专利名称：在人转移性肿瘤细胞中表达的糖蛋白抗原sima135的制作方法
技术领域：
本发明总体上涉及诊断癌症和减少哺乳动物(例如人类)癌细胞转移的方法。具体来讲，本发明涉及到一种肿瘤标记蛋白质的用途，用于产生可用来检测细胞中该蛋白质产量增加的抗体，并涉及所述抗体的用途，用来减少产生所述肿瘤标记蛋白质的癌细胞的转移。
背景技术：
恶性肿瘤将细胞转移到一个新的组织并且产生次生肿瘤，而良性肿瘤不会产生次生肿瘤。这种产生次生肿瘤的过程称为转移，是一种复杂的过程，次生肿瘤细胞集结位点远离初生肿瘤。肿瘤转移仍然是癌症患者死亡的主要原因，然而对肿瘤细胞传播的分子机制不是很清楚。
转移是一个多步过程，其中肿瘤细胞必需从初生瘤分离、侵入细胞基质、渗透血管，进而进入循环系统(intravasate)、停滞在一个较远的位点、从血液中释放出来(extravasate)并且生长。参见例如G.L.Nicolson(1982)Biochim.Biophis.Acta.695113-176；G.L.Nicolson和G.Poste(1983)In.Rev.Exp.Pathol.2577-181；G.Poste和I.J.Fidler(1980)Nature 283139-145；以及E.Roos(1984)Biochim.Biophis.Acta.738263-284。由于该过程复杂，据认为很多基因介导肿瘤细胞的转移。转移性表型确实与包括蛋白酶、粘附分子等在内的很多蛋白的表达相关。然而往往缺乏或者很难证明一种特定蛋白直接参与传播。L.A.Liotta和W.Stetler-Stevenson(1989)J.Natl.Cancer Inst.81556-557。
人鳞状细胞癌HEp-3提供了一个能检测和表征实现转移性传播的基因的独特系统。通过在鸡尿囊绒膜(CAM)上系列传代而繁殖的HEp-3细胞具有致瘤和自发转移能力(T+M+)。Ossowski和E.Reich(1980a)CancerRes.402300-2309)。然而，这些细胞在体外持续生长，它们很容易形成初级肿瘤，但是随着时间日益增长，它们转变为非转移型(T+M-)。L.Ossowski和E.Reich(1980b)Cancer Res.402310-2315)。在体外持续培养，它们最终转变为非致瘤型(T-M-)。转移能力的丧失是可逆的。T+M-细胞转到尿囊绒膜上生长2至3代将恢复形成自发瘤转移。因而，通过改变生长条件，研究者可以操纵这些细胞的转移能力。
人尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)直接参与HEp-3的传播，人尿激酶型纤溶酶原激活物的特异性抗体可以抑制鸡胚胎中HEp-3细胞的自发转移性。L.Ossowski和E.Reich(1983b)Cell 35611-619。随后发现，抑制uPA活性阻断了单个的HEp-3细胞对CAM间叶细胞的侵润。L.Ossowski(1988a)Cell 52321-328。然而，有活性的uPA显然对肿瘤细胞进入血管内而非渗出血管是必需的。L.Ossowski(1988a)。因此，一些其他的因子也一定参与HEp-3的传播和癌细胞的普遍传播。J.P.Quigley等(1988)，CibaFoundation Symposium 14122-4.7，Brooks等(1993)，J.Cell Biol.122(6)1351-1359，以及Testa等，美国专利号6,245,898和6,498,014报道了利用“消减免疫(subtractive immunization)”产生单克隆抗体(mAbs)，它能识别HEp-3细胞表达的表面抗原，并且抑制在尿囊绒膜模型中肿瘤的转移。然而，这些抗原与体内转移不相关，并且也没有显示出直接参与体内转移的过程。
因此，需要鉴定功能性参与癌细胞扩散的生物分子，以研发可用于抑制肿瘤细胞转移至新组织的疗法。也需要抑制肿瘤细胞转移的方法和诊断癌症的方法，以通过减少或消除癌细胞在患有癌症的哺乳动物体内扩散而有利于控制癌症。
发明概述本发明涉及转移细胞中产生的蛋白(SIMA135)(SEQ ID NO1)的鉴定和表征。因此，本发明提供糖基化和非糖基化形式的SIMA135。本发明同时提供特异地并且选择地结合SIMA135和SIMA135片段的抗体。这些抗体能结合糖基化或非糖基化的SIMA135或者SIMA135片段。因此，本发明提供通过使用特异地结合SIMA135的抗体来抑制、减少或者消除癌细胞转移的方法。本发明也提供在试验样品中诊断癌症和确定癌细胞存在的方法。这些方法可用于哺乳动物，例如人类。本发明也提供含有特异地并且选择地结合SIMA135和SIMA135片段的抗体的药物组合物和试剂盒。本发明也提供筛选调节细胞产生SIMA135的试剂的方法。
本发明提供SIMA135和SIMA135片段。优选地，SIMA135和SIMA135片段是非糖基化的。更优选地，SIMA135或SIMA135片段是糖基化的。优选地，SIMA135片段施与到生物体例如哺乳动物或者鸟类时，其是抗原性的并且能激发免疫反应。优选地，SIMA135的抗原性片段是糖基化的。
本发明提供了结合SIMA135或SIMA135片段的抗体，例如单克隆抗体41-2。优选地，当优选的单克隆抗体选择性和特异性地结合SIMA135时，抗体不是单克隆抗体41-2。优选地，抗体是重组抗体。更优选地，抗体是多克隆抗体。甚至更优选地，抗体是人源化抗体。最优选地，抗体是单克隆抗体。优选地，抗体结合非糖基化的SIMA135或者非糖基化的SIMA135片段。更优选地，抗体结合糖基化的SIMA135或者糖基化的SIMA135片段。
本发明提供抑制、减少或者消除癌细胞转移的方法。所述方法涉及施与生物体其需要的能结合SIMA135的抗体。单克隆抗体41-2能结合SIMA135，也能与参与转移的其它抗原结合，但是本方法优选其它非单克隆抗体41-2的抗体。此种其它抗体能选择地和特异地结合SIMA135。优选地，生物体是哺乳动物。更优选地，生物体是人类。优选地，抗体非特异地结合SIMA135或者其片段。更优选地，抗体特异地结合SIMA135或者其片段。优选地，抗体是多克隆抗体。更优选地，抗体是重组抗体。甚至更优选地，抗体是单克隆抗体。最优选地，抗体是人源化抗体。优选地，抗体结合非糖基化的SIMA135或者非糖基化的SIMA135片段。更优选地，抗体结合糖基化的SIMA135或者糖基化的SIMA135片段。优选地，抗体作为药物组合物施与需要其的生物体。
本发明也提供在生物体中诊断癌症的方法。在一个实施方案中，结合SIMA135的抗体与获自生物体的试验样品接触，然后比较试验样品和无癌对照样品结合的抗体相对数量。试验样品比对照样品结合的抗体数量增多则说明生物体患有癌症。在另一实施方案中，本发明提供了在生物体诊断癌症的免疫组织化学的方法，其中抗体与获自生物体的试验样品接触，比较试验样品显示的抗体结合模式和对照样品产生的抗体结合模式。如果使用试验样品产生的抗体结合模式与使用致癌对照样品产生的抗体结合模式匹配，生物体诊断为患有癌症。另外，如果试验样品的抗体结合模式不同于使用无癌对照样品产生的抗体结合模式，这样生物体诊断为患有癌症。优选地，优选地，抗体非特异地结合SIMA135或其片段。更优选地，优选地，抗体特异地结合SIMA135或其片段。
本发明也提供了含有结合SIMA135或者其片段抗体以及可药用载体的药物组合物，条件是其中所述抗体不为单克隆抗体41-2。
本发明也提供包含结合SIMA135或者其片段的抗体以及包装材料的试剂盒。
本发明提供鉴定能调节细胞产生SIMA135的试剂的方法。本发明还包括该方法中有效的细胞系和测试方法本身。优选地，依照所述方法鉴定的试剂增加细胞SIMA135的产生。这种鉴定将证明某一试剂的致癌性，因此可用于致癌剂的快速试验。更优选地，依照该方法鉴定的试剂减少细胞SIMA135的产生。这种鉴定可证明此种试剂的抗致癌性。在一个实施方案中，将候选试剂与试验细胞接触，比较试验细胞和未与该候选试剂接触的对照细胞SIMA135的产生。与对照细胞相比，增加或者减少试验细胞SIMA135的产生，则证明候选试剂调节细胞SIMA135的产生。优选地，细胞是哺乳动物细胞。更优选地，细胞是人细胞。甚至更优选地，细胞是非转移性的HEp3细胞。最优选地，细胞是转移性HEp3细胞。
附图简述
图1显示了SIMA135的氨基酸序列。信号序列为小写字母，推断的跨膜结构域用方框标记。12个共有的N糖基化基序(motif)用实心三角形标记。胞质酪氨酸残基用圆圈标记。CUB结构域用下划线标记，CUB结构域被认为跨越221位残基到348位残基以及417位残基到544位残基。胰蛋白酶消化鉴定的三个肽段和序列用上划线标记。肽2前面的Arg残基和肽3前面的Lys残基用方框标记，以突出与胰蛋白酶对含有Arg/Lys的底物具特异性是一致的。胞质结构域PXXP序列用下划线标记。在推断的跨膜结构域之后共有的十六烷基化基序用实心圈标记。
发明详述本发明涉及通过消减免疫途径，利用命名为41-2的单克隆抗体从转移性HEp3细胞中纯化的一种糖基化蛋白质这一发现。该蛋白质命名为SIMA135(消减免疫M+Hep3相关的135kDa蛋白)。
SIMA135是指可以从细胞物理分离的蛋白质，这不同于通过翻译核苷酸序列而推测得到的推定蛋白质。物理分离SIMA135对许多理由是有意义的。一个理由是，该蛋白质的分离说明该蛋白质的mRNA确实转录成多肽。第二，此处报道的该蛋白质的分离和鉴定说明该蛋白质是糖基化的。物理分离的糖基化蛋白质证实了多肽中的糖基化位点可以糖基化，没有隐藏在折叠的蛋白质中而变得不能结合糖基转移酶。由于已知糖基化参与蛋白质折叠和免疫原性的作用，这些构象是重要的。因此，当与由核苷酸序列推断的理论上的多肽序列相比，分离SIMA135蛋白质是一个重大的进步。
