专利名称：含水飞蓟宾和三七总苷的保肝制剂及其制备与质控方法
专利说明含水飞蓟宾和三七总苷的保肝制剂 及其制备与质控方法 本发明涉及一种具有保肝作用，治疗多种肝脏损伤疾病的注射用药物及其制备方法和质量控制方法。该药物由中药水飞蓟中提取的黄酮类成分水飞蓟宾的水溶性衍生物水飞蓟宾葡甲胺和传统名贵中药三七中提取的有效组分三七总皂苷制成。肝脏是人体重要的代谢器官，结构和功能复杂，易受多种病原体、毒物及免疫病理累及。病毒、化学物质、药物、酒精及自体免疫等都可能造成肝损伤的发生。尤其是病毒性肝炎，分布于世界各地，由于难以根治和危害面广，而与癌症、艾滋病并称“世纪三大顽症”；我国是病毒性肝炎高发区，仅乙型肝炎病毒携带者就达1.3亿。随着制药业的迅速发展，药物性肝炎日益成为一个世界性的大问题，长期用药或重症时大量用药，可引起肝细胞损害，可导致急性肝衰竭、急性肝炎、慢性肝炎、生化异常、胆汁淤积性肝炎、脂肪肝、脂质过氧化、肉芽肿、血管损伤等，即“药物性肝炎”发生；研究表明女性和年龄40岁以上的人群更容易患药物性肝损伤。近年来，我国酒精性肝病(Alcoholic，liver disease，ALD)的发病率亦呈逐年增加的趋势，在一些地区已成为第二大肝病；我国现有酒民3亿多，酒精性肝病的发病率约为20％左右。各种原因所致的肝损伤如果得不到及时、有效的治疗和保护，就会进一步恶化为肝纤维化、肝硬化。
临床上采用对症进行抗肝损伤治疗，保肝降酶是抗肝损伤的基本治疗法则。临床研究报道中药保肝降酶没有明显副作用，从而具有抗肝损伤治疗优势。因此，具有保肝降酶活性的中药成为目前的研究热点。
近年来，水飞蓟被公认为治疗肝炎的5大有效植物药物之一，其制剂已广泛用于治疗急慢性肝炎及肝硬化等[睢大.保肝药水飞蓟素的药理研究进展.时珍国药研究，1993，4(4)41]。
水飞蓟药用有效组分以水飞蓟素为主，药用有效成分以水飞蓟宾为主。水飞蓟成分以直接清除活性氧、保护肝细胞膜为特点，同时具有抑制5-脂氧合酶，促进被损伤肝细胞合成DNA及结构蛋白，免疫调节和抗肝纤维化等药理学作用，现主要制剂是德国公司生产的利肝隆片、国内研制的“益肝灵”(水飞蓟素制剂)及水飞蓟宾葡甲胺片(主要含水飞蓟素中的水飞蓟宾)。临床研究显示，该类药物具有上述广泛的药理学效应，且不良反应少、病人耐受力好，是各型病毒性肝炎、肝纤维化、酒精性肝损害以及其它中毒代谢性肝损害等的一种良好治疗药物。
但水飞蓟宾极难溶于水，且传统制剂都为口服制剂，生物利用度很低。有人将水飞蓟宾制成葡甲胺单独用于临床，但是不稳定，较易出现絮状物，且在水中的溶解度仍不高。
水飞蓟在治疗肝损伤方面的主要药理作用①抗氧化、对肝细胞膜的保护作用水飞蓟成分具有强抗氧化活性，在欧洲和亚洲都被作为抗肝毒制剂在临床上广泛应用[Lahiri-Chatterjee M，Katiyar SK，Mohan RR，AgarwalR.Aflavonoidant ioxidant，silymarin，affords exceptionally high protection agaist tumor promotionin the SENCAR mouse skin tumorigenesis model.Cancer Research，1999，59(3)622]。活性氧(ROS)包括超氧阴离子O2-，经自由基(OH·)，次氯酸阴离子(HOCl-)，过氧化氢(H2O2)等，具有高度的反应性，可与不饱和脂肪酸作用引发脂质过氧化反应，损伤细胞膜，水飞蓟素可通过抗脂质过氧化反应维持细胞膜的流动性、保护肝细胞膜，还能阻断损害肝细胞成分与肝细胞膜上特异受体的结合，抑制其对肝细胞膜的攻击及跨膜转运，中断其肝肠循环，因此，水飞蓟素可以增强肝细胞膜对多种损害因素的抵抗力[于乐成，顾长海.利加隆及其药理学效应研究进展.国外医药—合成药生化药制剂分册，2000，21(4)201～203]。
②促进肝细胞修复、再生水飞蓟素进入肝细胞后可与雌二醇受体结合并使之激活，活化的受体则可增强肝细胞核内RNA聚合酶I的活性，使核糖体RNA(r RNA)转录增强，胞浆内核糖体数目增多，促进酶及结构蛋白等的合成，并间接促进细胞DNA的合成，有利于肝细胞的修复、再生。这种作用可见于受损伤的肝细胞及肝部分切除术后剩余的肝细胞，而未见于正常肝细胞及多种恶性肿瘤细胞[Leng Peschlow E，Strenge-Hesse A.The milk thistle(silybum marianum)and sily-marin as hepatic therapeutic agents[J].Phytotherapie，1991，12(1)162]。
③抗炎作用细胞膜磷脂在磷脂酶A2的作用下代谢为花生四烯酸，后者通过5-脂氧合酶转变为白三烯(LTs)，研究显示水飞蓟素优先抑制脂氧合酶，显著减少LTs的生成，减少其毒性损害[Demlow C，Murawski N，de Groot H，et al.Scavenging ofreactive oxygen species andinhibition of arachidonic acid metabolism by silibum in human cells[J].Life Science，1996，58(18)1591.]；研究表明水飞蓟素能抑制白三烯的产生，具有抗炎和抗纤维化作用[徐诺摘译.国外医学中医中药分册.1998，20(1)37]。
三七总皂苷(简称PNS)是三七中的一类主要化学成分，以改善肝脏微循环促进肝代谢、抗肝纤维化活性为特色，同时具有抗肝脂质过氧化、保护肝细胞、抗炎等药理作用，因此具有良好的抗肝损伤作用。但单独使用三七总皂苷易出现溶血作用引起的不良反应。
三七总皂苷在治疗肝损伤方面的主要药理作用①改善肝脏微循环李哲等用造成大鼠离体灌流肝损伤模型，并观察了PNS对该模型的影响，表明PNS能明显增加血管流量，改善肝脏微循环，减轻肝损伤[李哲.三七总皂苷对大鼠离体灌流苷的影响[J].云南中医学院学报，1993，16(2)11]。巫善明对13例慢性肝炎患者在用参三七注射治疗前后进行血液流变学观察，治疗3个月后，全血黏度、血沉、血沉方程K值，红细胞电泳率和纤维蛋白原含量明显降低，认为三七能解除血液的浓、黏、聚、凝状态，改善肝脏循环，增加血流量[巫善明.三七注射液治疗13例慢性肝炎血液流变血观察[J].上海中医药杂志，1983，5(8)12]。
