物34在5ml二噁烷和5ml H2O中的溶液加入103mg(1.22mmol)NaHCO3，再加入211mg(0.692mmol)化合物40。搅拌混合物18小时，真空浓缩。在Sephadex(MeOH)上层析纯化，得140mg(87％)油状化合物41。用制备性HPLC(C18，20/80/0.1到25/75/0.1 CH3CN/H2O/TFA在60分钟内的梯度，225nm)制备分析用样品。1H NMR数据如下(CDCl3)d 2.59(m，4H)，2.65(m，4H)，3.44-3.62(m，60H)，3.77(s，4H)，3.78(s，4H)，4.02(s，4H)，4.21(s，4H).
化合物42在0℃及剧烈搅拌下向171mg(0.161mmol)化合物34在8ml二噁烷、2ml饱和NaHCO3溶液和2ml水中的溶液加入145mg(0.935mmol)N-甲氧羰基马来酰亚胺。(The Practice of PeptideSynthesis，M.Bodansky和A.Bodansky，Springer-Verlag，NewYork，1984，p 29-31.Keller，O.，Rudinger，J.Helv.Chem.Acta1975，58，531)。15分钟后加入25ml二噁烷，除去冷浴，在室温下继续搅拌45分钟。用2×30ml CHCl3萃取此混合物，合并CHCl3层并用MgSO4干燥，过滤并浓缩成油。在G-10 Sephadex(MeOH)上层析纯化，得103mg(45％)油状化合物42。用制备性HPLC(C18，20/80/0.1-25/75/0.1 CH3CN/H2O/TFA 65分钟梯度，225nm)制备分析用样品，得一油品。
1H NMR(CDCl3)d 2.57(m，4H)，2.67(m，4H)，3.42-3.65(m，52H)，3.72(m，8H)，4.03(s，4H)，4.17(s4H)，6.74(s，4H)，6.75(s，4H).
化合物43[羟甲基-三-(2-氰乙氧基甲基)甲烷]向6.8g(50mmol)季戊四醇在50ml水中的溶液加入0.30g(5.41mmol)KOH，再加入23ml(18.6g，350mmol)丙烯腈。在室温下搅拌混合物16小时，用1.5ml浓HCl溶液酸化，用2×50mlCH2Cl2萃取。合并CH2Cl2层，经干燥(MgSO4)、过滤及浓缩得16.97g液体。在硅胶上层析纯化(EtOAc)得8.49g(51％)粘性油化合物43。
TLC，Rf＝0.15(EtOAc)；1H NMR(CDCl3)d 2.62(t，6H)，3.54(s，6H)，3.68(t，6H)，3.70(s，2H).
化合物44[羟甲基-三-(2-甲氧羰基乙氧基甲基)甲烷]向5.45g(15.6mmol)化合物43中加入78ml HCl的饱和甲醇溶液。加热回流混合物1小时，冷却后在100ml H2O和4×100mlEt2O间分配。合并Et2O层，相继用100ml饱和NaHCO3溶液和100ml饱和NaCl溶液洗涤，干燥(MgSO4)，过滤并浓缩得4.74g粘性液体。在硅胶上层析纯化得3.05g(50％)油状化合物44。
TLC，Rf＝0.27(80/20 EtOAc/己烷)；1H NMR(CDCl3)d 2.58(t，6H)，3.43(s，6H)，3.61(s，2H)，3.69(t，6H)，3.70(s，9H)；13C NMR(CDCl3)d 34.8，44.9，51.6，65.2，66.9，71.0，172.1.
化合物45将560mg(1.4mmol)化合物44和1.69g(6.0mmol)化合物4在氮气下150℃加热4小时。将混合物在50ml EtOAc和25ml 1N HCl间分配，HCl层用25ml CH2Cl2萃取。合并EtOAc和CH2Cl2萃取物，用饱和NaHCO3溶液洗涤，干燥(MgSO4)，过滤并浓缩得粘性残余物。在硅胶上层析纯化(95/5-90/10 CH2Cl2/MeOH梯度)得300mg(19％)化合物45，为粘性油品。
TLC，Rf＝0.24(90/10 CH2Cl2/MeOH)；1H NMR(CDCl3)d 2.40(t，6H)，3.38(s，6H)，3.39-3.48(m，12H)，3.52-3.67(m，32H)，5.13(s，6H)，5.62(bd s，3H)6.80(bd s，3H)，7.40(s，15H).
化合物46在N2下向308mg(0.269mmol)化合物45在10.4ml乙醇和5.2ml环己烯中的溶液加入104mg 10％Pd/C。装一回流冷凝器，在85℃油浴中加热混合物1.5小时。冷却后，混合物通过硅藻土过滤，浓缩滤液得177mg残余物。将残余物部分溶解在5.98ml二噁烷中。将形成的混合物加到386mg(1.49mmol)化合物10中，再加入251mg(2.99mmol)NaHCO3在3.99ml水中的溶液。在N2下搅拌该混合物18小时，并在25ml 1N HCl和3×25ml CH2Cl2间分配。水相用3×25ml 3/1 CH2Cl2/MeOH和3×25ml 1/1 CH2Cl2/MeOH萃取。弃去前两部分CH2Cl2萃取液，其余萃取液合并，干燥(Mg-SO4)，过滤并浓缩得102mg粘性油。用HPLC纯化(C18，23/77/0.1CH3CN/H2O/CF3CO2H，234nm检测)得43mg(14％)粘性油状化合物46。1H NMR(CDCl3)d 2.48(t，6H)，3.40(s，6H)，3.44-3.54(m，14H)，3.56-3.62(m，12H)，3.63(s，12H)，3.67(t，6H)，3.91(s，6H)，6.90(t，3H)，7.10(t，3H)； MS(FAB)m/e(相对强度)MH+[1103(17)，1105(42)，1107(41)，1109(18)]，MNa+[1125(38)，1127(100)，1129(99)，1131(39)].
化合物47[S-(6-羟己基)异硫脲鎓氯化物]向16.6ml(20.0g，146mmol)6-氯己醇在49ml乙醇中的溶液加入11.1g(146mmol)硫脲，回流混合物24小时。冷却至0℃，产物结晶。真空过滤收集晶体，干燥得28.4g(92％)白色固体化合物47。
mp 122-124°；1H-NMR(DMSO)1.40(m，4H)，1.65(m，2H)，3.21(t，2H)，3.41(t，2H)，9.27和9.33(重叠的宽单峰，4H)；元素分析，计算C7H17ClN2OSC，39.51；H，8.06；N，13.17；S，15.07.
实测C，39.69；H，8.00；N，13.01；S，15.16.
化合物48[6-巯基己-1-醇]将9.25g NaOH片加至17.8mg(83.6mmol)化合物47在120ml水和120ml乙醇中的溶液中。回流混合物4小时。仔细浓缩混合物至约75ml，真空蒸馏纯化浓缩物，得7.4g(66％)化合物48bp 95-105℃，5mmHg。
1H NMR(CDCl3)1.41(m，9H)，2.59(dt，2H)，3.69(t底下有宽单峰，3H)；13C NMR(CDCl3)d 24.5，25.2，28.0，32.5，33.9，62.7；元素分析，计算C6H14OSC，53.68，H，10.51；S，23.89.实测C，53.35；H，10.72；S，23.60.
化合物49[二-(6-羟己基)二硫化物]将4.02g(15.8mmol)I2在90ml甲醇中的溶液在N2下10分钟内滴加到4.26g(31.7mmol)化合物48在10ml甲醇和13.7ml(9.97g，98.5mmol)三乙胺中的溶液中，并在冰浴中冷却。除去冷浴，于室温下搅拌混合物4小时。在旋转蒸发器上浓缩混合物，经硅胶层析纯化(1∶1己烷/EtOAc)得3.12g(73％)灰黄色固态化合物49。 TLC Rf.18(1∶1己烷/EtOAc)；mp 38-48°；1H NMR(CDCl3)1.15-2.20(m，16H)，2.73(t，4H)，3.70(t，4H)；元素分析，计算C12H26S2O2C，54.09；H，9.84；S，24.06.实测C，54.85，H，9.86；S，24.11.
化合物50单-O-(4’，4”-二甲氧基三苯甲基)-二-(6-羟己基)二硫化物向3.12g(11.7mmol)化合物49在45ml吡啶中的溶液加入3.97g(11.7mmol)4，4’-二甲氧基三苯甲基氯。在室温下搅拌混合物16小时。在旋转蒸发器上除去大部分吡啶。残余物在100ml饱和NaHCO3溶液和100ml EtOAC之间分配。 EtOAc层用50ml饱和NaCl溶液洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤并浓缩成油。在硅胶上层析纯化(9/1 CH2Cl2/EtOAc)得2.84g(43％)粘性油化合物50。TLCRf0.35(9/1 CH2Cl2/EtOAc)。
1H NMR(CDCl3)1.41(m，8H)，1.65(m，8H)，2.70(两个重叠的三重峰，4H)，3.08(t，2H)，3.65(t，2H)，3.81(s，6H)，6.85(d，4H)，7.32(m，7H)，7.47(d，2H)；HRMS(FAB，M+)，计算C33H44O4S2568.2681.实测568.2665.
化合物51O-[14-(4’，4”-二甲氧基三苯甲氧基)-7，8-二硫杂十四基]-O-(2-氰乙基)-N，N-二异丙基氨基亚磷酸酯
氮气下向771mg(1.36mmol)化合物50和116mg(0.68mmol)二异丙基铵四唑盐在6.8ml CH2Cl2中的溶液加入458mg(1.52mmol)O-氰乙基-N，N，N’，N’-四异丙基二氨基亚磷酸酯在0.5mlCH2Cl2中的溶液。搅拌混合物4小时，并在25ml NaHCO3和3×25ml CH2Cl2间分配。合并CH2Cl2层，用饱和NaCl溶液洗涤，干燥(MgSO4)，过滤并浓缩成油。通过一25mm柱中的2”plug的碱性氧化铝过滤，用9/1 CH2Cl2/Et3N洗脱，纯化得到831mg(80％)粘性油状化合物51。1H NMR(CDCl3)d 1.25(m，12H)，1.45(m，8H)，1.70(m，8H)，2.72(m，6H)，3.09(t，2H)，3.65(m，4H)，3.87(s，6H)，3.91(m，2H)，6.89(d，4H)，7.35(m，7H)，7.49(d，2H)；31P NMR(CDCl3以15％H3PO4为内标)147.69；HRMS(FAB，MH+)计算for C42H62N2O5PS2769.3839，实测769.3 853.