此处显示的SIMA135 cDNA编码一个135kDa的，能特异地与mAb41-2进行特异性免疫反应的I型跨膜细胞表面蛋白质。免疫纯化和氨基酸测序证实成熟的该蛋白质起始于30位的Phe，前面切除了29个氨基酸的信号肽。免疫细胞化学分析证实了此蛋白质定位于细胞表面和该蛋白质的I型定位。此外，Western印迹分析去糖基化的细胞裂解物表明由于N连接的多糖，成熟SIMA135的表观分子量(约135kDa)和理论分子量(约90kDa)存在多达40kDa的差异，该结果与存在的12个可能的胞外糖基化位点相一致。Western印迹分析证明，SIMA135是一个酪氨酸磷酸化蛋白质，这与细胞内存在5个酪氨酸残基相一致。另外，利用PP2抑制剂证明，Src激酶家族成员参与HEp3细胞中SIMA135的酪氨酸磷酸化。
SIMA135的结构域表明其可与例如可溶性配基、其它细胞表面蛋白质或者基质成分在内的胞外蛋白质发生相互作用，这些作用有可能通过存在于其氨基端区域推测的CUB结构域而发生。这些结构被认为介导结合许多蛋白质配基。例如，CUB结构域参与稳定在补体级联反应的外源凝集素分支中起作用的MASP丝氨酸蛋白酶同型二聚体(Chen和Wallis，2001)。许多II型跨膜丝氨酸蛋白酶也含有CUB结构域，CUB结构域被认为介导酶与底物的相互反应(Hooper等，2001)。此外，cubilin的CUB结构域介导结合内在因子-维生素B12和清蛋白(Yammani等，2001)。由于SIMA135胞外结构域糖基化程度很高，据认为配基结合需要依靠，至少部分需要依靠糖类部分，在细胞表面糖蛋白质CD44的多种同种型已经证实了此现象(Bajorath，2000)。糖基化也被认为有助于SIMA135蛋白质的折叠，以及有助于运输至和维持在细胞表面(Gorlike等，2001；Grogan等，2002)。
SIMA135在氨基酸序列上显示出与其它与指环状癌相关的蛋白质(GenBank登录号AK026622)以及非小肺细胞癌细胞系Calu6相关的蛋白质(GenBank登录号AY026461)(Scher-Mostageer等，2001)不同。与之前已知的蛋白质相比，这些差异被认为影响SIMA135与其它分子的相互作用能力。第一个氨基酸的改变，525位Arg变为Gln，出现在胞外可能的配基结合结构域；SIMA135的第二个可能的CUB结构域。第二个氨基酸的改变，709位Gly变为Asp，位于酪氨酸残基后的第二个残基。此由一个非极性的氨基酸变为带电荷残基的改变预期对邻近的酪氨酸被磷酸化的能力有很大的影响，因此，也被认为影响SIMA135的结合能力，例如结合SH2结构域的能力。最后一个氨基酸的改变，827位Ser变为Asn，位于距离PXXP基序的四个残基处。因此，此改变可能也影响SIMA135与其它蛋白质的相互作用能力；所述其它蛋白质在此情况下为含有SH3结构域的蛋白质。
在正常结肠组织中，蛋白质SIMA135存在于结肠上皮细胞的基底和顶端表面以及存在于隐窝上皮细胞的顶端表面。与正常结肠中其明显的定位形成对照，结肠瘤组织中的SIMA135呈混乱的和异型的分布，通过质膜和胞质染色可观察到这种失调。在侵染结肠浆膜的深层腺体和引流血管内部，SIMA135的表达显得较为强烈。这些结果表明，蛋白质SIMA135表达的增加更多地与癌发生的后期阶段有关，例如，局部侵袭和转移。Western印迹分析取自同一组织中的成对人瘤细胞，可在一定程度上证明这个观点。例如，与同类系的且低转移性的变体M-HEp3相比，SIMA135在高转移性M+HEp3中的表达水平非常高。此外，不同类系的前列腺癌细胞系PC-3和LNCaP表现出相似的趋势，前者是一个转移性细胞系，后者是一个低转移性细胞型，SIMA135在前者中的表达水平远远高于后者(Soos等，1997)。
在正常和恶性腺体的腺液中都可以观察到明显的游离SIMA135，此现象与观察到的HEp3细胞体外释放的该蛋白110kDa可溶形式的结果相一致。腺体组织超微结构在肿瘤发生明显的损失是很显然的，这可允许可溶形式的SIMA135/CDCP1释放到结肠癌病人的体液和血管系统。因此，认为SIMA135作为血清或组织液标记具有实用性，对跨膜蛋白质MUC1(Rye和McGuckin，2001)、CD44(Adham等，1990)和ICAM-1(Maruo等，2002)也已提出此实用性。
I.糖基化的或者非糖基化的SIMA135、片段和其变体本发明提供可被糖基化的或不被糖基化的蛋白质SIMA135(SEQ IDNo1)、SIMA135片段和SIMA135的变体。这些蛋白质、片段和其变体可作为抗原来诱导产生结合SIMA135的抗体，例如，特异地和/或选择性地结合SIMA135的抗体。这些选择性结合的抗体包括那些结合SIMA135或者部分SIMA135，但不结合非SIMA135或者非SIMA135片段的其他蛋白质和蛋白质片段的抗体。这些蛋白质、片段和其变体可用于选择特异地和选择性地结合SIMA135的抗体。这些特异地和选择性地结合抗体包括那些结合SIMA135或者部分SIMA135，但不结合非SIMA135或者非SIMA135片段的其他蛋白质和蛋白质片段的抗体。这些抗体的选择性特别地表明它们结合SIMA135或者部分SIMA135，而不结合转移性Hep3细胞裂解产物产生的一种180kDa的蛋白质(美国专利号6,498,014)，SIMA135或者其片段与抗体结合的解离常数具有相同的数量级，但这些抗体结合180kDa的蛋白质可产生至少高于结合SIMA135或者其片段两个数量级的解离常数。这些抗体的特异性表明免疫原性的结合是表位-高变区相互作用的结果，而不是非特异的蛋白质-蛋白质相互作用的结果。非特异的蛋白质-蛋白质相互作用的解离常数一般比特异的表位-高变区相互作用的解离常数高三个数量级。抗体-抗原免疫结合对的解离常数的测定可参照Harlow等人的方法(Harlow等，AntibodiesA Laboratory Manual(ColdSpring Harbor Pub.1988))，此处引用作为参考。
此处所用的SIMA135片段是指一个足够长度的抗原性的肽段。一般来说，所述片段至少包含5个氨基酸。本发明涉及糖基化的或者非糖基化的SIMA135片段，例如糖基化的或者非糖基化的SEQ ID No1的片段，其中所述的片段包含525位的氨基酸和/或827位的氨基酸。本发明涉及SIMA135片段，例如SEQ ID No1的片段，其中所述的片段中525位的氨基酸不是谷氨酰胺和/或827位的氨基酸不是天冬酰胺。本发明涉及SIMA135片段，例如，SEQ ID No1的片段，其中所述的片段中525位的氨基酸是精氨酸和/或827位的氨基酸是丝氨酸。
变体蛋白质包括具有氨基酸替代的蛋白质，是有生物学活性的或者作为抗原时引起产生抗体。SIMA135的变体旨在包括通过缺失(也叫截短)或者添加一个或多个氨基酸至天然SIMA135的N端和/或C端；通过缺失或者添加一个或多个氨基酸至天然SIMA135的一个或多个位点处；或者通过在天然SIMA135的一个或多个位点处替代一个或多个氨基酸而自天然SIMA135衍生的蛋白质。
因此，本发明的SIMA135可以通过包括氨基酸替代、缺失、截短和插入在内的不同方法进行改变。这些操作的方法是本领域公知的。例如，多肽的氨基酸序列变体可通过突变编码SIMA135的DNA来制备。诱变和核苷酸序列改变的方法是本领域众所周知的。参照例如，Kunkel，Proc.Natl..Acad.Sci.USA，82；488(1985)；Kunkel等，Methods inEnzymoll，154；367(1987)；美国专利号4,873,192；Walker和Gaastra编著，Techniques in Molecular biology，MacMillan Publishing Company，New York(1983)和其中引用的参考文献。关于合适的不影响目的蛋白质生物学活性的氨基酸替代的指南，可以参照Dayhoff等人的模型，Dayhoff等，Atlas of Protein Sequence and Structure，Natl.Biomed.Res.Found.，Washington，C.D.(1978)此处引用作为参考。保守的替代是优选的，例如用另外一个具有相似特性的氨基酸替代一个氨基酸。保守的氨基酸替代是优选的，并且包括例如天冬氨酸和谷氨酸是酸性氨基酸；赖氨酸/精氨酸/亮氨酸是碱性氨基酸；亮氨酸/异亮氨酸、甲硫氨酸/缬氨酸、丙氨酸/缬氨酸是疏水性氨基酸；丝氨酸/甘氨酸/丙氨酸/苏氨酸是亲水性氨基酸。保守的氨基酸替代也包括基于侧链的分组。每一组中的成员可相互替代。例如，甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸是一组有脂肪族侧链的氨基酸。这些氨基酸可以互相替代。丝氨酸和苏氨酸是一组有脂肪族-羟基侧链的氨基酸。天冬酰胺和谷氨酰胺是一组有酰胺基侧链的氨基酸。苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸是一组具有芳香族侧链的氨基酸。赖氨酸、精氨酸和组氨酸是一组具有碱性侧链的氨基酸。半胱氨酸和甲硫氨酸是一组含有硫侧链的氨基酸。例如，用异亮氨酸或者缬氨酸替代亮氨酸、用谷氨酸替代天冬氨酸、用丝氨酸替代苏氨酸、或者用一个结构上相关的氨基酸相似地替代一个氨基酸，这些替代可以实现产生本发明的变体多肽。
本发明的蛋白质可以被糖基化或者不被糖基化。通过在能够糖基化重组蛋白质的细胞中表达这些蛋白质，这些蛋白质可以在体内被糖基化。备选地，通过使用糖转移酶，本发明的蛋白质可以在体外被糖基化。这些蛋白质可以通过使用商品化的酶例如PNGase F(New England Biolabs，Beverly，MA)进行处理，切开任一结合的聚糖。因此，本发明的蛋白质可用来产生结合天然SIMA135、变性的SIMA135、SIMA135的特异部分、糖基化的SIMA135和非糖基化的SIMA135的抗体。
II.选择性结合SIMA135或者SIMA135片段的抗体本发明提供结合SIMA135的抗体。优选的用于药物组合物的抗体包括那些抑制肿瘤转移的抗体。肿瘤转移的抑制可以通过例如迁移试验、侵染试验或者鸡尿囊绒膜试验在内的很多试验鉴定。
