专利名称：造影剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及适用于其中可以用该类造影剂反映疾病状态的诊断性影像学技术的诊断性造影剂。本发明更特定地涉及其中靶载体与血管紧张素II受体结合的造影剂。
背景技术：
血管紧张素II(Ang II)-八肽(Asp-Arg-Val-Tyr-IIe-His-Pro-Phe)-是一种与两种不同受体I型Ang II(AT1)和II型(AT2)受体结合的多效的Pleiotropic血管活性肽。肾素-血管紧张素-醛固酮(aldostrone)系统(RAAS)的活化导致了血管肥大、血管收缩、盐和水潴留、和高血压。这些作用主要是由AT1受体介导的。自相矛盾地是，其它Ang II-介导的作用，包括细胞死亡、血管舒张、和尿钠排泄是由AT2受体活化所介导的。对Ang II发信号机理的理解仍然还不完全。AT1受体活化触发了许多细胞内系统，包括酪氨酸激酶-诱导的蛋白磷酸化作用、花生四烯酸代谢产物的生成、反应性氧化剂种属活性的变更、和细胞内Ca2+浓度的流通。AT2受体活化导致了缓激肽的刺激、一氧化氮产生、和前列腺素代谢，其大部分与AT1受体的作用相反。(见Berry C，Touyz R，Dominiczak AF，Webb RC，Johns DG.Am J PhysiolHeart Circ Physio.2001年12月；281(6)H2337-65.血管紧张素受体发信号、血管病理生理学、以及与神经酰胺的相互作用(Angiotensin receptorssignaling，vascular pathophysiology，and interactions with ceramide))。
Ang II是肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)的有效组分。其在血压、血浆体积、交感神经活性、以及渴感响应的调节中起着重要的生理学作用。Ang II还在心脏肥大、心肌梗死、高血压、慢性阻塞性肺疾病、肝纤维化和动脉粥样硬化中起作用。其通过经典的RAAS产生全身作用，通过组织RAAS产生局部作用。在经典的RAAS中，循环的得自肾的肾素裂解了得自肝的血管紧张素原从而形成十肽血管紧张素I(Ang I)，其被肺中的血管紧张素-转化酶(ACE)转化成有活性的AngII。Ang I还可以被组织内肽酶加工成七肽Ang-(1-7)。在
图1中对所说的RAAS系统进行了简要说明，该图是以Foote等人在Ann.Pharmacother.271495-1503(1993)的文章中的图1为基础的。
RAAS除在正常心血管内环境稳定中起着重要作用外，在许多心血管疾病如高血压、充血性心衰、冠状动脉局部缺血和肾机能不全中也涉及RAAS的活性过度。在心肌梗死(MI)后，RAAS被活化。特定地，AT1受体似乎在MI后的改型中起着重要作用，这是因为在MI和左心室功能紊乱后AT1受体表达增加。因此，已经表明干扰RAAS的药物如ACE抑制剂和AT1受体拮抗剂在该类心血管病症的治疗中有着极大的治疗益处。
同样，对于心、肾、肺和肝而言，纤维变性代表了其衰竭的共同途径。因此，了解器官纤维变性中涉及的病理生理学机理是十分令人感兴趣的，对于保护性药理学策略而言，其可能特别有潜力。组织修复涉及炎性细胞，包括开始该修复过程固有的单核细胞/巨噬细胞系成员；和肌成纤维细胞，表型转化的间隙成纤维细胞(负责胶原翻转和纤维组织形成)。在修复的微环境中的这些细胞事件中的各事件都与导致血管紧张素II(Ang II)新生的分子事件有关。在一种自分泌/旁分泌方式中，这种肽通过血管紧张素(AT1)受体-配体结合控制着TGF-β1的表达。这种细胞因子有助于成纤维细胞向肌成纤维细胞(myoFb)的表型转化并控制着胶原的肌成纤维细胞翻转。血管紧张素-转化酶(ACE)的抑制或AT1受体的结抗各自阻止了许多结果为纤维变性的这些分子和细胞响应，从而发现其是保护性干预。(见Weber KT.纤维变性，一种器官衰竭的共同途径血管紧张素II和组织修复(Fibrosis，a commonpathway to organ failureangiotensin II and tissuerepair).Semin Nephrol.1997年9月；17(5)467-91以及其中的参考文献)。
Ang II可能通过间质细胞的活化控制组织的纤维变性。例如，AngII在体外通过AT1的活化刺激了心成纤维细胞的增殖。在体外在心成纤维细胞上也证明了AT1受体的出现。Ang II的大多数纤维变性前(profibrotic)的作用显然是由这种受体介导的；但是，在人肥大的心脏中已经探测到在心成纤维细胞上有AT2表达，并且这两种亚型之间的平衡在确定对Ang II的响应中可能很关键。(见Am.J.Respir.Crit.Care Med.，第161卷，第6期，2000年6月，1999-2004对于人肺成纤维细胞而言血管紧张素II是通过1型受体的活化致有丝分裂的(Angiotensin II Is Mitogenic for HumanLung Fibroblasts via Activation of the Type 1 Receptor)Richard P.Marshall，Robin J.McAnulty，和Geoffrey J.Laurent以及其中的参考文献)。
可以根据特定拮抗剂对其的抑制作用来对Ang II受体进行区分。AT1受体被联苯基咪唑类物质，如氯沙坦选择性拮抗，而四氢咪唑并吡啶类物质特定地抑制了AT2受体。AT2受体还可以被CGP-42112A选择性活化。其是一种Ang II的六肽类似物，其还可以选择性抑制AT2受体(取决于其浓度)。已经对两种其它血管紧张素受体AT3和AT4亚型进行了描述。