②抗肝纤维化活性作用熊磊等观察了PNS及三七对成纤维细胞增殖及I型胶原合成与分泌的影响，结果表明三七及PNS可抑制NIH/3T3细胞增殖及I型胶原生成与分泌，可能有抗肝纤维化活性而PNS则是三七抗肝纤维化活性的物质基础[熊磊，刘平.三七总皂苷抗肝纤维化活性的实验研究[J].中国中医药科技，1999，6(5)317]。熊磊等还对三七及PNS对NIH/3T3细胞增殖抑制作用进行了比较，结果表明二者均能抑制NIH/3T3细胞增殖，并呈一定浓度依赖性。与同浓度组三七比较，PNS效果更显著，说明三七抗肝纤维化活性的主要化学物质基础可能是PNS[熊磊，刘成海.三七及三七总皂苷对NIT/3T3细胞增殖抑制作用比较[J].云南中医学院学报，1999，22(2)1]。熊磊等进一步探讨肝纤维化作用机制结果证明PNS抗肝纤维化作用可能是通过抑制肝星状细胞增殖及细胞内外I型胶原生成来实现的[熊磊，刘平.三七皂苷对肝星状细胞及胶原生成的影响[J].中西医肝病杂志，1999，9(3)19]。张荣华等探讨三七对四氯化碳中毒性肝纤维化的防治作用，结果三七治疗后肝细胞损害，肝脏脂肪变性，炎细胞浸润的程度均较轻，成纤维细胞和胶原纤维增生亦较少。说明三七对肝细胞损害有一定保护作用，并可明显抑制肝组织中成纤维细胞及胶原纤维增生，是较理想的抗肝损伤、防治肝纤维化的药物[张荣华，周子龙三七抗肝纤维化的实验研究[J].第三军医大学学报，2000，22(4)307]。
③抗炎活性用PNS、电针(EA)对炎症动物进行治疗，并用纳络酮阻断两者作用，用组织化学的方法对PNS和EA的效应进行比较，两者均有明显的抗炎镇痛及免疫调整作用[王一菱，陈迪，吴景兰.三七总甙抗炎和镇痛作用及其机理探讨.中国中西医结合杂志.1994，14(1)35]。
目前国内肝损伤病群多，治疗用药市场大，特别是在注射液用药上，药物奇缺，主要是甘草酸类的注射液在大量临床应用，但其疗效有限，因此我国尚没有好的治疗肝损伤的特效药，也没有三七与水飞蓟配伍的研究报道及相关研究信息。我们以水飞蓟宾与三七总皂苷配合制成注射液主要优点为水飞蓟宾葡甲胺与三七总皂苷有配伍增效、互补作用，使抗肝损伤作用比单一药物作用更强。三七总皂苷能显著提高水飞蓟宾葡甲胺在水中的溶解度及稳定性，从而提高其粉针溶化性及质量，而水飞蓟宾能降低三七总皂苷的溶血作用，从而提高其安全性。本制剂具有显著的抗肝损伤作用，用于保护肝脏、治疗各型病毒性肝炎、酒精性肝损害、药物及其它中毒代谢性肝损害、肝纤维化、肝硬化等肝脏疾病。本发明的目的之一在于提供一种由水飞蓟中提取的黄酮类成分水飞蓟宾的水溶性衍生物水飞蓟宾葡甲胺和三七中提取的有效组分三七总皂苷组成的注射用复方制剂，可有效保护受损肝脏，用于各类肝脏疾病的治疗。经药理活性筛选和拆方研究，我们将水飞蓟宾葡甲胺与三七总皂苷进行了配伍研究，发现本处方二药合在一起配用，与单独使用其中任何一种相比，药效明显增强，毒副作用降低；药效学实验证明，本复方制剂用于多种肝脏疾病疗效显著；该注射用复方药物经毒理实验表明，毒性极小。
由于水飞蓟宾葡甲胺与三七总皂苷的口服吸收差，将其开发成注射给药的粉针剂后，有效成分可直接进入人体内，疗效高，充分发挥配伍优势，旨在开发出新一代保肝、抗肝损伤特效药物。本发明另一目的在于提供上述注射用复方制剂的制备方法及质控方法，其中质控方法包括水飞蓟宾葡甲胺与三七总皂苷的薄层鉴别、含量测定及指纹图谱的制定。
本中药为有效部位复方制剂，原料重量配比为水飞蓟宾葡甲胺1份三七总皂苷0.2-2份。
本中药为有效部位复方制剂，较优的原料重量配比为水飞蓟宾葡甲胺1份三七总皂苷1份其中水飞蓟宾葡甲胺(含水飞蓟宾50-65％)为原料药，来源于盘锦格林恩生物资源开发有限公司。
三七总皂苷(含人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1及三七皂苷R1总和60-80％)为原料药，来源于云南植物药业有限公司。
水飞蓟宾葡甲胺与三七总皂苷的用量比不受本文的限制，本发明研究发现水飞蓟宾葡甲胺与三七总皂苷的用量比还可以变化，而使用效果不发生显著的变化。
本注射用复方制剂剂型包括注射液、粉针。
本注射用复方制剂的配伍使用，主要优点为1.水飞蓟宾葡甲胺与三七总皂苷有配伍增效作用，使本制剂起效快，疗效高；2.三七总皂苷有助溶作用，能显著提高水飞蓟宾葡甲胺在水中的溶解度及稳定性，从而提高其生物利用度；3.水飞蓟宾葡甲胺的加入，能降低三七总皂苷的溶血作用，从而提高其安全性。
本发明还提出了上述组合物的制备方法，其注射剂的制备步骤如下
取1重量份水飞蓟宾葡甲胺，用适量注射用水搅拌，溶解，离心，上清液加入0.2-2重量份三七总皂苷，再加入配液总体积10-20％(V/V)的助溶剂，该助溶剂为聚乙二醇或丙二醇的任一种，使溶解，用适量的注射用水定容至一定体积，混匀，过滤，滤液经通量为50000～100000分子量的超滤膜超滤，超滤液灌封成注射液，消毒，即得注射液。
上述组合物制备粉针剂，按如下步骤取1重量份水飞蓟宾葡甲胺，用适量注射用水搅拌，溶解，离心，上清液加入0.2-2重量份三七总皂苷，再加入配液总体积2-8％(W/V)的成型剂，该成型剂为甘露醇或葡萄糖中的至少一种，使溶解，用适量的注射用水定容至一定体积，混匀，过滤，滤液经通量为50000～100000分子量的超滤膜超滤，无菌超滤液分装，每瓶4-5ml，冻干，压盖，即得粉针。超滤液也可以直接冷冻干燥，无菌分装，压盖，得粉针。
本发明复方药物冻干粉的鉴别方法，具体步骤是(1)水飞蓟宾葡甲胺的鉴别取本品1瓶，用甲醇分次少量超声溶解，溶液浓缩至1ml，离心，取上清液作为供试品溶液。取水飞蓟宾对照品适量，加甲醇制成1mg/ml的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2000版一部附录VIB)试验，吸取上述两种溶液各10ul，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-丙酮-甲酸(9∶2∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外灯(254nm)下观察。在供试品色谱中，与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
(2)三七总皂苷的鉴别供试品溶液的制备同上。另取三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1对照品，加甲醇制成每1ml各含1mg的混合溶液，作为对照品溶液。吸取上述两种溶液各10ul，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正丁醇-醋酸乙酯-水(4∶1∶5)的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃下加热至斑点清晰。供试品色谱中，在与混合对照品溶液色谱相应的位置上，显相同颜色斑点。
本发明复方药物冻干粉的含量测定方法，具体是(1)水飞蓟宾葡甲胺的含量测定HPLC测定水飞蓟宾的含量取本品1瓶，用甲醇分次少量超声使溶解，完全转移至100ml量瓶中，用甲醇定容，摇匀，过0.45μm的微孔滤膜，为供试品液；以甲醇配制的水飞蓟宾液为对照；Agilent 1100高效液相色谱仪，QuatPump泵，VWD紫外-可见检测器。
