微流化水包油乳剂及疫苗组合物的制作方法

专利名称：微流化水包油乳剂及疫苗组合物的制作方法
技术领域：
本发明总的涉及疫苗领域，特别是增强兽医动物的免疫应答的佐剂制剂。具体而言，本发明涉及亚微米(submicron)水包油乳剂作为增强抗原免疫原性的疫苗佐剂的用途。本发明提供亚微米水包油乳液制剂、包含掺入这种乳剂中的抗原的疫苗组合物及这种乳剂与疫苗的制备方法。
背景技术：
细菌、病毒、寄生虫与支原体感染在兽医动物(如牛、猪及陪伴动物)中广泛地传播。由这些感染因子造成的疾病经常对抗微生物医药治疗有抗性，使得无有效的治疗方法。结果，逐渐使用疫苗方式控制兽医动物的感染性疾病。在化学灭活或适当的遗传操作后，全感染病原体可适用于疫苗制剂。或者，病原体的蛋白质亚单位可在重组表现体系中表达且纯化而用于疫苗制剂。
佐剂通常指增加对抗原的体液和/或细胞免疫应答的任何材料。传统疫苗由已被杀死的病原微生物粗制品组成，而且伴随病原微生物培养的杂质可作为佐剂以增强免疫应答。然而，在使用病原微生物或纯化蛋白质亚单位的均质制品作为抗原进行免疫接种时，这种抗原引发的免疫性差，加入特定外源材料作为佐剂因而变得必要。此外，合成及亚单位疫苗在制造上昂贵。因此，藉助于佐剂，仅需要较小剂量的抗原来刺激免疫应答，从而节省疫苗的制造成本。
已知佐剂以多种不同方式作用以增强免疫应答。许多种佐剂修改与免疫应答相关的细胞因子网络。即使在其不与抗原在一起时这些免疫调节性佐剂也可发挥其作用。免疫调节性佐剂通常造成特定细胞因子的总体上调，及导致细胞Th1和/或体液Th2应答的其它细胞因子的伴随下调。
一些佐剂具有保存抗原的构象完整性的能力，使得抗原可有效呈递给适当的免疫效应细胞。作为此种佐剂制剂保存抗原构象的结果，疫苗可具有增加的储存寿命，如免疫刺激复合物(ISCOM)所示。Ozel M.等人Quarternary Structure of the ImmunestimmulatingComplex(Iscom)，J.of Ultrastruc.and Molec.Struc.Res.102，240-248(1989)。
一些佐剂具有在注射部位处保留抗原成为贮藏所(depot)的性质。作为此贮藏所效应的结果，抗原不因肝清除而快速地失去。铝盐及油包水乳剂经此贮藏所效应作用较短的持续时间。例如，通过使用为油包水乳剂的弗氏完全佐剂(FCA)可获得长期贮藏所。FCA通常保留在注射部位处，直到生物降解使得因抗原呈递细胞能移除抗原。
基于其物理性质，佐剂可分成两大类，即粒状佐剂及非粒状佐剂。粒状佐剂作为微粒而存在。免疫原可掺入或结合此微粒。铝盐、油包水乳剂、水包油乳剂、免疫刺激复合物、脂质体及毫微粒与微粒为粒状佐剂的实例。非粒状佐剂通常为免疫调节剂且其通常与粒状佐剂联合使用。胞壁酰二肽(自分枝杆菌(Mycobacteria)提取的肽聚糖的佐剂活性成分)、非离子性嵌段共聚物、皂苷(自皂树(Quillajasaponaria)的树皮提取的三萜类的复杂混合物)、脂质A(葡糖胺的二糖，其具有两个磷酸基团及五或六个长度通常为C12至C16的脂肪酸链)、细胞因子、碳水化合物聚合物、衍生的多糖及细菌毒素(如霍乱毒素及大肠杆菌不稳定毒素(LT))为非粒状佐剂的实例。
一些最为熟知的佐剂为非粒状免疫调节剂与可赋予佐剂制剂以储藏所效应的粒状材料的组合。例如，FCA结合了结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)成分的免疫调节性质与油乳剂的短期储藏所效应。
油乳剂已长期用作为疫苗佐剂。Le Moignic与Pinoy在1916年发现，已被杀死的鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)于矿物油中的悬浮液增加免疫应答。继而在1925年，Ramon描述了淀粉油作为一种增加对白喉类毒素的抗毒素反应的物质。然而油乳剂没有流行起来，直到1937年Freund提出现在已知为弗氏完全佐剂(FCA)的佐剂制剂。FCA为一种由矿物(石蜡)油混合已被杀死的分枝杆菌与阿拉塞A(Arlacel A)组成的油包水乳剂。阿拉塞A主要为二缩甘露醇单油酸酯且用作为乳化剂。虽然FCA在诱发抗体应答方面是优异的，其造成严重的疼痛、脓肿形成、发烧及肉芽肿性炎症。为了避免这些不希望的副反应，开发了不完全弗氏佐剂(IFA)。IFA的组成类似FCA，除了无分枝杆菌成分。IFA通过注射部位处的贮藏所制剂起作用且缓慢地释放抗原刺激抗体产生细胞。
另一种改进FCA的方法是基于以生物相容性油替换矿物油会有助于消除在注射部位与FCA有关的反应的观点。亦据信乳剂应为水包油而非油包水，因为后者在注射部位处产生持续长时间的贮藏所。Hilleman等人描述了一种油基佐剂“Adjuvant 65”，其由86％的花生油、10％的作为乳化剂的阿拉塞A及4％的作为稳定剂的单硬脂酸铝组成。Hilleman，1966，Prog.Med.Virol.8131-182；Hilleman与Beale，1983，于New Approaches to Vaccine Development(编者Bell，R.与Torrigiani，G.)，Schwabe，Basel。在人体中，Adjuvant 65安全且强效，但是呈现较IFA低的佐剂性。不过Adjuvant 65的应用因与某些批次疫苗对人类的致反应性及在使用纯化或合成乳化剂代替阿拉塞A时佐剂性降低而中断。美国专利第5,718,904与5,690,942号教导，为了改善安全性的目的，水包油乳剂中的矿物油可以替换为可代谢性油。