通过分别使用天然的或者变性的SIMA135免疫动物，可制备识别天然折叠的SIMA135或者变性的SIMA135的抗体。通过分别使用糖基化的或者非糖基化的SIMA135免疫动物，可制备识别糖基化的或者非糖基化的SIMA135的抗体。识别不同形式SIMA135的抗体(例如，天然的或变性的，以及糖基化的或非糖基化的)对于确定一个细胞是否能够正确折叠和糖基化SIMA135是有用的。这些抗体对于确定在转移过程中，一种候选试剂是否能够干涉产生SIMA135的细胞活性是有用的。因此，这些抗体可用于鉴定能用于抑制癌细胞转移的试剂的作用。
使用完整的蛋白质或者含有目的蛋白质小段肽段的片段作为免疫抗原，可制备结合SIMA135、SIMA135片段和SIMA135变体的抗体。可用作抗原的SIMA135片段包括在动物中产生免疫反应的SIMA135片段。这些片段一般是五个氨基酸或者更长。用于免疫动物的蛋白质或者肽可衍生自翻译的cDNA或者化学合成，需要的话，可将这些蛋白质共轭到载体蛋白质。化学偶联至肽的此类常用载体包括钥孔形血蓝素(KLH)，甲状腺球蛋白，牛血清白蛋白(BSA)，和破伤风类毒素。偶联的蛋白质或者肽然后用于免疫动物(例如，小鼠、大鼠或者兔子)。单克隆抗体41-2起初是一种用于分离SIMA135的抗体。它识别SIMA135和另外包括美国专利号6,245,898和6,498,014所描述的180kDa在内的几种其它转移蛋白质。基于该原因，本发明优选的抗体是这样的单克隆抗体，例如这些抗体选择地和/或特异地结合SIMA135、例如所述的抗体不结合其它转移蛋白质、例如所述的抗体识别SIMA135的表位。
根据需要可纯化单克隆或者多克隆抗体，例如，通过从结合有针对所述抗体的多肽或者肽的基质上结合和洗脱。本领域的技术人员知道很多在免疫学领域用于纯化和/或浓缩单克隆抗体以及多克隆抗体的常用技术(Coligan等，Unit 9，Current Protocols in Immunology，Wiley Interscience，1991，引用作为参考)。
适用于结合本发明蛋白质的抗体至少对该蛋白质区域的一部分是特异的。例如，本领域的技术人员可以利用蛋白质或者肽产生本发明适当的抗体。本发明的抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体以及单克隆抗体和多克隆抗体的片段。
本发明涉及本发明的抗体用来治疗性治疗人和动物，本发明也涉及本发明的抗体用于制备抑制哺乳动物癌细胞转移的药物。
制备多克隆抗体对于本领域的研究人员来说是众所周知的(Green等，Production of Polyclonal Antisera，在Immunochemical Protocols(Manson编著)一书中，1-5页(Humana Press 1992)；Coligan等，Production ofPolyclonal Antisera in Rabbits，Rats，Mice and Hamsters，在CurrentProtocols in Immunology一书中，2.4.1节(1992)，此处引用作为参考。
制备单克隆抗体同样也是常规的(Kohler和Milstein，Nature，256；495，1975；Coligan等，2.5.1-2.6.7节；和Harlow等，AntibodiesALaboratory Manual，726页(Cold Spring Harbor Pub.1988))，此处引用作为参考。简要地说，单克隆抗体可通过下面的步骤得到，用包含抗原的组合物注射小鼠、取血清样品以检验抗体产生的存在、取出脾脏以获得B淋巴细胞、融合B淋巴细胞和骨髓瘤细胞以产生杂交瘤、克隆杂交瘤、挑选产生抗原抗体的阳性克隆以及从杂交瘤培养物中分离抗体。通过许多成熟的技术，可从杂交瘤中分离和纯化单克隆抗体。这些分离技术包括用蛋白质A葡聚糖的亲和层析、分子筛层析和离子交换层析(Coligan等，2.7.1-2.7.12节和2.9.1-2.9.3节；Barnes等，Purification of ImmunoglobulinG(IgG)，Methods in Molecular Biology，10；79-104(Humana Press 1992))。体外和体内增殖单克隆抗体的方法对于本领域的研究人员是熟知的。体外增殖可在合适的培养基中完成，例如Dulbecco′s Modified Eagle培养基或者RPMI 1640培养基，任选地添加哺乳动物血清例如胎牛血清或者微量元素，以及包括例如正常小鼠腹膜渗出细胞、脾细胞、骨髓巨噬细胞在内的维持生长补充物。体外生产提供相对纯的抗体制品并且允许扩大规模以产生大量目的抗体。大规模杂交瘤培养可通过在空气反应器中、连续搅拌反应器中通过均相悬浮培养，或者固定化的或截留的细胞培养来完成。体内增殖可通过注射细胞克隆到与当前细胞能够组织相容的哺乳动物，例如同基因型小鼠，以引起抗体产生瘤的生长来完成。动物在注射前任选地用碳氢化合物，尤其是例如姥鲛烷、四甲基十五烷在内的油类进行预处理。一至三周后，目的单克隆抗体可从动物的体液中回收。
本发明的抗体可衍生自“人源化的”单克隆抗体。人源化的单克隆抗体是通过转移取自小鼠免疫球蛋白的重链和轻链中的互补决定区至人的可变结构域，然后将小鼠的构架区残基替换为人的残基。衍生自人源化单克隆抗体的抗体组成物的用途是消除与鼠类恒定区的免疫原性相关的潜在问题。克隆鼠免疫球蛋白可变区的一般技术已有报道(Orlandi等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，863833(1989)。生产人源化单克隆抗体的技术已有报道(Jones等，Nature，321522，(1986)；Riechmann等，Nature，332323，(1988)；Verhoeyen等，Science，2391534，(1988)；Carter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，894285，(1992)；Sandhu，Crit.Rev.Biotech，12437，(1992)以及Singer等，J.hnmunol.，1502844，(1993)，此处引用作为参考)。
此外，本发明的抗体可衍生自人的单克隆抗体。这些抗体可获自转基因小鼠，这些小鼠是被“设计的”对抗原性攻击产生反应，以产生特异的人抗体。在该技术中，将人重链和轻链基因座的元件导入到取自小鼠胚胎干细胞系的株系中，该胚胎干细胞系含有内源重链和轻链基因座的定向破坏。转基因小鼠可合成特异人抗原的人抗体，并且这些小鼠可用于产生人抗体分泌型杂交瘤。从转基因小鼠获得人抗体的方法已有报道(Green等，Nature Genet，713，(1994)；Lonberg等，Nature，368856，(1994)；和Taylor等，Int.Immunol，6579，(1994)，此处引用作为参考)。
本发明的抗体片段可以通过蛋白水解抗体或者在大肠杆菌(E.coli)中表达编码片段的DNA来制备。运用常规方法，利用胃蛋白酶或者木瓜蛋白酶消化完整抗体可以得到抗体片段。例如，通过利用胃蛋白酶酶切抗体以提供标记为F(ab′)2的5S片段，从而可以得到抗体片段。巯基还原剂可以进一步地剪切此片段，并且任选地封闭由二硫键剪切产生的巯基基团的基团以产生3.5S Fab′单价片段。或者用胃蛋白酶酶切直接产生两个单价的Fab′片段和一个Fc片段。这些方法已有报道(Goldenberg，美国专利号4,036,945和4,331,647，这里引用作为参考，Porter，Biochem.J，73119(1959)；Edelman等，Methods in Enzymology，1422(Academic Press 1967)和Coligan等，2.8.1-2.8.10节和2.10.1-2.10.4节)。
其它的剪切抗体的方法，例如分离重链以形成单价轻-重链片段，片段的进一步剪切、或者其它酶、化学和遗传技术也可用，只要片段结合至能被完整抗体识别的抗原上。
例如，Fv片段包括VH和VL链的连接。该连接可以是非共价的(Inbar等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，692659，(1972))。备选地，可变链可利用分子间二硫键进行结合，或者用化学试剂进行交联，例如戊二醛(Sandhu，见上文)。优选的Fv片段包含通过肽接头连接的VH和VL链。通过构建一个包含由寡核苷酸连接的编码VH和VL区的DNA序列，可以制备这些单链抗原结合蛋白质(sFv)。该结构基因插入到表达载体，然后再将此载体转入宿主细胞，例如大肠杆菌.。此重组宿主细胞合成用衔接肽桥接两个v结构域的单链多肽。生产sFvs的方法已有报道(Whitlow等，MethodsA Companion to Methods in Enzymology，297，(1991)；Bird等，Science，242423，(1988)；Ladner等，美国专利号4,946,778；Pack等，Bio/Technology，111271(1993)和Sandhu，supra)。
抗体片段的另外一种形式是编码单一互补决定区域(CDR)的肽。CDR肽(″最小识别单元″)可通过构建编码目的抗体CDR的基因来获得。例如，通过使用多聚酶链反应从抗体生成细胞的RNA合成可变区，可制备这些基因(Larrick等，MethodsA Companion to Methods in Enzymology，2106(1991))。
III.治疗转移性肿瘤和抑制肿瘤细胞转移的方法。
本发明也包括治疗转移性肿瘤的方法。″治疗转移性肿瘤″的意思是肿瘤的转移被阻止、延缓或者抑制。转移性肿瘤包括在原发部位具有转移能力的肿瘤，以及在继发部位的转移肿瘤。这些转移性肿瘤可以是肺、肝、肾、乳腺、上皮细胞、甲状腺、白血病、胰脏、子宫内膜、卵巢、颈、皮肤、结肠和淋巴样组织的组织起源。被治疗的受试者可以是除小鼠外的任何哺乳动物受试者，包括人、狗、猴子、牛等。
本发明的一个实施方案提供了治疗患者转移性肿瘤的方法，此方法通过施与患者治疗有效量的本发明的肿瘤转移抑制抗体。本发明的肿瘤转移抑制抗体已经在前文进行了描述。优选的肿瘤转移抑制抗体包括那些选择性地结合SIMA135或者其片段的抗体。
