专利名称：黑色素瘤相关抗原MAAT1p15的功能与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及黑色素瘤相关抗原MAAT1 p15(melanoma-associated antigen recognized bycytotoxic Tlymphocytes p15)的功能与应用。
背景技术：
Wnt是一种糖蛋白因子，通过旁分泌的形式发挥功能。正常的Wnt信号通路在胚胎发育过程中极其重要，不但参与了胚胎背腹轴的形成，而且与细胞极性建立、细胞命运决定等多个发育事件有关；而Wnt信号通路的异常活化则往往导致肿瘤发生如结肠癌，肝癌，卵巢癌，前列腺癌，皮肤癌等。因此深入了解Wnt信号的传导机制，是从分子水平上认识相关疾病的发生发展过程的前提，也能为疾病的预防和治疗提供必要的理论基础，具有非常重要的意义。
Frizzled基因家族编码的七次跨膜蛋白是最早被发现的Wnt受体。Frizzled蛋白的七个跨膜区具有G蛋白耦联受体特征性，但至目前为止，仍然没有任何研究证实Frizzled蛋白可通过结合G蛋白来发放信号。
低密度脂蛋白受体相关蛋白(low density-lipoprotein receptor related protein，LRP6)是1998年被克隆出来的单跨膜受体。随后的研究结果表明，LRP6在果蝇，爪蟾和小鼠三种模式动物中都参与Wnt信号传导通路，并因此被认为是七跨膜受体Frizzled的辅助受体。目前的研究初步确定了Wnt信号传导的经典通路，即Wnt配体与细胞表面的复合受体LRP6/Frizzled相互作用后，激活Dishevelled蛋白，进而使细胞质中β-连环蛋白(β-catenin)向细胞核聚集，从而激活下游基因的表达。虽然已经有大量的报道对Wnt信号传导通路的各个环节进行了阐释，但是LRP6作为最新发现的Wnt信号途径的受体，其激活下游蛋白的分子机制尚不完全清楚。利用酵母双杂交系统从小鼠11.5d胚胎cDNA文库中筛选LRP6胞内区的相互作用蛋白，并利用荧光素酶报告系统检测阳性克隆对Wnt信号通路的调节作用，为研究Wnt信号的传导机制提供新的线索和启示。
发明内容
本发明的目的是提供黑色素瘤相关抗原MAAT1 p15(melanoma-associated antigenrecognized by cytotoxic Tlymphocytes p15)的功能。
黑色素瘤相关抗原MAAT1 p15是序列表中序列表中SEQ ID No.1的氨基酸残基序列或将SEQ ID No.1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID No.1相同活性的由SEQ ID No.1衍生的蛋白。
序列表中SEQ ID No.1的蛋白全长257个氨基酸，它能够被细胞毒性T淋巴细胞识别，在其他正常组织中也有广泛分布，还是线粒体核糖体蛋白的组成部分。GenBank中检索发现，除了小鼠，在人，果蝇，线虫等物种中也存在MAAT1 p15同源基因，这与Wnt信号通路中许多蛋白质的高度保守性相类似。如图1所示，这些同源基因之间的同源性很高，鼠与人的基因序列同源性为85％，与线虫和果蝇的基因序列同源性分别为40％和32％。
我们用LRP6的胞内区为诱饵蛋白进行的酵母双杂交筛选，发现了黑色素瘤相关抗原MAAT1 p15与LRP6之间的相互作用，并在哺乳动物细胞中验证了这种相互作用的真实性。荧光素酶报告系统检测结果还显示，MAAT1 p15能够明显增强Wnt1和LRP6响应的下游基因转录活性，而且这种协同激活的效应随MAAT1 p15转染量的增多而加强。因此，MAAT1 p15很有可能是通过与LRP6之间的相互作用参与了Wnt信号的通路，协助受体LRP6进行信号传导的。