化合物52三苯甲基-HAD醇向57g(0.21mol)化合物49在60ml吡啶中的溶液加入60g(0.21mol)三苯甲基氯。在100℃搅拌此混合物19小时。冷却至室温并过滤。用300ml二氯甲烷稀释滤液，用200ml饱和碳酸氢钠萃取。用Na2SO4干燥有机层，过滤并浓缩成油。经硅胶层析纯化(9/1己烷/乙酸乙酯到3/1己烷/乙酸乙酯的梯度)得55g化合物52(50％)。
1H NMR(CDCl3)δ1.38(m，8H)，1.63(m，8H)，2.66(m，4H)，3.04(t，2H)，3.62(t，2H)，7.25(m，9H)，7.42(m，6H).HRMS(FAB，M+)ca计算or C31H40O2S 508.2470，实测化合物53三苯甲基HAD氨基亚磷酸酯0℃及氩气下向10g(19.7mmol)化合物52和6.3ml(36.2mmol)二异丙基乙基胺在90ml二氯甲烷中的溶液慢慢加入4.5ml(20.2mmol)2-氰乙基-N，N-二异丙基氯代氨基亚磷酸酯。搅拌90分钟后用100ml饱和碳酸氢钠萃取反应混合物2次。二氯甲烷溶液用Na2SO4干燥，过滤并浓缩成油。经碱性氧化铝层析(75/24/1，己烷/乙酸乙酯/三乙胺)纯化得11.3g油状化合物53(81％)。
1H NMR(CDCl3)δ1.18(m，12H)，1.37(m，8H)，1.62(m，8H)，2.6(m，6H)，3.04(t，2H)，3.60(m，4H)，3.82(m，2H)，7.26(m，6H)，7.44(m，9H).HRMS(FAB，MH+)计算C40H58N2O3PS2709.3626，实测709.3621.
化合物54O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-5-己烯醇向12.47ml(10.4g，104mmol)5-己烯-1-醇在104ml DMF中的溶液中加入15.66g(230mmol)咪唑和20.0g(130mmol)叔丁基二甲基甲硅烷基氯。在室温下搅拌混合物4小时，并在200ml E-tOAc和100ml饱和NaHCO3溶液之间分配。EtOAc层用100ml饱和NaHCO3溶液、100ml饱和NaCl溶液洗涤，干燥(MgSO4)，过滤并浓缩至约100ml体积。真空蒸馏得70.07g(90％)化合物54。
bp 130-143°@100mm Hg；1H NMR(CDCl3)0.11(s，6H)，0.95(s，9H)，1.48(m，2H)，1.57(m，2H)，2.11(dt，2H)，3.66(t，2H)，5.03(m，2H)，5.86(m，1H)；13C NMR(CDCl3)-5.25，18.40，25.21，26.01，32.35，33.60，63.09，114.40，138.92；元素分析，计算 C12H26OSiC，67.22；H，12.22.实测C，66.96；H，12.16.
化合物551-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-1，5，6-己三醇向9.86g(46.0mmol)化合物54在92ml丙酮的溶液中加入6.46g(55.2mmol)N-甲基吗啉氧化物在23ml水中的溶液。向此混合物中加入443μl 2.5％ OsO4/叔丁醇溶液(360mg溶液，9.0mgOsO4，35μmol)和50μl 30％ H2O2。搅拌混合物16小时，加入474mg连二硫酸钠在14ml H2O中的溶液。再过0.5小时后，将混合物滤过硅藻土。用MgSO4干燥滤液，在一150ml Buchner漏斗中滤过1”硅胶，用250ml(每份)EtOAc洗脱。浓缩含产物的流份得11.0g(96％)粘性油状化合物55。
TLC Rf0.2(1∶1己烷/EtOAc)；1H NMR(CDCl3)0.05(s，6H)，0.89(s，9H)，1.25(m，4H)，1.55(m，2H)，3.41(dd，2H)，3.62(t，2H)，3.71(m，1H)；13CNMR(CDCl3)-5.23，18.42，21.91，26.02，32.68，32.81，63.16，66.74，72.24；HRMS(FAB，MH+)，计算C12H29O3Si249.1886.实测249.1889.
化合物565，6-(二-O-苯甲酰基)-1-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-1，5，6-己三醇将6.18ml(7.48g，53.2mmol)苯甲酰氯加至5.29g(21.3mmol)化合物55在106ml吡啶中的溶液中。搅拌混合物18小时并在旋转蒸发器上浓缩。混合物在100ml冷1N HCl和100ml EtOAc间分配。检查水层的pH值，保证其为酸性。相继用100ml水和100ml饱和NaCl洗涤EtOAc层，干燥(MgSO4)、过滤并浓缩，得10.33g(99％)粘性黄色油状化合物56。 TLC Rf＝0.45(1/4；EtOAc/己烷)。1H NMR(CDCl3)d 0.05(s，6H)，0.88(s，9H)，1.59(m，4H)，1.85(m，2H)，3.14(t，2H)，4.49(dd，1H)，4.59(dd，1H)，5.54(m，1H)，7.45(m，4H)，7.58(m，2H)，8.05(m，4H).
化合物575，6-(二-O-苯甲酰基)-1，5，6-己三醇将10.7ml(10.7mmol)1N氟化四丁铵的THF溶液加到2.62g(5.35mmol)化合物56于10.9ml THF中的溶液中。搅拌混合物16小时。将混合物在25ml饱和NaHCO3溶液和3×25ml EtOAc之间分配。合并EtOAc层，用饱和NaCl溶液洗涤，干燥(MgSO4)，过滤并浓缩成粘性油，经硅胶层析纯化(1/1己烷/EtOAc)得823mg(41％)粘性油状化合物57。 Rf＝0.14(1/1，己烷/EtOAc)。
1H NMR(CDCl3)d 1.58(m，2H)，1.68(m，2H)，1.88(m，2H)，3.68(t，2H)，4.52(dd，1H)，4.62(dd，1H)，5.56(m，1H)，7.46(m，4H)，7.58(m，2H)，8.05(m，4H)；13C NMR(CDCl3)d 22.08，31.20，31.30，32.88，62.92，66.17，72.63，128.93，130.19，130.57，133.62，166.72，166.86；HRMS(FAB MH+)，计算C20H23O5；343.1545.
实测343.1553.
化合物58O-[5，6-(二-O-苯甲酰氧基)己基]-O-(2-氰乙基)-N，N-二异丙基氨基亚磷酸酯将989mg(3.28mmol)O-氰乙基-N，N，N’，N’-四异丙基二氨基亚磷酸酯的CH2Cl2(2.0ml)溶液加到1.02g(2.98mmol)化合物57和255mg(1.49mmol)二异丙铵四唑盐(将二异丙胺和四唑的乙腈溶液按1∶1的摩尔比混合并浓缩至白色固体而制得)的二氯甲烷(14.9ml)溶液中。搅拌混合物4小时，然后在25ml二氯甲烷和25ml冷的饱和NaHCO3溶液间分配。二氯甲烷层用饱和NaCl溶液洗涤，干燥(Na2SO4)、过滤并浓缩。滤过25mm柱中2”plug碱性氧化铝，用9∶1 EtOAc/Et3N洗脱纯化得1.5g(93％)粘性油化合物58。1H NMR(CDCl3)d 1.19(m，12H)，1.62(m，2H)，1.73(m，2H)，1.90(m，2H)，2.62(dd，2H)，3.53-3.92(m，6H)，4.53(dd，1H)，4.62(dd，1H)，5.58(m，1H)，7.48(m，4H)，7.60(m，2H)，8.09(m，4H)；31P NMR(CDCl3以15％H3PO4为内标)d 148.2；HRMS(FAB，MH+)，计算C29H40O6N2P 543.2624. 实测，543.2619.
化合物59[4-(碘代乙酰氨基)苯甲酸]按Weltman.J.K.，1983 Biotechniques 1148-152中描述的方法制备该化合物。简单讲，向137mg(1.0mmol)对氨基苯甲酸的二恶烷(10ml)溶液中加入708mg(2.0mmol)碘代乙酸酐。避光搅拌混合物18小时，并在25ml水和25ml EtOAc间分配。乙酸乙酯层用饱和氯化钠溶液洗，用MgSO4干燥，过滤并浓缩得797mg桃红色固体。在己烷/乙酸乙酯中重结晶得22lmg(72％)白色固态4-(碘代乙酰氨基)苯甲酸。mp 220-230℃。1H NMR(CDCl3)d 3.86(s，2H)，7.68(d，2H)，7.91(d，2H)，10.60(s，1H)。
化合物60[α，ω-二-(N-2-氨基乙基氨基甲酰基)聚乙二醇的4-(碘代乙酰氨基)苯甲酰衍生物]向185mg(0.606mmol)4-(碘代乙酰氨基)苯甲酸和406mg(0.121mmol)α，ω-二(N-2-氨基乙基氨基甲酰基)聚乙二醇(Sig-ma Chemical Co.，St.Louis，MO.，用甲苯共沸蒸馏干燥)的THF(2ml)溶液中，加入188mg(0.909mmol)二环己基碳化二亚胺。搅拌混合物2小时，然后加入6滴乙酸。加入10ml二氯甲烷并将混合物在冷箱中保持30分钟。过滤除去固体，浓缩滤液成粘性残余物。硅胶层析纯化(99/1～96/4 CH2Cl2/MeOH的梯度)得一固体，与MeOH研制得292mg奶油色固体。1H(CDCl3)NMR数据如下3.48(m，8H)，3.63(bd s，(CH2CH2O)n，积分太大无法精确测定)，3.98(s，4H)，4.18(bd m，4H)，5.91(bd m，2H)，7.48(bd m，2H)，7.76(d，4H)，7.88(d，4H)，9.38(bd m，2H)碘代乙酰测定(European Journalof Biochemistry1984，140，63-71)计算0.46mmol/g；实测0.37mmol/g.