肿瘤转移抑制抗体可以单独给药或者结合可药用载体。可药用载体包括所有溶剂，例如脂肪、油类、水、盐溶液、脂类、脂质体、树脂、粘合剂、充填剂、分散介质、细胞培养介质等，或者其组合，这些溶剂对受试者没有毒性。
依照本发明，有效成分可以与载体以任何方便的和实际的方式进行结合，例如通过溶解、悬浮、乳化、混合、胶囊化、吸附等，并且如果必需，可通过加工将组合的组合物制成丸剂或者片剂。这些操作对这些领域的技术人员是常规的。
抗体的治疗有效量视疾病状态和其它的临床因素而定，例如患者的体重和状态、患者对治疗的反应、制剂类型和给药途径。治疗有效的化合物的精确剂量可由此研究领域的技术人员决定。作为一般的规则，抗体的治疗有效量可以在每单位剂型约0.5μg到约2g的范围内。一个单位剂型指用于哺乳动物治疗中，物理上分离的适合作为单个剂量的单位每个单位含有预定量的活性物质，这些与任何所需药用载体结合的活性物质计划产生预期的治疗效果。本发明的方法考虑了单次及多次给药，可以同时或者在一段长时间阶段给药。
肿瘤转移抑制抗体的给药可以以任意方便的方式来完成，这些方式包括通过气溶胶吸入、注射、口服、输液、植入或者移植。优选地，本发明的抗体通过皮下(s.c.)、腹膜内(i.p.)、动脉内(i.a.)或者静脉内(i.v.)注射施与患者。
IV.诊断哺乳动物癌症的方法本发明也包括通过检测SIMA135的表达来诊断受试者转移性肿瘤的方法。
转移性肿瘤包括在原发部位具有转移能力的肿瘤，以及在继发部位的转移肿瘤。这些转移性肿瘤可以是肺、肝、肾、乳腺、上皮细胞、甲状腺、白血病、胰脏、子宫内膜、卵巢、颈、皮肤、结肠和淋巴组织的组织起源。
通过使用结合SIMA135或者SIMA135片段的抗体，可以检测SIMA135的表达。多克隆抗体和单克隆抗体都可使用。
在一个实施方案中，样品取自受试者，例如活组织检测样品取自于疑似有转移性肿瘤的组织。通常在检测进行之前处理样品。可用的测定方法包括ELISA、RIA、EIA、Western印迹分析、免疫组织染色等。根据所用的测定方法，抗原或者抗体可以被酶、荧光团或者放射性同位素所标记。参考例如，Coligan等，Current Protocols in Immunology，John Wiley &Sons Inc.，New York，N.Y.(1994)；Frye等，Oncogen，41153-1157，1987。
样品的处理根据所使用的检测SIMA135的测定方法而不同。例如，活体组织的细胞可进行裂解，并且细胞裂解产物被用于例如Western印迹分析。对于例如Whole Cell ELISA测定方法的测定，细胞在测定前可先用如PBS漂洗，然后在含有0.25％戊二醛的PBS中固定。
比较通过使用前文所述的任意一种方法检测到的SIMA135或者SIMA135片段的表达与组织的正常部分中同样抗原的表达。当抗原的表达水平比正常组织中的表达有实质的增加，预示为转移性肿瘤。实质的增加意味着至少增加约20％，优选地，至少增加约25％，更优选地，至少增加约35％。
在另一个实施方案中，免疫组织化学可用于诊断生物体内的转移性肿瘤。在此实施方案中，样品取自生物体，例如活组织检测样品取自于疑似有转移性肿瘤的组织。样品可被固定在载玻片上并且与此处所公开的抗体接触，此处公开的是结合SIMA135的抗体。抗体可以被酶、荧光团或者放射性同位素标记。参考例如，Coligan等，Current Protocols inimmunology，John Wiley & Sons Inc.，New。在抗体结合到SIMA135后，抗体的位置通过使用已知的技术确定。异种染色、整个组织样品中SIMA135的广泛表达、以及恶性腺体中的染色表明转移性癌症。
V.含有选择性地结合SIMA135或者其片段的抗体和包装材料的试剂盒本发明提供了含有选择性地结合SIMA135的抗体和包装材料的试剂盒。此类试剂盒对于运输和存储用于治疗和检测癌症的抗体是有用的。这些试剂盒尤其可被实验室的医药工作者用于检测取自生物体组织样品中的转移性癌症。此外，这些试剂盒可用于医药工作者用来配制含有本发明抗体的药物组合物。
包装材料可以给抗体提供一个被保护的环境。例如，包装材料可以防止抗体被污染。此外，包装材料可以防止溶解的抗体变干。
可用作包装材料的适合材料的实例包括玻璃、塑料、金属等。这些材料可被硅烷化以避免抗体吸附到这些包装材料上。
VI.包含选择性地结合SIMA135或者SIMA135片段的抗体以及可药用载体的药物组合物本发明的药物组合物包括结合SIMA135的抗体，这些抗体制剂成药物组合物并且给药动物宿主，例如人类患者，其有多种适合施用的被选择途径，例如口服或者肠胃外施用，通过静脉内、肌肉内、局部或者皮下途径。
因此，抗体可通过结合例如惰性稀释剂或者可同化的可食载体在内的可药用载体而全身给药，例如口服。它们可包封在硬壳的或软壳的明胶胶囊中、可压缩成片剂、或者可直接与患者的食物混合。对于经口的治疗性服用，这些抗体可与一种或者多种赋形剂结合，并且以可吸收的片剂、口腔含化片剂、含片剂、胶囊剂、酏剂、悬浮液、糖浆、糯米纸囊剂等形式使用。这些组合物和制品应该至少含有0.1％的抗体。组合物和制品的比例当然可以是多样的，并且方便地为给定单位剂型重量的约2％到约60％之间。在这些治疗上有用的组合物中，一种或者多种抗体的量是可获得有效剂量水平的量。当口服给药时，本发明的组合物可优选地在明胶胶囊中给药。
片剂、含片剂、丸剂、胶囊剂等也可含有如下组分粘合剂，例如西黄芪树胶、阿卡胶、玉米淀粉或者明胶；赋形剂，例如磷酸二钙；崩解剂，例如玉米淀粉、马铃薯淀粉、藻酸等；润滑剂，例如硬脂酸镁；甜化剂，例如蔗糖、果糖、乳糖或者天冬甜精；或者调味剂，例如薄荷、冬绿树油，或者樱桃调味料，这些组分可被添加。当单位剂型是胶囊剂时，除上述种类的材料之外，其可含有液体载体，例如植物油或者聚乙二醇。多种其他材料可作为包衣或者改进固体单位剂型的物理形状。例如，片剂、丸剂或者胶囊剂可包衣有明胶、蜡、虫胶或者糖等。糖浆或者酏剂可含有一种抗体或者多种抗体、作为甜化剂的蔗糖或者果糖、作为防腐剂的羟苯甲酸甲酯和羟苯甲酸丙酯、染料以及调味剂例如樱桃和橙色香料。用于制备任何单位剂型的材料当然应该是可药用的并且所使用的量基本上没有毒性。此外，一种抗体或者多种抗体可掺入到持续释放制剂和设备中。
本发明的一种或者多种抗体可以通过灌输或者注射，由静脉内或者腹膜内给药。一种或者多种抗体的溶液可用水制备，任选地混合无毒性表面活性剂。也可以在甘油、液体聚乙二醇、甘油醋酸脂和其混合物以及在油中制备分散剂。在存储和使用的通常条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物的生长。
用于注射或者灌输的合适的药物剂型包括含有一种或者多种抗体的无菌水溶液、分散剂、无菌干粉，这些干粉适用于无菌可注射的、可灌输的溶液或者分散剂的临时制备，其任选地被包囊在脂质体中。在所有情况下，最终的剂型在制造和存储的条件下应该是无菌的、液体的和稳定的。液态载体可以是溶剂或者液态分散介质，其包括例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液态的聚乙二醇等)、植物油、无毒性的甘油脂类和其合适的混合物。适当的流动性可以被维持，例如，通过形成脂质体、在分散剂的情况下通过维持所需的颗粒大小、或通过使用表面活性剂。防止微生物的活性可通过多种抗细菌剂和抗真菌剂产生，例如，羟苯甲酸酯、氯丁醇、酚、山梨酸、硫汞柳酸钠等。在许多情况下，药物剂型优选地含有等渗剂，例如糖、缓冲剂或者氯化钠。可注射组合物的延长吸收可以通过在组合物中使用延缓吸收的试剂例如单硬脂酸铅和明胶而产生。
通过将所需量的一种或者多种抗体与多种上述列举的其它成分混合到适当的溶剂中可制备无菌可注射溶液，并根据需要进行过滤灭菌。
VII.鉴定调控细胞SIMA135产生的试剂的方法本发明提供了鉴定增加或者减少细胞SIMA135产生的试剂的方法。一般来讲，该方法包括将候选试剂与试验细胞接触，并且确定试验细胞相对于未接触候选试剂的对照细胞，其SIMA135的产生是否增加或者减少。
试验细胞和对照细胞产生的SIMA135可通过使用许多领域公认的方法来检测。这些方法已被通过包括放射免疫测定法(RIA)、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、使用荧光标记的抗体等在内的免疫学方法例证过。
候选试剂的许多样品可按照官方的United States Pharmacopeia、官方的National Formulary以及它们附录中所描述的方法进行筛选。简要地说，候选试剂的例子包括碳氢化合物、环状有机分子、二环有机分子、芳香基有机分子、烷基有机分子等。Merck Manual，Merck ResearchLaboratories，Whitehouse Station，N.J.第17版，Beers和Berkow，1999，Merck Index，Merck Research Laboratories，Whitehouse Station，N.J.第13版，2001。
例如下面章节里举例说明的转移性HEp3细胞可用做本发明方法中的试验细胞和对照细胞。然而，该方法也可在正常产生SIMA135的细胞中实行，或者通过重组的方法。例如，提供用来生产SIMA135的表达构建体可导入这样的细胞，所述细胞为在导入所述表达盒之前不产生SIMA135的细胞。转化的细胞然后可用于本发明方法中用来鉴定调控SIMA135产生的试剂。利用此细胞系统，上文所述的检测SIMA135存在和数量的诊断方法可用于测定试验和对照细胞产生的SIMA135。
本发明的方法也可在体内实行。在下面章节的例证中，候选试剂可被施与试验动物。组织样品可取自试验动物，比较该组织样品中细胞产生的SIMA135和取自对照动物组织样品中细胞产生的SIMA135。与对照动物相比，试验动物SIMA135产生增加说明候选试剂增加SIMA135产生。与对照动物相比，试验动物SIMA135产生减少说明候选试剂减少SIMA135产生。SIMA135的测定可通过上文诊断章节提供的任意一种分析方法来测定。许多种动物都可用于本发明的方法。这些动物的实例包括兔子、大鼠、小鼠、猴子等。