对啮齿动物而言，AT1受体具有两种不同功能亚型，AT1A和AT1B，二者具有＞95％的氨基酸序列同源性。
第二种重要的血管紧张素受体亚型是AT2受体。其与AT1A或AT1B受体具有低氨基酸序列同源性(～34％)。虽然不清楚AT2受体确切的发信号途径和功能作用，但是这些受体在生理学条件下可以拮抗AT1-介导的抑制细胞生长作用并且诱导细胞凋亡和血管舒张。AT2受体在心血管疾病中的确切作用仍然有待明确。
除AT1和AT2之外的其它Ang II受体是已知的并且通常被称为AT非典型的(见Kang等人，Am.Heart J.1271388-1401(1994))。
相关现有技术的描述WO98/18496(Nycomed Imaging AS)公开了包含被标记的用于体内成像的Ang II-受体拮抗剂的造影剂。
US 5,138,069公开了用作Ang II受体阻滞剂的被取代的咪唑类物质。US 5,264,581(Cariani)进一步公开了放射性碘标记的咪唑AngII拮抗剂。
本发明现在已经发现用在体内可探测的部分或一些部分标记的Ang II-受体拮抗剂如例如氯沙坦、缬沙坦、坎地沙坦和依普沙坦以及其衍生物对人或动物体的体内成像而言是有用的诊断性影像学物质。
本发明的造影剂可用于体内Ang II受体部分的成像，即使用其中所说的靶载体对Ang II-受体部位有亲合力的靶向造影剂。该Ang II受体通常位于心血管系统内并且当将所说的造影剂给药到血流中时可受到该类造影剂的影响。因此，使用该类靶向造影剂可探测诸如心衰、动脉粥样硬化和血流受限之类的疾病和病症以及其它血管疾病和病症、和其中纤维变性显著的疾病，并且还可以监测该类疾病和病症的治疗进程。
本发明的详细描述在第一个方面，本发明提供了一种式I所定义的造影剂，V-L-Z(式I)其中V是对血管紧张素II-受体有亲合力的非肽载体，L表示一种键、一种间隔物或连接物并且Z表示一种在人或动物体的体内成像过程中可探测的部分。
载体V是一种对Ang II受体具有亲合力的非肽靶向部分。V进一步表示一种咪唑Ang II拮抗剂如例如氯沙坦、缬沙坦、坎地沙坦(Caldesartan)和依普沙坦以及其衍生物。
连接物L的作用是将载体偶合到所说的成像部分上，并且其中L是一种间隔物部分，L的作用是将相对大量的成像部分Z与所说载体V的有效部位间隔开。
一种连接物部分可将一种载体连接到一种成像部分上；或者，其可以将一种以上的载体和/或一种以上的成像部分连接到一起。同样，可以将成像部分或载体连接到一种以上的连接物上。以这种方式使用的许多成像部分(例如一些被连接到一种载体上的一些连接物-成像部分或一些被连接到一种本身被连接到一种载体上的连接物上的成像部分)使得增加了造影剂的可检测性(例如通过增加其射线不透性、产生回声性或relaxivity而增加了其可检测性)或者使得其可以以一种以上的显像模式被探测到。以这种方式使用的许多载体可例如增加造影剂的靶向效率或者可以制备能靶向于一种以上部位的造影剂/治疗剂，所说的一种以上部位例如对于具有受体不均匀性的物质而言的不同受体。
所说的连接物部分L可以是一种简单的键、戊二酸、二羟乙酸、PEG单位、PEG-样连接物或可以代表现有技术中众所周知的其它连接物例如WO 01/77145(其在这里被引入作为参考)第23-27页中所描述的物质。L还可以是连接物单位的组合。
本发明化合物中的成像部分(Z)可以是在体内诊断性影像学操作中能直接或间接探测的任何部分。
对用于诊断并且特别是体内诊断的药物应用而言，所说的部分Z必需能携带M所表示的可成像部分或可成像部分们。携带指的是部分Z和M之间任何形式的缔合，例如化学键，例如共价键或电价键或离子键或者通过吸附或任何其它类型的缔合连接到一起。
特别优选下面式(II)和(e)的螯合剂。
M可以是任何可以成像部分。M的性质将取决于在诊断中所利用的显像模式。M必需能在体内诊断性影像学操作中被直接或间接检测到。例如一些发射或者可以使其发射(例如通过放射性衰变、荧光激发、自旋共振激发等等)可检测辐射的部分、一些影响局部电磁场的部分(例如顺磁、超顺磁、铁淦氧磁物或铁磁种类物质)、一些吸收或者分散辐射能量的部分(例如发色团、微粒(包括包含气体或液体的囊)、重元素以及其化合物等等)、和一些产生可检测物质的部分(例如微气泡发生器)。
许多适宜的可成像部分是已知的，例如可得自WO 98/18496(其内容在这里被引入作为参考)。
在下文中对显像模式和可成像部分M进行了更详细的描述在第一个实施方案中，式(I)的化合物包含携带一种或多种用于Radio和SPECT显像模式的可成像部分M的部分Z。M优选地是具有低或没有α-和β-发射性并且具有高于一小时的半衰期的γ发射体。优选的基团M是放射性核素67Ga、111In、123I、125I、131I、81mKr、99Mo、99mTc、201TI和133Xe。最优选的是99mTc。
当M表示一种金属放射性核素时，Z则包含适于与M形成稳定的螯合物的螯合剂。该类螯合剂在现有技术中是众所周知的并且在WO01/77145的表1中对该类螯合剂的典型实例进行了描述。
特别优选的是式II的螯合剂
其中R1、R2、R3和R4各自独立地是R基；各R基团独立地是H或C1-10烷基、C3-10烷基芳基、C2-10烷氧基烷基、C1-10羟基烷基、C1-10烷基胺、C1-10氟烷基，或2或多个R和其与之相连的原子一起形成一种碳环、杂环饱和或不饱和的环。
更优选的是式a、b、c和d所表示的螯合剂。
一种更优选的螯合剂实例是式e所示的物质，其在这里被表示为cPn216。对于Z而言，最优选的是当所说的螯合剂是cPn216时成像部分M是99mTc 可以在室温下在水性条件下在近中性pH下对包含式II的螯合剂的轭合物进行放射性标记从而提供良好的放射化学纯度。在室温下对该轭合物进行放射性标记的一个优点是其是医院药学中的一种简化操作。对于式II螯合剂的合成而言，可参考WO 03/006070，其内容在这里被引入作为参考。