实施例3活化价平台分子和偶联物的制备有许多方法可制备生物或合成分子与价平台分子的偶联物。一种特别特异的方法是利用连在生物或合成分子上的硫醇与价平台分子上的活性“亲硫”基团产生亲核反应形成硫醚键，但也可以利用平台分子上和生物或合成分子上反应活性基团的其他组合来将生物或合成分子共价连接在价平台分子上。表1中是相互反应性基团的几种组合。优选何种给定方法要由生物或合成分子的性质(溶解性、是否存在其他活性基团等)来决定。
表1亲核基团 相互反应性基团胺，酰肼，肼 活性酯，酸酐，酰卤，磺酰卤，亚胺酸酯，异氰酸酯，异硫氰酸酯，氯代甲酸酯，碳化二亚胺加合物，醛，酮硫醇卤代乙酰，烷基卤，烷磺酸酯，马来酰亚胺，α，β-不饱和羰基，烷基汞化合物，巯基，α，β-不饱和砜下列实施例说明如何合成各种价平台分子以及如何与生物或合成分子偶联。这些实施例显示如何利用表1中的相互反应性基团将肽和寡核苷酸偶联到价平台分子上。除肽和寡核苷酸外，其他生物活性分子(蛋白，药物等)也可以偶联到价平台分子上。
组合1平台上的硫醇-配体上的亲硫基团反应方案14
化合物A将化合物36(861mg，1.0mmol)和252mg(3.0mmol)NaHCO3溶解在20ml 1/1二噁烷/水中。冷却混合物至0℃，搅拌下加入1.16g(5.0mmol)N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基硫代乙酸酯(ProchemInc.)在40ml二噁烷中的溶液。1小时后用CH2Cl2萃取混合物。合并萃取物，干燥(MgSO4)，过滤并浓缩。在硅胶上层析纯化该粗品得化合物A。
化合物B具有4个巯基的平台将732mg(0.55mmol)化合物A的DMSO(7.3ml)溶液加至55ml氦气喷射下的pH10，100mM碳酸钠，10mM NH4OH缓中液中。混合物在N2下保持并搅拌1小时，得到四巯基平台B的约10mM溶液。
化合物X溴代乙酰化肽按标准的固相方法在Wang(对烷氧苄基)树脂上用FMOC化学合成一种肽。将FMOC保护的氨基酸依次加在氨基末端。最后一步是与N-溴代乙酰氨基己酸偶联。除去保护基并用三氟乙酸从树脂上释放肽得到化合物X，用制备性反相HPLC纯化。
肽-平台偶联物，C向四巯基平台B在pH10缓冲液中的约10mmol溶液中加入过量的溴代乙酰化肽X的DMSO溶液。用制备性反相HPLC纯化肽偶联物C。
组合2平台上的胺-肽上的活化羧酸反应方案15 化合物Y具有活化羧酸的肽按标准固相方法在Wang(对烷氧苄基)树脂上利用TFA稳定性保护基(羧基上的苄酯和氨基上的CBZ)合成肽。依次向氨基末端加上氨基酸残基。用TFA从树脂上解下肽，得到羧基末端有一游离羧基而所有其他羧基和胺均被封闭的肽。用反相HPLC纯化此保护的肽Y。
肽-平台偶联物，D将化合物Y(0.3mmol)溶于1ml DMF中，并向此溶液中加入0.3mmol二异丙基碳化二亚胺和0.3mmol HOBT。将此溶液加至0.025mmol四氨基平台36的DMF(1ml)溶液中。反应完全后真空除去DMF得到全保护偶联物粗品。将此偶联物溶于甲醇中，并将此溶液置于含100mg 10％ Pd/C(每克偶联物)的巴氏氢化仪中。在60psi H2下震摇混合物，并用制备性反相HPLC纯化脱保护的偶联物D。
组合3平台上的胺-寡核苷酸上的醛反应方案16 寡核苷酸-平台偶联物，E在0℃避光向1.0g(400mg全长，25μmol)ACT-修饰的(CA)25在19.5ml水中的溶液加入500μl(100μmol)NaIO4的200mM溶液。将混合物保持于0℃40分钟，加入50ml乙醇。保持混合物于-20℃计30分钟，2000rpm离心5分钟。弃去上清液，真空干燥沉淀。将沉淀溶于3.3ml水中，向形成的溶液中加入4.3mg(0.005mmol)化合物36在2.0ml pH8.00的100mM硼酸钠中的溶液。向形成的溶液中加入250μl(50μmol)200mM吡啶-硼烷复合物在甲醇中的溶液，保持混合物于37℃4天。用离子交换层析纯化偶联物E。
组合4平台上的活化羧酸-配体上的胺反应路线17
化合物F具有4个羧基的平台向861mg(1.0mmol)化合物36和252mg(3.0mmol)NaHCO3在20ml 1/1二噁烷/水中的溶液加入琥珀酸酐(1.0g，10mmol)，室温下搅拌混合物16小时。用1N HCl酸化混合物并浓缩。浓缩物经硅酸层析纯化得到化合物F。
化合物G具有4个N-琥珀酰亚胺基酯的平台制备126mg(0.1mmol)化合物F和46mg(0.4mmol)N-琥珀酰亚胺基于5ml无水THF中的溶液。冷却该混合物至0℃，加入103mg(0.5mmol)二环己基碳化二亚胺。搅拌混合物使其在数小时内升至室温。滤除固体，浓缩滤液得化合物G，可在硅胶上层析纯化。
化合物Z带氨基的肽按标准固相方法在Wang(对烷氧苄基)树脂上合成肽。赖氨酸ε-氨基以CBZ基团保护。利用FMOC化学向氨基末端依次加上氨基酸残基。加入的最后一个残基是N-FMOC-氨基己酸。用三氟乙酸从树脂上解下后，用哌啶除去FMOC基团，得到具有游离胺接头的肽。用反相HPLC纯化肽Z。
肽-平台偶联物H制备0.05mmol化合物Z和0.1mmol三乙胺在1ml DMF中的溶液。向此溶液中加入16.5mg(0.01mmol)化合物G在1ml DMF中的溶液。搅拌反应混合物直到反应完全。为了除去保护基，将偶联物溶于甲醇中，将此滤液与100mg 10％Pd/C(每克偶联物)一起置于一巴氏氢化仪中。在60psi H2下震摇混合物，用制备性反相HPLC纯化脱保护的偶联物H。
组合5平台上的异硫氰酸酯-配体上的胺反应方案18
化合物I有4个异硫氰酸酯的平台向861mg(1.0mmol)化合物36在10ml THF中的溶液加入三光气(381μl，575mg，5.0mmol)，室温下搅拌直到TLC检测反应完全。将混合物在二氯甲烷和5％NaHCO3溶液之间分配。萃取物经干燥(MgSO4)、过滤及浓缩。硅胶层析纯化产物I。
肽-平台偶联物J制备0.05mmol化合物Z和0.1mmol三乙胺在1ml DMF中的溶液。向此溶液中加入10.3mg(0.01mmol)化合物I在1ml DMF中的溶液。搅拌混合物直到反应完全。为了除去保护基团，将偶联物溶于甲醇，将此溶液与100mg 10％Pd/C(每克偶联物)一起置于一巴氏氢化仪中。在60psi H2下振摇混合，用制备性反相HPLC纯化脱保护偶联物J。
组合6平台上的氯甲酸酯-配体上的胺反应方案19 化合物K有4个羟基的平台将205μl(275mg，1mmol)三乙二醇二-氯甲酸酯在5ml CH2Cl2中的溶液加到497μl(525mg，5mmol)二乙醇胺和696μl(506mg，5mmol)三乙胺在5ml CH2Cl2中的0℃溶液中。让混合物升温至室温，搅拌直到TLC显示反应完全。浓缩混合物，经硅胶层析分离产物K。
化合物L具有氯甲酸酯基团的平台向412mg(1mmol)化合物K在20ml CH2Cl2中的溶液加入吡啶(100μl)，再加入1.19g(4mmol)三光气。室温下搅拌混合物20小时，真空蒸发溶剂得化合物L。
肽-平台偶联物M将1mmol化合物Z在10ml吡啶中的溶液加到132mg(0.2mmol)化合物L在5ml 1/1 THF/吡啶中的溶液中。搅拌混合物直到反应完全。真空除去溶剂。为脱去保护基团，将偶联物溶于甲醇中，并将此溶液与100mg 10％Pd/C(每克联物)在巴氏氢化仪中混合。在60psi H2下摇动混合物，经制备性反相HPLC纯化脱保护偶联物M。
实施例4含两种不同生物分子的偶联物的合成将一种以上生物活性基团偶联在平台分子上是有用的。该实施例描述含有两个马来酰亚胺基团(其与含巯基肽反应)和两个活化酯基团(其与含游离胺的药物反应)的平台的制备。如方案20中所示，形成的偶联物含有两个肽和两个药物分子。
杂活化价平台分子的制备6-氨基己酸苄酯对甲苯磺酸盐，K将32mmol 6-氨基己酸、51mmol对甲苯磺酸和40mmol苯甲醇在60ml甲苯的混合物用Dean-Stark阱回流除去水。反应完全后冷却混合物并沉淀产物。过滤收集固体，在乙醇/乙醚中重结晶得化合物K。
化合物L向1当量化合物5和2当量N-羟基琥珀酰亚胺在THF中的溶液加入二环己基碳化二亚胺(2当量)。搅拌混合物4小时并加入2.2当量化合物K。搅拌混合物至TLC检测反应完全。过滤混合物并浓缩。经硅胶层析纯化产物。
化合物M在二氯甲烷中用三氟乙酸处理化合物L。反应完全后真空浓缩混合物得化合物M的三氟乙酸盐。
化合物N
在二氯甲烷中用三氟乙酸处理化合物6(方案2)。反应完全后真空浓缩混合物，得化合物N的三氟乙酸盐。
化合物O在20℃水浴中，向4mmol化合物M和4mmol化合物N在162ml吡啶中的溶液加入3.2mmol三乙二醇二氯甲酸酯。搅拌混合物至TLC检测到反应完全，真空浓缩。将浓缩物溶于二氯甲烷，依次用1N HCl溶液、5％ NaHCO3溶液和饱和NaCl溶液洗涤。干燥(MgSO4)层，过滤并浓缩。将浓缩液溶于10ml乙醇中，加入10ml1N NaOH。搅拌混合物数小时，直到TLC检测显示没有反应继续发生为止。用1N HCl酸化混合物，用二氯甲烷萃取。干燥(Mg-SO4)、过滤并浓缩二氯甲烷层。经硅胶层析分离产物O。
化合物P将化合物O溶于乙醇，并与100mg 10％Pd/C(每克化合物O)在巴氏震摇器中氢化。用TLC监视反应的完成。反应结束后，滤去催化剂，浓缩混合物得化合物P。
化合物Q向1mmol化合物P在20ml二噁烷和5ml饱和NaHCO3中的0℃溶液加入3mmol N-甲氧羰基马来酰亚胺。搅拌此混合物1小时，用1N HCl酸化，用二氯甲烷萃取。干燥(MgSO4)、过滤并浓缩二氯甲烷层，经硅胶层析纯化得化合物Q。
化合物R向1mmol化合物Q和2mmol对硝基苯酚在二氯甲烷中的溶液加入2mmol DCC，搅拌此混合物16小时。滤去固体，浓缩滤液，经硅胶层析纯化得化合物R。
具有两个肽和两个药物分子的偶联物化合物S向1当量杂活化平台R在pH7.5的磷酸缓冲液中的溶液加入过量2当量的含巯基肽。搅拌混合物1小时，加入过量2当量的含胺药物。经反相HPLC或离子交换层析或两者结合分离偶联物3。