本发明的方法可在体外实行。例如试验细胞和对照细胞可在组织培养基上生长。这就允许候选试剂在体外与试验细胞接触。试验细胞产生的SIMA135然后可与上文描述的对照细胞产生的SIMA135比较，以确定候选试剂是否增加或者减少细胞的SIMA135产生。
体外和体内方法将确定试验试剂促进和降低或阻止转移的能力。促进作用的测定可鉴定该试剂为致癌剂或者增强剂。此测定实际应用于快速致癌试剂的鉴定。降低或者阻止作用的测定可鉴定该试剂为癌症抑制剂。此测定实际应用于抗癌剂的鉴定。
实施例I细胞系和杂交瘤人颈腺癌HeLa、纤维肉瘤HT1080、结肠腺癌DLD-1和SW480、乳腺癌MCF7、前列腺癌PC-3、前列腺癌淋巴节转移瘤LNCaP、肺癌A549和杆状肾癌G401细胞获自美国典型培养物保藏中心(American TypeCulture Collection(Rockville，MD))。人肝癌HuH7和HLE、胃癌MKN45和STKM-1细胞由Peter Vogt博士(The Scripps Research Institute，LaJolla，CA)提供；乳腺癌MDA-MB-231细胞由Liliana Ossowski博士(MountSinai School of Medicine，NY)提供。人鳞状细胞癌HEp3细胞获自在鸡胚胎的尿囊绒膜(CAM)连续传代的实体瘤(Testa，1992；Brooks等，1993)。HEp3细胞的转移性变种，M+HEp3，使用前培养时间要少于20天。低转移性变种，M-HEp3，使用前至少在培养基上培养80天。人微血管内皮细胞(HEC)和皮成纤维细胞(HDF)获自Clonetics(San Diego，CA)，并且分别用EGM-2MV和FGM-2培养基(Clonetics)培养。癌细胞系作为单细胞层培养在添加10％FBS(HyClone，Logan，UT)、丙酮酸钠、青霉素/链霉素和非必需氨基酸(Invitrogen)的DMED(Invitrogen，Carlsbad，CA)中培养，并且在增湿的、5％CO2环境下、37℃生长。产生MoAb41-2的杂交瘤通过前文描述的消减免疫途径产生(Brooks等，1993)。杂交瘤培养和mAbs纯化由The Scripps Research Institute的Protein and NucleicAcids Core Facility使用标准程序完成。
实施例II试剂蛋白酶抑制剂、正常的小鼠IgG、抗FLAG M2 mAb、DAB试剂和Gill苏木精购自Sigma(St.Louis，MO)。反转录、PCR试剂和pCR-II Topo载体购自Invitrogen。PP2购自Calbiochem(La Jolla，CA)。
实施例III蛋白质纯化、肽测序和蛋白质分析免疫共沉淀作用在未标记或者35S标记的HEp3细胞(5×107)细胞裂解物上进行。代谢标记在含有Tran35S标记(100μCi/ml；ICN，Costa Mesa，CA)的无甲硫氨酸/半胱氨酸的DMEM中过夜实施。细胞彻底地用PBS漂洗，然后溶解在含有0.1M Tris(pH8.0)、0.1％Triton X-100、150mMNaCl、5mM EDTA、10μM反式环氧琥珀酰-L亮氨酰酰氨基(4-胍基)丁烷、20μg/ml大豆胰蛋白酶抑制剂和25μg/ml抑酶肽的缓冲液中。细胞裂解物用蛋白质G-Sepharose(Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)在4℃预先清洁30分钟，然后与20μg的mAb 41-2或者nmIgG在4℃孵育过夜。免疫复合体用蛋白质G-Sepharose沉淀出，在聚丙烯酰胺凝胶电泳前，复合体在还原性SDS上样缓冲液中煮沸变性。对于35S标记的蛋白质，将凝胶干燥并且在-80℃曝光于胶片。或者，将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上(Millipore，Bedford，MA)。切下明显的考马斯染色的135kDa条带，然后用胰蛋白酶消化。所得的肽通过高压液相色谱法来分离，并且用Procise 494蛋白质测序仪(Applied Biosystems，Inc.，Foster City，CA)进行测序。胰蛋白酶消化和肽段测序由The Scripps Research Institute的Proteinand Nucleic Acids Core Facility完成。肽段序列通过使用可自NationalCenter for Biotechnology Information(NCBI)网站获得的算法检索GenBank数据库。使用Prosite数据库(Blom等，1999)、SMART算法(Schultz等，1998)、PSORT算法(Nakai和Kanehisa，1992)和NetPhos 2.0算法(Blom等，1999)分析完整的SIMA135蛋白质序列的结构区、细胞加工信号和共有的翻译后修饰基序。
实施例IV表达构建体和瞬时转染在真核表达载体pME18S-FL3中的SIMA135 cDNA(GenBank登录号AK026622)作为日本NEDO人类cDNA测序计划的一部分而完成，并且由Hiroko Hata博士(Dept.of Virology，Institute of Medical Science，University of Tokyo)友情提供。SIMA135 FLAGin构建体是通过PCR在亲本构建体的终止密码子前放置编码FLAG表位(DYKDDDDK)的序列完成的。对这两种构建体测序。使用Superfect reagent(Qiagen，Valencia，CA)，根据厂商所述将SIMA135或者SIMA135 FLAGin表达构建体瞬时传染HeLa细胞(4×105)。细胞在含有10mM Tris(pH8.0)、150mM NaCl、1％TritonX-100、5mM EDTA和lx Complete mini EDTA-无蛋白酶抑制剂混合物(Roche，Indianapolis，IN)的冰冷缓冲液中裂解。不溶物通过14000转/分离心10分钟除去。
实施例V克隆HEp3细胞的SIMA135cDNA总RNA利用RNeasy试剂盒(Qiagen)分离，并且在利用Superscript II反转录酶进行反转录反应中，取2μg作为模板。PCR用1μl所得的cDNA为模板、使用引物TCCCCACCGTCGTTTTCC(SEQ ID NO2)和GGTTAGGAACACGGACGGGTG(SEQ ID NO3)(依据GenBank登录号AK026622设计的)，以及校正酶Platinum Pfx DNA聚合酶来实施。PCR的循环条件是94℃，3分钟，94℃，30秒、55℃，30秒、72℃，150秒，30个循环，最后72℃延伸10分钟。凝胶纯化PCR产物(Qiagen)，使用Platinum Taq DNA聚合酶加腺嘌呤尾，然后克隆到pCR-II Topo载体并测序。
实施例VII免疫荧光用SIMA135 FLAGin表达构建体瞬时转染的HeLa细胞，HEp3细胞平铺在盖玻片上。37℃孵育48小时后，用PBS清洗细胞，然后在2％甲醛中固定。用于和抗FLAG mAb孵育的HeLa细胞未被透化或者通过在含有0.5％TritonX-100的PBS中室温孵育5分钟被透化。两种细胞类型都在含有5％BSA的PBS中封闭。接着与mAb 41-2(5μg/ml)或者抗FLAG M2mAb(4μg/ml)在封闭液中4℃孵育过夜，用PBS清洗细胞，然后与连接有Alexa Fluor 546的山羊抗小鼠IgG(2μg/ml)(Molecular Probes)孵育。标记的细胞用BioRad 1024MRC2扫描共聚焦成像系统进行观察和照相。
实施例VIINorthern印迹分析人12泳道多组织Northern印迹(Clontech)用[α-32P]dCTP标记的(Ambion)SIMA135 cDNA的EcoRI/Hind III DNA插入片段，在UltraHyb溶液(Ambion)中68℃杂交过夜。印迹用最终的严格度0.1x SSC，0.1％SDS，68℃漂洗，然后在-80℃曝光于胶片。印迹用β-肌动蛋白cDNA再次探测以确定每个泳道RNA上样的一致性。
实施例VIIIWestern印迹分析细胞裂解产物、无血清培养基和免疫沉淀的蛋白质通过8％SDS-聚丙烯酰胺凝胶分离，然后转移到硝酸纤维素膜上(Millipore)。膜在含有5％脱脂奶粉的PBS中封闭，然后与mAb 41-2(2μg/ml)，抗FLAG M2 mAb(0.8μg/ml)或者抗磷酸酪氨酸mAb(1μg/ml，Upstate Biotechnology，LakePlacid，NY)在4℃孵育过夜。在充分漂洗后，膜与山羊抗小鼠IgG(0.16μg/ml，Pierce，Rockford，I1)在室温孵育2小时，免疫反应性带通过增强型化学发光(Pierce)来检测。
实施例IX生物化学表征方法为了切除N连接的聚糖，M+HEp3细胞和SIMA135FLAGin表达构建体瞬时转染的HeLa细胞的细胞裂解物(50μl)，在0.5％SDS、1％β-巯基乙醇中100℃10分钟以变性和还原，然后用PNGase F(New EnglandBiolabs，Beverly，MA)37℃孵育45分钟。为分析SIMA135酪氨酸磷酸化的基态水平，亚汇合培养的HEp3和HeLa(作为阴性对照)细胞在含有50mMNaF和1mM Na3VO4的无血清DMEM中37℃孵育30分钟，然后用冷PBS漂洗。为了抑制Src激酶家族磷酸化，HEp3细胞与PP2(50μm)在不含NaF和Na3VO4的无血清DMEM中37℃孵育30分钟。然后细胞在含有50mMTris(pH7.4)、150mM NaCl、1％Triton X-100、1mM苯甲基磺酰氟、1mM苯甲咪、25μg/ml抑酶肽、25μg/ml亮胰蛋白酶肽、50mM NaF和1mMNa3VO4的冰冷缓冲液中裂解。不溶物通过14000转/分钟离心10分钟去除。免疫沉淀是按照前文所述的方法实施，对300μg的细胞溶解物使用1μgmAb 41-2或者nmIgG(作为阴性对照)。为了测定溶解的SIMA135的存在，接近汇合的HEp3细胞用PBS清洗三次，然后在无血清的条件培养基中孵育24小时。收集培养基并且在4℃，10,000g离心，然后用截留分子量为30,000kDa的微米离心过滤器(Millipore)将其浓缩10倍。细胞裂解物按照上文所述方法收集。