有报道发现，MAAT1 p15在黑色素瘤中有异常高表达而且能够被细胞毒性T淋巴细胞识别，它可能在免疫系统识别并消灭黑色素瘤细胞中发挥着关键的作用。它的序列在进化上很保守，线虫，果蝇，小鼠和人等物种中都存在着高度同源的基因，这提示MAAT1 p15可能在生物体内有着十分重要的功能。MAAT1 p15的具体功能尚不清楚，根据其在黑色素瘤中的异常高表达分析它可能与黑色素瘤的发生有关，而本发明的数据显示，它能够参与Wnt信号的传导过程，协助激活Wnt下游基因的表达。也有报道表明，Wnt信号传导通路与黑色素瘤的发生和转移过程也有着密切的关系。Wnt下游响应因子β-catenin和LEF-1在黑色素瘤细胞系中均有异常高表达，并引起Wnt信号的过度活化，而Wnt5a因子的刺激能够增强黑色素瘤细胞的迁移能力。本发明显示，MAAT1 p15可以与LRP6相互作用并对Wnt信号通路传导有协同激活作用，这与MAAT1 p15和Wnt信号通路在黑色素瘤中均为高表达的报道是一致的。这种一致性提示，MAAT1 p15可能参与了Wnt信号通路对黑色素瘤的发生和转移过程的促进性调节。
总之，MAAT1 p15与LRP6之间相互作用的发现不仅为研究Wnt信号传导机理提供了新的线索，而且为进一步阐明黑色素瘤的发生发展过程的分子机制奠定了新的基础。
图1为MAAT1 p15在人、小鼠、线虫和果蝇中的氨基酸序列比较。图中线框区表示物种之间序列同源性为100％的保守区。
图2为MAAT1 p15蛋白与诱饵蛋白LRP6在酵母中β-半乳糖苷酶活性滤纸分析结果。
图3为在293T细胞中MAAT1 p15与LRP6的相互作用情况。上图为用anti-HA抗体免疫沉淀后，沉淀复合物的Western检测结果。中图和下图则分别表示细胞裂解液中LRP6和MAAT1 p15蛋白的表达情况。1为用HA-pCS2/LRP6C和Flag-pcDNA6/MAAT1 p15共转染后的细胞裂解液；2为用Flag-pcDNA6/MAAT1 p15单独转染后的细胞裂解液。
图4为MAAT1 p15(A)和MAAT1 p15C(B)对Wnt响应的下游基因转录的影响。
具体实施例方式
实施例1、LRP6C与MAAT1 p15蛋白相关表达载体的构建。
根据GenBank中基因序列及表达载体的阅读框设计特异性引物进行PCR反应，分别克隆得到了酵母表达载体pGBKT7/LRP6C，pACT2/MAAT1 p15，真核表达载体HA-pcDNA6/LRP6C(胞内区)，Flag-pcDNA6/MAAT1 p15C(缺氨基端15个氨基酸的片段)，Flag-pcDNA6/MAAT1 p15(全长)。克隆LRP6表达载体以质粒pCS2/LRP6为模板，克隆MAAT1 p15C以含有MAAT1 p15C的文库质粒为模板，克隆MAAT1 p15全长基因以鼠胚胎cDNA文库为模板。反应条件为首先95℃变性5min；然后PCR循环94℃变性30s，55℃(LRP6C)或60℃(MAAT1 p15)退火30s，72℃延伸60s，进行30个循环；最后72℃延伸10min。引物由上海生工生物技术公司合成，克隆完成后测序鉴定融合蛋白阅读框正确。
PCR反应的引物如下F/LRP6C/pGBKT75’-TATGAATTCAGGATGTTGTGTCCACGTATG-3’F/LRP6C/pcDNA65’-TATGAATTCTAGGATGTTGTGTCCACGTATG-3’R/LRP6C5’-TATAGTCGACTCAGGAGGAGTCTGTACAGG-3’F/MAAT1 p15/pACT25’-TATGAATTCGAATGCCGCTGCACAGGTAT-3’F/MAAT1 p15/pcDNA65’-TATGAATTCTATGCCGCTGCACAGGTAT-3’F/MAAT1 p15C/pcDNA65’-TATGAATTCTCTGCGGCAGGGCATCTG-3’R/MAAT1 p155’-TATTCTAGATCAGGCGTGGTCACCGGC-3’实施例2、LRP6相互作用蛋白的筛选与鉴定。