反应方案20
实施例5偶联3-II的合成和测试反应方案21 DMTr-5’-修饰的(CA)10的制备在Milligen 8800 Prep Scale DNA合成仪上按制造商推荐的DNA氨基亚磷酸酯合成步骤制备了多核苷酸d-[DMTr-(bzCp(CE)bzA)10]。在DMTr-d-bzA-CPG载体上加样30.0μmol/g核苷进行合成。利用该仪器的程序除去最后的DMTr封闭基团。向反应中加入Milligen激活剂溶液Cat.No.MBS 5040(45ml)和0.385g化合物51(见反应方案11)，用氩气沸腾混合该悬液8分钟。用一般的仪器方法氧化该混合物，过滤收集与载体结合的多核苷酸，风干，并用100ml浓氨水在55℃处理16小时。冷却后通过一Gel-man 10μ聚丙烯滤膜过滤。用200ml已用NaOH调至pHl2的2mMNaCl洗涤滤膜。然后将滤液加样至一Amicon色谱柱(0.45×9.4cm，150ml)上，该柱装有Q-Sepharose(Pharmacia)，先用3MNa-Cl再用2mM NaCl(pH12)平衡。用500ml线性梯度(2mM NaCl，pH12到1.3M NaCl，pH12)洗脱此柱，然后用1.3M NaCl，pH12冲洗，直到所有紫外吸收物质流出。用聚丙烯酰胺电泳进一步分析在260nm处有吸收的流份，将含纯产物的流份合并。合并液(120ml)用240ml冷异丙醇处理，于-20℃保存30分钟。在Sorvall RC 3B离心机中用H-6000A型转子于3000rpm和4℃下离心15分钟收集沉淀，得到DMTr-5’-修饰的(CA)10(14946 A260单位，498mg，62.2μM，基于300μmol CPG核苷的产率为20％)。
Tr-5’-修饰的(CA)10的合成反应方案22
按为DMTr-5’-修饰的(CA)10的合成所描述的方法，用化合物53代替化合物51来合成Tr-5’-修饰的(CA)10。
DMTr-5’修饰的多核苷酸与化合物3(IA-DABA-PEG，反应方案1)的偶联-偶联物3-I的制备在下述偶联步骤中，所有缓冲液都用氦气彻底喷射，所有反应器在用前均用氩气吹洗。用1ml 0.1M NaHCO3和210μl(876μmol，摩尔过量18倍)三丁基膦于室温下处理11.568 A260单位(48.2μmol，假定在260nm处摩尔消光值＝240,000)DMTr-5’-修饰的(CA)10在7.7ml水中的溶液0.5小时。不时摇动此悬液，用0.8ml 3MNa-Cl和16ml冷异丙醇处理。-20℃下30分钟后，3000rpm离心20分钟。将沉淀重溶于2ml水、0.2ml 3M NaCl中，用4ml异丙醇处理，再离心。将沉淀在真空下迅速干燥，溶于用氦气喷射过的2.8ml水和1ml 0.1N NaHCO3中。加入6.7mg化合物3(IA-DABA-PEG)，将混合物于暗处室温保存16小时。将终体积6ml的反应混合物加样于一用Sephacryl 200(Pharmacia)装填的5×91(1800M1)Pharmacia柱上。用0.5M NaCl，0.1M硼酸钠，pH8.3洗脱。使用蠕动泵并设置流速为约2ml/分钟。每15ml一份收集。在260nm处测定吸收度。还用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析这些流份，合并那些含纯偶联物的流份。
偶联物3-I的杂交-偶联物3-II的制备上述合并的流份含726A260单位。加入相当量的(TG)10，于90℃加热试管10分钟，然后让其在1.5小时内冷却至室温。加入等量的异丙醇，于-20℃保持3小时。3000rpm离心20分钟后，将沉淀溶于0.15M NaCl，0.01M柠檬酸钠，pH6.8中，得到53mg杂交产物。将一部分此物质用上述缓冲液稀释，在Carey 3E分光光度计中测定双链体的解链温度。此物质的Tm为73.4℃，增色率24.3％。10A260单位的产物如上所述与过量(TG)10退火。在Rainin HPLC仪上用Shodex Protein KW 8025柱经凝胶渗透HPLC分析该产物及未退火的偶联物及(TG)10标准品。用0.05M NaH2PO4，pH6.5，0.5MNaCl等梯度洗脱此柱。移行时间为12分钟。产物的保留时间为6.9分钟，(TG)10的保留时间为9.2分钟。比较峰下面积显示98.09％的产物为双链DNA。此偶联物用图6A中称为“偶联物3-II”的结构代表。
实施例6PN-KLH偶联物的制备按如下方案制备PN-KLH偶联物。

ACT-修饰的(CA)25的合成将化合物58偶联在自动化合成的最后一步所得的(CA)25上，引入非环三醇残基(ACT)单元。从10g DMT-d-BzA-CPG载体开始，用交替的dC和dA氨基亚磷酸酯，以30μmol/g的核苷加样量进行49个相继的合成步骤。从生成的d-[DMTr-(BzCP(CE)BzA)25]中除去封闭基团DMTr，并向反应混合物中加入40ml激活剂溶液(Milligen，Cat，No.MBS5040)和800mg化合物58。用氩气沸腾混合该悬液8分钟，并进行常规的氧化步骤。从反应器中取出与载体结合的多核苷酸，风干，用100ml浓氨水于55℃处理40分钟。冷却后，通过一Gelman 10μm聚丙烯滤膜过滤，然后用常规离子交换层析纯化滤液。在260nm处有吸收的流份进一步用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，合并含纯产物的流份，用异丙醇沉淀得510mg(31.9μmol，10％)的ACT-修饰的(CA)25。
单链PN-KLH偶联物的合成向100mg(2.5μmol)NaIO4处理的ACT修饰的(CA)25在1.33ml 50mM pH8.0硼酸钠中的溶液加入31.3mg(0.208μmol)KLH和2.0mg(31.8μmol)吡啶-硼烷。混合物在37℃保温72小时，在S-200上层析纯化产物。
单链PN-KLH偶联物与(TG)25的杂交向单链PN-KLH偶联物中加入相当量的(TG)25，于90℃加热试管10分钟，然后让其在1.5小时内冷却至室温。用异丙醇沉淀得53mg产物PN-KLH；Tm(0.15M NaCl，0.01M柠檬酸钠，pH6.8)73.4℃，31.1％增色率；与用过量(TG)10退火的样品、未退火的偶联物和未退火的(TG)10标准品相比较，经HPLC测得(Shodex ProteinKW 8025柱，0.05M NaH2PO4，pH6.5，0.5M NaCl)98％为双链。该偶联物可用下式代表KLH-[NH(CH2)5OPO2·O-(CA)25(TG)25]-5(假定KLH的分子量为105)并称为“PN-KLH”。
测试偶联物3-II这一耐受原用免疫原性多核苷酸PN-KLH免疫小鼠，测试偶联物3-II致此小鼠耐受的能力。
材料和方法小鼠从Jackson实验室(Bar Harbor，ME)购得6周龄C57BL/6雌性小鼠。按NIH提供的方法喂养。
免疫按照Iverson的方法(Assay for in vivo Adoptive ImmuneResponsein Handbook of Experimental Immunology，Vol.2CellularImmuoology，Eds，D.M.Weir，L.A.Herzenberg，C.Blackwell and A.Herzenberg，4th Edition，Blackwell Scientific Publications，Oxford)，给小鼠腹膜内注射100μg用明矾沉淀的PN-KLH和作为佐剂的2×109富尔马林固定的百日咳菌体，将小鼠致敏。用盐水中的50μgPN-KLH腹膜内加强注射。
PN与SRBC偶联Alsevers中的绵羊血红细胞(SRBC)购自Colorado Serum Co.，Denver，Co.，并在2周内使用。按Kipp和Miller的方法(“Prepara-tion of Protein-Cunjagated Red Blood Cells with ECDI(Modiflca-tion)”inSelected Methods in Cellalar Immuncology，(1980)，Eds，B.B.Mishell and S.M.Shiigi，W.H.Freemen and Co.，San Francisco，p103)，用(CA)25(TG)25(CAGT的25聚物)包被SRBC。简而言之，SRBC用冷盐水洗4次，在含10mg碳化二亚胺的0.35M甘露糖醇，0.01M NaCl中与偶联在D-EK上的2mg(CA)25(TG)25混合，并在4℃保温30分钟。用冷的平衡盐溶液洗涤包被的SRBC并重悬至10％(V/V)。
空斑试验用Cunningham技术(Marbrook，J.，”Liquid Matrix(SlideMethod)”inSelected Methods in Cellular Immunology，(1980)，Eds，B.B.Mishell and S.M.Shiigi，W.H.Freemen and Co.，San Francis-co，p.86)测定抗PN空斑形成细胞(pfc)的数目。如Henry所述(“Estimation of IgG responses by Elimination of IgM Plaques’inSe-lected Methods in Cellular Immunology，(1980)，Eds，B.B.Mishelland S.M.Shiigi，W.H.Freemen and Co.，San Francisco，P91)，用兔抗鼠IgG消除IgM空斑以测定IgG pfc数目。简言之，取脾脏并制得平衡盐溶液(BSS)中的单细胞悬液。向多核苷酸包被的SRBC中加入豚鼠血清得最终稀释度为1∶9豚鼠血清，并加入足量的兔抗鼠IgG使最终稀释度为1∶100兔抗鼠IgG。在微量滴定孔中混合等体积的SRBC混合物和稀释的脾细胞，并转至Cunningham室中。每只脾单独测试，并测三次。将室边缘用石蜡密封并在37℃孵育1小时。在一反式显微镜下观察这些室并计空斑数。