除了佐剂性及安全性，乳剂的物理外观亦为重要的商业考量。物理外观取决于乳剂的稳定性。乳状液分层、沉积及聚结为乳剂不稳定的指示。乳状液分层是在乳剂的油相与水相具有不同的比重时发生。乳状液分层亦在乳剂的起初小滴大且乳剂小滴不具有任何布朗运动时发生。在小滴大时有界面破裂的趋势且小滴凝聚成大颗粒。乳剂稳定性由许多因素决定，如所使用乳化剂的本性及量、乳剂中的小滴大小及油相与水相之间的密度差异。
乳化剂通过降低界面自由能且对小滴凝聚制造物理或静电屏障而促进分散小滴的稳定化。已使用非离子型及离子型去污剂作为乳化剂。非离子型乳化剂在界面处定向且产生相当大的结构，其导致分散小滴的立体回避。阴离子型或阳离子型乳化剂因吸引抗衡离子而诱发电双层形成；此双层斥力造成小滴在其接近时彼此互斥。
除了使用乳化剂，亦可经由藉机械装置降低乳剂的小滴大小而实现乳剂稳定性。典型地，已使用推进混合器、涡轮转动器、胶体研磨机、均化器及超声波振荡器制造乳剂。微流化为另一种增加乳剂中小滴大小均匀性的方式。微流化可产生具有亚微米范围的一致粒度的精巧的、物理上稳定的乳剂。除了增加乳剂的稳定性，微流化的过程还允许终末过滤，其为确保最终产物无菌性的优选方式。此外，亚微米油粒可自注射部位送入淋巴管然后至引流链的淋巴结、血液及脾脏。如此降低在注射部位处建立油性贮藏所(其可产生局部炎症及显著的注射部位反应)的可能性。
微流化器现已市售。乳剂形成是在微流化器中因两股流化流在相互作用室内以高速相互作用而发生。微流化器为空气或氮驱动且可以超过20,000psi内压操作。美国专利第4,908,154号教导了微流化器用于得到基本上无任何乳化剂的乳剂的用途。
许多种亚微米水包油佐剂制剂已叙述于文献中。美国专利第5,376,369号教导一种已知为Syntax佐剂制剂(SAF)的亚微米水包油乳剂佐剂制剂。SAF含鲨烯或鲨烷作为油成分、乳剂形成量的Pluronic L121(聚氧丙烯-聚氧乙烯)嵌段聚合物及免疫强化量的胞壁酰二肽。鲨烯为一种在许多组织中，特别是在鲨鱼及其它鱼类的肝脏中发现的胆固醇的直链烃前体。鲨烷是通过将鲨烯氢化而制备且完全饱和。鲨烯与鲨烷均可代谢且具有良好的毒理学研究记录。鲨烯或鲨烷乳剂已用于人类癌症疫苗，其副作用温和并具有期望的效力。例如，参见Anthony C.Allison，1999，Squalene and Squalane emulsions asadjuvants，Methods 1987-93。
美国专利第6,299,884号及国际专利公开WO 90/14837号教导聚环氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物对于亚微米水包油乳剂的形成不是必需。此外，这些参考资料教导无毒的可代谢性油的用途，而且在其乳液制剂中明确地排除矿物油及毒性石油蒸馏油的应用。
美国专利第5,961,970号教导另一种用作为疫苗佐剂的亚微米水包油乳剂。在此专利所述的乳剂中，疏水性成分选自中链甘油三酯油、植物油及其混合物。包括于此乳剂中的表面活性剂可为天然的生物相容性表面活性剂，如磷脂(例如，卵磷脂)，或医药可接受的非天然表面活性剂，如TWEEN-80。相对于在乳剂已独立地及外部地形成后混合抗原与乳剂，此专利亦教导在乳剂形成时将抗原掺入乳剂中。
美国专利第5,084,269号教导含卵磷脂组合矿物油的佐剂制剂造成在宿主动物内的刺激性降低，同时诱发增加的系统免疫性。由美国专利第5,084,269号得到的佐剂制剂以商标名AMPHIGEN市售用于兽医疫苗。AMPHIGEN制剂是由微团-被卵磷脂包围的油小滴制成。这些微团允许较传统油基佐剂更多的全细胞抗原附着。此外，相较于其它含油佐剂的疫苗制剂，其一般含10％至20％的油，基于AMPHIGEN的疫苗制剂含2.5至5％矿物油的低油含量。其低油含量使基于此佐剂的疫苗制剂对注射部位的组织刺激性较小，造成较少的损害及在屠宰时较少的修整。此外，包围油小滴的卵磷脂包层进一步减轻注射部位反应而得到安全且有效的疫苗。
AMPHIGEN制剂被用作为许多种兽医疫苗中的佐剂，在短期及长期储存期间及重组时需要维持疫苗产品的物理外观。此外，恰在注射前将冻干抗原与预制的佐剂制剂混合。此实践操作并不总能确保抗原在水包油乳剂内均匀分布，而且乳剂外观可能未如所需。此外，静置后，均化乳剂可显示出相分离。因此，仍存在对长期贮存不显示相分离的稳定佐剂制剂的需求。一种防止相分离的方式为降低乳剂的小滴大小及增加颗粒均匀性。虽然可代谢性油基乳液制剂的微流化过程已见于文献中，如AMPHIGEN的水包油乳剂的微流化尚未进行。
在本发明中，已使用微流化使卵磷脂包围的矿物油小滴的大小为亚微米大小。出乎意料地，本发明人已发现，以包含卵磷脂与油的混合物的水包油乳剂为佐剂的疫苗制剂的微流化不仅改善制剂的物理外观，而且还增强制剂的免疫效果。微流化制剂的特性亦具有改进的安全性的特征。
发明概述本发明人已出乎意料地发现，基于不可代谢性油的水包油乳剂的佐剂活性及安全性可经微流化而改进。掺入微流化乳剂的抗原是稳定的，即使抗原在微流化前内部地掺入乳剂中时亦如此。
因此，在一个具体实施方案中，本发明提供可用作为疫苗佐剂的亚微米水包油乳液制剂。本发明的亚微米水包油乳剂是由不可代谢性油、至少一种表面活性剂及水性成分组成，其中油是以亚微米范围的平均油小滴大小分散于水性成分中。优选不可代谢性油为轻质矿物油。优选表面活性剂包括卵磷脂、Tween-80与SPAN-80。
本发明提供的优选水包油乳剂是由AMPHIGEN制剂组成。