色谱柱淮阴汉邦科技公司，反相C18柱Kromasil C18(4.6×250mm，5μm)；淮阴汉邦科技公司，反相C18柱Lichrospher C18(4.6×250mm，5μm)。结果显示，Lichrospher C18色谱柱分离效果不及Kromasil C18色谱柱，故选用Kromasil C18(4.6×250mm，5μm)。
流动相若用乙腈-0.05％三氟乙酸水系统，水飞蓟宾的两个异构体峰很难分离；使用甲醇-0.05％三氟乙酸水系统，水飞蓟宾的其中一个异构体峰与杂质峰难以分离。故采用乙腈-甲醇-0.05％三氟乙酸水系统洗脱，甲醇∶乙腈∶0.05％三氟乙酸水＝17.5∶17.5∶65(V/V)为流动相，可使两个异构体峰和杂质峰达到很好的分离。
测定波长据水飞蓟宾的紫外光谱，其最大吸收波长为288nm，故将其测定波长确定在288nm。柱温35℃。流速1.0ml/min。
(2)三七总皂苷的高效液相法含量测定取本品1瓶，用水分次少量使溶解，并完全转移至5ml容量瓶中，用水定容，摇匀，精密量取2ml置分液漏斗中，加入正丁醇饱合的1％NaOH水溶液10ml，再加入水饱合的正丁醇液萃取3次，每次10ml，合并正丁醇液，用正丁醇饱合的水液分次洗涤至中性，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣用25％乙腈(V/V)溶解，转移至10ml容量瓶中，定容，摇匀，过0.45μm的微孔滤膜，即得，为供试品液；以流动相A配制的三七皂苷R1和人参皂苷Rb1对照品溶液；仪器、色谱柱同上。
测定波长据三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1的紫外光谱，其最大吸收波长为203nm、203nm、205nm，故将其测定波长确定在203nm。柱温30℃。流速1.0ml/min。
流动相为A溶剂系统25体积％的乙腈和B溶剂乙腈；梯度洗脱条件经过多次试验，只有梯度洗脱条件下才能使三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1与其它各峰达到很好的分离。流动相线性梯度条件如下
不直接用乙腈和水进行梯度混合，而采用25％乙腈(A)和乙腈(B)进行梯度洗脱，是为了防止乙腈与水混合时产生了气泡，在末端吸收处测定时基线不稳。
(3)三七总皂苷的比色法含量测定UV-754紫外分光光度仪。
供试品溶液的制备取本品1瓶，用水分次少量使溶解，并完全转移至5ml容量瓶中，用水定容，摇匀，精密量取2ml，置分液漏斗中，加入正丁醇饱合的1％NaOH水溶液10ml，再加入水饱合的正丁醇液萃取3次，每次10ml，合并正丁醇液，用正丁醇饱合的水液分次洗涤至中性，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣用甲醇溶解，转移至10ml容量瓶中，定容，摇匀，即得溶液，精密量取该溶液1ml，置5ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
对照品溶液的制备精密称取经60℃真空干燥2小时的人参皂苷Rg1对照品约1.84mg，置5ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，配成每1ml中含人参皂苷Rg10.368mg的溶液。
样品测定精密量取样品及对照品溶液各0.2ml于试管中，同时做一空白管，在烘箱里蒸干，冷至室温，加5％香荚兰醛冰醋酸溶液0.2ml，加1.2ml高氯酸，在70℃热水浴中显色50分钟，放冷，加冰醋酸4.6ml，摇匀，在546nm波长测定吸收度。计算，即得。
(4)三七总皂苷的薄层扫描法含量测定样品溶液的制备取本品2瓶，用甲醇分次少量使溶解，并完全转移置10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
对照品溶液的制备精密称定经60℃真空干燥2h的对照品人参皂苷Rg13mg、Rb12mg、三七皂苷R12mg，置于同一10ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，此混合液作为对照溶液。
扫描条件测定波长λs＝535nm，参比波长λR＝460nm。
薄层条件正丁醇-醋酸乙酯-水(4∶1∶5)上层溶液为展开剂，硅胶G预制板，展距8cm。
测定将点好样的硅胶G预制板展开，取出晾干，喷以27％硫酸无水乙醇溶液，于105℃烘干5min，取出放冷至室温，测定。计算，即得。
本发明复方药物冻干粉的指纹图谱测定方法，具体是(1)飞蓟宾葡甲胺的指纹图谱测定指纹图谱的测定色谱条件同飞蓟宾葡甲胺的含量测定条件。如果采用(乙腈∶甲醇)∶0.05％三氟乙酸水的酸性的梯度洗脱条件，基线不稳定，故采用恒度洗脱。
甲醇∶乙腈∶0.05％三氟乙酸水＝17.5∶17.5∶65(V/V)为流动相；计算共有峰相对保留时间及主峰的相对比值，即得。
(2)三七总皂苷的指纹图谱测定为使各峰(主峰和指纹峰)均能在规定时间内出现并达到良好分离，对三七总皂苷含量测定的流动相条件进行调整如下，其余条件同三七总皂苷含量测定。
表格表示的梯度如下在前8分钟内，流动相从纯A溶剂线性逐渐改变至A溶剂∶B溶剂比例为95.3∶4.7(V/V，下同)；再在随后的2分钟内，95.3∶4.7的A、B混合流动相又线性逐渐改变至89.3∶10.7；10分钟至27分钟，流动相保持89.3∶10.7；从27分钟至40分钟，流动相从89.3∶10.7线性逐渐改变至73∶27；至色谱峰60分钟结束，流动相保持73∶27。
计算共有峰相对保留时间及主峰的相对比值，即得。
根据本发明所述的中药有效部位复方注射制剂，用于保护肝脏、治疗各型肝损伤，包括病毒性肝炎、酒精性肝损害、其它中毒代谢性肝损害、肝纤维化、肝硬化等肝脏疾病。
实施例一保肝注射液的制备取100g水飞蓟宾葡甲胺，加5L注射用水搅拌，溶解，离心，上清液加入100g三七总皂苷，再加入3L助溶剂，该助溶剂为聚乙二醇或丙二醇的任一种，使溶解，用适量的注射用水稀释至20L，混匀，过滤，滤药液经通量为50000分子量的超滤膜超滤，灌封，10ml/支，即得注射液。
实施例二复方药物冻干粉针的制备取125g水飞蓟宾葡甲胺，加4L注射用水搅拌，溶解，离心，上清液加入125g三七总皂苷和成型剂750g，该成型剂为甘露醇或葡萄糖中的至少一种，使溶解，用适量的注射用水稀释至10L，混匀，过滤，滤药液经通量为100000分子量的超滤膜超滤，无菌干燥，分装共2500瓶，每瓶4ml，冻干，压盖，标签，即得粉针。