为了深入研究Wnt信号通路的传导机制，利用酵母双杂交系统进行筛选，以期找到与受体LRP6相互作用的蛋白。Wnt信号通路中的成员在进化上均很保守，在各个物种中的序列同源性都很高，受体LRP6的人和小鼠的蛋白质序列全长同源性是93％，胞内区长216个氨基酸，而同源性达到98％，所以用人LRP6的胞内区作为诱饵蛋白筛选小鼠胚胎cDNA文库。首先将诱饵蛋白质粒pGBKT7/LRP6C转化至酵母菌株AH109中，检测β-半乳糖苷酶活性，结果为阴性，表明LRP6C本身没有自激活能力，可以作为诱饵蛋白进行酵母双杂交筛选。经过文库筛选和鉴定，得到18个阳性克隆，其中的13号克隆是黑色素瘤相关抗原(melanoma-associated antigen recognized by cytotoxic Tlymphocytes p15，MAAT1 p15)的片段(16-257aa)，氨基端缺失15个氨基酸，后命名为MAAT1 p15C。
为了验证酵母双杂交筛选结果，用PCR方法克隆了MAAT1 p15全长基因，构建了捕获蛋白表达载体，与诱饵蛋白LRP6C重新共同转化酵母，并进行β-gal显色反应检测。结果显示，LRP6C与一个含有无关蛋白的AD质粒共同转化，或者MAAT1 p15与不含有LRP6C的pGBKT7质粒共同转化，其酵母细胞在三缺(Leu-/Trp-/His-)培养基的平板上都不能生长，而LRP6C与MAAT1 p15共同转化的酵母细胞在三缺培养基平板上生长良好。从二缺(Leu-/Trp-)培养基的平板上挑选生长良好的菌落做β-gal显色反应，只有LRP6C与MAAT1 p15共同转化的酵母细胞显蓝色(图2)，说明在酵母细胞中LRP6的胞内区与MAAT1 p15确实存在相互作用。
实施例3、LRP6与MAAT1 p15在哺乳动物细胞中的相互作用将构建好的表达载体Flag-pcDNA6/MAAT1 p15和HA-pcDNA6/LRP6C共同转染293T细胞，可以检测到过量表达的带HA的LRP6C融合蛋白(图3中)和带Flag的MAAT1 p15融合蛋白(图3下)。为了确认LRP6C和MAAT1 p15能在哺乳动物内相互作用，进行了免疫共沉淀实验，细胞裂解液用HA抗体沉淀，Flag抗体做Western检测。由图3结果可见，单独转染Flag-pcDNA6/MAAT1 p15的细胞裂解液免疫共沉淀后没有阳性信号出现，而HA-pcDNA6/LRP6C和Flag-pcDNA6/MAAT1 p15共同转染的细胞裂解液免疫共沉淀后则有阳性信号出现。表明LRP6C与MAAT1 p15在哺乳动物细胞内可以相互作用。
实施例4、DDIP对Wnt信号通路调节作用的验证。
LEF-1荧光素酶报告质粒的启动子序列带有6个重复的LEF-1结合位点。在Wnt因子的刺激作用下，LEF-1蛋白与这些位点结合并激活下游荧光素酶报告基因的转录。表达的荧光素酶催化底物释放荧光，通过荧光素酶报告分析仪(Top Count)可以检测荧光的强度，从而能反映报告基因转录的水平。为了验证MAAT1 p15与LRP6结合后是否会影响Wnt信号通路传导，利用这一荧光素酶报告系统，通过在细胞内过量表达MAAT1 p15基因来观察该基因对Wnt信号通路的调节。
结果如图4A所示，转染Wnt1能够激活荧光素酶报告系统，使报告基因荧光素酶活性与对照组相比增加了约3倍，而当单独表达MAAT1 p15时，报告基因不被激活。MAAT1 p15与Wnt1共表达之后荧光素酶活性明显增强，提示MAAT1 p15能够协同Wnt1促进报告基因表达。而且，随着MAAT1 p15转染量的增加，这种协助激活的作用也逐渐增强(图4A，3-5列)，共转染MAAT p15到600ng时，荧光素酶活性达到单独转染Wnt1时的两倍以上。