本发明的水包油乳剂可包括适当及需要的另外的成分，包括防腐剂、渗透剂、生物粘着分子及免疫刺激分子。优选的免疫刺激分子包括，例如，Quil A、胆固醇、GPI-0100、溴化二甲基二-十八烷基铵(DDA)。
在另一个具体实施方案中，本发明提供制备亚微米水包油乳剂的方法。依照本发明，将各种乳剂成分混合在一起，包括油、一种或多种表面活性剂、水性成分及任何适用于此乳剂的其它成分。使此混合物经受初步乳化过程以形成水包油乳剂，然后将其送经微流化器而得到具有直径小于1微米，优选平均小滴大小小于0.5微米的小滴的水包油乳剂。
在另一个具体实施方案中，本发明提供含抗原及上述亚微米水包油乳剂的疫苗组合物。抗原外部地或内部地掺入乳剂中，优选内部地。
可包括于本发明的疫苗组合物中的抗原可为细菌、真菌或病毒抗原或其组合。抗原可为灭活的全细胞或部分细胞或病毒制品的形式或藉常规蛋白质纯化、基因工程技术或化学合成而得到的抗原性分子的形式。
在进一步具体实施方案中，本发明提供制备含一种或多种抗原组合亚微米水包油乳剂的疫苗组合物的方法。
在制备本发明的疫苗组合物时，抗原可内部地(例如，在微流化前)或外部地(例如，在微流化后)与水包油乳剂的成分合并。优选为，抗原内部地组合水包油乳剂的成分。
在另一个具体实施方案中，本发明提供含微囊化抗原及上述亚微米水包油乳剂的疫苗组合物，其中微囊化抗原外部地组合乳剂。
附图简要说明

图1描绘非微流化疫苗组合物的分批制备过程。在此过程中，将各种疫苗成分加入左方的添加容器中且最后泵入掺合容器中，其中成分经简单机械装置混合在一起。
图2描绘含内部地掺入的抗原的微流化疫苗组合物的制备过程。将各种疫苗成分加入添加容器中并转移至乳剂前掺合单元以经简单机械装置混合。继而使乳剂通过微流化器且在微流化后室中收集。
图3描绘基于非微流化AMPHIGEN制剂的疫苗、基于微流化AMPHIGEN制剂的疫苗及实验台掺合疫苗制品的小滴大小分布。
图4显示在微流化疫苗制品中无相分离。
图5描绘内部地掺入基于微流化AMPHIGEN制剂的疫苗制品(A907505)及三种基于对照、非微流化AMPHIGEN制剂的疫苗制品(A904369、A904370与A904371)中的抗原稳定性的比较。将所有四种疫苗制品在4℃储存2年。在储存期间的不同时间点(0、6、12或24个月)，使用所有四种制剂对三个月大的乳牛接种。接种在第0及21天以2毫升疫苗剂量完成，并在第二次接种后2周采集血清。在各血清样品中测定对BVD II型病毒的中和抗体滴度。此数据是以5只动物的几何平均值给出的。
图6显示在施用微流化及非微流化疫苗前后牛的最小二乘方平均直肠温度。T01安慰剂组-单剂量；T02安慰剂组-双剂量；T03非微流化制剂-单剂量；T04非微流化制剂-双剂量；T05微流化制剂-单剂量；T06微流化制剂-双剂量。
图7描绘在施用非微流化及微流化疫苗制剂后在牛中观察到的最小二乘方平均注射部位反应体积。T03非微流化制剂-单剂量；T04非微流化制剂-双剂量；T05微流化制剂-单剂量；T06微流化制剂-双剂量。
图8描绘在接种含重组PauA抗原与大肠杆菌全细胞抗原的各种疫苗制剂后，对得自乳房链球菌的重组PauA抗原的几何平均IgG滴度。
图9描绘在接种含重组PauA抗原与大肠杆菌全细胞抗原的各种疫苗制剂后，对得自乳房链球菌的大肠杆菌全细胞抗原的几何平均IgG滴度。
图10A及10B描绘微流化Amphigen制剂在初始制造(图10A)及在制造后22个月(图10B)的粒度分布。
发明详述本发明人已出乎意料地发现，以水包油乳剂(包含卵磷脂与矿物油的混合物)为佐剂的疫苗制剂的微流化不仅改善疫苗制剂的物理外观，亦增强疫苗制剂的免疫效果。微流化疫苗制剂的特征亦为改进的安全性。
基于这些发现，本发明提供可在疫苗组合物中用作为佐剂的亚微米水包油乳剂。亦提供使用微流化器制造这些亚微米水包油乳剂的方法。此外，本发明提供其中抗原与亚微米水包油乳剂组合的亚微米疫苗组合物。亦提供制造此疫苗组合物的方法。本发明进一步提供含微囊化抗原组合亚微米水包油乳剂的疫苗组合物，及制造此疫苗的方法。
为了公开清楚，而且不为限制的方式，本发明的详细说明分成以下小部分，描述或例示说明本发明的某些特征、具体实施方案或应用。亚微米水包油乳剂在一个具体实施方案中，本发明提供可用作为疫苗佐剂的亚微米水包油乳液制剂。本发明的亚微米水包油乳剂增强疫苗组合物中抗原的免疫原性，对动物施用安全且在储存时稳定。
本发明的亚微米水包油乳剂是由不可代谢性油、至少一种表面活性剂及水性成分组成，其中油以亚微米范围的平均油小滴大小分散于水性成分中。
“亚微米”表示小滴为小于1μm(微米)的大小且平均(average)或均值(mean)油小滴大小小于1μm。优选为，乳剂的平均小滴大小小于0.8微米；更优选为小于0.5微米；而且甚至更优选为小于0.4微米，或约0.1-0.3微米。
“平均小滴大小”定义为粒度的体积分布内的体积平均直径(VMD)粒度。VMD是由各粒径乘以此大小的所有颗粒的体积并加总而计算。然后将其除以所有颗粒的总体积。
在此使用的术语“不可代谢性油”指投以乳剂的动物对象体无法代谢的油。
在此使用的术语“动物”及“动物对象”指所有非人类的动物，例如，包括牛、羊及猪。
适宜用于本发明乳剂的不可代谢性油包括烷烃、烯烃、炔烃及其对应酸与醇、其醚与酯及其混合物。优选为，油的各个化合物为轻烃化合物，即，此类成分具有6至30个碳原子。油可合成地制备或由石油产品纯化。用于本发明乳剂的优选不可代谢性油包括，例如，矿物油、石蜡油及环烷烃。