实施例三复方药物冻干粉与三七总皂苷溶液的兔红细胞溶血试验比较参照药理实验方法学，自家兔心脏取血20ml，置清洁干燥烧杯中，用竹签搅拌除去纤维蛋白，然后将血移入离心管内，加入生理盐水，混匀后离心5分钟(2500r/min)，弃去上清液，再加生理盐水混匀离心，反复洗至上清液呈无色透明，再将所得红细胞按其容积用生理盐水稀释成2％的混悬液。取试管12支，分为两组，均1-6编号置于试管架上，均1-6编号置于试管架上，1-6管分别加入生理盐水2.4、2.3、2.2、2.1、2.0、2.5ml，每管再加入2.5ml的2％的血球混悬液溶液，然后一组1-5号分别加入三七总皂苷溶液(剂量与复方药物冻干粉中三七总皂苷量相等，且制备方法一致)0.1、0.2、0.3、0.4、0.5ml，另一组1-5号分别加入复方药物冻干粉溶液(每瓶冻干粉用4ml注射用水溶解，下同)0.1、0.2、0.3、0.4、0.5ml。
将各管溶血轻轻摇匀，置37℃恒温水浴中，观察并记录0.5、1、2、3hr的结果。判断指标为全溶血溶液呈明红色，管底无细胞残留；部分溶血溶液呈明红色或棕色，管底有少量红细胞残留；无溶血红细胞全部下沉，上层液体无色澄明；凝集虽不溶血但出现红细胞凝集，振摇后不能分散。凡一小时后，第三管或第三管以前各管出现溶血、部分溶血或凝集反应的为溶血反应。实验结果见下表1。
表1复方药物冻干粉兔红细胞溶血试验结果
“-”表示无溶血现象，“+”表示溶血实验结果可见，6号管为对照管，3小时内未出现溶血现象。三七总皂苷溶液在1、2、3管3小时均未出现溶血，4管在2小时出现溶血，5管在1小时即出现溶血；而复方药物冻干粉1、2、3、4、5管3小时内均未出现溶血。提示复方药物冻干粉由于水飞蓟宾葡甲胺的加入而降低了三七总皂苷本身的溶血作用，使制剂的副作用降低。
实施例四三七总皂苷对水飞蓟宾葡甲胺的助溶作用取水飞蓟宾葡甲胺，称取8份，每份100mg，缓缓加入各类型溶剂，边加边搅拌，置烧杯中，逐渐增加溶剂量，至密闭加热时呈澄清溶液，记录所加溶剂的体积，并连续三个月观察溶液的稳定性，结果见表2。
表2三七总皂苷对水飞蓟宾葡甲胺溶解度的影响
由上表可见水飞蓟宾葡甲胺在水中的溶解度最低，稳定性最差，但在2％皂苷溶液+15％丙二醇中溶解度最高，比其在水中的溶解度提高了2.4倍，且溶液稳定；15％甘油、15％丙二醇和15％聚乙二醇均较显著地提高了水飞蓟宾葡甲胺的溶解度，且以15％丙二醇效果最好；单独2％皂苷溶液也可提高水飞蓟宾葡甲胺的溶解度，但效果不十分理想，而在2％皂苷溶液中加入15％甘油、15％丙二醇或15％聚乙二醇后，三七总皂苷对水飞蓟宾葡甲胺的助溶作用大大提高。综上所述，在注射液的制备中，在三七总皂苷液中加入15％的丙二醇或15％聚乙二醇，可显著提高水飞蓟宾葡甲胺的溶解度和药液的稳定性，效果比单独使用15％丙二醇或2％皂苷溶液好。
实施例五不同组方在肝纤维化模型中抗氧化的实验研究水飞蓟水飞蓟宾葡甲胺；三七三七总皂苷；复方药物各组水飞蓟宾葡甲胺与三七总皂苷复方。
雄性普通级Wistar大鼠80只，体重201士10g，随机均分为8组，每组10只正常组、模型组、阳性药组(马洛替酯，川成医药科技开发有限公司公司，生产批号030911)、复方药物组、水飞蓟组和三七组。肝纤维化模型的建立大鼠第一次后腿皮下注射40％四氯化碳花生油溶液0.5ml/100g，以后改为0.3ml/100g，每周两次，共6周。前两周给动物饲以高脂饮食(79.5％五米粉+20％猪油+0.5％胆固醇)，后4周饲以单纯玉米面(混以0.5％胆固醇)。动物于造模结束1周前腹腔注射给药，给药1周。复方药物组、水飞蓟组和三七组腹腔注射相应浓度药物，每日1次，每次2ml；阳性药对照组按60mg/kg给予马洛替酯；正常组和模型组给于等量生理盐水，末次给药后，颈动脉取血，得血清，处理后按试剂盒方法测MDA、SOD、NO。指标测定结果见下表表3不同组方在肝纤维化模型中抗氧化作用的实验研究(X±S)(n＝10)
与模型组比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001试验结果表明正常组与模型组比较，***P＜0.001，表明肝纤维化模型造模成功；水飞蓟组、三七组和复方药物各组均有明显的抗氧化作用，与模型组相比，呈显著性差异(*P＜0.05，**P＜0.01，且复方药物各组的抗氧化检测指标值均优于水飞蓟组和三七组，表明复方药物冻干粉的抗氧化作用强于水飞蓟宾葡甲胺、三七总皂苷，提示水飞蓟宾葡甲胺与三七总皂苷的配伍具有互补性，增强了抗氧化效应；此外，在复方药物各组中，配伍比例为1∶1的复方药物组，抗氧化作用比比例为1∶0.5、1∶2的复方药物组强，提示处方中两者比例为1∶1时，抗氧化作用较佳。
实施例六 不同组方抗肝纤维化的实验研究肝纤维化模型的建立每只大鼠首次后腿皮下注射纯四氯化碳0.05ml/kg，以后注射40％四氯化碳橄榄油0.03ml/kg(V/V)，每周2次，共9周。
水飞蓟水飞蓟宾葡甲胺；三七三七总皂苷；复方药物各组水飞蓟宾葡甲胺与三七总皂苷复方。
雄性普通级Wistar大鼠80只，体重198士10g，随机均分为8组，每组10只。①空白对照组，大鼠接受橄榄油后腿皮下注射，首次0.05ml/kg，以后0.03ml/kg，每周2次，同时予0.5％羧甲基纤维素钠溶液经口灌胃，5ml/kg，1/d。②肝纤维化模型组，在造模的同时予0.5％羧甲基纤维素钠灌胃5ml/kg，1/d。③阳性组(秋水仙碱，厦门星隆达化学试剂有限公司公司，批号为040116)，在造模的同时予秋水仙碱腹腔注射50μg/kg，1/d。④三七组。⑤水飞蓟组。⑥复方药物各组。④、⑤、⑥在造模的同时，腹腔注射予以相应浓度的药物(同实施例五)，1/d。各组于第9周末处死大鼠。用3％戊巴比妥钠腹腔注射0.02ml/kg，麻醉后，经股动脉放血，分离血清，-20℃保存。留取肝组织标本。
表4抗肝纤维化作用的实验研究(X±S)(n＝10)
与模型组比，**P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001根据表4正常组与模型组比较，***＜0.001，表明肝纤维化模型造模成功；从各检测指标的结果来看，水飞蓟组、三七组和复方药物各组具有不同程度的抗纤维化作用，与模型组相比，呈显著性差异(*P＜0.05，**P＜0.01，但复方药物各组的抗纤维化作用要强于水飞蓟组和三七组，提示水飞蓟宾葡甲胺与三七总皂苷的配伍具有互补性，增强了抗肝纤维化作用，而这一点也与两者均有抗肝损伤的作用有关一方面水飞蓟通过抗氧化作用使氧自由基不能攻击生物膜中的不饱合脂肪酸，起到抗脂质过氧化作用，从而防止肝细胞受损，进而防止肝纤维化的发生，另一方面根据中医辨证，结缔组织增生性疾病(包括肝纤维化和肝硬化)与血瘀证相关，活血化瘀药物对此类疾病有独特的功效，而三七是经典的止血活血良药；在复方药物各组中，水飞蓟宾葡甲胺与三七总皂苷配伍比例为1∶1时，抗肝纤维化作用比比例为1∶0.5、1∶2的复方药物组强，提示处方中两者比例为1∶1时，抗肝纤维化作用较佳。