可以用现有技术中众所周知的取代或加成反应将非金属放射性核素如123I、125I和131I共价连接到部分Z上。
在第二个实施方案中，式(I)的化合物包含携带一个或多个可用于PET显像模式的可成像部分M的部分Z。然后M表示具有正电子发射性的放射发射体。优选的基团M是放射性核素11C、18F、68Ga、13N、15O和82Rb。尤其优选18F。
当M表示一种金属放射性核素时，Z则包含一种适于与M形成稳定的螯合物的螯合剂。该类螯合剂在现有技术中是众所周知的并且在WO01/77145的表I中对该类螯合剂的典型实例进行了描述，并且可参见之前Radio和SPECT成像的部分。
在另一个优选的实施方案中，Z是DOTA螯合剂并且M是68Ga，可以用微波化学容易地将M引入到所说的螯合物中。
可以用现有技术中众所周知的取代或加成反应将非金属放射性核素如18F共价连接到部分Z上并且也在例如在这里被引入作为参考的WO 03/080544中对其进行了描述。
在第三个实施方案中，式(I)的化合物包含携带一个或多个可用于MR显像模式的可成像部分M的部分Z。M在这里表示一种顺磁金属如在US 4,647,447中提及的这些物质、Gd3+、Dy3+、Fe3+并且特别优选地是Mn2+，并且Z包含一种螯合剂，特别是诸如开链或环状聚氨基羧酸酯的螯合剂(例如DTPA、DTPA-BMA、DOTA和D03A)，如例如在US 4,647,447和WO 86/02841中描述的物质。M还可以表示金属氧化物如以例如使得Z可作为该金属氧化物的包衣的方式被吸附的超顺磁、铁淦氧磁物或铁磁种类物质。在例如US 6,230,777中对用作MR造影剂的金属氧化物进行了描述，该专利在这里被引入作为参考。
在第四个实施方案中，式(I)的化合物包含携带一个或多个可用于X-射线显像模式的可成像部分M的部分Z。M在这里表示一种重金属如W、Au和Bi，其优选地为可以被吸附到Z上的氧化物的形式。作为X-射线造影剂的碘化(Iodinated)芳基衍生物是十分众所周知的，例如IopamironTM和OmnipaqueTM。
在受体的成像中可以使用气体填充的微囊形式的超声成像剂，例如如现有技术例如WO 98/18500中所述那样，当其被功能化成与载体V结合时可以采取该类形式。
成像部分Z还可以表示一种被用于光成像操作的发色团。发色团指的是物质组成中的一种基团，例如吸收和/或发射光线的有机或无机基团。
光指的是波长为300-1300nm的电磁辐射。在可见至远红外范围具有最大吸收和/或发射的发色团特别相关。
按照现有技术中的操作可进一步提供用于光学成像的对生物学靶具有亲合力的造影剂的应用，所说的现有技术如WO 96/17628，其在这里被引入作为参考。
可以用氯沙坦衍生物来对本发明举例说明并且其是在连接物(L)和成像部分(Z)连接到咪唑5-位的基础上进行说明的。该原理也适用于具有相似结构的其它化合物，在相当于氯沙坦咪唑环的分子部分上具有适宜的锚凹部位，例如缬沙坦、坎地沙坦和依普沙坦。
氯沙坦缬沙坦 坎地沙坦 依普沙坦反应路线1表示了怎样将咪唑5-位固定一种式e的螯合剂从而给出用于Tc螯合的被衍生化的氯沙坦分子。将母体氯沙坦分子转化成叠氮化物衍生物，然后将其还原成相应的胺。将该胺与二羟乙酸酐反应，然后活化并将其与式e螯合剂的适宜衍生物进行反应。
反应路线1反应路线2表示了氯沙坦连接物螯合剂轭合物的固相合成的一种实例。
反应路线2下面表示了相关结构的其它实例；
式(I)的造影剂优选地是以包含式(I)的化合物的适于给药于哺乳动物如人的药物制剂的形式被给药的。所说的给药可以适当地通过所说制剂如水溶液的注射或输注来进行。该制剂可包含一种或多种可药用的添加剂和/或赋形剂例如缓冲剂；增溶剂如环糊精；或表面活性剂如普罗尼克(Pluronic)、吐温或磷脂。此外，还可以加入稳定剂或抗氧剂如抗坏血酸、龙胆酸或对-氨基苯甲酸，并且还可以加入用于冷冻干燥的膨胀剂如氯化钠或甘露醇。
本发明还提供了一种包含有效量(例如可有效提高体内成像过程中的影像对比度的数量)的通式I的化合物或其盐以及一种或多种可药用的助剂、赋形剂或稀释剂的药物组合物。
从另一方面来看，本发明提供了式I的组合物用于制造用于一种涉及将所说的造影剂给药于人或动物体并产生所说机体至少一部分的影像的诊断方法的造影剂的应用。
从另一方面来看，本发明还提供了一种在先使用一种包含式I所定义的物质的组合物的造影剂组合物来产生增强的人或动物体影像的方法，该方法包括产生所说机体至少一部分的影像。
本发明还提供了一种监测心衰和与AT1受体上调有关的其它疾病的治疗效果的方法。
本发明另一方面还提供了一种包含配体-螯合物轭合物和还原剂的用于制备式(I)的放射性药物组合物的试剂盒。所说的还原剂优选地是亚锡盐。该试剂盒可进一步包含一种或多种稳定剂、抗氧剂、用于冷冻干燥的膨胀剂和增溶剂。
这里所用缩写的含义如下DOTA-1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸PEG-聚乙二醇DIEA-N，N-二异丙基乙基胺DPPA-二苯基磷酰基叠氮化物DBU-1，8-二氮杂-二环(5，4，0)十一碳-7-烯DMF-二甲基甲酰胺MDP-亚甲基二膦酸TFA-三氟醋酸THF-四氢呋喃HATU-N-[(二甲基氨基)-1H-1，2，3-三唑并[4，5-b]吡啶并-1-基亚甲基]-N-甲基甲鎓(methanaminium)六氟膦酸盐N-氧化物Fmoc-9-芴基甲氧基羰基Boc-叔-丁氧基羰基TBTU-2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基尿鎓(uronium)四氟硼酸盐HOBt-N-羟基苯并三唑TIS-三异丙基硅烷(silan)NMP-N-甲基吡咯烷酮MDP-亚甲基二膦酸用下面的非限制性实施例对本发明进行进一步说明具体实施方式