术语“矿物油”指经蒸馏技术得自矿脂的液态烃的混合物。此术语与“液化石蜡”、“液体石蜡”及“白色矿物油”同义。此术语还意图包括“轻质矿物油”，即，藉矿脂蒸馏类似地得到，但是具有比白色矿物油稍低的比重的油。例如，参见Remington’s Pharmaceutical Sciences，第18版，(Easton，Pa.Mack Publishing Company，1990，第788与1323页)。矿物油可得自各种商业来源，例如，J.T.Baker(Phillipsburg，PA)、USB Corporation(Cleveland，OH)。优选的矿物油为以商标名DRAKEOL市售的轻质矿物油。
一般而言，本发明亚微米乳剂的油成分是以1％至50％体积比的量；优选为10％至45％的量；更优选为20％至40％的量存在。
本发明的水包油乳剂一般包括至少一种(即，一种或多种)表面活性剂。表面活性剂与乳化剂(所述术语在此可互换使用)为稳定油小滴表面且将油小滴维持在所需大小内的试剂。
适宜用于本发明乳剂的表面活性剂包括天然生物相容性表面活性剂及非天然合成表面活性剂。生物相容性表面活性剂包括磷脂化合物或磷脂的混合物。优选的磷脂为磷脂酰胆碱(卵磷脂)，如大豆或蛋卵磷脂。卵磷脂可通过水洗粗植物油及将所得水合胶分离且干燥，作为磷脂与甘油三酯的混合物而得。精制产物可通过在丙酮清洗而去除甘油三酯及植物油后，分馏残留的丙酮不溶性磷脂与糖脂的混合物而得。或者，卵磷脂可得自各种商业来源。其它适当的磷脂包括磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、心肌磷脂与磷脂酰乙醇胺。磷脂可分离自天然来源或常规合成。
适宜用于本发明亚微米乳剂的非天然合成表面活性剂包括基于脱水山梨糖醇的非离子型表面活性剂，例如，脂肪酸取代的脱水山梨糖醇表面活性剂(以名称SPAN或ARLACEL市售)、聚乙氧基化山梨糖醇的脂肪酸酯(TWEEN)、得自如蓖麻油来源的脂肪酸的聚乙二醇酯(EMULFOR)；聚乙氧基化脂肪酸(例如，名为SIMULSOLM-53的硬脂酸)、聚乙氧基化异辛酚/甲醛聚合物(TYLOXAPOL)、聚氧乙烯脂肪醇醚(BRIJ)；聚氧乙烯非苯基醚(TRITONN)、聚氧乙烯异辛基苯基醚(TRITONX)。优选的合成表面活性剂为名为SPAN与TWEEN的表面活性剂。
用于本发明水包油乳剂的优选表面活性剂包括卵磷脂、Tween-80与SPAN-80。
一般而言，表面活性剂或表面活性剂的组合(如果使用两种或更多种表面活性剂)是以0.01％至10％，优选为0.1％至6.0％，更优选为0.2％至5.0％体积比的量存在于乳剂中。
水性成分组成乳剂的连续相且可为水、经缓冲盐水或任何其它适当的水溶液。
本发明的水包油乳剂可包括适当且需要的另外的成分，包括防腐剂、渗透剂、生物粘着分子及免疫刺激分子。
据信生物粘着分子可增强抗原在目标粘膜表面上或通过目标粘膜表面的输送及附着而产生粘膜免疫性。适当生物粘着分子的实例包括酸性非天然存在聚合物，如聚丙烯酸与聚甲基丙烯酸(例如，CARBOPOL、CARBOMER)；酸性经合成修饰天然聚合物，如羧甲基纤维素；中性经合成修饰天然聚合物，如(羟丙基)甲基纤维素；碱性带胺聚合物，如壳聚糖；可得自天然来源的酸性聚合物，如海藻酸、透明质酸、果胶、黄蓍胶与梧桐胶；及中性非天然存在聚合物，如聚乙烯醇；或其组合。
在此使用的术语“免疫刺激分子”指增强疫苗组合物中抗原性成分诱发的保护性免疫应答的分子。适当的免疫刺激材料包括细菌细胞壁成分，例如，N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺的衍生物，如壁肽丁酯、苏氨酰基-MDP与胞壁酰三肽；植物皂苷与其衍生物，例如，Quil A、QS 21与GPI-0100；胆固醇；及季铵化合物，例如，溴化二甲基二-十八烷基铵(DDA)与N，N-二-十八烷基-N，N-双(2-羟乙基)丙二胺(“阿夫立定”)。
皂苷为广泛种类的植物物种中作为次级代谢产物而制造的糖苷化合物。皂苷的化学结构赋予广泛范围的药理学及生物学活性，包括一些强效及有效的免疫学活性。
结构上，皂苷由任何附着于一个或多个糖链的糖苷配基组成。皂苷可依照其糖苷配基组成分类三萜糖苷、类固醇糖苷与类固醇生物碱糖苷。
皂苷可自皂树的树皮分离。皂苷长期已知为免疫刺激剂。Dalsgaard，K.的“Evaluation of its adj uvant activity with a specialreference to the application in the vaccination of cattle againstfoot-and-mouth disease”，Acta.Vet.Scand.691-40 1978。含皂苷的植物粗提取物增强口蹄疫疫苗的效力。然而，此粗提取物在用于疫苗时伴有不良副作用。后来，Dalsgaard藉透析、离子交换与凝胶过滤层析术自皂苷部分地纯化了佐剂活性成分。Dalsgaard，K.等人的“Saponin adjuvants III.Isolation of a substance from Quillajasaponaria Morina with adjuvant activity in foot-and-mouth diseasevaccines”，Arch.Gesamte.Virusforsch.44243-254 1974。以此方式纯化的佐剂活性成分已知为“Quil A”。以重量计，Quil A相较于皂苷显示增加的效力且呈现降低的局部反应。Quil A广泛地用于兽医疫苗。