实施例七对醋氨酚所致小鼠肝毒性的保护作用90只小鼠，雌雄兼用，随机分成6组，每组15只。水飞蓟组给予水飞蓟宾葡甲胺溶液；三七组给予三七总皂苷溶液；复方药物组给予复方药物冻干粉溶液；正常组和模型组给予等量注射用水；阳性组给予甘利欣(连云港正大天晴制药有限公司，国药准字H10940190号)(50mg/kg)。上述各组每天给药1次，连续3天。于第3天给药后，除正常组，各组腹腔注射2％醋氨酚500mg/kg，观察其48h死亡率，结果见下表表5对醋氨酚致小鼠肝毒性的保护作用
由表5看出，三七总皂苷抗肝毒性的作用不如水飞蓟宾葡甲胺，这与水飞蓟能捕获肝细胞产生的毒性自由基、稳定细胞膜、对多种肝毒性物质(包括醋氨酚)造成的肝损害均有抑制作用，以及三七抗肝毒性的作用未见相关报道、三七本身具有一定的溶血作用相符，但水飞蓟宾葡甲胺与三七总皂苷合用后，对醋氨酚所致的小鼠肝毒性有较好的保护作用，死亡率比单独使用水飞蓟宾葡甲胺或三七总皂苷有所降低，提示经配伍后的复方药物冻干粉具有减毒作用。
实施例八对醋氨酚所致小鼠肝脏还原型谷胱甘肽耗竭的保护作用水飞蓟水飞蓟宾葡甲胺；三七三七总皂苷；复方药物各组水飞蓟宾葡甲胺与三七总皂苷复方。
90只小鼠，雌雄各半，随机分成6组，每组15只。水飞蓟组、三七组、复方药物组分别给予相应浓度的药物，正常组和模型组给予等量注射用水，阳性组给予甘利欣(50mg/kg)，每天给药1次，连续3天。于第3天给药后，水飞蓟组、三七组、复方药物组、阳性组和模型组腹腔注射0.8％醋氨酚200mg/kg，正常组给予等量注射用水。45min后，解剖肝脏，测定其还原型谷胱甘肽(GSH)含量，结果见下表表6对醋氨酚所致小鼠肝脏还原型谷胱甘肽耗竭的保护作用
与模型组比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001试验结果表明，水飞蓟组、复方药物组对醋氨酚所致小鼠肝脏还原型谷胱甘肽耗竭有明显的保护作用，与模型组相比，具有显著性差异(*P＜0.05，**P＜0.01，且复方药物组抗肝GSH耗竭作用要高于水飞蓟组、三七组，提示了复方药物冻干粉的配伍增效作用。
实施例九复方药物冻干粉针对四氯化碳致大鼠急性肝损伤的保护作用取SD雄性大鼠60只，体重180～220g，随机分为6组，即正常组、模型组、阳性药物组、复方药物冻干粉针低、中、高3个剂量组。各组动物每天iv给药1次，连续5天。末次给药12小时后，除正常组外，各组动物ip CCl4溶液1.0ml/kg，注射CCl412小时后，各动物眼眶取血，以3000r/min离心10min常规制备血清，应用谷丙转氨酶测定试剂盒及谷草转氨酶测定试剂盒，在754-型紫外可见分光光度计505nm处测定吸收度，计算ALT含量、AST含量，并采用组间t检验法与模型组进行显著性测定比较。
表7复方药物冻干粉针对四氯化碳致大鼠急性肝损伤的保护作用
实验结果表明，iv保肝粉针可明显降低CCl4致急性肝损伤大鼠的血清ALT、AST含量，证明其对CCl4所致的大鼠急性肝损伤具有保护作用。
实施例十复方药物冻干粉针对氨基半乳糖致大鼠急性肝损伤的保护作用取SD雄性大鼠60只，体重180～220g，随机分为6组，即正常组、模型组、阳性药物组、复方药物冻干粉针低、中、高3个剂量组。各组动物每天iv给药1次，连续5天。末次给药12小时后，除正常组外，各组动物ip GaLN溶液600mg/kg，注射GaLN 36小时后，各动物眼眶取血，以3000r/min离心10min常规制备血清，应用谷丙转氨酶测定试剂盒及谷草转氨酶测定试剂盒，在754-型紫外可见分光光度计505nm处测定吸收度，计算ALT含量、AST含量；应用碱性磷酸酶测定试剂盒，在754-型紫外可见分光光度计520nm处测定吸收度，计算AKP含量，并采用组间t检验法与模型组进行显著性测定比较。
表8复方药物冻干粉针对氨基半乳糖致大鼠急性肝损伤的保护作用
实验结果表明，iv保肝粉针可明显降低GaLN致急性肝损伤大鼠的血清ALT、AST、AKP含量，证明其对GaLN所致的大鼠急性肝损伤具有保护作用。
实施例十一复方药物冻干粉针的犬一般药理作用试验选用健康犬24只，体重8～12kg，，♀♂兼用。随机分为对照组(静脉推注对照溶媒，即等浓度成型剂的生理盐水溶液)，复方药物冻干粉针高、中、低3个剂量组(分别静脉推注复方药物冻干粉针40mg/kg、20mg/kg、10mg/kg)，给药容积为2ml/kg，静脉推注给药速度为10ml/分钟。动物称重后在3％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉下，仰卧位固定，分离并暴露右下肢股动脉，插管连接血压换能器，记录血压。分离左下肢股静脉以备给药。接呼吸换能器，记录呼吸；肢体II导联测定心电图。上述准备工作结束，动物稳定半小时后测定并记录血压、呼吸和心电图，作为给药前正常指标(血压、呼吸和心电图有异常者剔去不用)。然后从股静脉推注给药，分别于给药后1、5、10、15、30、45、60、90和120分钟同步测定记录II导联心电图P、R、T、P-R和Q-T、血压和呼吸，并与对照组比较，进行统计学处理。
结果表明复方药物冻干粉针40mg/kg、20mg/kg、10mg/kg经静脉推注给药后2小时内，对犬呼吸频率无明显影响；对犬心血管系统除高剂量40mg/kg组可使犬血压在给药后1min内出现明显下降外，其他指标如血压、心率、心律、P、R、T、P-R和Q-T等，均未见明显改变，与对照组相比，无显著性统计学意义。提示，犬静脉推注复方药物冻干粉针40mg/kg、20mg/kg、10mg/kg，除高剂量组犬的血压出现短暂波动，可能具有一过性的扩张血管作用外，对犬呼吸系统和心血管系统其他指标均无明显影响。
实施例十二复方药物冻干粉针的急性毒性试验小鼠1次静脉注射复方药物冻干粉针(30mg/ml)0.5ml/20g(750mg/kg/d)及小鼠1次腹腔注射复方药物冻干粉针(30mg/ml)0.8ml/20g(1200mg/kg/d)，给药后7天内均未见动物死亡或出现异常，无法测出复方药物冻干粉针尾静脉注射及腹腔注射给药的LD50。
结果提示复方药物冻干粉针小鼠尾静脉注射最大给药量为750mg/kg；复方药物冻干粉针腹腔注射的最大给药量为1200mg/kg。
复方药物冻干粉针建议临床用量是成人每日给药量200mg。成人体重按60kg计，复方药物冻干粉针临床成人用药量约为生药量3.33mg/kg。复方药物冻干粉针小鼠静脉注射最大给药量750mg/kg/d，约为临床成人用药量的225倍，复方药物冻干粉针小鼠腹腔注射最大给药量1200mg/kg/d，约为临床成人用药量的360倍。
实施例十三复方药物冻干粉针的大鼠长期毒性试验取7周龄左右SD大鼠，在本实验室条件下饲养1周后，选出80只大鼠供实验用。三个给药组和对照组每组各20只，雌雄各半。雌雄分开，每笼5只，挂牌饲养。每天1次，上午8～10时左右，腹腔注射给药。各组给药容积均为10ml/kg。分别给药(1)低剂量组0.75％复方药物冻干粉针溶液(75mg/kg/d)。(2)中剂量组1.5％复方药物冻干粉针溶液(150mg/kg/d)。(3)高剂量组3％复方药物冻干粉针溶液(300mg/kg/d)。(4)对照溶媒，即等浓度成型剂的水溶液。每周根据动物体重情况调整给药量。连续给药13周。连续给药实验结束停药观察3周(恢复期)。