实施例X免疫组织化学取自三个患者的纪录为人腺癌结肠组织样品的低温切片(6μm)在锌-福尔马林中固定15分钟，用PBS简短漂洗，然后非特异结合位点通过在含有3％BSA的PBS中孵育而封闭。使用mAb 41-2(5μg/ml)且4℃过夜。特异性抗体结合通过添加连接有生物素的抗小鼠抗体(Pierce)，接着通过添加能用DAB试剂显色的连接有辣根过氧化酶的中性亲和素(neutravidin)(Pierce)被检测到。切片用Gill苏木精复染。
实施例XImAb 41-2识别在高转移性人瘤HEp3细胞中以升高水平表达的135kDa抗原被抗体mAb 41-2识别的抗原已被鉴定和表征。作为确定被抗体mAb41-2识别的抗原重要性的最初步骤，用mAb 41-2对细胞裂解物(20μg)实施Western印迹分析，其中所述细胞裂解物制备自高转移(M+)和低转移(M-)HEp3细胞，且在非还原条件下电泳。在两种细胞型中通过消减免疫产生的单克隆抗体41-2(mAb)都检测到了大约135kDa的单一条带。与用来产生mAb 41-2的消减免疫途径相一致的是，免疫反应性蛋白质在M+HEp3细胞的表达水平高于M-HEp3细胞。用高转移(M+)和低转移(M-)HEp3细胞制备的细胞裂解物进行的平行考马斯染色的凝胶表明，M+HEp3和M-HEp3细胞提取物的总蛋白质图型和含量是无差别的。mAb41-2在免疫反应性上的差异表明，两种细胞系间的关联抗原在表达水平上有显著的差异。
实施例XII鉴定mAb 41-2识别的来自转移性HEp3细胞的抗原将纯化的mAb 41-2用于免疫沉淀实施例XI中M+HEp3细胞的抗原。用mAb 41-2或者正常小鼠IgG从M+HEp3细胞中免疫沉淀的35S标记的蛋白质于还原条件下在SDS-PAGE上分析。干燥凝胶且在-80℃过夜曝光于胶片。从放射性标记的HEp3细胞免疫沉淀的主要蛋白质的分子量约135kDa。这与实施例XI中检测到的抗原的分子量一致。在用未标记HEp3细胞进行的平行实验中，免疫沉淀的蛋白质被转移到PVDF膜上，将135kDa的蛋白质带切下来，进行胰蛋白酶消化，并且对分离的片断从N端测序。获得了3个主要的肽序列。检索GenBank无重复蛋白质数据库表明，每个肽段序列与一个未公布的登录号为BAB15511的理论序列完全或者几乎完全匹配，此蛋白质序列翻译自登录号为AK026622的未公布cDNA。
肽1FEIALPRESQITVLG(I)KXGTSEQ ID No4BAB15511 FEIALPRESNITVLIKXGT SEQ ID No5肽2XXXXIPGSTTNPE SEQ ID No6BAB15511 VEYYIPGSTTNPE SEQ ID No7肽3XYXLQVPSDILH SEQ ID No8BAB15511 SYSLQVPSDILH SEQ ID No9鉴定的蛋白质被命名为消减免疫的M+HEp3相关的135kDa蛋白质(subtractiveimmunizationM+HEp3associated135kDa protein；SIMA135)，其完整序列在图1中显示。为了证实SIMA135和由mAb 41-2特异识别的蛋白质是同一蛋白质，用HEp3细胞、未转化的HeLa细胞和用SIMA135 cDNA瞬时传染的HeLa细胞的细胞裂解物进行Western印迹。使用mAb 41-2探测，Western印迹分析非还原条件下电泳的总细胞裂解物(25μg)，这些细胞裂解物来自HEp3细胞、未转染的HeLa细胞和用SIMA135 cDNA瞬时传染的HeLa细胞。mAb 41-2与HEp3细胞和用SIMA135 cDNA瞬时传染的HeLa细胞中存在的同样的135kDa蛋白质带发生反应，但是在未转染的HeLa细胞中没有此带。为了提供其它的证明，通过反转录PCR，从HEp3细胞克隆SIMA135 mRNA的蛋白质编码区。DNA序列分析由此方法产生的两个克隆，证明了SIMA135 mRNA是由这些细胞表达的。在GenBank登录号为AK026622和来自HEp3细胞的SIMA135序列之间，鉴定出四个核苷酸差异核苷酸1684G→A、1847T→C、2236G→A和2590G→A。第二个转换是沉默的，其余的转换导致氨基酸分别地改变525Arg→Gln、709Gly→Asp和827Ser→Asn。
实施例XIII
SIMA135的结构特征SIMA135蛋白质序列包括863个氨基酸(SEQ ID No.1-图1)，且其推算的分子量为92.9kDa。序列分析鉴定有以下结构特征。一个推断的切割氨基末端信号肽预测出现在Ala29后。此特征与肽1的序列一致，表明成熟的SIMA135起始于Phe30，其推测的分子量是90.1kDa。一个可能的跨膜结构域预测(Hartmann等，1989)定向SIMA135的羧基端位于细胞内，此跨膜结构域跨距666到686位残基(图1方框所示)。12个共有的N糖基化基序在图1中指出。一个共有的I型十六烷基化基序(IICCV)(Hansen等，1999)位于687到691位残基。存在5个PXXP基序(图1)，PXXP基序在其他蛋白质中被表明介导结合至Src同源区(SH)3(Pawson，1995；Mayer，2001)。5个酪氨酸残基(图1中圆圈所示)可能是磷酸化位点。两个邻近位置的酪氨酸残基(Tyr734和Tyr743)出现在结合SH2结构域(Songyang等，1993)的共有序列(YXXL/I)中。SIMA135与GenBank无重叠数据库中其他被证实的蛋白质缺少同源性。然而，SIMA135确实与推断的蛋白质CDCP1有很高的同源性，CDCP1通过翻译报道的核苷酸序列(Scherl-Mostageer等，2001)而确定。此外，SIMA135蛋白质的跨距221到348残基和417到544残基的两个区域被鉴定为与CUB(补体蛋白亚组分Clr/Cls、urchin胚生长因子和骨(bone)形态发生蛋白)结构域有低同源性(Bock和Beckmann，1993)。这些结构域据报道参与介导蛋白质-蛋白质相互作用(Chen和Wallis，2001；Sieron等，2000)。由Scherl-Mostageer和其合作者描述的第三个推测的CUB结构域跨越545到660位残基(Scherl-Mostageer等，2001)，其在我们用以检索SIMA135氨基酸序列和CDCP1推测的氨基酸序列所使用的检索算法的同源性检出阈值之下。
实施例XIVSIM135在正常和恶性细胞和组织中的表达模式来自12个正常人组织的polyA+RNA(每个泳道1μg)的Northern印迹分析通过用α32P标记的SIMA135 cDNA探针进行探测来完成。β-肌动蛋白mRNA的水平作为上样量被显示。12个正常人组织中SIMA135的表达模式通过Northern印迹分析检测，Northern印迹分析使用α32P标记的2.8kb SIMA135 cDNA探针进行杂交。一条大约6.0kb的条带在骨骼肌和结肠以最高水平检测到，其在肾、小肠、胎盘和肺中以较低水平表达。在外周血白细胞也出现了一条6.0kb的几乎不能检测到的信号。此外，一个相当弱的、约3.3kb的信号出现在骨骼肌、结肠、胎盘和肺中。SIMA135mRNA在脑、心、胸腺、脾或者肝中没有检测到。根据SIMA135和CDCP1cDNA7和基因组的序列对比(数据未显示)表明，通过Northern印迹分析检测到的两个SIMA135转录物非常可能是由使用SIMA-1353’UTR中备选的多聚腺苷酸化信号产生。较长的且较高表达的转录物被认为由使用一个更靠近3’的共有多聚腺苷酸化信号(核苷酸59507)产生，然而较短的且较低表达的转录物很有可能由使用一个位于核苷酸31867的低效率多聚腺苷酸化信号的变体产生。这些不同的转录物也有可能由SIMA135前体mRNA的备选剪接产生。
在16个人细胞系、14个人癌细胞系和2个正常人细胞系中，用mAb41-2探测的SIMA135蛋白质表达通过非还原条件下的Western印迹分析分析，其中每个细胞系等量的细胞裂解蛋白质(20μg)被电泳。SIMA135在转移性HEp3细胞中的表达最高，前列腺癌细胞系PC3和结肠癌细胞系DLD-1也显示出高的表达水平。中等水平的抗原在纤维肉瘤细胞系HT1080、胃癌细胞系MKN45和STKM-1、结肠癌细胞系SW480和非转移性前列腺癌细胞系LNCaP中被检测到。低水平的SIMA135在2个肝癌细胞系、两个乳腺癌细胞系、肺癌细胞系A549和肾杆状瘤细胞系G401中被检测到。SIMA135在正常人微血管内皮细胞和皮成纤维细胞中没有被检测到。在许多人癌细胞系中表达不同水平的SIMA135蛋白质，然而两个正常人细胞类型中没有表达该蛋白质。
实施例XVSIMA135是一种细胞表面的磷酸化的糖蛋白免疫组织化学被用来鉴定HEp3细胞以及瞬时转染SIMA135表达构建体的HeLa细胞中SIMA135的细胞定位。该表达构建体含有一个在蛋白质SIMA135C末端融合的FLAG表位。HEp3细胞和mAb41-2孵育在质膜上显出强烈的染色。瞬时转染FLAG标记的SIMA135的HeLa细胞中，当和mAb41-2孵育也在膜上显出同样强烈的染色。此外，SIMA135的C末端被确定是细胞内的，因为当瞬时转染的HeLa细胞用0.5％TritonX-100透化处理可允许抗体进入到FLAG标签定位的细胞内，并且当与抗FLAG表位的mAb孵育时，与抗FLAG mAb孵育的细胞显出了强烈的细胞膜染色，然而与抗FLAG mAb孵育的未透化细胞显出低或者接近背景的染色。未转染的HeLa细胞与mAb 41-2或者抗FLAG表位mAb孵育时，其基本上无染色。这些数据证实了推断的细胞表面定位和SIMA135的I型定位。在瞬时转染SIMA135 FLAG标签表达构建体的HeLa细胞中，用mAb 41-2和抗FLAG mAb染色观察到了一致结果，更加证实了SIMA135是mAb 41-2的靶抗原。