结果用以百日咳菌体为佐剂(A&P)的明矾沉淀的PN-KLH致敏小鼠，7周后每3只鼠分为一组。给小鼠腹膜内注射一系列成倍稀释的PN-PABA-PEG(偶联物3-II)，5天后所有小鼠(包括对照组)用盐水中的PN-KLH腹膜内加强注射。4天后取出脾脏并测定IgG pfc数目。如表2中所示，与对照组相比所有受试剂量的偶联物3-II均显示出pfc数目显著降低。
表2偶联物3-II(PN-DABA-PEG)的致耐受活性pfc/106剂量 脾细胞 平均降低(μg/小鼠)均值(S.D.) 百分率无12865(2846)62.5 2868(6809) 77.7125 3331(939) 74.1250 3044(1929) 76.3500 1809(759) 85.91000 2814(554) 78.1实施例7偶联物20-II的制备和测试Tr-5’修饰的(CA)10与价平台分子20的偶联-单链偶联物20-I的制备在氢气氛下向918mg(0.14mmol)Tr-5’-修饰的(CA)10在30ml水中的溶液加入969μl(789mg，3.89mmol)三正丁基膦。搅拌此混合物1小时，然后加入2.4ml 3M NaCl溶液，再加入已用氦喷射除去氧的42ml异丙醇。将混合物置于-20℃冰箱中1小时，然后在3000rpm离心30分钟。除去上清液，将油状残余物溶于15.5ml氦气吹过的水中。向此混合物中加入1.24ml 3M NaCl和21.7ml氦气吹过的异丙醇。将形成的混合物置于-20℃冰箱中1小时，于3000rpm离心20分钟。将油状残余物真空干燥18小时得一固体。将此固体溶于6ml氦吹过的水中达总体积6.4ml。以260nm处紫外吸收度测得DNA量为863mg(在pH7.5磷酸盐缓冲的盐水中每单位吸收度为0.033mg)。在氩气下将此溶液转移到一50ml三颈烧瓶中。一颈为氩气入口，塞住其他两颈。用水和0.87ml氦吹洗的1M磷酸钠缓冲液(pH7.8)及0.97ml甲醇调节总体积为7.7ml。向混合物中加入1.9ml(33.63mg，0.025mmol)化合物20的17.7mg/ml甲醇溶液。形成的溶液在氩气下搅拌20小时，然后用含0.1M NaCl、0.05M磷酸钠(pH7.5)和10％甲醇的溶液稀释至100ml。在Frac-togel上层析进行纯化(平衡0.1M NaCl，0.05M磷酸钠，pH7.5，10％MeOH；洗脱梯度0.5M NaCl，0.05M磷酸钠，pH7.5，10％MeOH到0.8 NaCl，0.05M磷酸钠，pH7.5，10％MeOH)。收集经HPLC和聚丙烯酰胺凝胶电泳测定含纯偶联物20-I的洗脱流份232ml。加入等体积异丙醇沉淀产物和盐，并置于-20℃冰箱中1小时。对水(2×100vol)透析得335mg偶联物20-I(32ml 10.47mg/ml的溶液，假定在260nm处0.033mg/吸收度单位)。
偶联物20-I与(TG)10退火形成双链偶联物20-II将150mg(14.33ml 10.47mg/ml，基于0.033mg/260nm吸收度单位)偶联物20-I和157.5mg(1.50ml 104.6mg/ml，基于0.033mg/260nm吸收度单位)(TG)10置于一50ml聚丙烯离心管中。加入2.0ml pH7.2 10×PBS和2.17ml水调节浓度至15mg/ml。将此混合物置于90℃水浴中，并在1.5小时内冷却至室温。用260nm处吸收度测得浓度为17.7mg/ml(0.050mg/吸收度单位)；解链温度为67.5℃；增色率为27％；渗透压346；pH7.2。为最终配制偶联物20-II，加入7.23ml pH7.2 1/2×PBS将溶液稀释至终浓度12.7mg/ml，渗透压299，通过一0.22μ滤膜过滤。
Tr-5’修饰(CA)10-20的替代偶联法单链偶联物20-I的制备向Tr-5’-修饰的(CA)10在He吹洗的100mM pH5醋酸钠中的10mg/ml溶液加入10当量三正丁基膦。搅拌该混合物1小时，然后用1.4体积异丙醇(IPA)沉淀。将混合物置于-20℃冷箱中1小时，于3000rpm离心20分钟。除去上清液，将沉淀溶于用He吹洗的IPA中达10mg/ml。将混合物置于-20℃冰箱中1小时，于3000rpm离心20分钟。将沉淀在真空下干燥18小时得一固体。制备该固体在He吹洗的100mM pH10硼酸钠缓冲液中的50mg/ml溶液。向此混合物中以9/1 MeOH/H2O中40mg/ml溶液形式加入0.25当量化合物20。在室温下搅拌混合物3-20小时并稀释(0.1M NaCl，0.05磷酸钠，pH7.5，10％MeOH)。在Factogel上层析进行纯化(平衡0.1M NaCl，0.05M磷酸钠，pH7.5，10％MeOH；洗脱梯度0.5M NaCl，0.05M磷酸钠，pH7.5，10％MeOH到0.8MNaCl，0.05M磷酸钠，pH7.5，10％MeOH)。合并经HPLC和聚丙烯酰胺凝胶电泳显示含纯20-I的流份。加入等体积IPA沉淀产物和盐，在-20℃冰箱中静置1小时。对H2O(2×10vol)渗析得20-I。
20-I与(TG)10-20的替代退火法形成双链偶联物20-II按与上述基本相同的方法进行，只是在70℃而不是90℃进行退火。
Tr-5’修饰的(CA)10-20的第二替代偶联法单链偶联物20-I的制备N2下向7.75g Tr-5’修饰的(CA)10在104ml Ar吹洗过的100mM pH5醋酸钠中的溶液加入4.8ml三正丁基膦。搅拌混合物1小时，用232.5ml异丙醇沉淀。将混合物置于-20℃冰箱中1.5小时，于3000rpm离心20分钟，然后于-20℃冷冻24小时。除去上清液，将沉淀溶于170ml He吹洗的0.3M NaCl溶液中。再次用232ml Ar吹洗的异丙醇沉淀。然后将此混合物置于-20℃冰箱中，3000rpm离心20分钟，再于-20℃放11小时。倾去上清液，沉淀在真空下干燥12小时得一固体。在110ml Ar吹洗的100mM pH10硼酸钠缓冲液中制备该固体的溶液。向此混合物中加入4.4ml 9/1甲醇/水中406mg化合物20的溶液。室温下搅拌混合物2小时。经高压离子色谱测得该产品混合物含60％20-I，Waters Gen PakFax柱(100×4mm)，60℃，从65％A/35％B到18％A/82％B的线性梯度，A＝0.05M NaH2PO4，pH7.5，1mM EDTA，10％ MeOH(V/V)；B＝0.05M NaHPO4，pH7.5，1M NaCl，1mM EDTA，10％MeOH(v/v)，在19.5分钟洗出。
偶联物20-II和未偶联对照的测试用PN-KLH和A&P免疫C57BL/6小鼠。三周后，各组(每组5只鼠)用不同剂量20-II或4.5nM HAD-AHAB-TEG(与衍生化价平台分子AHAB-TEG相连的接头HAD，见图7)，或18nM(4×4.5)(CA)10(TG)10腹膜内注射，有一组不处理。各组进行加强注射，采集血清并如实施例6中所述进行测定。抗PN应答的降低百分率如图4中所示。这些小鼠抗KLH的应答正常，与图2中所示的那些没有显著差别。这些结果清楚表明抗PN应答不受(i)仅价平台分子，(ii)仅PN，或(iii)两者的混合物的影响。PN必须与非免疫原性价平台分子偶连才能诱导耐受性。
偶联物20-II引起产生PN特异性抗体的细胞数量减少用PN-KLH和A&P免疫C57BL/6小鼠。3周后，各组动物(每组3只小鼠)用不同剂量的20-II腹膜内处理，有一组不处理。5天后，给所有的小鼠腹膜内加强注射PN-KLH(盐水中)，4天后取其脾脏，用溶血空斑试验测定产PN-特异性IgG的细胞数量。如表3中所示结果清楚表明该偶联物能降低产PN特异性IgG的细胞数量。
表3 偶联物20II降低pfc数量PN特异性剂量pfc/106脾细胞组别# μg/小鼠 (Mean&S.E.) 降低百分率1 None 5562(2570)2 274 982(1871) 82.33 91 1867(1335)66.44 30 2247(1606)59.65 10 6109(2545)06 34045(1411)27.37 14578(2475)17.78 0.4 5930(897) 0实施例8测试偏联物的致耐受性测试偶联物17-II的致耐受性用PN-KLH，A&P免疫C57BL/6小鼠。3周后各组动物(每次5只小鼠)用不同剂量偶联物17-II腹膜内处理，有一组不经处理。5天后给所有小鼠腹膜内加强注射盐水中的PN-KLH，7天后从小鼠取血。用Farr方法在PN浓度10-8M下分析血清中抗PN抗体。抗PN应答的降低百分率如图1所示。还用ELISA法分析血清中抗KLH抗体。结果用与标准抗KLH血清相比抗KLH的降低百分率表示并示于图2中。图1中数据显示该偶联物降低了抗PN的应答。在所有小鼠中抗KLH(平台分子)的应答均正常(见图2)。
测试不同的11-系列偶联物的致耐受性各组C57BL/6小鼠(每次3只)用PN-KLH、A&P免设。3周后，两组用3种不同剂量偶联物11-IV、11-II、11-VI或11-VIII腹膜内处理，有一组未处理。在图6A-B中描述了这些偶联物，按实施例7中所述方法制得。5天后给所有小鼠加强注射(腹膜内)盐水中的PN-KLH，7天后从小鼠取血。用Farr法以PN浓度10-8M分析血清中抗PN抗体。表示抗PN应答降低百分率的结果示于图3中。这些小鼠的抗KLH应答与图2中所示应答没有显著差异。所有四种偶联物在所有试验剂量下均显著降低抗PN应答。偶联物11-II降低产PN特异性抗体的细胞数量用PN-KLH，A&P免疫C57B1/6小鼠。3周后用三种不同剂量11-II腹膜内处理各组小鼠(每次3只)，一组未经处理。 5天后，所有小鼠用盐水中PN-KLH加强注射；4天后取其脾脏，用溶血空斑试验测定产PN特异性IgG的细胞数量。使用不同剂量偶联物11-II的本实验结果图于表4中。这些结果清楚表明该偶联物降低了产PN特异性IgG的细胞数量，抗体滴度的降低并不是因为血清抗体与偶联物结合的清除作用。