实验过程中各组动物的外观体征、行为活动和粪便性状等均未见异常。连续给药13周后，给药组与对照组动物的体重均明显增加，给药组动物体重增长与对照组相比，经统计学处理基本无明显差异。实验过程中给药组动物摄食量与对照组相比，经统计学处理基本无明显差异。
血液学检查在连续用药13周给药实验结束时，各组动物的凝血时间、血红蛋白、血小板、红细胞总数、白细胞总数和分类均在正常范围内，给药组与对照组相比，经统计学处理无明显差异；在连续给药实验结束停药观察3周(恢复期)后，各组动物的凝血时间、血红蛋白、血小板、红细胞总数、白细胞总数和分类均在正常范围内，给药组与对照组相比，经统计学处理无明显差异。
血液生化检查在连续给药13周给药实验结束时，各组动物的血清丙氨酸氨基转换酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转换酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、尿素氮(BUN)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、总胆红素(T-BIL)、血糖(GLU)、肌酐(Crea)、总胆固醇(T-CHO)值均基本在正常范围内，给药组与对照组相比，经统计学处理，基本无明显差异；连续给药实验结束停药观察3周(恢复期)后，各组动物的血清丙氨酸氨基转换酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转换酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、尿素氮(BUN)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、总胆红素(T-BIL)、血糖(GLU)、肌酐(Crea)、总胆固醇(T-CHO)值均基本在正常范围内，给药组与对照组相比，经统计学处理，基本无明显差异。
病理检查在连续给药13周给药实验结束时，各组均取10只大鼠，雌雄各半；在连续给药实验结束停药观察3周(恢复期)后，各组再取10只大鼠，雌雄各半，剖杀取心、肝、脾、肺、肾、脑、肾上腺、甲状腺、前列腺、睾丸(带附睾)、卵巢、子宫等脏器和腺体，肉眼观察未见异常。各脏器称重，计算主要脏器重量系数。各组动物主要脏器重量系数均在正常范围内，给药组与对照组相比，经统计学处理无明显差异。
重要脏器切片镜检在连续给药13周给药实验结束时，高剂量组和对照组均取10只大鼠，雌雄各半；在连续给药实验结束停药观察3周(恢复期)后，高剂量组和对照组再取10只大鼠，雌雄各半，取心、肝、脾、肺、肾、脑、肾上腺、甲状腺、垂体、胸腺、前列腺、睾丸(连附睾)、卵巢、子宫、胃、十二指肠、回肠、结肠、胰腺、膀胱、淋巴结、脊髓、胸骨(骨和骨髓)、视神经等24个脏器和腺体，10％福尔马林固定，石腊包埋，常规切片，HE染色，作组织学镜检。结果基本无组织学影响。
实施例十四复方药物冻干粉针热原检查试验选取健康家兔按中国药典附录XIIIA法检验，用MC-3B电脑数字式体温计测量各兔肛门体温，结果如表9表9热原检查的试验结果
由表9可见，家兔注射经超滤的冻干粉，体温升高不明显；而注射未经超滤的冻干粉，体温略有升高；结果表明，溶液经过超滤可以除去热原，保证制剂的安全性。
上述药效学资料显示根据本发明所述的中药有效部位复方注射制剂，用于保护肝脏、治疗各型病毒性肝炎、酒精性肝损害、其它中毒代谢性肝损害、肝纤维化、肝硬化等肝脏疾病，而不被本发明的具体文字所限定。
实施例十五复方药物冻干粉针中水飞蓟宾葡甲胺的薄层鉴别取本品1瓶，用甲醇分次少量超声溶解，溶液浓缩至1ml，离心，取上清液作为供试品溶液。取水飞蓟宾对照品适量，加甲醇制成1mg/ml的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2000版一部附录VIB)试验，吸取上述两种溶液各10ul，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-丙酮-甲酸(9∶2∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外灯(254nm)下观察。在供试品色谱中，与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
实施例十六复方药物冻干粉针中三七总皂苷的薄层鉴别供试品溶液的制备同上。另取三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1对照品，加甲醇制成每1ml各含1mg的混合溶液，作为对照品溶液。吸取上述两种溶液各10ul，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正丁醇—醋酸乙酯-水(4∶1∶5)的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃下加热至斑点清晰。供试品色谱中，在与混合对照品溶液色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
实施例十七复方药物冻干粉针中水飞蓟宾葡甲胺的含量测定本制剂根据高效液相色谱法(《中国药典》2000版一部附录VID)测定。
色谱条件与系统适应性试验使用Agilent 1100高效液相色谱仪，QuatPump泵，VWD紫外-可见检测器；(甲醇-乙腈＝1∶1)-0.05％三氟乙酸水＝35∶65(均为V/V)为流动相；检测波长为288nm；流速1.0ml/min；柱温为35℃。理论板数按水飞蓟宾峰计算应不低于3000。
标准品溶液的制备精密称取于70℃干燥至恒重的水飞蓟宾对照品适量，用甲醇制成每1ml含0.140mg水飞蓟宾的溶液，即得；供试品溶液的制备取本品1瓶，用甲醇分次少量超声使溶解，并完全转移至100ml量瓶中，用甲醇定容，摇匀，即得；测定分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定，用外标法计算，即得，本品每瓶含水飞蓟宾葡甲胺以水飞蓟宾计为25～31mg。
实施例十八复方药物冻干粉针中三七皂苷的含量测定[一]本制剂根据高效液相色谱法(《中国药典》2000版一部附录VID)测定。
色谱条件与系统适应性试验使用Agilent 1100高效液相色谱仪，QuatPump泵，VWD紫外-可见检测器；检测波长为203nm；流速1.0ml/min；柱温为30℃。理论板数按三七皂苷R1、人参皂苷Rb1峰计算均应不低于3000。流动相见下表
表10线性梯度洗脱表