实施例实施例1用生物素衍生化的氯沙坦
a)用叠氮化物代替氯沙坦的羟基 向进行着搅拌的氯沙坦(MSD，0.423g，1.00mmol)和二苯基磷酰基叠氮化物(Aldrich，0.259ml，1.20mmol)在四氢呋喃(8ml)中的混悬液中加入DBU(0.329ml，2.20mmol)。在搅拌一整夜后，向其中加入水/乙腈(11，4.8ml)并将该混合物过滤。在加入纯TFA(至pH2)后，将该混合物用制备HPLC纯化(柱Phenomenex Luna C18(2)5μm 21.2x250mm，溶剂A＝水/0.1％TFA和B＝乙腈/0.1％TFA；梯度在60分钟内35-45％B；流速10.0ml/min，在214nm下UV检测)运行几次，在冷冻干燥后得到99mg(22％)白色晶体形式的产物。LC-MS分析(柱Phenomenex Luna C18(2)3μm 50×4.60mm，溶剂A＝水/0.1％TFA和B＝乙腈/0.1％TFA；梯度在10分钟内20-80％B；流速1ml/min，在214nm下UV检测，ESI-MS)与该结构相一致地在7.3分钟给出了m/z为448.1(MH+)的峰。
b)将叠氮化物基还原成氨基官能团
向得自a)的化合物(5.0mg，0.011mmol)在甲醇(3ml)中的溶液中加入Pd/C(Koch-Light，约10mg)。将该混合物在氢气(1atm)下搅拌10分钟，过滤并浓缩。将残余物不进行进一步后处理地用于下一步。LC-MS分析(柱Phenomenex Luna C18(2)3μm 50×4.60mm，溶剂A＝水/0.1％TFA和B＝乙腈/0.1％TFA；梯度在10分钟内20-80％B；流速1ml/min，在214nm下UV检测，ESI-MS)，与该胺相一致地在1.9分钟给出了m/z为422.2(MH+)的峰。
c)生物素的轭合将生物素(Fluka，3.0mg，0.011mmol)用HATU(AppliedBiosystems，4.0mg，0.011mmol)和DIEA(2M，位于NMP中，11μl，0.022mmol)在DMF(1ml)中活化10分钟。将该混合物加入到化合物b)(0.011mmol)在DMF(0.5ml)中的溶液中。在反应45分钟后，将该产物用制备HPLC纯化(柱Phenomenex Luna C18(2)5μm 21.2×250mm，溶剂A＝水/0.1％TFA和B＝乙腈/0.1％TFA；梯度在60分钟内20-60％B；流速10.0ml/min，在214nm下UV检测)，在冷冻干燥后得到2.0mg(28％)产物。LC-MS分析(柱Phenomenex LunaC18(2)3μm 50×4.60mm，溶剂A＝水/0.1％TFA和B＝乙腈/0.1％TFA；梯度在10分钟内10-80％B；流速1ml/mi n，在214nm下UV检测，ESI-MS)与该结构相一致地在10.6分钟给出了m/z为648.6(MH+)的峰。
实施例2用荧光素衍生化的氯沙坦
将NHS-荧光素(Pierce，6.0mg，0.014mmol)和DIEA(2M，位于NMP中，14μl，0.028mmol)加入到得自实施例1b)的被氨基官能化的氯沙坦(0.014mmol)在DMF(1.5ml)中的溶液中。将该反应混合物放置一整夜。将产物用制备HPLC纯化(柱Phenomenex Luna C18(2)5μm 21.2×250mm，溶剂A＝水/0.1％TFA和B＝乙腈/0.1％TFA；梯度在60分钟内20-80％B；流速10.0ml/min，在214nm下UV检测)，在冷冻干燥后，得到4.0mg(37％)产物。LC-MS分析(柱Phenomenex LunaC18(2)3μm 50×4.60mm，溶剂A＝水/0.1％TFA和B＝乙腈/0.1％TFA；梯度在10分钟内20-80％B；流速1ml/min，在214nm下UV检测，ESI-MS)与该结构相一致地在10.4分钟给出了m/z为780.8(MH+)的峰。
实施例3用于Tc-标记的用戊二酸修饰的cPn216衍生化的氯沙坦 a)cPn216-戊二酸中间体的合成
将cPn216(100mg，0.29mmol)溶解于DMF(10mL)中并在搅拌的情况下分成几份向其中加入戊二酸酐(33mg，0.29mmol)。将该反应搅拌23小时以使得完全转化成所需的产物。在RP-HPLC后以良好的收率得到该纯酸。
b)cPn216-戊二酸四氟苯硫酯的合成 向位于DMF(2mL)中的cPn216-戊二酸(300mg，0.66mmol)中加入HATU(249mg，0.66mmol)和NMM(132μL，1.32mmol)。将该混合物搅拌5分钟，然后向其中加入四氟苯硫酚(0.66mmol，119mg)。将该溶液搅拌10分钟，然后将该反应混合物用20％乙腈/水(8mL)稀释并将该产物用RP-HPLC纯化，在冷冻干燥后，得到110mg所需的产物。
c)cPn216-戊二酸活性酯与氨基衍生化的氯沙坦的偶合向位于DMF(1ml)中的得自实施例1b)的氨基衍生化的氯沙坦(10μmol)中加入N-甲基吗啉(3.3μl，30μmol)、得自b)的cPn216-戊二酸四氟苯硫酯(6.8mg，11μmol，用标准方法由cPn216和戊二酸酐制得的)。在45分钟后，将该反应混合物浓缩。将残余物用乙腈/水吸收并用制备HPLC纯化(柱Vydac 218TP 1022 C18 10μm，22×250mm，溶剂A＝水/0.1％TFA和B＝乙腈/0.1％TFA；梯度在60分钟内10-40％B；流速10.0ml/min，在214nm下UV检测)，在冷冻干燥后得到4.2mg(49％)产物。LC-MS分析(柱Phenomenex Luna C18(2)3□m2.0×50mm，溶剂A＝水/0.1％HCOOH和B＝乙腈/0.1％HCOOH；梯度在10分钟内10-40％B；流速0.3ml/min，在214和254nm下UV检测，ESI-MS)如所预期的那样在6.2分钟给出了m/z为861.6(MH+)的峰。用NMR光谱对其进一步定性以确认结构。