以高压液相色谱(HPLC)进一步分析Quil A显示一种密切相关皂苷的异质混合物且导致QS21的发现，其为具有降低或最小毒性的强效佐剂。Kensil C.R.等人的“Separation and characterization ofsaponins with adjuvant activity from Quillaja saponaria Molinacortex，”J.Immunol.146431-437，1991。不似大多数其它的免疫刺激剂，QS21为水溶性且可用于有或无乳剂型制剂的疫苗。QS21已显示在小鼠中引出Th1型应答，刺激IgG2a与IgG2b抗体产生，及应答亚单位抗原而诱发抗原特异性CD8+CTL(MHC第I类)。对人类的临床研究已证明其佐剂性，并具有可接受的毒理学特征。Kensil，C.R.等人的“Structural and immunological characterization of the vaccineadjuvant QS-21.In Vaccine Designthe subunit and AdjuvantApproach，”编者Powell，M.F.与Newman，M.J.Plenum PublishingCorporation，纽约，1995，第525-541页。
美国专利第6,080,725号教导制造及使用皂苷-亲脂体缀合物的方法。在此皂苷-亲脂体缀合物中，使亲脂性部分(如脂质、脂肪酸、聚乙二醇或萜烯)经存在于三萜烯皂苷的3-O-葡萄糖醛酸上的羧基而共价地附着于非酰化或去酰化三萜烯皂苷。亲脂性部分对皂苷(如皂树去酰皂苷、lucyoside P或得自丝石竹(Gypsophila)、肥皂草(saponaria)与针珊瑚属(Acanthophyllum)的皂苷)的3-O-葡萄糖醛酸的附着增强其对体液及细胞介导的免疫性的佐剂效应。此外，亲脂性部分对非-或去酰基皂苷的3-O-葡萄糖醛酸残基的附着产生比原始皂苷更易纯化、更低毒性、化学上更稳定而且具有相等或更好佐剂性质的皂苷类似物。
GPI-0100为美国专利第6,080,725号所述的皂苷-亲脂体缀合物。GPI-0100是通过经葡萄糖醛酸的羧基将脂族胺加入去酰基皂苷而制造。
季铵化合物-已提出许多种脂族含氮碱可用作为免疫学佐剂，包括胺、季铵化合物、胍、苄脒与thiouroniums。特定的此类化合物包括溴化二甲基二-十八烷基铵(DDA)与N，N-二-十八烷基-N，N-双(2-羟乙基)丙二胺(“阿夫立定”)。
美国专利第5,951,988号教导含季铵盐(如DDA)联合油成分的佐剂制剂。此制剂可用于联合已知的免疫物质，例如，疫苗组合物中的病毒或细菌抗原，以增强免疫原性应答。此组合物亦可不掺入抗原而作为非特异性免疫刺激性制剂而应用。
美国专利第4,310,550号描述N，N-高碳烷基-N，N′-双(2-羟乙基)-丙二胺与N，N-高碳烷基-二甲苯二胺与脂肪或脂质乳剂调配成疫苗佐剂的用途。一种经由将佐剂制剂经肠胃外施用而诱发或增强人类或动物中抗原的免疫原性应答的方法叙述于美国专利第4,310,550号。
在优选具体实施方案中，本发明提供一种可用作为疫苗佐剂的亚微米水包油乳剂，其由AMPHIGEN制剂组成，小滴大小小于1微米且平均小滴大小为约0.25微米。
在此使用的术语“AMPHIGEN制剂”指通过在TWEEN80与SPAN80存在下混合DRAKEOL卵磷脂油溶液(Hydronics，Lincoln，NE)与盐水溶液而形成的溶液。典型AMPHIGEN制剂含40％体积比(v/v)的轻质矿物油、约25％w/v的卵磷脂、约0.18％体积比(v/v)的TWEEN 80及约0.08％体积比(v/v)的Span 80。
制备亚微米水包油乳剂的方法在另一个具体实施方案中，本发明提供制备上述亚微米水包油乳剂的方法。
依照本发明，将乳剂的各种成分，包括油、一种或多种表面活性剂、水性成分及适宜用于乳剂的任何其它成分合并且混合在一起。
使形成的混合物经受乳化过程，一般经由通过一个或多个均化器或乳化器一次或多次以形成水包油乳剂，其具有均匀的外观及约0.5微米的平均小滴大小。任何市售均化器或乳化器均可用于此目的，例如，Ross乳化器(Hauppauge，NY)、Gaulin均化器(Everett，MA)。
然后使如此形成的乳剂经受微流化以使小滴大小落入亚微米范围。微流化可使用市售微流化器完成，如得自Mass，Newton的Microfiuidics的型号11OY；Gaulin Model 30CD(Gaulin，Inc.，Everett，Mass.)；及Rainnie Minilab Type 8.30H(Miro Atomizer Food andDairy，Inc.，Hudson，Wis.)。这些微流化器是通过迫使液体在高压下强制通过小穿孔，使得两股液体流在相互作用室中以高速相互作用而形成具亚微米大小小滴的乳剂而操作。
小滴大小可使用市售定径仪器通过本领域已知的多种方法例如激光衍射来测定。取决于使用的表面活性剂类型、表面活性剂对油的比例、操作压力、温度等，大小可以不同。本领域技术人员无需过度实验即可确定这些参数的理想组合以得到具有所需小滴大小的乳剂。本发明乳剂的小滴直径小于1微米，优选平均小滴大小小于0.8微米，而且更优选为平均小滴大小小于0.5微米，而且甚至更优选为平均小滴大小小于0.3微米。