成熟的SIMA135理论上的分子量是90.1kDa。然而，用mAb 41-2检测到的该蛋白质的表观分子量是135kDa。瞬时转染SIMA135 FLAG标签表达构建体的HeLa细胞的细胞裂解物在酶活性优化的条件下，用N糖苷酶F进行处理以确定分子量上的差异是否应归于N糖基化。蛋白质在还原条件下通过Western印迹分析检测，其使用未处理的(-)和N糖苷酶F(PNGaseF)处理的(+)来自瞬时转染SIMA135 FLAGin表达构建体的HeLa细胞裂解物与抗FLAG表位mAb反应。属于SIMA135的条带被标明。一条非特异的交叉反应带在表观上位于80kDa。N糖苷酶F处理导致SIMA135在135kDa处的条带消失，取而代之的是一条位于约95到105kDa宽的较低分子量条带(数据未显示)。M+HEp3细胞的细胞裂解物也用mAb 41-2进行免疫共沉淀，并且用N糖苷酶F处理。按照此方法检测到的蛋白质也显示出相似的减小的分子量。因此，SIMA135表观分子量中多达30到40kDa应归于N糖基化，这与该蛋白质胞外区域中大量共有的糖基化位点相一致(图1，SEQ ID No.1)。
SIMA135的细胞内区含有5个酪氨酸残基(图1)。在还原条件下，用抗磷酸酪氨酸抗体对来自HEp3细胞裂解物与mAb 41-2免疫沉淀的蛋白质进行Western印迹分析，以确定这些残基每个是否都被磷酸化。免疫沉淀用来自HEp3和HeLa(阴性对照)细胞裂解物与正常小鼠IgG(nmIgG)或者mAb 41-2反应。免疫沉淀的蛋白质用抗磷酸酪氨酸抗体(Anti-P-Tyr)和mAb 41-2探测，以分别标明磷酸化的蛋白质和全长SIMA135的存在。细胞裂解蛋白质与mAb 41-2免疫沉淀。细胞裂解物制备自未处理的(-)或者用PP2(50μM)在37℃孵育30分钟的(+)HEp3细胞。抗磷酸酪氨酸抗体检测到了来自HEp3细胞与mAb 41-2免疫沉淀的135kDa蛋白质。当免疫沉淀的蛋白质用mAb 41-2探测时，同样的蛋白质条带也被检测到。Western印迹分析也对来自HeLa细胞的裂解物与mAb 41-2免疫沉淀的蛋白质，以及作为对照的HEp3细胞裂解物与正常小鼠IgG免疫沉淀的蛋白质实施。
当用抗磷酸酪氨酸抗体或mAb 41-2探测时，两种免疫沉淀都是无免疫反应性的，这证明了用HEp3细胞所观察到的免疫反应的特异性。参与SIMA135酪氨酸磷酸化的Src激酶家族成员用PP2进行检测，PP2是一种Src家族选择性酪氨酸激酶抑制剂(Hanke等，1996)。用抗磷酸酪氨酸抗体对来自HEp3细胞裂解物与mAb 41-2免疫沉淀的蛋白质所进行的Western印迹分析表明，用PP2处理30分钟的HEp3细胞与未处理的HEp3细胞相比，其SIMA135酪氨酸磷酸化的水平有明显的降低(约75％)。用mAb41-2对同样免疫沉淀的蛋白质所进行的Western印迹分析表明，大约等量的SIMA135蛋白质存在于膜上的两个泳道。这些数据表明，在HEp3细胞SIMA135酪氨酸磷酸化过程中，Src激酶家族成员参与其中。
许多整合的细胞表面蛋白质例如c-met(Wajih等，2002)和CD44(Goebeler等，1996)也以可溶性分子形式产生。用mAb 41-2探测进行的Western印迹分析用来检验HEp3细胞是否产生可溶形式的SIMA135。HEp3细胞培养物用PBS充分漂洗，然后用无血清(SF)培养基孵育20小时。条件培养基(CM)被收集并且细胞物质通过离心被除去，培养基然后浓缩10倍。抗体mAb 41-2在HEp3 SFCM中，检测到了一条约110kDa的免疫反应条带。来自HEp3细胞裂解物的细胞相关SIMA135在135kDa处被检测到。相反地，不产生SIMA135的未转染HeLa细胞，在细胞裂解物和浓缩的SFCM中都没有产生免疫反应条带。这些数据表明，HEp3细胞释放可溶形式的SIMA135并且可溶形式呈现为低分子量免疫反应性蛋白质。
实施例XVI正常和患癌结肠中SIMA135的表达免疫组织化学分析被用来确定正常和患癌结肠中SIMA135的体内定位。用mAb 41-2作为一级抗体对切片(6μm)进行染色。典型的正常结肠粘膜表明SIMA135的上皮表达(彩色照片中的棕红色，未显示)。结肠癌显示SIMA135异质的和广泛的表达。SIMA135由在结肠绒膜的侵入恶性腺体里的细胞表达。SIMA135由在结肠微绒膜的引流血管腔里的恶性上皮细胞表达。在正常结肠粘膜中，SIMA135由上皮细胞专有地表达，并且其均匀地出现在结肠腔衬细胞的腔和基底表面以及腺体隐窝衬细胞的顶端表面(数据未显示)。在隐窝的杯状细胞内含物和腺体腔内粘液中存在强烈的染色，这也证实了可溶形式的SIMA135是由结肠上皮细胞产生的想法。在结肠癌样品中，SIMA135广泛的和异质的表达，同时在恶性腺内的粘液中局部增强。许多侵入的癌细胞团被深度染色，这表明SIMA135存在于基部、顶生和侧生膜以及腺体粘液内。一个明显的趋势是癌细胞在结肠微绒毛深层更恶性的、侵入腺体处强烈的染色以及在引流血管中经常出现的强烈的SIMA135抗原阳性有联系。用二级抗体而不是一级抗体孵育的对照切片是无染色的。
实施例XVII遵循上文叙述的HeLa细胞转染方法，7个不同的细胞系被用于研究和监视SIMA135 mRNA的表达。在这些细胞系中，克隆3号产生显著的和合适的碱基对信号。
这些细胞系在体外研究中的输送能力、在SCID小鼠中转移和产生瘤的能力以及在SCIP小鼠中寄居次生器官的能力也被研究。克隆3号被确定为能够从疏松的膜和体内脱离和移行，并且寄居次生器官。这些结果证明了SIMA135是一种操纵转移的关键的和中枢的因子。转化的克隆3号细胞作为鉴定促进或者抑制/减少恶性细胞转移的试剂的细胞系统也是有用的。
按照上文的传染方法，7个不同的细胞系被用来研究SIMA135表达的效果。这些细胞系在图8中得到图解。遵循上文所述的SIMA135 mRNA检测的分析方法，这7个细胞系得到分析。图7表明监视SIMA135 mRNA的这7个细胞系RT-PCR分析的结果。对照和无关的RT-PCR数据在图1的左手部分。图的右手部分显示了一条用SIMA135特异引物产生的600bp扩增信号。未转化的HeLa细胞无信号得到，HeLa 4号也无信号得到，现在被称为克隆3号的Eff(2)3号产生一条实质的600bp信号。这些数据表明克隆3号细胞有升高水平的SIMA135 mRNA。
这7个细胞系的样品被裂解，并且细胞内含物按照标准Western印迹方法，通过与MoAb 41-2结合进行分析以确定SIMA135的存在。Western印迹的裂解物制备自7个不同细胞系，并用MoAb 41-2探测。结果表明克隆3号(Eff(2)3号)产生大量水平的SIMA135免疫反应性蛋白质。此克隆的细胞系比我们的高转移性HEp-3细胞系M+产生更多的SIMA135蛋白质。克隆4号和亲本HeLa细胞不产生可检测的SIMA135蛋白质。
一旦确定SIMA135阴性细胞和SIMA135过表达细胞已获得，这些细胞被用于试验它们的恶性潜力，即在SCID小鼠中生长和形成瘤的能力以及在SCID小鼠中寄居次生器官的能力。表I是两个单独试验类型的总结表格A显示实验转移性测定法的结果，其中目的细胞被直接接种(i.v.)到鼠的尾部静脉。几星期以后，被接种小鼠的所选器官被用来与分析人细胞(人DNA)在总器官(小鼠DNA)背景中的存在。分析用实时PCR完成，其所用的人特异性引物依据下列参考文献所述的alu重复序列(A.Zijlstra等，Cancer Research，2002)。表格A显示的结果表明克隆3号细胞在小鼠的肺和骨髓中寄居和/或生长，其水平大量地超过相似地接种克隆4号细胞的小鼠的水平。克隆3号显然不遍及蔓延所接种的小鼠，因为在此所显示的另外一个器官即胰腺仅含有接近背景水平的克隆3号和克隆4号细胞。
表1的表格B包括标准的自发转移测定法的结果，其中所用的细胞被皮下地接种到SCID小鼠侧腹，瘤允许发展到100mg，然后所选的器官(通常是肺)被用来分析次生转移沉着物。次生转移通过同样的对人DNA特异的实时aluPCR方法测量。结果表明克隆3号和克隆4号形成大约相等尺寸的初生瘤(毫克重量-mg)。然而，克隆3号显示转移到肺的水平至少多于克隆4号10倍。其或许超过10倍，因为克隆4号肺中的细胞水平接近背景(50-100个细胞)，即几乎不能检测到的水平。
结果表明，导入或者表达SIMA135蛋白质到正常地不产生该蛋白质的细胞可赋予这些细胞恶性特性。为了表征这两个克隆的特性，这可能表明为什么它们获得恶性潜力，我们对这些克隆进行了一些细胞生物学实验。细胞生长和增殖试验在按照上文所述方法通过细胞培养物实施。这两种克隆的体外生长是相似的，并且也与亲代的HeLa细胞相似。然而，单独的增殖速率不是它们有差别的恶性潜力的原因。
也进行了跨孔迁移试验，其中目的细胞被强制地迁移通过一个插入在两个室之间的孔过滤器得到完成。试验用培养基进行。结果在图10显示。上室包含培养基中的细胞，而下室包括含有胎牛血清(FCS)的浓缩培养基以吸引上室的迁移细胞。结果表明克隆3号细胞比克隆4号迁移性大。这可能是SIMA135过表达细胞获得的特性之一，这在它们的恶性潜力中帮助了它们。初步的数据也表明，克隆3号细胞显得比克隆4号细胞对用化合物ara C化学诱导的细胞程序性死亡有更强的抵抗力。
表I两个HeLa克隆的体内恶性；克隆4号(SIMA-135阴性)和克隆3号(SIMA135过表达)接种到SCID小鼠
*基于对提取自静脉内接种2周和皮下接种4周后的离体器官的总DNA实施的实时alu PCR参考文献Adham IM，KlemmU，Maier WM和Engel W.，(1990)，Hum.Genet.，84125-128.