实施例4用于Tc-标记的用二羟乙酸修饰的Pn216衍生化的氯沙坦 a)用二羟乙酸酸酐进行的酰化 如实施例1b)下所述的那样将得自实施例1a)的叠氮化物衍生化的氯沙坦(0.12mmol)还原成相应的胺。将催化剂滤出并直接向该甲醇溶液中加入二羟乙酸酸酐(Acros，70mg，0.60mmol)。在搅拌一整夜后，将该混合物浓缩并将残余物用制备HPLC纯化(柱Vydac 218TP 1022C18 10□m 22×250mm，溶剂A＝水/0.1％TFA和B＝乙腈/0.1％TFA；梯度在60分钟内10-40％B；流速10.0ml/min，在254nm下UV检测)，在冷冻干燥后得到30mg(两步的收率为46％)绒毛状的白色物质。LC-MS分析(柱Phenomenex Luna C18(2)3□m 2.0×50mm，溶剂A＝水/0.1％ HCOOH和B＝乙腈/0.1％HCOOH；梯度在10分钟内10-80％B；流速0.3ml/min，在214和254nm下UV检测，ESI-MS)与该结构相一致地在6.7分钟给出了m/z为538.0(MH+)的峰。用NMR光谱对其进一步定性。
b)与Pn216的轭合向氯沙坦衍生物a)(5.4mg，0.010mmol)和HATU(3.8mg，0.010mmol)在DMF(1ml)中的溶液中加入2M位于NMP(150□l，0.030mmol)中的DIEA。该反应混合物变黄并将其搅拌15分钟。向该被活化的羧酸中加入Pn216(3.4mg，0.010mmol)在DMF(0.25ml)中的溶液。用分析HPLC对该反应的过程进行监测(柱Phenomenex LunaC18(2)3□m 4.6×50mm，溶剂A＝水/0.1％TFA和B＝乙腈/0.1％TFA；梯度在10分钟内10-40％B；流速2.0ml/min，在214和254nm下UV检测)。在反应1小时后，加入一份新鲜的HATU(3mg)。在20分钟后，该反应已经进行完全。将该混合物用制备HPLC纯化(柱Vydac 218TP1022 C18 10□m 22×250mm，溶剂A＝水/0.1％TFA和B＝乙腈/0.1％TFA；梯度在60分钟内10-40％B；流速10.0ml/min，在254nm下UV检测)，在冷冻干燥后得到4.3mg(50％)产物。LC-MS分析(柱Phenomenex Luna C18(2)3□m 2.0×50mm，溶剂A＝水/0.1％HCOOH和B＝乙腈/0.1％HCOOH；梯度在1O分钟内10-4O％B；流速0.3ml/min，在214和254nm下UV检测，ESI-MS)与该结构相一致地在6.0分钟给出了m/z为864.3(MH+)的峰。
实施例5用于Tc-标记的用二羟乙酸修饰的cPn216衍生化的氯沙坦
向得自实施例4a)的氯沙坦衍生物(5.4mg，0.010mmol)和HATU(3.8mg，0.010mmol)在DMF(1ml)中的溶液中加入2M位于NMP中的DIEA(15□1，0.030mmol)。该反应混合物变黄并将其搅拌15分钟。向该被活化的羧酸中加入cpn216(3.4mg，0.010mmol)在DMF(0.25ml)中的溶液。用分析HPLC对该反应的过程进行监测(柱Phenomenex Luna C18(2)3□m 4.6×50mm，溶剂A＝水/0.1％TFA和B＝乙腈/0.1％TFA；梯度在10分钟内10-40％B；流速2.0ml/min，在214和254nm下UV检测)。在再加入两等份HATU后，起始材料获得完全转化。将该混合物用制备HPLC纯化(柱PhenomenexLuna C18(2)5□m 21.2×250mm，溶剂A＝水/0.1％TFA和B＝乙腈/0.1％TFA；梯度在60分钟内10-40％B；流速10.0ml/min，在214nm下UV检测)，在冷冻干燥后得到3.7mg(43％)产物。LC-MS分析(柱Phenomenex Luna C18(2)3□m 2.0×50mm，溶剂A＝水/0.1％HCOOH和B＝乙腈/0.1％HCOOH；梯度在10分钟内10-40％B；流速0.3ml/min，在214和254nm下UV检测，ESI-MS)与该结构相一致地在6.1分钟给出了m/z为863.2(MH+)的峰。用NMR光谱对其进一步定性。
实施例6通过PEG连接物用生物素衍生化的氯沙坦 a)PEG的轭合
将Boc-氨基PEG酸(Po1ypure，6.0mg，0.013mmol)用HATU(5.0mg，0.013mmol)和DIEA(2M，位于NMP中，13μl，0.026mmol)在DMF(1ml)中活化5分钟。将该混合物加入到得自实施例1b)的化合物(0.013mmol)在DMF(0.5ml)中的溶液中。在反应1.5小时后，将该溶液用30％位于水(4ml)中的乙腈稀释并将产物用制备HPLC纯化(柱Phenomenex Luna C18(2)5μm 21.2×250mm，溶剂A＝水/0.1％TFA和B＝乙腈/0.1％TFA；梯度在60分钟内30-60％B；流速10.0ml/min，在214nm下UV检测)，在冷冻干燥后，得到5.5mg(47％)产物。LC-MS分析(柱Phenomenex Luna C18(2)3μm 2.0×50mm，溶剂A＝水/0.1％TFA和B＝乙腈/0.1％TFA；梯度在10分钟内30-100％B；流速1ml/min，在214nm下UV检测，ESI-MS)与该结构相一致地在7.0分钟给出了m/z为900.9(MH+)的峰。