在本发明的优选具体实施方案中，将由Hydronics(Lincoln，NE)市售且在轻质矿物油中含25％卵磷脂的DRAKEOL卵磷脂油溶液组与盐水及表面活性剂TWEEN80与SPAN80合并及混合而形成“AMPHGEN溶液”或“AMPHIGEN制剂”。然后将AMPHGEN溶液以Ross(Hauppauge，NY 11788)乳化器于大约3400rpm乳化而形成水包油乳剂。继而使此乳剂通过于大约4500±500psi操作的微流化器一次。此微流化水包油乳剂具有小于1微米大小的小滴，平均小滴大小为约0.25微米。
含掺入亚微米水包油乳剂中的抗原的疫苗组合物。
在另一个具体实施方案中，本发明提供含抗原和上述亚微米水包油乳剂的疫苗组合物。这些疫苗组合物的特征为具有增强的免疫原性效应及改善的物理外观(例如，在长期储存后未观察到相分离)。此外，本发明的疫苗组合物对动物施用安全。
依照本发明，抗原可外部地或优选内部地与乳剂组合合并。术语“内部地(intrinsically)”指其中在微流化步骤前将抗原与乳剂成分合并组合的过程。术语“外部地(extrinsically)”指其中在乳剂已微流化后将抗原加入乳剂的过程。外部地加入的抗原可为游离抗原或其可包封于微粒中，如以下进一步叙述。
在此使用的术语“抗原”指在动物中为免疫原性，而且包括于疫苗组合物中以在施打疫苗组合物的动物中引出保护性免疫应答的任何分子、化合物或组合物。
在此有关抗原使用的术语“免疫原性”指抗原在动物中针对抗原引起免疫应答的能力。此免疫应答可为主要由细胞毒性T-细胞介导的细胞免疫应答，或主要由辅助T-细胞(其依次活化B-细胞，导致抗体产生)介导的体液免疫应答。
“保护性免疫应答”在此定义为在动物中发生，对于因抗原或含抗原的病原体造成的障碍或疾病，预防或可检测地降低其发生，或消除或可检测地降低其严重性，或可检测地减缓其进展速率的任何免疫应答(抗体或细胞介导的免疫应答或两者)。
可包括于本发明疫苗组合物中的抗原包括由以下物种制备的抗原致病性细菌，如猪关节支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)、嗜睡嗜血杆菌(Haemophilus somnus)、副猪嗜血杆菌(Haemophilusparasuis)、支气管败血性鲍特菌(Bordetella bronchiseptica)、胞膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumonie)、多杀巴斯德菌(Pasteurella multocida)、Manheimia hemolytica、牛支原体(Mycoplasma bovis)、Mycoplasma galanecium、牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)，副结核分枝杆菌(Mycobacteriumparatuberculosis)、梭状芽孢杆菌属(Clostridial spp.)、乳房链球菌(Streptococcus uberis)、猪型链球菌(Streptococcus suis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、红斑丹毒丝菌(Erysipelothrixrhusopathiae)、弯曲杆菌属(Campylobacter spp.)、坏死梭形杆菌(Fusobacterium necrophorum)、大肠杆菌(Escherichia coli)、肠炎沙门菌(Salmonella enterica serovars)、钩端螺旋体属(Leptospiraspp.)；致病性真菌，如念珠菌属(Candida)；原虫，如隐担孢子虫(Cryptosporidium parvum)、Neospora canium、鼠弓形体(Toxoplasma gondii)、艾美球虫属(Eimeria spp.)；蠕虫，如胃线虫属(Ostertagia)、库珀线虫属(Cooperia)、血矛线虫属(Haemonchus)、片吸虫属(Fasciola)，为灭活的全细胞或部分细胞制品的形式，或为藉由常规蛋白质纯化、基因工程技术或化学合成而得到的抗原性分子的形式。另外的抗原包括致病性病毒，如牛疱疹病毒-1，3，6、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)1和2型、牛副流感病毒、牛呼吸道合胞病毒、牛白血病病毒、牛瘟病毒、口蹄疫病毒、狂犬病、猪瘟病毒、非洲猪热病毒、猪小病毒、PRRS病毒、猪环状病毒、流感病毒、猪水病病毒、泰琛(Techen)热病毒、假狂犬病病毒，为灭活的全病毒或部分病毒制品的形式，或为藉由常规蛋白质纯化、基因工程技术或化学合成而得到的抗原性分子的形式。
抗原量应使得抗原与水包油乳剂组合在动物中有效诱发保护性免疫应答。有效的抗原精确量取决于抗原的性质、活性及纯度，而且可由本领域技术人员确定。
存在于疫苗组合物中的水包油乳剂的量应足以增强疫苗组合物中抗原的免疫原性。在希望及适当时，除了水包油乳剂提供的表面活性剂，额外量的表面活性剂或另外的表面活性剂可加入疫苗组合物中。一般而言，油成分以1.0％至20％体积比的量；优选为1.0％至10％体积比的量；更优选为2.0％至5.0％体积比的量，存在于疫苗组合物的终体积中。表面活性剂或表面活性剂的组合(如果使用两种或更多种表面活性剂)是以0.1％至20％，优选为0.15％至10％，更优选为0.2％至6.0％体积比的量，存在于疫苗组合物的终体积中。
