专利名称：一种预防和治疗蜜蜂真菌病的中药提取液及其制备方法
技术领域：
本发明涉及中成药，具体地说是提供一种预防和治疗蜜蜂真菌病的中药提取液及其制备的工艺方法。
背景技术：
蜜蜂常见的白垩病(Chalkbrood Disease)又称“石灰质病”，是由蜂球囊菌(Pericystis apis)引起的蜜蜂幼虫死亡，并使虫体肿胀长出白色附着物的一种顽固性真菌传染病。目前国内对白垩病的防治主要采用抗生素制霉菌素，或化学合成药物如优白净、杀白灵等，这些药物的使用都存在着蜂产品中农药残留问题。如何解决因蜜蜂病防治过程中引起的抗生素等药物残留问题，提高蜂产品质量和市场竞争力，成为当前的首要任务，使用中草药等生物制剂防治蜜蜂传染病是解决好这个问题的关键。但国内用中草药为主要原料的蜂药的研制才刚刚开始，多数停留在开发试用阶段，无大规模产品推广。
发明内容
本发明提供了一种预防和治疗蜜蜂真菌病的中药提取液及其制备的工艺方法，能对蜜蜂真菌病进行有效地预防和治疗，并能解决蜂产品的抗生素药物残留问题。
根据中药药理，选择51味具有杀菌功效的中药进行抗蜂球囊菌的实验室筛选，发现土荆皮提取液对蜂球囊菌有良好的抑制作用。土荆皮，松科植物金钱松Pseudolarix kaempferi Gor.的干燥根皮近根树皮。根皮呈不规则的长条状，扭曲而稍卷，大小不一，厚2～5mm。外表灰黄色，粗糙、有皱纹及灰白色横向皮孔，粗皮常呈鳞片状剥落，剥落处红棕色。内表面黄棕色至红棕色，平坦，有细致的纵向纹理。质韧，折断面呈裂片状，可层层剥离。气微，味苦而涩。本品粉末淡棕色或红棕色。石细胞多，类长方形、类圆形或不规则分枝状，直径30～96μm，含黄棕色块状物。筛胞大多成束，直径20～40μm，侧壁上有多数椭圆形筛域，黏液细胞类圆形，直径100～300μm。树脂细胞纵向连接成管状，含红棕色至黄棕色树脂状物，有的埋有草酸钙方晶。木栓细胞壁稍厚，有的木化，并有纹孔。土荆皮性辛、温，具有杀虫止痒作用，常以外用为主，实验证明具有抗真菌作用经选择试验，选用土荆皮来制备预防和治疗蜜蜂真菌病的中药提取液，提取液是由土荆皮的水和/或醇提取物作活性成分和药学上可接受的附加剂组成。
本发明所提供的制备预防和治疗蜜蜂真菌病的中药提取液的生产工艺如下取土荆皮作为原料，加8-12倍量水浸泡1小时，水煎煮1-2小时，过滤，得滤液I；取药渣再加8-12倍量水煎煮1-2小时，过滤，得滤液II；合并滤液I、滤液II浓缩；将浓缩液搅拌20-30分钟后取上清液，上清液加入苯甲酸钠0.4％-0.5％重量份，搅拌水加至1.25g生药/ml，灌装，100℃，30分钟蒸汽消毒，包装、即得成品。
所述的浓缩液在30℃下相对密度为1.007-1.20g/ml。
本发明的中药提取液在预防和治疗蜜蜂真菌病中的应用，抑菌使用浓度为62.5mg-1.25g生药/ml；杀菌使用浓度为125mg-1.25g生药/ml。
在本发明以纯中草为原料，通过一定的工艺将土荆皮进行提取，提取液低浓度使用时对蜂球囊菌具有较强的抑制效果，高浓度使用时具有良好的杀菌效果，使用后蜂产品中无残留，提高了蜂产品质量。
图1为本发明的制备工艺流程图；具体实施方式