b)除去Boc保护基 将化合物a)(5.5mg，6.1μmol)溶解于50％TFA在二氯甲烷(4ml)中的溶液中。用分析HPLC对该反应的过程进行监测(柱PhenomenexLuna C18(2)3μm 4.6×50mm，溶剂A＝水/0.1％TFA和B＝乙腈/0.1％ TFA；梯度在10分钟内10-40％B；流速2.0ml/min，在214和254nm下UV检测)，其证明在20分钟后裂解完全，tR＝6.1分钟。MS分析(直接注射(溶剂A＝水/0.1％TFA和B＝乙腈/0.1％TFA；在2分钟内50％B；流速0.3ml/min，ESI-MS)与该胺相一致地给出了位于800.7(MH+)的m/z。将该溶液浓缩并将产物不进行进一步纯化地用于下一步。
c)生物素的轭合将生物素(Fluka，1.0mg，4.0μmol)用HATU(1.5mg，4.0μmol)和DIEA(2M，位于NMP中，4.5μl，9.0μmol)在DMF(1ml)中活化10分钟，然后将其加入到化合物b)(3.0μmol)在DMF(1.5ml)中的溶液中。将该反应混合物搅拌15分钟，用20％乙腈水溶液稀释并用制备HPLC纯化(柱Phenomenex Luna C18(2)5μm 21.2×250mm，溶剂A＝水/0.1％TFA和B＝乙腈/0.1％ TFA；梯度在60分钟内20-60％B；流速10.0ml/min，在214nm下UV检测)，得到2.4mg(81％)产物。MS直接注射分析(溶剂A＝水/0.1％TFA和B＝乙腈/0.1％TFA；在2分钟内50％B；流速0.3ml/min，ESI-MS)与该结构相一致地给出了1026.8(MH+)的m/z。
实施例7通过PEG连接物用荧光素衍生化的氯沙坦 将NHS-荧光素(PierGe，2mg，4μmol)和DIEA(2M，位于NMP中，4.5μl，9.0μmol)加入到得自实施例6b)的化合物(3μmol)在DMF(1.5ml)中的溶液中。将该反应放置一整夜。在用30％乙腈稀释并将pH调至2(TFA)后，将该产物用制备HPLC纯化(柱PhenomenexLuna C18(2)5μm 21.2×250mm，溶剂A＝水/0.1％TFA和B＝乙腈/0.1％TFA；梯度在60分钟内30-60％B；流速10.0ml/min，在214nm下UV检测)，在冷冻干燥后得到2.5mg(72％)产物。MS直接注射分析(溶剂A＝水/0.1％TFA和B＝乙腈/0.1％TFA；在2分钟内50％B；流速0.3ml/min，ESI-MS)与该结构相一致地给出了1158.5(MH+)的m/z。
实施例8用于Tc-标记的用PEG-戊二酸-cPn 216衍生化的氯沙坦 将DIEA(2M，位于NMP中，8μl，16μmol)以及得自实施例3b)的cPn216-琥珀酸四氟苯硫酯(5mg，8μmol)在DMF(0.5ml)中的溶液加入到得自实施例6b)的化合物(4μmol)在DMF(1.5ml)中的溶液中。在搅拌一整夜后，将该反应混合物用水(3ml)稀释并通过加入TFA将pH调至2。将产物用制备HPLC纯化(柱Phenomenex Luna C18(2)5μm21.2×250mm，溶剂A＝水/0.1％TFA和B＝乙腈/0.1％TFA；梯度在60分钟内20-60％B；流速10.0ml/min，在214nm下UV检测)，在冷冻干燥后得到2.0mg(40％)产物。MS直接注射分析(溶剂A＝水/0.1％TFA和B＝乙腈/0.1％TFA；在2分钟内50％B；流速0.3ml/min，ESI-MS)与该结构相一致地给出了1239.8(MH+)的m/z。
实施例9用于Tc-标记的用PEG-二羟乙酸-cPn216衍生化的氯沙坦
a)用二羟乙酸酸酐进行的酰化 将得自实施例6b)的化合物(5.0μmol)溶解于甲醇(2.5ml)中并通过加入DIEA将其pH调至9。向该溶液中加入二羟乙酸酸酐(Acros，1.2mg，10μmol)。在50分钟后，将该反应混合物浓缩并将残余物用制备HPLC纯化(柱Phenomenex Luna C18(2)5μm 21.2×250mm，溶剂A＝水/0.1％TFA和B＝乙腈/0.1％TFA；梯度在60分钟内20-60％B；流速10.0ml/min，在214nm下UV检测)，得到4.5mg(98％)产物。MS直接注射分析(溶剂A＝水/0.1％TFA和B＝乙腈/0.1％TFA；在2分钟内50％B；流速0.3ml/min，ESI-MS；m/z916.9(MH+))与该结构相一致。
b)cPn216的轭合将化合物a)(5μmol)溶解于DMF(2ml)中并用HATU(2mg，5μmol)和DIEA(2M于NMP中，5，ul，10μmol)活化5分钟。加入cPn216(3.4mg，10μmol)(柱Phenomenex Luna C18(2)5μm 21.2×250mm，溶剂A＝水/0.1％TFA和B＝乙腈/0.1％TFA；梯度在60分钟内20-60％B；流速10.0ml/min，在214nm下UV检测)，在冷冻干燥后得到3.7(57％)mg产物。LC-MS分析(柱Phenomenex Luna C18(2)3μm2.0×50mm，溶剂A＝水/0.1％甲酸和B＝乙腈/0.1％甲酸；梯度在10分钟内10-40％B；流速1ml/min，在214nm下UV检测，ESI-MS)与该结构相一致地在6.8分钟给出了m/z 1241.2(MH+)的峰。
实施例10通过PEG-戊二酸连接物用cPn216修饰的氯沙坦的固相合成 a)氯沙坦与甲氧基三苯甲基树脂的连接 向得自Novabiochem的4-甲氧基三苯甲基氯树脂(53mg，相当于0.050mmo )在二氯甲烷(1ml)中的混悬液中加入氯沙坦(MSD，42mg，0.10mmol)在DMF(0.5ml)和DIEA(2M NMP溶液，0.10ml，0.20mmol)中的溶液中。将该混合物在一种滚台上放置4天。将树脂沥干并用DMF和二氯甲烷洗涤几次。将该树脂的等分试样裂解(5％TFA和5％TIS，都位于二氯甲烷中，15分钟)并用HPLC对其进行分析(柱Phenomenex Luna C18(2)3□m 4.6×50mm，溶剂A＝水/0.1％TFA和B＝乙腈/0.1％TFA；梯度在10分钟内10-80％B；流速2.0ml/min，在214和254nm下UV检测)，给出一种与氯沙坦共洗脱的峰。