对照品溶液的制备精密称取于70℃干燥至恒重的三七皂苷R1、人参皂苷Rb1对照品适量，分别用25％乙腈制成每1ml含0.284mg的三七皂苷R1溶液和每1ml含0.296mg的人参皂苷Rb1溶液，即得；供试品溶液的制备取本品1瓶，用水分次少量使溶解，并完全转移至5ml容量瓶中，用水定容，摇匀，精密量取2ml置分液漏斗中，加入正丁醇饱合的1％NaOH水溶液10ml，再加入水饱合的正丁醇液萃取3次，每次10ml，合并正丁醇液，用正丁醇饱合的水液分次洗涤至中性，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣用25％乙腈溶解，转移至10ml容量瓶中，定容，摇匀，即得；测定分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定，用外标法计算，即得。
本品每瓶含三七总皂苷以三七皂苷R1和人参皂苷Rb1总和计为15～20mg。
实施例十九复方药物冻干粉针中三七总皂苷的含量测定[二]UV-754紫外分光光度仪。
供试品溶液的制备取本品1瓶，用水分次少量使溶解，并完全转移至5ml容量瓶中，用水定容，摇匀，精密量取2ml，置分液漏斗中，加入正丁醇饱合的1％NaOH水溶液10ml，再加入水饱合的正丁醇液萃取3次，每次10ml，合并正丁醇液，用正丁醇饱合的水液分次洗涤至中性，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣用甲醇溶解，转移至10ml容量瓶中，定容，摇匀，即得溶液，精密量取该溶液1ml，置5ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
对照品溶液的制备精密称取经60℃真空干燥2小时的人参皂苷Rg1对照品约1.84mg，置5ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，配成每1ml中含人参皂苷Rg10.368mg的溶液。
样品测定精密量取样品及对照品溶液各0.2ml于试管中，同时做一空白管，在烘箱里蒸干，冷至室温，加5％香荚兰醛冰醋酸溶液0.2ml，加1.2ml高氯酸，在70℃热水浴中显色50分钟，放冷，加冰醋酸4.6ml，摇匀，在546nm波长测定吸收度。计算，即得。
本品每瓶含三七总皂甙应为45～55mg。
实施例二十复方药物冻干粉针中三七总皂苷的含量测定[三]样品溶液的制备取本品2瓶，用甲醇分次少量使溶解，并完全转移置10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
对照品溶液的制备精密称定经60℃真空干燥2h的对照品人参皂苷Rg13mg、Rb12mg、三七皂苷R12mg，置于同一10ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，此混合液作为对照溶液。
扫描条件测定波长λs＝535nm，参比波长λR＝460nm。
薄层条件正丁醇-醋酸乙酯-水(4∶1∶5)上层溶液为展开剂，硅胶G预制板，展距8cm。
测定将点好样的硅胶G预制板展开，取出晾干，喷以27％硫酸无水乙醇溶液，于105℃烘干约5min，取出放冷至室温，测定。
本品每瓶含三七总皂苷以三七皂苷R1、人参皂苷Rb1和人参皂苷Rg1计应为32～40mg。
实施例二十一复方药物冻干粉针中水飞蓟宾葡甲胺的指纹图谱研究测定条件同实施例十七，符合下列指纹图谱特征表11制剂的水飞蓟宾葡甲胺标准指纹图谱
实施例二十二复方药物冻干粉针中三七总皂苷的指纹图谱研究流动相见下表外，其余测定方法同实施例十八，符合下列指纹图谱特征。
表12线性梯度洗脱表
表13制剂的三七总皂苷标准指纹图谱
图1三七皂苷R1HPLC图，图2人参皂苷Rg1HPLC图，图3人参皂苷Rb1HPLC图，图4复方药物冻干粉含量测定HPLC图(三七总皂苷)，图5复方药物冻干粉HPLC指纹图(三七总皂苷)，图6缺三七总皂苷阴性样品HPLC图，图7复方药物冻干粉含量测定HPLC图(水飞蓟宾葡甲胺)，图8复方药物冻干粉HPLC指纹图(水飞蓟宾葡甲胺)，图9缺水飞蓟宾葡甲胺阴性样品HPLC图。
权利要求
1.一种用于保护肝脏、治疗肝病的中药有效部位的复方制剂，其特征在于由水飞蓟宾葡甲胺和三七总皂苷制成。
2.根据权利要求1所述的中药有效部位的复方制剂，其特征是制成注射液或注射用粉针。
3.根据权利要求1或2所述的中药有效部位的复方制剂，其特征在于原料组分的重量配比为水飞蓟宾葡甲胺 1份三七总皂苷 0.2～2份。
4.根据权利要求3所述的中药有效部位的复方制剂，其特征在于原料组分重量配比为水飞蓟宾葡甲胺 1份三七总皂苷 1份。
5.根据权利要求3所述的中药有效部位的复方制剂，其特征在于制备方法如下取1重量份水飞蓟宾葡甲胺，用适量注射用水搅拌，溶解，药液加入0.2-2重量份三七总皂苷，再加入配液总体积10-20％(V/V)的助溶剂，该助溶剂为聚乙二醇或丙二醇的至少一种，使溶解，用适量的注射用水稀释至一定体积，混匀，过滤，滤液经50000～100000分子量的超滤膜超滤，超滤液灌封成注射液，消毒，即得注射液。
6.根据权利要求3所述的中药有效部位的复方制剂，其特征在于制备方法如下取1重量份水飞蓟宾葡甲胺，用适量注射用水搅拌，溶解，药液加入0.2-2重量份三七总皂苷，再加入配液总体积2-8％(W/V)的成型剂，该成型剂为甘露醇或葡萄糖中的至少一种，使溶解，用适量的注射用水稀释至一定体积，混匀，过滤，滤液经50000～100000分子量的超滤膜超滤，超滤液分装，每瓶4-5ml，冷冻干燥，压盖，即得粉针。
7.根剧权利要求6的中药有效部位的复方制剂的制备方法，其特征在于滤液经50000～100000分子量的超滤膜超滤，药液无菌冷冻干燥，冻干粉分装于灭菌西林瓶中，得粉针剂。
8.根据权利要求6、7所述的中药有效部位的复方制剂的薄层鉴别方法a.水飞蓟宾葡甲胺的鉴别取本品1瓶，用甲醇分次少量超声溶解，溶液浓缩至1ml，离心，取上清液作为供试品溶液，取水飞蓟宾对照品适量，加甲醇制成1mg/ml的溶液，作为对照品溶液，吸取上述两种溶液各10ul，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为9∶2∶1的氯仿-丙酮-甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，置254nm紫外灯下观察，在供试品色谱中，与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；b.三七总皂苷的鉴别供试品溶液的制备同a，取三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1对照品，加甲醇制成每1ml各含1mg的混合溶液，作为对照品溶液，吸取上述两种溶液各10ul，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为4∶1∶5的正丁醇-醋酸乙酯-水的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃下加热至斑点清晰，供试品色谱中，在与混合对照品溶液色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