一、配方筛选(一)受试药物大黄、黄柏、黄连、百部、蛇床子、大青叶、白头翁、地锦草、车前草、苦参、鱼腥草、威灵仙、大蒜、辛夷、桂枝、栀子、土荆皮、野菊花、灯笼草、蜈松、连翘、金银花、蒲公英、丹皮、茵陈、龙葵、夏枯草、贯众、细辛、马钱子、艾、干姜、青蒿、云木香、柴胡、麻黄、莪术、黄精、半夏、侧柏叶、龙胆、龙葵、金钱草、黄芪、防风、薄荷、蝉蜕、天花粉、满山香、知母、四季青51味中药材，50味中药各取50g分别水煎二次(30分/次)，煎液合并浓缩成1g生药/ml浓度，15磅20分钟蒸汽消毒，备用，大蒜取新鲜榨汁。
(二)菌种蜂球囊菌(Pericystis apis)，由浙大农学院提供，菌落呈白色棉絮状，检镜为真菌。
(三)培养基采用SDA+Y培养基(由蛋白胨2g、葡萄糖8g、琼脂3g、酵母浸膏0.4g、蒸馏水200ml配成)，自制。
(四)仪器数显电热培养箱和净化工作台。
(五)纸片扩散法1.琼脂平板制备SDA+Y琼脂熔化后倾注平皿(直径15cm)制备平板，待其凝固，取培养于琼脂平板上72小时的真菌(Pericystis apis)用无菌生理盐水混匀，均匀涂在SDA+Y琼脂平皿上，待其干燥后备用。
2.药液稀释将1g生药/ml的无菌中药煎液，在无菌试管中作原液、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64倍比稀释，备用。
3、药敏试验用无菌镊子镊纸片(直径5.5mm)浸泡稀释的药液，放置在已接种真菌(Pericystis apis)的琼脂平板上，轻压纸片使其与琼脂适当接触，每一平皿接种8片纸片，其中7片为一味中药的7种不同稀释度药片，1片为无菌生理盐水浸片。另取平皿制霉菌素和0.4％苯甲酸钠液作对照。
将平皿分别在30℃，60％湿度的培养箱中培养72小时后，用塑料尺从平皿背面侧量每个抑菌圈的直径，试验结果见表1。
表1 51味中药对蜂球囊菌的抑制作用
注0表示直径5.5mm。
由表1可见，51种中药液中，只有土荆皮有抑制蜂球囊菌的作用，并呈良好的量效关系。将土荆皮平皿和制霉菌素平皿继续培养72小时，土荆皮抑菌圈仍未长真菌，而制霉菌素抑菌圈长满真菌丝。
(六)土荆皮煎液对蜜蜂的毒性试验将土荆皮水煎煮60分钟×2次的溶液，配成1.25g生药/ml浓度，100ml装/瓶，进行毒性试验，以每蜂箱放一饲喂器10倍稀释的土荆皮水煎液，观察72小时，结果无蜜蜂死亡，初步表明该制剂对蜜蜂无毒性。
三、配方实施例取土荆皮加8倍量水浸泡1小时，水煎煮1小时，滤过，得滤液I。药渣再加入8倍量水煎煮1小时，滤过，得滤液II。合并滤液I、II浓缩至相对密度为1.05g/ml(30℃测)液体，3000rpm条件下搅拌20分钟，取上清液，弃沉淀物。上清液加入苯甲酸钠，为0.4重量份，搅拌，水加至0.5g生药/ml浓度，灌装，100℃30分钟蒸汽消毒，包装，即得成品，临用时用水稀释4倍。
1、水提正交试验以加水量(A)、煎煮时间(B)、煎煮次数(C)为主要影响因素，每个因素选3个水平，见表2。
表2水提因素水平表
根据因素水平表2，选择L9(34)正交设计表进行试验，将每1水平样品配成0.5g生药/ml浓度，再用无菌水稀释成1∶4倍进行试验，以抑菌试验直径作为考察指标，并分别对有关数据作分析，结果见表3。
表3水提正交试验设计及结果