b)叠氮化物形成 该反应是在一种手动氮气起泡器装置中进行的。向得自上面a)的树脂在THF(约1ml)中的混悬液中加入DBU(16μl，0.11mmol)和二苯基磷酰基叠氮化物(Aldrich，13μl，0.060mmol)。在约30分钟后，向其中加入新鲜的二苯基磷酰基叠氮化物(7μl)和DBU(8μl)的等分试样。在45分钟后，将该树脂的等分试样裂解(CH2Cl2/TFA/TIS，97.5∶5∶2.5)并用LC-MS对其进行分析(柱Phenomenex Luna C18(2)3μm 2.0×50mm，溶剂A＝水/0.1％HCOOH和B＝乙腈/0.1％HCOOH；梯度在10分钟内10-80％B；流速0.3ml/min，在214和254nm下UV检测，ESI-MS)，与该叠氮化物的结构相一致地在8.8分钟给出了m/z447.9(MH+)的峰。没有观察到痕量的起始材料。
c)该叠氮化物还原为相应胺
该反应是在一种手动氮气起泡器装置中运行的。向氯化亚锡(II)二水合物(23mg，0.10mmol)在THF(0.5ml)中的溶液中加入苯硫酚(41μl，0.40mmol)和三乙胺(42μl，0.30mmol)。加入更多的THF直至沉淀几乎溶解。将该混合物转移到用THF(0.5ml)涂抹了的得自上面b)的树脂的等分试样中(形式上相当于0.05mmol叠氮化物)。在反应1小时后，将该反应溶液排干并将树脂用THF、DMF和甲醇进行洗涤。将该树脂的等分试样裂解(CH2Cl2/TFA/TIS，97.5∶5∶2.5)并用LC-MS对其进行分析(柱Phenomenex Luna C18(2)3□m 2.0×50mm，溶剂A＝水/0.1％HCOOH和B＝乙腈/0.1％HCOOH；梯度在10分钟内10-80％B；流速0.3ml/min，在214和254nm下UV检测，ESI-MS)，表明起始材料完全转化成更亲水的在4.6分钟时被洗脱下来的产物，其具有与该胺相一致的421.7(MH+)的m/z。
d)PEG-戊二酰基-cPN216单位的偶合该反应是在一种手动氮气起泡器装置中运行的。将Fmoc-氨基PEG-二羟乙酸(Polypure AS，40mg，0.075mmol)、TBTU(24mg，0.075mmol)、HOBt(12mg，0.075mmol)和2M位于DMF(75μl，0.15mmol)中的DIEA在DMF(0.5ml)中的混合物加入到该树脂中。在两小时后，将该树脂沥干并用DMF对其进行洗涤。Kaiser试验为阴性。通过用20％位于DMF中的哌啶进行的标准处理使Fmoc基裂解。向该被混悬于DMF(2ml)中的该树脂(形式上为0.02mmol)的等分试样中加入得自实施例3b)的cPn216-戊二酸四氟苯硫酯(25mg，0.040mmol)、HOBt(6mg，0.04mmol)和2M DIEA(30□1，0.060mmol)。在反应两小时后，产物从该树脂上被裂解下来(CH2Cl2/TFA/TIS，97.5∶5∶2.5)。将裂解液浓缩并将残余物用制备性HPLC纯化(柱Phenomenex Luna C18(2)5□m 21.2×250mm，溶剂A＝水/0.1％TFA和B＝乙腈/0.1％TFA；梯度在60分钟内20-30％B；流速10.0ml/min，在214nm下UV检测)，在冷冻干燥后，得到0.1mg产物。LC-MS分析(柱Phenomenex Luna C18(2)3□m 2.0×50mm，溶剂A＝水/0.1％HCOOH和B＝乙腈/0.1％HCOOH；梯度在10分钟内10-80％B；流速0.3ml/min，在214和254nm下UV检测，ESI-MS)与该正确结构的MH+相一致地在4.3分钟给出了m/z1151.4的峰。
实施例11通过PEG-戊二酸连接物用cPn216修饰的氯沙坦的固相合成 a)氯沙坦与三苯甲基衍生化的固体支撑物的连接 将氯沙坦(MSD，0.236g，0.558mmol)和三乙胺(Fluka，0.233ml，1.67mmol)加入到三苯甲基氯树脂(Novabiochem，取代1.24mmol/g，0.300g)在DMF(5ml)中的混悬液中。在4天后，将该树脂沥干并洗涤。将该树脂的等分试样裂解(二氯甲烷/TFA/三异丙基硅烷，92.5∶5.0∶2.5，15分钟)。HPLC分析(柱PhenomenexLuna C18(2)3μm 4.6×50mm，溶剂A＝水/0.1％TFA和B＝乙腈/0.1％TFA；梯度在10分钟内10-40％B；流速2.0ml/min，在214和254nm下UV检测)与氯沙坦一致地给出了一种tR为6.7分钟的峰。将该树脂用二氯甲烷/甲醇/二异丙基乙基胺溶液(17∶2∶1，20ml，1h)处理，用二氯甲烷洗涤并干燥。
b)用叠氮化物代替羟基 将二苯基磷酰基叠氮化物(Aldrich，0.481ml，2.23mmol)和DBU(0.611ml，4.09mmol)加入到得自a)的与氯沙坦结合的树脂(0.372mmol)在THF(10ml)中的混悬液中。将该反应放置一整夜。如a)下所述那样对该树脂的等分试样进行裂解。LC-MS分析(柱PhenomenexLuna C18(2)3μm50×4.60mm，溶剂A＝水/0.1％TFA和B＝乙腈/0.1％TFA；梯度在10分钟内20-80％B；流速1ml/min，在214nm下UV检测，ESI-MS)给出了一种与该结构相一致的峰，tR为7.3分钟，m/z为448.1(MH+)。
c)将叠氮化物基团还原成胺