表4偶联物11-II降低pfc数量PN特异性pfc/106脾细胞 降低百分率组别#μg/小鼠 (圴值&S.E.) (SD)1None 10845(1308)2263 3613(547) 66.23(8.6)3873462(1041)64.98(17)4297354(1504)29.5(23.8)59 6845(2031)30.9(32.2)63 7982(223) 26.8(3.52)71 6043(545) 44.5(7)80.4 9343(1251)13(19.8)实施例9HADpS-(CA)10-偶联物20-IV的制备制备5′末端用磷代磷酸酯加接头修饰的多核苷酸。除下列不同点外，按实施例5的方法合成20聚体(CA)10并向此多核苷酸加上HAD接头。在最后的氧化步骤中，用3H-1，2-苯并二硫杂环戊二烯-3酮1，1-二氧化物(Glen Rosearch，Sterling，VA)的0.05M乙腈溶液代替碘溶液。按制造商的说明进行硫化。按实施例5中所述方法进行氨处理和纯化。该多聚核苷酸与AHAB-TEG价平台的偶联按实施例5的方法进行。
测试偶联物20-IV的致耐受性因为PN的5′-磷酸酯易于酶降解，末端磷酸酯上一个氧原子用硫取代，这样得HADpS。用PN-KLH，A&P免疫C57BL/6小鼠。三周后各组小鼠(每组5只)用不同剂量的偶联物20-IV腹膜内处理；有一组未经处理。给各组加强注射，采集血清并按上文所述方法检测。显示抗PN应答降低百分率的结果示于图5中。这些鼠的抗KLH应答正常，与图2中所示的那些没有显著差别。这些结果表明该偶联物显著降低抗PN的应答。
偶联物20-IV引起产生PN特异性抗体的细胞数降低用PN-KLH，A&P免疫C57BL/6小鼠。三周后各组动物(每组3只)腹膜内注射不同剂量的偶联物20-IV，有一经未经处理。5天后给所有小鼠腹膜内加强注射盐水中的PN-KLH，4天后取其脾脏，用溶血空斑试验检测产PN特异性IgG的细胞数量。结果如表5中所示，它表明该偶联物降低了产生PN特异性IgG的细胞数量。
表5偶联物20-IV降低pfc数量
PN特异性剂量pfc/106脾细胞组别# μg/小鼠 (均值&S.E.)降低百分率1 None 5889.4(3444)2 274 3413(1604) 423 91222(752) 96.24 301492(2269) 74.75 105421(832) 86 3 5077(1946) 13.97 1 7023(679) 08 0.4 4159(2688) 29实施例10用LJP 394-偶联物20-II处理BXSB小鼠小鼠处理方案在La Jolla Pharmaceutical喂养6-9周龄雄性BXSB小鼠(Jackson Laboratory，Bar Harbor，Me)。随意摄取食物和水。使用前一周限制动物。在第一次偶联物处理前获取原始血样及体重。在7-9周龄开始偶联物处理，从第59到150天每周静脉内注射两次。周期性采血并测定其抗DNA抗体滴度。
检测抗DNA IgG抗体的产生从每只鼠采取血清样品并用ELISA确定是否存在抗DNA抗体。用100μl/孔(PN)50-D-EK(D-谷氨酸与D-赖氨酸的一共聚物)以50μg/ml浓度于4℃下包被Falcon Probind 96孔微滴定检测板(Becton Dickerson，Oxnard，cA)过夜。用无钙和镁和0.05％Tween20的PBS(洗涤缓冲液)用一M 96V洗板器(ICN Biomedical，Inc，.Irvine，cA)洗板两次。在含1％明胶(Norland Products，Inc.，New Brunswick，NJ)和0.05％Tween 20的PBS在室温下封闭1小时。加入血清样品或标准品以前，用洗涤缓冲液洗板两次。在含1％明胶、0.05％Tween 20和10％绵羊血清的PBS稀释液中制备血清样品和标准品。培养板与血清样品在37℃孵育60-90分钟，然后用洗涤缓冲液洗孔四次。生物素标记的羊抗鼠IgG(SigmaChemical Co.，St，Louis，MO)用含10％羊血清的封闭液稀释至1/1000。 37℃孵育1小时，洗4次。加入底物OPD(Sigma ChemicalCo.，St.Louis，MO)。将培养板在黑暗中保温直到用ELISA读板器在OD 450nn(Bio-TeK Instruments，Winooski，VT)测得最大标准品的最大读数为约1OD单位为止。用50μl 3M HCl终止反应，在490hm处读板。在每个微滴定板中都有参照阳性血清，每次实验的阳性孔均在参照时间曲线95％灵敏度范围内。在随后的血样中，一些阳性样品超出了参照曲线。但大部分稀释度的鼠血清样品在参照曲线范围内。正常的阴性对照血清中未观察到显著的结合。结果示于图15中。
实施例11蜂毒肽和其偶联物的制备蜂毒蛋白分子由26个氨基酸组成，是蜂毒的主要成分。三分之一的蜂毒敏感性个体具有蜂毒蛋白特异性抗体。蜂毒蛋白在一些小鼠品系中(Bal b/c，CAF1)是高免疫原性的。在应答性小鼠品系中大部分(＞80％)蜂毒蛋白特异性抗体与B细胞表位结合，该表位是蜂毒蛋白的C末端七肽。
蜂毒蛋白H2N-Gly-Ile-Gly-Ala-Val-Leu-Lys-Val-Leu-Thr-Thr-Gly-Leu-Pro-Ala-Leu-Ile-Ser-Trp-Ile-Lys-Arg-Lys-Arg-Gln-Gln-CONH2(SEQ.ID.1).
刺激T细胞的蜂毒肽cell Stimulation蜂毒肽#1.
Ile-Lys-Arg-Lys-Arg-Gln-Gln-Gly(″7 mer″)(SEQ.ID NO.2).
蜂毒肽#2.
Trp-Ile-Lys-Arg-Lys-Arg-Gln-Gln-Gly(″8 mer″)(SEQ.IDNO.3).
蜂毒肽#3.
Ser-Trp-Ile-Lys-Arg-Lys-Arg-Gln-Gln-Gly(″9 mer″)(SEQ IDNO.4).
蜂毒肽#4.
Ile-Ser-Trp-Ile-Lys-Arg-Lys-Arg-Gln-Gln-Gly(″10 mer″)(SEQ.ID NO.5).
蜂毒肽#5.
Cys-Ile-Ser-Trp-Ile-Lys-Arg-Lys-Arg-Gln-Gln-Gly(″11mer″)(SEQ.ID NO.6).
肽合成按标准的Fmoc化学技术，在甘氨酸树脂(Advanced Chem Tech#SG5130或等同物(Advanced ChemTech，2500 Seventh StreetRoad，Louisville，KY)上，每个偶连步骤用2.3M过量氨基酸衍生物合成蜂毒蛋白。用溴酚蓝监视偶连的完成，用茚三酮证实。
偶联中使用的蜂毒蛋白肽蜂毒肽#6.
H2N-Cys-Trp-Ile-Lys-Arg-Lys-Arg-Gln-Gln-Gly-CO2H(SEQ.IDNO.7).
蜂毒肽#7.
H2N-Trp-Ile-Lys-Arg-Lys-Arg-Gln-Gln-Lys-Cys-Gly-CO2H(SEQ.ID NO.8).
蜂毒肽#8.
(H2N-Trp-Ile-Lys-Arg-Lys-Arg-Gln-Gln)2-Lys-Cys-Gly-CO2H(SEQ.ID NO.9).
加入一个半脱氨酸，因为某些肽通过硫醚键与价平台分子连结。合成后用反相HPLC纯化肽，冷冻干燥至干。然后称出适量的肽用于每次偶联。
还原预形成的二硫键(三丁基膦法)所有缓冲液用He喷洗。将肽溶于最小体积(约10-20mg/ml)的0.05M NaHCO3(pH8.25)中。通过向825.6μl异丙醇(iPrOH)中加入174.4μl三丁基膦制备1ml 0.7M三丁基膦溶液(TBP；MW＝202.32g/mol；d＝0.812g/ml)。然后向如上制备的肽溶液中加入1∶1当量的TBP，充分混合，反应30分钟到1小时，不时混合以保持TBP溶解或/和分散在溶液中。经HPLC证实还原完全。
肽与价平台分子#3或#60的偶联所有缓冲液用He喷洗。将聚乙二醇(PEG)衍生物#3或#60溶于最小体积(约20mg/ml)的0.05M NaHCO3(pH8.25)中。PEG衍生物上每个碘代乙酰基使用约3当量的肽。对氨基苯甲酸(PA-BA)-PEG；有2个碘代乙酰基；MW＝约4100g/mol；每当量PA-BA-PEG使用6当量肽。二氨基苯甲酸(PABA)-PEG有4个碘代乙酰基；MW＝约4300g/mol；每当量PABA-PEG使用12当量肽。将PEG溶液加到还原的肽溶液中，在黑暗中反应至少1小时。用制备性HPLC纯化肽偶联物。经用15％tricine[N-三(羟甲基)甲基甘氨酸]凝胶电泳检查各流份，然后合并及冷干。
表6蜂毒肽与PEG的偶联物肽或偶联物对偶联物号价平台所偶联的肽#B细胞 偶联末端表位/分子T细胞的激活1 6062N no(pep)2 3 64N no(pep/conj)3 3 74C nd4 3 54N yes(pep)5 3 882C nd
1.刺激来自蜂毒蛋白免疫小鼠的培养T细胞吸收[3H]胸苷；nd＝未测定；pep＝受试肽，conj＝受试的肽-PEG偶联物。
2.4份分支肽，每肽含两相同分支；每个分支含一个B细胞表位。鼠淋巴结增殖试验在La Jolla Pharmaceutical动物中心获得雌性Balb/c小鼠(6-8周龄；Jackaon Laboratory，Bar Harbor，Maine)并按国立卫生研究院(NIH)的指南喂养。自由摄取食物和水。用在福氏完全佐剂(CFA)(Sigma Chemical Co.，St.Lonis，MO)中的50μg蜂毒蛋白分子在每只后肢脚垫上免疫Balb/c小鼠。7天后无菌取下腘淋巴结。通过将细胞压过一50目筛将淋巴结轻轻分解。在含谷氨酰胺、青霉素和链霉素的RPMI-1640(Irvine Scientific，Irvine CA)中洗涤此单细胞悬液。5×105个细胞在圆底96孔Corning微滴定板的4个孔中，在补有10％胎牛血清(FCS)的RPMI培养液中，与10、1.0或0.1μg/ml蜂毒蛋白一起培养。阳性对照孔中细胞与100或50U/ml鼠白细胞介素2(IL-2)、1μg/ml pHA(植物血细胞凝集素)一起培养。阴性对照孔含有RPM-1640和10％FCS中的淋巴结细胞。在有5％CO2的37℃孵箱中培养细胞4天。每孔中加入1μCi[3H]胸苷(ICNBiochemicals，Costa Mesa，CA)再培养18小时。用一半自动细胞收集器(Scatron，Sterling，VA)将细胞收集在一玻璃纤维滤垫上。用液闪测定[3H]胸苷的掺入。结果用每分钟平均计数表示。