以上结果提示，MAAT1 p15可能和细胞内源性LRP6结合，从而协同响应Wnt1信号刺激下的信号通路传导。由于过量表达LRP6亦可激活Wnt信号通路，因此进而观察MAAT1 p15对LRP6的影响。当单独表达LRP6时，报告基因荧光素酶活性提高了约3倍，而当逐渐表达MAAT1 p15时，LRP6对报告基因的激活亦逐渐加强(图4A，6-8列)。这表明，MAAT1 p15可能是LRP6的一个辅助蛋白，与LRP6相结合后能加强Wnt信号的转导。
由于酵母双杂交筛选时得到了MAAT1 p15的片段MAAT1 p15C，故而进一步研究了MAAT1 p15C是否也可以影响LRP6的激活作用。我们应用MAAT1 p15C重复LEF-1荧光素酶报告系统实验。结果表明，MAAT1 p15C和全长一样，均能够协同增加Wnt信号所介导的报告基因转录水平(图4B)。
序列表<160>1<210>1<211>257<212>PRT<213>小鼠(Mus musculus)<400>11 maftasqrwe egqarqigfr frwalnperl amplhkypvw lwkrlqlreg icsrlpghyl61 rsleeertpt pvhyrphgak fkinpkngqr ervedvpipi yfppesqrgl wggegwilgq121 iyanndklsk rlkkvwkpql ferefyseil dkkftvtvtm rtldlideay gldfyilktp181 kedlcskfgm dlkrgmllrl arqdpqlhpe dperraaiyd kykefaipee eaewvgltle241 eaiekqrlle ekdpvplfki yvaeliqqlq qqalsepavv qkrasgq
权利要求
1.黑色素瘤相关抗原MAAT1 p15(melanoma-associated antigen recognized by cytotoxic Tlymphocytes p15)的功能。MAAT1 p15是序列表中SEQ ID No.1的氨基酸残基序列或将SEQID No.1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ IDNo.1相同活性的由SEQ ID No.1衍生的蛋白。
2.含有权利要求1所述蛋白编码基因的表达载体。
3.含有权利要求1所述蛋白编码基因的细胞系。
4.权利要求1所述蛋白及其编码基因在构建抗肿瘤药物筛选模型中的应用。
5.权利要求1所述蛋白及其编码基因在制备治疗癌症的药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了黑色素瘤相关抗原MAAT1p15(melanoma－associated antigen recogmzed by cyto toxic T lymphocytes p15)的功能，它是序列表中SEQ ID No.1的氨基酸残基序列或将SEQID No.1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ IDNo.1相同活性的由SEQ ID No.1衍生的蛋白。用LRP6的胞内区为诱饵蛋白进行的酵母双杂交筛选，发现了黑色素瘤相关抗原MAAT1p15与LRP6之间的相互作用，并在哺乳动物细胞中验证了这种相互作用的真实性。荧光素酶报告系统检测结果还显示，MAAT1p15能够明显增强Wnt1和LRP6响应的下游基因转录活性，而且这种协同激活的效应随MAAT1p15转染量的增多而加强。因此，MAAT1p15很有可能是通过与LRP6之间的相互作用参与了Wnt信号的通路，协助受体LRP6进行信号传导的。MAAT1p15功能的发现为研究Wnt信号传导机理提供了新的线索，为进一步阐明黑色素瘤的发生发展过程的分子机制奠定了新的基础。
文档编号A61K38/17GK1796410SQ20041010287
公开日2006年7月5日 申请日期2004年12月29日 优先权日2004年12月29日
发明者韩亮, 黄世思, 张新军, 王芳, 张慧, 翟永功, 常智杰 申请人:北京师范大学, 清华大学