9.根据权利要求6、7所述的中药有效部位的复方制剂的含量测定方法a.HPLC测定水飞蓟宾葡甲胺的含量取本品1瓶，用甲醇分次少量超声使溶解，完全转移至100ml量瓶中，用甲醇定容，摇匀，过0.45μm的微孔滤膜，为供试品液；以甲醇配制的水飞蓟宾液为对照；使用Agilent 1100高效液相色谱仪，QuatPump泵，VWD紫外-可见检测器；色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；检测波长为288nm；流速1.0ml/min，柱35℃；流动相为A溶剂系统甲醇17.5体积乙腈17.5体积和B溶剂0.05％三氟乙酸水65体积；b.HPLC测定三七总皂苷的含量取本品1瓶，用水分次少量使溶解，并完全转移至5ml容量瓶中，用水定容，摇匀，精密量取2ml置分液漏斗中，加入正丁醇饱合的1％NaOH水溶液10ml，再加入水饱合的正丁醇液萃取3次，每次10ml，合并正丁醇液，用正丁醇饱合的水液分次洗涤至中性，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣用25％乙腈溶解，转移至10ml容量瓶中，定容，摇匀，过0.45μm的微孔滤膜，即得，为供试品液；以流动相A配制的三七皂苷R1和流动相A配制的人参皂苷Rb1对照；使用Agilent 1100高效液相色谱仪，QuatPump泵，VWD紫外-可见检测器；色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；检测波长为203nm；流速1.0ml/min，柱温30℃；流动相为A溶剂系统25体积％的乙腈和B溶剂乙腈；洗脱梯度是
b.比色法测定三七总皂苷的含量供试品溶液的制备取本品1瓶，用水分次少量使溶解，并完全转移至5ml容量瓶中，用水定容，摇匀，精密量取2ml，置分液漏斗中，加入正丁醇饱合的1％NaOH水溶液10ml，再加入水饱合的正丁醇液萃取3次，每次10ml，合并正丁醇液，用正丁醇饱合的水液分次洗涤至中性，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣用甲醇溶解，转移至10ml容量瓶中，定容，摇匀，即得溶液，精密量取该溶液1ml，置5ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。对照品溶液的制备精密称取经60℃真空干燥2小时的人参皂苷Rg1对照品约1.84mg，置5ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，配成每1ml中含人参皂苷Rg10.368mg的溶液。样品测定精密量取样品及对照品溶液各0.2ml于试管中，同时做一空白管，在烘箱里蒸干，冷至室温，加5％香荚兰醛冰醋酸溶液0.2ml，加1.2ml高氯酸，在70℃热水浴中显色50分钟，放冷，加冰醋酸4.6ml，摇匀，在546nm波长测定吸收度。计算，即得。d.薄层扫描法测定三七总皂苷的含量取本品2瓶，用甲醇分次少量使溶解，并完全转移置10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，作为供试品液；以甲醇配制的三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1的混合液为对照；测定波长λs＝535nm，参比波长λR＝460nm；体积比为4∶1∶5的正丁醇-醋酸乙酯-水的上层溶液为展开剂，硅胶G预制板，展距8cm；以27％硫酸无水乙醇溶液为显色剂，于105℃烘干5min。
10.根据权利要求6、7所述的中药有效部位的复方制剂的指纹图谱测定方法a.水飞蓟宾葡甲胺的指纹图谱的测定取本品1瓶，用甲醇分次少量超声使溶解，并完全转移至100ml量瓶中，用甲醇定容，摇匀，即得，为供试品液；以甲醇配制的水飞蓟宾液为对照；使用Agilent 1100高效液相色谱仪，QuatPump泵，VWD紫外-可见检测器；色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；检测波长为288nm；流速1.0ml/min，柱温35℃；流动相为A溶剂系统甲醇 17.5体积乙腈 17.5体积和B溶剂0.05％三氟乙酸水 65体积；制剂中水飞蓟宾葡甲胺的标准指纹图谱
b.三七总皂苷的指纹图谱的测定取本品1瓶，用水分次少量使溶解，并完全转移至5ml容量瓶中，用水定容，摇匀，精密量取2ml置分液漏斗中，加入正丁醇饱合的1％NaOH水溶液10ml，再加入水饱合的正丁醇液萃取3次，每次10ml，合并正丁醇液，用正丁醇饱合的水液分次洗涤至中性，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣用25％乙腈溶解，转移至10ml容量瓶中，定容，摇匀，即得，为供试品液；以流动相A配制的三七皂苷R1和流动相A配制的人参皂苷Rb1对照；使用Agilent 1100高效液相色谱仪，QuatPump泵，VWD紫外-可见检测器；色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；检测波长为203nm；流速1.0ml/min，柱温30℃；流动相A溶剂系统25体积％乙腈水和B溶剂乙腈洗脱梯度是
制剂中三七总皂苷的标准指纹图谱
11.根据权利要求1、2、3或4所述的中药有效部位的复方药物注射制剂，其特征在于用于保护肝脏、治疗各型肝损伤，包括病毒性肝炎、酒精性肝损害、其它中毒代谢性肝损害、肝纤维化、肝硬化等肝脏疾病。
全文摘要
本发明为一种用于保护肝脏、治疗多种肝脏疾病的中药有效部位复方制剂及其制备方法和质控方法。该复方制剂由中药水飞蓟中提取的黄酮类成分水飞蓟宾的水溶性衍生物水飞蓟宾葡甲胺和三七的有效组分三七总皂苷按1∶0.2－2重量分配比组合制成，经溶解、加入聚乙二醇或丙二醇助溶剂、过滤、超滤、灌封制成注射液；或经溶解、加入甘露醇或葡萄糖成型剂、过滤、超滤、冻干制成粉针剂。用HPLC法测定了其水飞蓟宾与三七总皂苷的含量与指纹图谱。本发明的复方注射制剂的疗效显著提高于组方中的任一单味药制成注射用制剂。本发明的复方注射用药物具有疗效高，安全性好的特点。
文档编号A61P1/00GK1771976SQ20041006565
公开日2006年5月17日 申请日期2004年11月9日 优先权日2004年11月9日
发明者彭国平, 阮鸣, 李红阳 申请人:南京中医药大学