体内实验用4μg CFA中蜂毒蛋白腹膜内(i，p.)致敏Balb/c小鼠。一日后腹膜内注入潜在耐受原或配制用缓冲液。三天后所有小鼠接受不完全福氏佐剂(ICF)(Sigma Chemical Co.，St Louis，MO)中的4μg蜂毒蛋白腹膜内注射。10天后从眶后静脉丛采取100-200μl血液。检测血清样品中的抗肽或抗蜂毒蛋白IgG抗体。
检测抗蜂毒蛋白IgG或抗蜂毒蛋白全抗体用ELISA依次确定每个鼠血清样品中抗蜂毒蛋白抗体的存在与否。Falcon Probind 96孔微滴定板在磷酸盐缓冲的盐水(PBS)(pH7.2)中于4℃用10μg 1ml蜂毒蛋白预包被过夜。用含PBS、0.02％Tween 20和1％明胶(Norland Products Inc.，NewBrunswick，NJ)的洗涤溶液洗板2次。用含5％明胶的200μl PBS于37℃封板1小时。在含5％明胶的PBS稀释液中制备血清样品。在1∶100到1∶1000的稀释度测试样品。37℃孵育1小时后洗板4次。用含5％明胶的PBS稀释ExtraAvidin过氧化物酶(SigmaChemical Co.，St，Louis，MO)稀释至1∶1000。37℃保温30分钟，然后洗涤5次。每孔中加入邻苯二胺(OPD)(Sigma Chemical Co.，StLouis，MO)在黑暗中反应15-30分钟，用3M HCl终止反应。用一微板读数器(Bio-tek Instruments，Winooski，VT)在450nm处测定光密度(OD)。
抗体形成细胞的检测按如上IgG抗体测检(ELISA)中所述方法准备纤维素微滴定板(Millipore Co.，Bedford，MA)。但在上述实验中向孔中加入血清样品的地方，用脾细胞(5×105/孔)代替血清，并孵育过夜。ELISA实验的其余部按如上所述方法进行。
T细胞表位来自用蜂毒蛋白致敏的小鼠的T细胞表明，与蜂毒蛋白全分子和与C-末端蜂毒蛋白3、4和5应答，T细胞增殖(图8)。但C末端肽1和2不诱导显著的T细胞增殖。将蜂毒肽2和5与PEG偶联。象蜂毒肽2一样，蜂毒肽2的PEG偶联物也不诱导显著的T细胞增殖。
为了使用蜂毒蛋白致敏并加强的小鼠耐受，用蜂毒蛋白偶联的肽进行研究用上述制备的偶联物处理(10mg/kg，200μg/鼠)的小鼠，与用配制用缓冲液处理的对照Balb/c小鼠相比，抗蜂毒肽2抗体水平显著降低(图9)，抗蜂毒蛋白抗体水平也降低(图10)。检测用缓冲对照或偶联物处理的小鼠脾细胞，测定抗体形成细胞产生抗蜂毒蛋白或抗蜂毒肽2抗体的能力，用可溶性ELISA实验测定抗体。如图11中所示，偶联物2处理组中抗蜂毒肽2抗体形成细胞的水平显著低于用缓冲液处理的对照组。用偶联物4(含T细胞表位的肽5的偶联物)处理小鼠，没能降低所处理鼠中抗肽5抗体的滴度。因此，含T细胞表位的偶联物不是耐受原(图12)。实际上，非但没有降低应答，抗肽抗体水平还稍有升高。
实施例12为致用蜂毒蛋白致敏并加强的小鼠耐受，用蜂毒肽偶联物进行的另一些研究5-8周龄雌性C57 BL/6小鼠购自The Jackson Laboratory(Bar Harbor，ME)。按国家卫生研究院(NIH)的指南喂养动物。
免疫方案腹膜内注射5μg明矾沉淀的蜂毒蛋白和作为佐剂的2×109百日咳菌体(Michigan Department of Public Health，Lansing，MI)致敏小鼠。腹膜内加强注射PBS中的5μg蜂毒蛋白。
pfc试验用碳化二亚胺将绵羊血红细胞(SRBC)(Colorado Serum Co.，Denver，Colorado)与蜂毒肽2偶联。新鲜SRBC(2周内)用冷盐水洗4次，用甘露糖醇(0.35M甘露糖醇，0.01M NaCl)洗1次。将SRBC悬浮在甘露糖醇中达浓度10％(v/v)。向1ml 10％SRBC中加入含30μg蜂毒肽#3的100μl甘露糖醇，然后在冰中孵10分钟。然后加入100μl 1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳化二亚胺HCl(EDCI)的100mg/ml溶液，并在冰中孵育30分钟。用平衡盐溶液(BSS)(Irvine Scientific Co.，Irvine，CA)洗涤SRBC两次，并重新悬浮为10％(v/v)。用BSS重配冷干的豚鼠补体(GIBCO，NewYork，NY)，然后用BSS稀释1∶3。将1ml稀释的豚鼠补体加至3ml偶联SRBC中。加入兔抗鼠IgG达最终稀释度1∶100兔抗血清。这一浓度是预先确定的，以抑制所有IgM pfc，而提高IgG pfc的最大数目。将等体积的这种补体/抗鼠IgG/SRBC悬液与来自单一鼠的脾细胞悬液混合。将每种混合物50μl转移到Cunningham载片的室中(每个载片有3个室)。边缘用石蜡密封，于37℃孵育1小时。借助于解剖显微镜对每个室中空斑计数。每个脾悬液还用非偶联SR-BC作为对照进行分析。测定每个脾细胞悬液中存活细胞的数目。测定每个室中每106脾细胞中pfc的数目，计数三份的平均值。从偶联SRBC的pfc数中减去非偶联SRBC的pfc数以确定肽特异性pfc的数目。
确定测pfc的最佳时间用蜂毒蛋白将小鼠致敏。各组(每织3只)致敏小鼠在第2，4，6和8天用蜂毒蛋白加强免疫。在第10天处死小鼠并取其脾脏。制备细胞悬液并测定肽特异性pfc数目。用蜂毒蛋白加强免疫后第6天获得最佳数量的pfc。
肽在PEG偶联物上的方向并不影响偶联物诱导耐受性的能力为了确定PEG偶联物上肽的方法是否影响其诱导耐受性的能力，构建了两种不同的耐受原。将肽通过C-末端与价平台分子3共价相连得蜂毒肽偶联物3。各组(3/组)用蜂毒蛋白致敏的小鼠腹膜内注射偶联物或盐水。 5天后，包括未处理对照组的所有小鼠加强注射5μg蜂毒蛋白。6天后处死小鼠，取其脾并测定肽特异性pfc数目。如表8所示，两个方向都对降低用蜂毒蛋白母蛋白致敏和加强的小鼠中肽特异性pfc/106脾细胞数目上有效。
表7PEG偶联物上肽的方向不影响偶联物诱导耐受性的能力蜂毒肽 肽特异性pfc/106偶联物#μg/小鼠 脾细胞(均值和S.D.) 降低百分率3 1000μg 386(85)86.8％″ 500μg489(一只小鼠) 83.3％″ 250μg957(298) 67.3％2 1000μg 546(160) 81.3％″ 500μg866.6(235) 70.4％″ 250μg1280(一只小鼠) 56.2％无 无2924(164) --每个PEG偶联物上肽的数目影响偶联物诱导耐受性的能力为了确定肽与PEG分子的比率是否重要，构建了三种不同的偶联物，每种PEG偶联物上肽的数目不同。偶联物1中每个PEG偶联物仅有两个肽。另一种偶联物中每个PEG偶联物有四个肽(偶联物2)。第三种每PEG偶联物有八个肽(偶联物5)。各组(3/组)用蜂毒蛋白致敏的小鼠腹膜内注射不同的偶联物或盐水。5天后，包括未处理对照组的所有小鼠加强注射5μg蜂毒蛋白。6天后，处死小鼠，取其脾并测定肽特异性pfc的数目，如表8所示，每PEG分子含两肽的偶联物1不能降低用蜂毒蛋白母蛋白致敏和加强的小鼠中肽特异性pfc/106脾细胞的数量。结果表明蜂毒肽偶联物2和5都可有效地作为耐受原；但含8个肽的偶联物5在低于偶联物2的剂量下有效，偶联物2中每个价平台分子含4个肽。
表8每PEG偶联物上肽的数目影响偶联物诱导耐受性的能力肽特异性间接处理所剂量IgG用分子μg/小鼠(nMoles) pfc(SD) 降低百分率未处理 1159(280) std偶联物1 1000(217)1290(98) -11％250(54) 1350(206) -16％偶联物2 500(80) 585(125) 49.5％250(40) 1001(176) 14％偶联物5 500(53) 630(325) 45.6％250(26.5)443(105) 61.8％125(13.25) 583(69) 49.7％
对多核苷酸化学、偶联物化学、免疫学领域和相关领域的技术人员显而易见的，对实施本发明的上述方案的修正应包括在下述权利要求范围之内。
权利要求
1.包含分支基团的价平台分子，其中所述平台分子的化合价是二或更高，并且其中所述分支基团的数目预先确定了所述平台的化合价和生物活性分子附着位点的位置。
2.权利要求1的分子，其中所述分支基团来源于选自二氨基酸、三胺和氨基二酸基团的功能性部分。
3.权利要求1或2的分子，其具有实质上均一的分子量。
4.权利要求1-3之任一项的分子，其包含至少一个末端分支基团，其中所述末端分支基团是二分叉的，从而为生物活性分子提供两个附着位点。