2、醇处理对抑菌效果的影响取上述水煎浓缩液，加95％乙醇，使乙醇终浓度达70％，冷置24h，3000rpm 20分钟离心，弃沉淀物，上清液回收乙醇，加苯甲酸钠(终浓度为0.4％)，搅拌，水加至0.5g生药/ml浓度，100□30分钟蒸汽消毒，备用。将上述水煎醇沉淀用生理盐水倍比稀释，用纸片扩散法进行抑菌实验，同时设单纯水煎液作对照，结果见表4。
表4醇处理对提取液抑菌作用的影响
由表4可见，醇处理后上述提取液同样具有抑菌效果。
四、药效测试1、抑菌作用试验选取不同批次的土荆皮按实施例进行制备，取得3批提取液，抑菌作用采用纸片扩散法，抑菌环直径作为考察指标，观察提取液对蜂球囊菌的抑制作用，测试结果见表5
表5 不同批次的提取液的抑菌作用测试结果
2、最小抑菌试验(MIC)将0.5g生药/ml土荆皮提取液用无菌生理盐水按原液、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32倍比稀释，用纸片扩散法检测各稀释度对蜂球囊菌的抑制作用，结果见表6表6 最小抑菌试验(MIC)测试结果
结论本发明提取液的最小抑菌浓度为62.5mg生药/ml(即1∶8倍稀释)。
3、最小杀菌试验(MBC)将0.5g生药/ml土荆皮提取液用无菌生理盐水按原液、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32倍比稀释，在各稀释液中分别加入蜂球囊菌浸泡，各稀释管置30℃、60％湿度培养箱中培养24h，再用无菌镊子取蜂球囊菌接种于SDA+Y琼脂平皿上，各平皿置30℃、60％湿度培养72小时，观察有无蜂球囊菌生长，以无蜂球囊菌生长的土荆皮液浓度为最低杀菌浓度(MBC)。结果见表7。
表7 最小杀菌试验结果
结论最小杀菌浓度为1∶4倍稀释液，即125mg生药/ml。
4、杀菌时间试验将0.5g生药/ml土荆皮提取液用无菌生理盐水按1∶2、1∶4、1∶8、1∶6、1∶32倍稀释，在各稀释液中分别加入生长良好的蜂球囊菌浸泡。并分别于浸泡0、1、2、4、8、12、24h、72h后取真菌接种于SDA+Y培养基中，30℃60％湿度培养箱中培养72h，观察是否有蜂球囊菌生长。结果见表8。
表8 杀菌时间试验
结论提取液以1∶2倍稀释，对蜂球囊菌作用2小时，即可杀死真菌；以1∶4倍稀释液对该真菌作用4h即可杀死蜂球囊菌，以1∶8倍稀释液对该真菌作用12小时即可杀灭蜂球囊菌。
5、制剂存放按《新药审批方法》规定和中国药典2000年版一部中的方法进行存放考察，本发明产品在37□～40□温度和75％相对湿度条件下保温3个月，结果无明显变化，质量稳定。
6、蜂群防治试验报告由于2004年春季出现了近年来少有的蜂群春繁好气候，阴雨天气少，气温比常年偏高，无“倒春寒”情况，因而白垩病在浙江及周遍地区的蜂场几乎没有爆发和流行。为了检测防治效果，不得不采用人工接种发病的方法，使蜂群发病，然后采用本发明提取液进行防治，同时以农业部《蜜蜂病虫害综合防治规范》中规定使用的蜂病防治药物(西药)为阳性对照，以检测其防治效果。
(一)试验材料(1)、意大利蜂60群，蜂群健康无病害，群势中等。
(2)、人工发病用真菌菌种(蜂球囊菌)由浙江省中医药研究院提供。
(3)、本发明0.5g生药/ml土荆皮提取液。
(4)、致霉菌素从药店购入。