除了抗原及水包油乳剂，此疫苗组合物可包括适当及希望的其它成分，如以上关于水包油乳剂所述的防腐剂、渗透剂、生物粘着分子及免疫刺激分子(如Quil A、胆固醇、GPI-0100、溴化二甲基二-十八烷基铵(DDA))。
本发明的疫苗组合物亦可包括兽医可接受的载体。术语“兽医可接受的载体”包括任何及所有溶剂、分散介质、涂料、辅剂、稳定剂、稀释剂、防腐剂、杀细菌剂与杀真菌剂、等渗压剂、吸附延迟剂等。稀释剂可包括水、盐水、葡萄糖、乙醇、甘油等。等渗压剂可包括氯化钠、葡萄糖、甘露糖醇、山梨糖醇与乳糖等。稳定剂包括白蛋白等。
在优选具体实施方案中，本发明提供一种疫苗组合物，其包括内部地掺入水包油乳剂(其具有大小小于1微米的小滴，优选为平均小滴大小小于0.8微米，更优选为小于0.5微米，而且甚至更优选为平均小滴大小为约0.5微米)中的BVDV I型或BVDV II型抗原至少之一。BVDV I型及/或II型抗原优选为灭活病毒制品的形式。亚微米水包油乳剂优选为由AMPHIGEN制剂(即，含轻质矿物油、卵磷脂、TWEEN80与SPAN80的制剂)组成。此疫苗组合物优选还包括Quil-A、胆固醇与乙基汞硫代水杨酸钠。
在另一个优选具体实施方案中，本发明提供一种疫苗组合物，其包括钩端螺旋体抗原及BVDV I型或BVDV II型抗原至少之一于水包油乳剂中。所述抗原(优选为灭活细胞或病毒制品的形式)是内部地掺入水包油乳剂(其具有小于1微米大小的小滴，优选为平均小滴大小小于0.8微米，更优选为小于0.5微米，而且甚至更优选为平均小滴大小为约0.5微米)中。此亚微米水包油乳剂优选为由AMPHIGEN制剂(即，含轻质矿物油、卵磷脂、TWEEN80与SPAN80的制剂)组成。此疫苗组合物优选亦包括一种或多种选自Quil-A、胆固醇、DDA、GPI-100与氢氧化铝(AlOH)的免疫刺激分子。
在另一个优选具体实施方案中，本发明提供一种疫苗组合物，其包括至少一种细菌抗原，例如，重组乳房链球菌PauA蛋白质或大肠杆菌的细胞制品或两者的组合，于水包油乳剂中。所述抗原是内部地与水包油乳剂(其具有小于1微米大小的小滴，优选为平均小滴大小小于0.8微米，更优选为小于0.5微米，而且甚至更优选为平均小滴大小为约0.25微米)组合。此亚微米水包油乳剂优选为由AMPHIGEN制剂(即，含轻质矿物油、卵磷脂、TWEEN80与SPAN80的制剂)组成。此疫苗组合物优选亦包括一种或多种选自Quil A、胆固醇、DDA与GPI-100的免疫刺激分子。
本发明的疫苗组合物可由已知途径施用于动物，包括口服、鼻内、粘膜、局部、经皮肤及肠胃外(例如，静脉内、腹膜内、真皮内、皮下或肌内)途径。施用可使用途径的组合完成，例如，首次施用采用肠胃外途径，继而使用粘膜途径施用。
制备疫苗组合物的方法在进一步具体实施方案中，本发明提供制备含一种或多种抗原及亚微米水包油乳剂的疫苗组合物的方法。
在制备本发明的疫苗组合物中，抗原可内部地或外部地与水包油乳剂的成分组合。优选为，抗原是内部地与水包油乳剂的成分组合。
抗原可与乳剂的各种成分组合，包括油、一种或多种表面活性剂、水性成分及任何其它适当成分，而形成混合物。此混合物经受初步掺合过程，其一般为通过一或多个均化器或乳化器一次或多次，以形成含抗原的水包油乳剂。任何市售均化器或乳化器均可用于此目的，例如，Ross乳化器(Hauppauge，NY)、Gaulin均化器(Everett，MA)或Microfluidics(Newton，MA)。或者，可首先使用均化器或乳化器合并乳剂佐剂的各种成分，包括油、一种或多种表面活性剂与水性成分，以形成水包油乳剂；然后将抗原加入该乳剂。初步掺合后的水包油乳剂的平均小滴大小为约1.0-1.2微米。
然后使含抗原的乳剂经受微流化以使小滴大小处于亚微米范围。微流化可使用市售微流化器完成，如得自Mass Newton的Mierofiuidies的型号11OY；Gaulin Model 30CD(Gaulin，Inc.，Everett，Mass.)；及Rainnie Minilab Type 8.30H(Miro Atomizer Food andDairy，Inc.，Hudson，Wis.)。
小滴大小可使用市售定径仪器通过本领域已知的多种方法例如激光衍射来测定。取决于使用的表面活性剂类型、表面活性剂对油的比例、操作压力、温度等，大小可以不同。可确定这些参数的理想组合，以得到具所需小滴大小的乳剂。本发明乳剂的油小滴直径小于1微米。优选为平均小滴大小小于0.8微米。更优选为平均小滴大小小于0.5微米。甚至更优选为平均小滴大小为约0.1至0.3微米。
在本发明的优选具体实施方案中，将在轻质矿物油中含25％卵磷脂的DRAKEOL卵磷脂油溶液与表面活性剂TWEEN80和SPAN80及盐水溶液合并及混合，而形成含有40％的轻质矿物油、卵磷脂、0.18％的TWEEN80与0.08％的SPAN80的混合物。然后将此混合物以Ross(Hauppauge，NY 11788)乳化器于3400rpm乳化而形成乳剂产物，其亦称为“AMPHIGEN制剂”或“AMPHIGEN溶液”。继而藉助乳化器，例如，Ross均化器，将所需抗原与AMPHIGEN溶液及任何其它适当成分(例如，免疫刺激分子)组合，而形成含抗原的水包油乳剂。使此乳剂通过以大约10000±500psi操作的微流化器一次。此微流化水包油乳剂具有小于1微米大小的小滴，及约0.25微米的平均小滴大小。
在亚微米水包油乳剂中含微囊化抗原的疫苗组合物及制法在另一个具体实施方案中，本发明提供含包封于微粒中的抗原(或“微囊化抗原”)的疫苗组合物，其中微囊化抗原是外部地掺入上述的亚微米水包油乳剂中。