5. 权利要求1的分子，由下式表示G[2]{L[2]-J[2]-Z[2](T[2])p[2]}n[2]其中G[2]选自-(CH2)q--CH2-(CH2OCH2)r-CH2-(HO)4-sC(CH2OCH2CH2-)s其中n[2]个L[2]的每一个所述残基存在时独立地选自O，NRSUB和S；其中n[2]个J[2]的每一个所述残基存在时独立地选自C(＝O)和C(＝S)；其中n[2]个Z[2]的每一个独立地选自下式所表示的基团 或W[4]-N{Y[4]}2或W[5]-CH{Y[5]}2其中各W[3]，W[4]或W[5]存在时独立地为包含1-100个选自C，H，N，O，Si，P和S的原子的基团；2×n[2]个Y[4]的每一个以及2×n[2]个Y[5]的每一个独立地为包含1-100个选自C，H，N，O，Si，P和S的原子的基团，其含有至少p[2]/2(其中p[2]/2是整数)个功能性基团在烷基、链烯基和芳族碳原子上的附着位点；其中p[2]×n[2]个T[2]的每一个独立地选自 其中q是0-20的整数；r是0-300的整数；而s是1-4的整数；每个X独立地是F，Cl，Br，I，或允许亲核加成至所述价平台分子的其它功能性基团；每个RALK独立地为直链、支链或环状C1-20烷基；每个RSUB独立地是H；直链、支链或环状C1-20烷基；C6-20芳基；或C7-30烷芳基；并且每个RB独立地是包含1-50个选自C，H，N，O，Si，P和S的原子的化学基团；每个RESTER独立地是N-琥珀酰亚氨基、对硝基苯基、五氟苯基、四氟苯基、五氯苯基、2，4，5-三氯苯基、2，4-二硝基苯基或氰甲基；p[2]是1-8的整数；n[2]是1-32的整数；并且条件是p[2]×n[2]大于1而小于33。
6.权利要求5的分子，其中结构L[2]-J[2]-Z[2]选自 和
7.权利要求6的分子，其中p[2]×n[2]个T[2]的每一个独立地选自-SH -NH2 -NCS-RALKX
8.权利要求5-7任一项的分子，其中s是3或4。
9.权利要求5-8任一项的分子，其中所有p[2]×n[2]个T[2]是相同的。
10.权利要求5-9任一项的分子，其中n[2]是1-16。
11.权利要求10的分子，其中n[2]是1-8。
12.权利要求10的分子，其中n[2]是1-4。
13.权利要求10的分子，其中n[2]是1-2。
14.权利要求5-13任一项的分子，其中p[2]是1-4。
15.权利要求14的分子，其中p[2]是1-2。
16.权利要求5-15任一项的分子，其中所有n[2]个Z[2]是相同的。
17.偶联物，其包含(a)生物活性分子，和(b)权利要求1-16任一项的价平台分子。
18.权利要求17的偶联物，其中所述价平台分子结合至多核苷酸。
19.权利要求18的偶联物，其中所述多核苷酸是长度为至少约20bp的双链体。
20.权利要求17的偶联物，其中所述生物活性分子是特异性结合抗体并且缺乏T细胞表位的免疫原的类似物，所述抗体与所述免疫原特异性结合。
21.权利要求17的偶联物，其中所述生物活性分子选自糖类、脂类、脂多糖、蛋白质、肽、糖蛋白、药物、单链或双链寡核苷酸、半抗原、拟表位、适体、或其类似物。
22.权利要求17的偶联物，其中所述生物活性分子是多肽。
23.权利要求17-22任一项的偶联物，其中生物活性分子位于平台分子的末端。
24.权利要求17-23任一项的偶联物，其中所述价平台分子包含至少一个末端分支基团，其中所述末端分支基团是二分叉的，从而为所述生物活性分子提供两个附着位点。
25.权利要求17-24任一项的偶联物，其中所述生物活性分子是相同的。
26.权利要求25的偶联物，其中所述价平台分子具有实质上均一的分子量。
27.权利要求17-26任一项的偶联物，其中所述偶联物包含分别结合至分支基团末端和生物活性分子的连接部分。
28.权利要求17的偶联物，其中所述生物活性分子包含至少约20个碱基对的多核苷酸双链体，各自结合至价平台分子，所述多核苷酸双链体各具有对人系统性红斑狼疮抗dsDNA自身抗体的显著结合活性。
29.权利要求17的偶联物，其中所述生物活性分子选自糖类、脂类、脂多糖、肽、蛋白质、糖蛋白、单链寡核苷酸、双链寡核苷酸、半抗原、及其类似物包括拟表位和适体、及其混合物。
30.权利要求17的偶联物，其中所述价平台分子通过选自DABA，BAHA，BAHAOX和ARAB的试剂衍生化。
31.权利要求28的偶联物，其中一个接头分子将双链体偶联至价平台分子。
32.权利要求31的偶联物，其中所述接头分子选自HAD和HADPS。
33.权利要求28的偶联物，其中所述多核苷酸双链体的长度是实质上均一的。
34.权利要求28的偶联物，其中所述多核苷酸双链体在核苷酸组成方面是实质上均一的。
35.权利要求28的偶联物，其中所述多核苷酸双链体的长度为约20-约50bp。
36.权利要求28的偶联物，其中所述多核苷酸双链体在其一个末端或接近一个末端处结合至价平台分子。
37.权利要求28的偶联物，其中所述多核苷酸双链体是(CA)10(TG)10，并且所述价平台分子是衍生化的三甘醇。
38.权利要求37的偶联物，其中多核苷酸双链体与价平台分子的摩尔比为2∶1到8∶1。
39.权利要求37的偶联物，其中多核苷酸双链体与价平台分子的摩尔比为4∶1。
40.权利要求28的偶联物，其中所述多核苷酸双链体是(CA)10(TG)10，并且所述价平台分子是衍生化的2，2’-亚乙二氧基二乙胺。
41.权利要求40的偶联物，其中多核苷酸双链体与价平台分子的摩尔比为2∶1到8∶1。
42.权利要求40的偶联物，其中多核苷酸双链体与价平台分子的摩尔比为4∶1。
43.权利要求28的偶联物，其中所述偶联物是人系统性红斑狼疮的耐受原。
44.权利要求28的偶联物，其中所述多核苷酸双链体具有B-DNA型螺旋结构和对人系统性红斑狼疮抗dsDNA自身抗体的显著结合活性。
45.权利要求20的偶联物，其中所述免疫原是外免疫原。
46.权利要求45的偶联物，其中所述外免疫原是生物药物、过敏原、与Rh溶血疾病相关的Rh/D免疫原、与男性不育相关的α-精子或与风湿热相关的糖复合物。
47.权利要求20的偶联物，其中所述免疫原是自身免疫原。
48.权利要求47的偶联物，其中所述自身免疫原与甲状腺炎、糖尿病、中风或重症肌无力相关。
49.权利要求20的偶联物，其中所述免疫原与类似物属于相同的化学类别。
50.权利要求49的偶联物，其中所述免疫原和类似物是多肽。
51.权利要求20的偶联物，其中所述免疫原与类似物属于不同的化学类别。
52.权利要求17的偶联物，由下式表示 其中r＝0-300；而每个U是 其中X＝O或S；而PN是单链或双链多核苷酸。
53.权利要求52的偶联物，其中将多核苷酸连接至磷原子的氧是单链多核苷酸5’羟基的氧或双链多核苷酸的一条链5’羟基的氧。
54.权利要求53的偶联物，其中PN是双链多核苷酸。
55.权利要求54的偶联物，其中r＝2；X＝O，并且其中PN是20个碱基对的多核苷酸。
56.权利要求55的偶联物，其中所述多核苷酸是(CA)10(TG)10。
57.权利要求56的偶联物，其中将多核苷酸连接至磷原子的氧是(CA)10的5’羟基的氧。
58.权利要求52的偶联物，其中PN是单链多核苷酸。
59.权利要求58的偶联物，其中r＝2；X＝O，并且其中PN是20个碱基的多核苷酸。
60.权利要求59的偶联物，其中所述多核苷酸是(CA)10。
61.权利要求60的偶联物，其中将多核苷酸连接至磷原子的氧是(CA)10的5’羟基的氧。
62.制备权利要求17-61任一项的偶联物的方法，包括将生物活性分子结合至平台分子，从而形成偶联物。
63.制备权利要求28的偶联物的方法，包括(a)将多条至少20个碱基对的单链多核苷酸各结合至价平台分子上；和(b)将互补的单链多核苷酸退火至与价平台分子结合的单链多核苷酸，以形成所述多核苷酸双链体。
64.权利要求63的制备偶联物的方法，进一步包括以下步骤首先将单链多核苷酸结合至接头分子，然后将接头分子结合至价平台分子。
65.制备权利要求20的偶联物的方法，包括(a)将缺乏T细胞表位的免疫原的类似物共价结合至价平台分子以形成偶联物；和(b)从反应混合物中回收该偶联物。
66.用于形成与生物活性分子的偶联物的组合物，其包含价平台分子，其中所述平台分子包含分支基团，其中所述平台分子的化合价是由分支基团的数目预先确定的，其中所述平台分子的化合价是二或更高，并且其中分支基团的数目预先确定了所述平台的化合价和生物活性分子附着位点的位置。
67.权利要求66的组合物，其中所述分支基团来源于选自二氨基酸、三胺和氨基二酸基团的基团。
68.权利要求66或67的组合物，其中所述价平台分子具有实质上均一的分子量。
69.权利要求66-68任一项的组合物，其中所述价平台分子包含至少一个末端分支基团，其中所述末端分支基团是二分叉的，从而为所述生物活性分子提供两个附着位点。
70.权利要求66-69任一项的组合物，其中所述生物活性分子结合至价平台分子，从而产生包含偶联物的组合物；并且其中所述生物活性分子是相同的。
71.权利要求70的组合物，其中所述生物活性分子包含多核苷酸。
72.权利要求71的组合物，其中所述偶联物包含分别结合至分支基团的末端和生物活性分子的连接部分。
73.用于治疗抗体介导病变的组合物，其包含权利要求17-61任一项的偶联物，其中所述组合物配制成注射施用。
74.权利要求73的组合物，其中所述组合物适于降低抗体水平。
75.权利要求73的组合物，其中所述组合物适于抑制抗体产生。
76.用于治疗人系统性红斑狼疮的组合物，其包含权利要求19或20的偶联物，其中所述组合物配制成注射施用。
77.药物组合物，其包含权利要求17-61任一项的偶联物，还包含可药用赋形剂。
78.用于治疗抗体介导病变的药物组合物，其包含治疗有效量的权利要求28的偶联物，与可药用载体。
79.用于治疗狼疮的药物组合物，其包含治疗有效量的权利要求28的偶联物，与可药用载体。
80.权利要求79的组合物，用于在个体中诱导对免疫原的特异性细胞无反应性。
81.权利要求79的组合物，用于治疗个体的抗体介导病变，其中在所述抗体介导病变中，作为对免疫原的应答产生了不希望的抗体。
82.权利要求78-81任一项的组合物，其中所述组合物配制成通过注射给药。
全文摘要
公开了化学上定义的非聚合价平台分子和含有化学上定义的价平台分子和生物或合成分子的偶联物，生物或合成分子包括具有至少20个碱基对、对人狼疮病抗dsDNA自身抗体有显著结合活性的多核苷酸双链体。
文档编号A61K38/11GK1572797SQ20041006212
公开日2005年2月2日 申请日期1994年9月8日 优先权日1993年9月8日
发明者S·M·库茈, D·S·琼斯, D·A·利文斯通, 余林 申请人:拉卓拉药物公司