(5)、试验用具量筒、烧杯、喷雾器等。
(二)试验方法(1)、试验时间从2004年6月12日开始至7月6日结束。此时，蜂场周围没有蜜粉源；气候处于“梅雨”季节，湿度高，温度较高，多雨。
(2)、试验方法(a)将60群蜂均衡群势，随机分为3组，每组10群。这3组分别为本发明提取液(D组)、致霉菌素组(E组)和空白对照2组(F组)。
(b)本发明提取液组、致霉菌素组和空白对照2组这三组的30群蜂全部接种真菌菌种(蜂球囊菌)，使蜂群发生白垩病。
(c)在蜂群发病后的6月27日、6月30日和7月3日分别用本发明提取液按1∶4稀释后，喷雾蜜蜂和巢脾，用致霉菌素喷雾致霉菌素组的蜜蜂和巢脾；空白对照2组的蜂群则未作任何处理。
(4)在防治前后对每群蜂的发病率(指患病幼虫房占子脾总数的百分比)进行详细的检查，根据防治前后的发病率，计算出防治效果。
(三)试验结果(a)D组
(b)E组
(c)F组
上述结果表明，本发明的提取液对白垩病具有很好的防治效果，平均达98.20％，与阳性对照(致霉菌素)组的防治效果(95.99％)相比，无显著差异(P＞0.05)。
权利要求
1.一种预防和治疗蜜蜂真菌病的中药提取液，其特征在于它是由土荆皮水和/或醇提取物作活性成分和药学上可接受的附加剂组成。
2.根据权利要求1所述的中药提取液，其特征在于所述的醇为乙醇。
3.根据权利要求1所述的中药组合物，其特征在于所述的组合物中还加有苯甲酸钠0.4％-0.5％重量份。
4.一种预防和治疗蜜蜂真菌病的中药提取液的制备方法，取土荆皮作为原料，加8-12倍量水浸泡1小时，水煎煮1-2小时，过滤，得滤液I；取药渣再加8-12倍量水煎煮1-2小时，过滤，得滤液II；合并滤液I、滤液II浓缩；将浓缩液搅拌20-30分钟后取上清液，上清液加入苯甲酸钠0.4％-0.5％重量份，搅拌，加水至足量，灌装，100℃，30分钟蒸汽消毒，包装、即得成品。
5.根据权利要求4所述的中药组合物的制备方法，其特征在于所述的浓缩液在30℃下相对密度为1.007-1.20g/ml。
6.根据权利要求1所述的中药提取液在预防和治疗蜜蜂真菌病中的应用。
7.根据权利要求6所述的中药提取液在预防和治疗蜜蜂真菌病中的应用，其特征在于所述的中药提取液在蜜蜂中的抑菌使用浓度为62.5mg-1.25g生药/ml。
8.根据权利要求6所述的中药组提取液在预防和治疗蜜蜂真菌病中的应用，其特征在于所述的中药提取液在蜜蜂中的杀菌使用浓度为125mg-1.25g生药/ml。
全文摘要
本发明公开了一种预防和治疗蜜蜂真菌病的中药提取液，由土荆皮的水和/或醇提取物作活性成分和药学上可接受的附加剂组成。本发明还公开了该中药提取液的生产工艺及在预防和治疗蜜蜂真菌病中的应用浓度。本发明以纯中草为原料，通过一定的工艺将土荆皮进行提取，提取液低浓度使用时对蜂球囊菌具有较强的抑制效果，高浓度使用时具有良好的杀菌效果，使用后蜂产品中无残留，提高了蜂产品质量。
文档编号A61P31/00GK1748721SQ20041006639
公开日2006年3月22日 申请日期2004年9月15日 优先权日2004年9月15日
发明者杨锋, 戴关海, 胡福良, 王超敏, 南建博 申请人:浙江省中医药研究院, 江山天宝蜂业科技开发有限公司