向得自b)的树脂在THF(4ml)中的混悬液中加入氯化亚锡(II)(Acros，0.141g，0.744mmol)、苯硫酚(Fluka，0.304ml，2.976mmol)和三乙胺(Fluka，0.311ml，2.23mmol)。在1.5小时后，如a)下所述那样对树脂的等分试样进行裂解。LC-MS分析(柱PhenomonoxLuna Cl8(2)3μm 50×4.60mm，溶剂A＝水/0.1％TFA和B＝乙腈/0.1％TFA；梯度在10分钟内20-80％B；流速1ml/min，在214nm下UV检测，ESI-MS)在l.9分钟给出了一种m/z为422.2(MH+)的峰，其正是对该胺所预期的。
d)PEG-戊二酰基-cPN2l6单位的轭合该反应是在一种手动氮气起泡器装置中运行的。将Fmoc-PEG丙酸(Polypure AS，72mg，0.086mmol)、HATU(Applied Biosystems，33mg，0.086mmol)和DIEA(Fluka，29μl，0.172mmol)在DMF(2ml)中的混合物加入到得自c)的树脂(0.043mmol)中。2.5小时后，将该树脂沥干并用DMF洗涤。Kaiser试验为阴性。用20％位于DMF中的吡啶通过标准处理对Fmoc基团进行裂解。向位于DMF(1.5ml)中的树脂中加入得自实施例3b)的cPn216一戊二酸四氟苯硫酯(53mg，0.086mmol)和DIEA(15μl，0.086mmol)。将该反应放置一整夜，Kaiser试验为阴性。将产物从数值上裂解下来(CH2Cl2/TFA/TIS，97.5∶5∶2.5)。将该裂解溶液浓缩并将产物用制备HPLC纯化(柱Phenomenex Luna C18(2)5μm 21.2×250mm，溶剂A＝水/0.1％TFA和B＝乙腈/0.1％TFA；梯度在60分钟内10-40％B；流速10.0ml/min，在214nm下UV检测)，在冷冻干燥后得到3.8mg产物。LC-MS分析(柱Phonomenex Luna C18(2)3μm 2.0×50mm，溶剂A＝水/0.1％HCOOH和B＝乙腈/0.1％HCOOH；梯度在10分钟内10-40％B；流速0.3ml/min，在214和254nm下UV检测，ESI-MS)与该正确结构的MH+相一致地在7.2分钟给出了m/z为1460.6的峰。用NMR光谱对其进一步定性。
常规的99mTc-标记方案通过将0，1mg冷冻干燥的cPn216衍生的化合物溶解于0，2ml(蒸馏的和无氧的)水中来制备一种制剂。将这种溶液转移到一个10ml氮填充的小瓶中。加入0.5ml碳酸盐缓冲剂、0.5ml Na99mTcO4溶液和0.1ml Sn-MDP溶液。将该制剂在室温下放置20分钟。
碳酸盐缓冲剂该碳酸盐缓冲剂具有9.2的pH并且每ml水包含8.4mg NaHCO3，和10.6mg Na2CO3。使用前将其用氮气清洗至少15分钟。
Na99mTcO4溶液锝发生器(例如Ifetec发生器)洗脱物，稀释到2GBq/ml的放射活性浓度，无氧。
Sn-MDP溶液这种溶液每ml水包含0.131mg SnCl2·2H2O和0.925mg MDPL(亚甲基二膦酸)。该溶液在使用前在连续氮气清洗下是新制备的。
权利要求
1.通式I的化合物或其可药用的盐V-L-Z式I其中V是对血管紧张素II受体具有亲合力的非肽载体，L是一种键、间隔物或连接物部分，并且Z表示一种在人或动物体的体内成像过程中可检测的部分。
2.如权利要求1所述的化合物，其中V是氯沙坦、缬沙坦、坎地沙坦、依普沙坦或其衍生物。
3.如前面权利要求任意一项所述的化合物，其中Z是一种携带可成像部分M的式II的螯合剂 其中R1、R2、R3和R4各自独立地是一种R基团；各R基团独立地是H或C1-10烷基、C3-10烷基芳基、C2-10烷氧基烷基、C1-10羟基烷基、C1-10烷基胺、C1-10氟烷基、或2个或多个R基团和其与之相连的原子一起形成一种碳环、杂环、饱和或不饱和的环。
4.如前面权利要求任意一项所述的化合物，其中Z是一种携带可成像部分M的式e的螯合剂
5.如前面权利要求任意一项所述的化合物，其中Z包括一种成像部分，其中所说的成像部分包括金属放射性核素、顺磁金属离子、荧光金属离子、发色团(choromophores)、重金属离子或簇离子。
6.如权利要求3-5所述的化合物，其中所说的成像部分包括99Y，99mTc，111In，47Sc，67Ga，51Cr，177mSn，67Cu，167Tm，97Ru，168Re，177Lu，199Au，203Pb，141Ce或18F。
7.一种用于增强体内成像的影像对比度或用于治疗疾病的药物组合物，其包含有效量的通式(I)的化合物或其盐以及一种或多种可药用的助剂、赋形剂或稀释剂。
8.如权利要求1至6中任意一项所述的化合物在制备用于涉及将所说的造影剂给药于人或动物体并产生所说机体至少一部分的影像的诊断方法的造影剂中的用途。
9.一种涉及将一种造影剂给药于所说的机体并产生所说造影剂分散于其中的机体的至少一部分的影像的产生人或动物体影像的方法，其特征在于所说的造影剂包含如权利要求1至6中任意一项所述的化合物。
10.一种在先使用一种包含如权利要求1至6所述化合物的造影剂组合物的人或动物体中产生增强的影像的方法，该方法包括产生所说机体至少一部分的影像。
全文摘要
本发明涉及式I的造影剂，V－L－Z式I，其中V是对血管紧张素II受体具有亲合力的非肽载体，L是一种键、间隔物或连接物部分并且Z表示一种在人或动物体体内成像过程中可检测的部分。
文档编号A61K49/08GK1723043SQ200480001954
公开日2006年1月18日 申请日期2004年1月9日 优先权日2003年1月9日
发明者M·索尔巴肯, T·恩格尔, H·J·沃兹沃尔思, C·M·阿切尔 申请人:安盛药业有限公司