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所有刊物、专利和专利申请此处引用作为参考。虽然在上述的说明书中，已描述的本发明涉及其优选的实施方案，给出的许多详情是用于阐明目的，本领域的技术人员明白的，本发明可有其它的实施方案，并且此处描述的某一详情可在没有脱离本发明基本原则的基础上被相当大的改动。
序列表<110>诺瓦提斯公司<120>在人转移性肿瘤细胞中表达的糖蛋白抗原SIMA135<130>4-33290<160>9<170>PatentIn版本3.2<210>1<211>836<212>PRT<213>人<400>1Met Ala Gly Leu Asn Cys Gly Val Ser Ile Ala Leu Leu Gly Val Leu1 5 10 15Leu Leu Gly Ala Ala Arg Leu Pro Arg Gly Ala Glu Ala Phe Glu Ile20 25 30Ala Leu Pro Arg Glu Ser Asn Ile Thr Val Leu Ile Lys Leu Gly Thr35 40 45Pro Thr Leu Leu Ala Lys Pro Cys Tyr Ile Val Ile Ser Lys Arg His50 55 60Ile Thr Met Leu Ser Ile Lys Ser Gly Glu Arg Ile Val Phe Thr Phe65 70 75 80Ser Cys Gln Ser Pro Glu Asn His Phe Val Ile Glu Ile Gln Lys Asn85 90 95
Ile Asp Cys Met Ser Gly Pro Cys Pro Phe Gly Glu Val Gln Leu Gln100 105 110Pro Ser Thr Ser Leu Leu Pro Thr Leu Asn Arg Thr Phe Ile Trp Asp115 120 125Val Lys Ala His Lys Ser Ile Gly Leu Glu Leu Gln Phe Ser Ile Pro130 135 140Arg Leu Arg Gln Ile Gly Pro Gly Glu Ser Cys Pro Asp Gly Val Thr145 150 155 160His Ser Ile Ser Gly Arg Ile Asp Ala Thr Val Val Arg Ile Gly Thr165 170 175Phe Cys Ser Asn Gly Thr Val Ser Arg Ile Lys Met Gln Glu Gly Val180 185 190Lys Met Ala Leu His Leu Pro Trp Phe His Pro Arg Asn Val Ser Gly195 200 205Phe Ser Ile Ala Asn Arg Ser Ser Ile Lys Arg Leu Cys Ile Ile Glu210 215 220Ser Val Phe Glu Gly Glu Gly Ser Ala Thr Leu Met Ser Ala Asn Tyr225 230 235 240Pro Glu Gly Phe Pro Glu Asp Glu Leu Met Thr Trp Gln Phe Val Val245 250 255Pro Ala His Leu Arg Ala Ser Val Ser Phe Leu Asn Phe Asn Leu Ser260 265 270
Asn Cys Glu Arg Lys Glu Glu Arg Val Glu Tyr Tyr Ile Pro Gly Ser275 280 285Thr Thr Asn Pro Glu Val Phe Lys Leu Glu Asp Lys Gln Pro Gly Asn290 295 300Met Ala Gly Asn Phe Asn Leu Ser Leu Gln Gly Cys Asp Gln Asp Ala305 310 315 320Gln Ser Pro Gly Ile Leu Arg Leu Gln Phe Gln Val Leu Val Gln His325 330 335Pro Gln Asn Glu Ser Asn Lys Ile Tyr Val Val Asp Leu Ser Asn Glu340 345 350Arg Ala Met Ser Leu Thr Ile Glu Pro Arg Pro Val Lys Gln Ser Arg355 360 365Lys Phe Val Pro Gly Cys Phe Val Cys Leu Glu Ser Arg Thr Cys Ser370 375 380Ser Asn Leu Thr Leu Thr Ser Gly Ser Lys His Lys Ile Ser Phe Leu385 390 395 400Cys Asp Asp Leu Thr Arg Leu Trp Met Asn Val Glu Lys Thr Ile Ser405 410 415Cys Thr Asp His Arg Tyr Cys Gln Arg Lys Ser Tyr Ser Leu Gln Val420 425 430Pro Ser Asp Ile Leu His Leu Pro Val Glu Leu His Asp Phe Ser Trp435 440 445
Lys Leu Leu Val Pro Lys Asp Arg Leu Ser Leu Val Leu Val Pro Ala450 455 460Gln Lys Leu Gln Gln His Thr His Glu Lys Pro Cys Asn Thr Ser Phe465 470 475 480Ser Tyr Leu Val Ala Ser Ala Ile Pro Ser Gln Asp Leu Tyr Phe Gly485 490 495Ser Phe Cys Pro Gly Gly Ser Ile Lys Gln Ile Gln Val Lys Gln Asn500 505 510Ile Ser Val Thr Leu Arg Thr Phe Ala Pro Ser Phe Arg Gln Glu Ala515 520 525Ser Arg Gln Gly Leu Thr Val Ser Phe Ile Pro Tyr Phe Lys Glu Glu530 535 540Gly Val Phe Thr Val Thr Pro Asp Thr Lys Ser Lys Val Tyr Leu Arg545 550 555 560Thr Pro Asn Trp Asp Arg Gly Leu Pro Ser Leu Thr Ser Val Ser Trp565 570 575Asn Ile Ser Val Pro Arg Asp Gln Val Ala Cys Leu Thr Phe Phe Lys580 585 590Glu Arg Ser Gly Val Val Cys Gln Thr Gly Arg Ala Phe Met Ile Ile595 600 605Gln Glu Gln Arg Thr Arg Ala Glu Glu Ile Phe Ser Leu Asp Glu Asp610 615 620
Val Leu Pro Lys Pro Ser Phe His His His Ser Phe Trp Val Asn Ile625 630 635 640Ser Asn Cys Ser Pro Thr Ser Gly Lys Gln Leu Asp Leu Leu Phe Ser645 650 655Val Thr Leu Thr Pro Arg Thr Val Asp Leu Thr Val Ile Leu Ile Ala660 665 670Ala Val Gly Gly Gly Val Leu Leu Leu Ser Ala Leu Gly Leu Ile Ile675 680 685Cys Cys Val Lys Lys Lys Lys Lys Lys Thr Asn Lys Gly Pro Ala Val690 695 700Gly Ile Tyr Asn Gly Asn Ile Asn Thr Glu Met Pro Arg Gln Pro Lys705 710 715 720Lys Phe Gln Lys Gly Arg Lys Asp Asn Asp Ser His Val Tyr Ala Val725 730 735Ile Glu Asp Thr Met ValTyr Gly His Leu Leu Gln Asp Ser Ser Gly740745 750Ser Phe Leu Gln Pro Glu Val Asp Thr Tyr Arg Pro Phe Gln Gly Thr755 760 765Met Gly Val Cys Pro Pro Ser Pro Pro Thr Ile Cys Ser Arg Ala Pro770 775 780Thr Ala Lys Leu Ala Thr Glu Glu Pro Pro Pro Arg Ser Pro Pro Glu785 790 795 800
Ser Glu Ser Glu Pro Tyr Thr Phe Ser His Pro Asn Asn Gly Asp Val805 810 815Ser Ser Lys Asp Thr Asp Ile Pro Leu Leu Ser Thr Gln Glu Pro Met820 825 830Glu Pro Ala Glu835<210>2<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>2tccccaccgt cgttttcc 18<210>3<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>3ggttaggaac acggacgggtg 21<210>4<211>20<212>PRT<213>人<220>
<221>misc_feature
<222>(18)..(18)<223>Xaa可为任一天然存在的氨基酸<400>4Phe Glu Ile Ala Leu Pro Arg Glu Ser Gln Ile Thr Val Leu Gly Ile1 5 10 15Lys Xaa Gly Thr20<210>5<211>19<212>PRT<213>人<220>
<221>misc_feature<222>(17)..(17)<223>Xaa可为任一天然存在的氨基酸<400>5Phe Glu Ile Ala Leu Pro Arg Glu Ser Asn Ile Thr Val Leu Ile Lys1 5 10 15Xaa Gly Thr<210>6<211>13<212>PRT<213>人<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(4)<223>Xaa可为任一天然存在的氨基酸
<400>6Xaa Xaa Xaa Xaa Ile Pro Gly Ser Thr Thr Asn Pro Glu1 5 10<210>7<211>13<212>PRT<213>人<400>7Val Glu Tyr Tyr Ile Pro Gly Ser Thr Thr Asn Pro Glu1 5 10<210>8<211>12<212>PRT<213>人<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(1)<223>Xaa可为任一天然存在的氨基酸<220>
<221>misc_feature<222>(3)..(3)<223>Xaa可为任一天然存在的氨基酸<400>8Xaa Tyr Xaa Leu Gln Val Pro Ser Asp Ile Leu His1 5 10<210>9<211>12<212>PRT<213>人
权利要求
1.具有SEQ ID NO1的蛋白质，其为糖基化的或者非糖基化的。
2.糖基化的或者非糖基化的SEQ ID NO1的片段，其中所述片段含有525位氨基酸和/或827位氨基酸。
3.根据权利要求1所述的SEQ ID NO1的蛋白质的变体，其中所述的变体中525位氨基酸是精氨酸和/或827位氨基酸是丝氨酸。
4.特异地结合根据权利要求1所述的蛋白质的抗体，其中所述的抗体不是mAb 41-2。
5.特异地结合根据权利要求2所述的片段的抗体，其中所述的抗体不是mAb 41-2。
6.特异地结合根据权利要求3所述的变体的抗体，其中所述的抗体不是mAb 41-2。
7.根据权利要求5或6所述的抗体，其中所述的抗体是单克隆或者多克隆抗体。
8.根据权利要求5或6所述的抗体，其用于治疗性治疗人和动物体。
9.根据权利要求5或6所述的抗体，其用于制备抑制哺乳动物中癌细胞转移的药物。
10.根据权利要求9所述的抗体，其中的癌细胞是鳞状细胞癌细胞、前列腺癌细胞、结肠癌细胞、纤维肉瘤、胃癌细胞、肝癌细胞、乳腺癌细胞、肺癌细胞和肾杆状癌细胞。
11.根据权利要求10所述的抗体，其中的癌细胞是Hep3细胞。
12.药物组合物，其包含根据权利要求5或6所述的抗体以及可药用载体。
13.试剂盒，其包含根据权利要求5或6所述的抗体以及包装材料。
14.根据权利要求5或6所述的抗体用于癌症的诊断方法，其包括(a)将根据权利要求5到8中任意一项所述的抗体与获自哺乳动物的试验样品接触，以及；(b)确定抗体与试验样品的结合是否比抗体与非癌组织的对照样品的结合程度更大。
15.根据权利要求5或6所述的抗体用于癌症的诊断方法，其包括(a)观察根据任何一项权利要求所述的抗体与组织切片的结合并且(b)确定是否所述抗体导致组织样品的异种染色，是否所述抗体表明SIMA135的广泛表达遍及组织样品，或者是否所述抗体染色结肠浆膜的恶性腺体。
16.根据权利要求5或6所述的抗体用于确定试验样品是否含有转移性细胞，其包括(a)将试验样品与根据权利要求5到8中任意一项所述的抗体接触，并且，(b)将抗体与试验样品的结合以及抗体与含有非转移性Hep3细胞的对照样品的结合进行比较，其中与抗体与对照样品的结合相比较，抗体与试验样品的结合增强表明试验样品含有转移性HEp3细胞。
17.根据权利要求5或6所述的抗体用于确定试剂的癌转移调控能力，其包括该试剂与表达SIMA-135的细胞组合以产生受试细胞，确定自受试细胞的SIMA-135表达是否大于或者小于该细胞与此试剂组合前细胞表达的量。
18.根据权利要求5或6所述的抗体用于确定候选试剂是否调控细胞产生SIMA-135，其包括(a)将试验细胞与候选试剂接触，并且(b)确定相对于对照的SIMA135产生，试验细胞的SIMA135产生是否增加或者减少。
全文摘要
本发明提供了一种这样的蛋白质，其为一种肿瘤标记蛋白质。此蛋白质可用于制备结合此肿瘤标记蛋白质的抗体。这些抗体可用于减少或者消除产生此肿瘤标记蛋白质的癌细胞转移。此外，本发明提供了可用于诊断癌症和癌细胞转移的方法。
文档编号A61K39/395GK1761750SQ200480007463
公开日2006年4月19日 申请日期2004年2月18日 优先权日2003年2月19日
发明者J·P·奎格利, J·D·霍珀, J·E·泰斯塔 申请人:诺瓦提斯公司, 斯克里普斯研究所