吸收或捕捉抗原于粒状载体中的方法在本领域为已知的。例如，参见Pharmaceutical Particulate CarriersTherapeutic Applications(Justin Hanes，Masatoshi Chiba与Robert Langer.Polymermicrospheres for vaccine delivery.InVaccine design.The subunit andadjuvant approach。编者Michael F.Powell与Mark J.Newman，1995Plenum Press，纽约及伦敦)。粒状载体可呈现多个拷贝的所选择抗原给动物对象的免疫系统，并促进抗原在局部淋巴结的捕捉及保留。颗粒可被巨噬细胞吞噬且可经细胞因子释放而增强抗原呈递。粒状载体亦已叙述于本领域中且包括，例如，衍生自聚甲基丙烯酸甲酯聚合物的那些及衍生自聚(丙交酯)与聚(丙交酯-共-乙交酯)(其已知为PLG)的那些。聚甲基丙烯酸甲酯聚合物为不可生物降解的，而PLG颗粒因与沿正常代谢路径分泌的乳酸及羟乙酸的酯键的随机非酶水解而可生物降解。
可生物降解微球亦用于实现疫苗的控释。例如，可实现长期的抗原连续释放。视聚合物的分子量及聚合物中乳酸对羟乙酸的比例而定，PLGA聚合物可具有数日或数周至数个月或一年的水解速率。缓慢的控制释放可造成类似在多次注射后所观察到的高水平抗体的形成。或者，可通过选择具有不同水解速率的聚合物而实现疫苗抗原的脉冲释放。聚合物的水解速率一般视聚合物的分子量及聚合物中乳酸对羟乙酸的比例而定。由两种或更多种具有不同抗原释放速率的不同聚合物制造的微粒提供抗原的脉冲释放且模拟多剂量方案的免疫接种。
依照本发明，抗原(包括任何上述抗原)可使用本领域已知的任何操作(如实施例7所例示的操作)而被吸收至粒状聚合物载体，优选为PLG聚合物，而形成微囊化抗原制品。然后将此微囊化抗原制品与亚微米水包油乳剂混合并分散于其中，此乳剂已叙述于上，而形成疫苗组合物。
在优选具体实施方案中，本发明提供含包封于PLG聚合物中的抗原的疫苗组合物，其中微囊化抗原是外部地分散于微流化水包油乳剂中，所述乳剂是由轻质矿物油、卵磷脂、TWEEN80、SPAN80与盐水组成，而且具有小于1.0微米的平均小滴大小。
以下为实施本发明的特定具体实施方案的实施例。所述实施例仅为了描述性目的而提供，而绝不意图限制本发明的范围。
实施例1AMPHIGEN制剂的制备以二步骤过程制备AMPHIGEN制剂。在第一步骤中，将80升的Drakeol卵磷脂油溶液、116升的破伤风类毒素盐水、1.2升的SPAN80及2.8升的Tween 80混合在一起且使用Ross乳化器乳化。Drakeol卵磷脂油溶液含25％的大豆卵磷脂及75％的矿物油。使乳化产物经Ross乳化器再循环最少5倍体积或最少10分钟。乳化产物在2-7℃储存最多24小时以进一步加工处理。将得自Ross乳化器槽的乳剂转移至Gaulin均化器且在4500psi的压力下均化20分钟。然后将所得的40％Drakeol卵磷脂油溶液(以下称为“AMPHIGEN制剂”或“AMPHIGEN溶液”)分配至无菌聚丙烯羧基容器中。分配是在位于10,000级控制环境中的100级分配通风橱内实行。将所述容器储存在2-7℃。此AMPHIGEN制剂用于下述的实验，除非另有指示。
实施例2将BVD疫苗急速掺合均化的初步掺合用于此均化过程的装置示于图1。使用无菌技术或蒸气转换阀，将含BVD I型抗原(灭活BVD I型病毒制品)的瓶附着至掺合容器的底侧口。在转移所需体积的BVD I型抗原结束后，以含灭活BVD II型病毒制品(灭活BVD II型病毒制品)的瓶替换BVD I型抗原瓶。在所需量BVD II型抗原转移结束后，将Ross均化器附着至可携式容器且以最大RPM(3300rpm)开始再循环。容器搅拌维持在中速。
使用无菌技术或蒸气转换阀，将含50毫克/毫升浓度的Quil-A的瓶附着至掺合容器的均化器连线口。使所需量的Quil-A溶液经线吸滤送至容器中。在Quil-A溶液转移结束后，将瓶移除。以相同的方式将所需量的胆固醇于乙醇溶液(18毫克/毫升)转移至掺合容器。继而将所需量的AMPHIGEN制剂、10％的乙基汞硫代水杨酸钠溶液及基础改良Eagles培养基(“BME”)增容(extender)溶液加入掺合容器。
一旦所有的添加结束，则混合继续又15分钟。将所得制剂等分成2毫升剂量且示为基于非微流化AMPHIGEN制剂的BVD疫苗。各剂疫苗含500微克的Quil-A、500微克的胆固醇、2.5％的AMPHIGEN制剂及0.009％的乙基汞硫代水杨酸钠。以对gp53的ELISA滴度计，测定两种不同BVD株的抗原浓度。
实施例3通过微流化进行二次掺合图2例示用于经微流化二次掺合的过程。将微流化器蒸气灭菌。首先将辅助处理模组室装设于此单元中且将空室装设于第二室位置。将含如实施例2所述而制备的完全佐剂化BVD疫苗的容器通过将来自供应容器排放阀的转移线附着至微流化器入口而连接至微流化器。
将氮气连接至供应容器滤气入口且将容器压力设定调整至20+/-5PSI。将收集容器排放阀连接至来自微流化器出口的转移线。在完成所有必要的连接后，将阀打开且以10,000+/-500PSI的操作压力开始微流化。使疫苗的全部内容物一次通过微流化器且在微流化后室中收集。将此制品等分成2毫升剂量且示为基于微流化AMPHIGEN制剂的BVD疫苗。
实施例4经实验台(bench)掺合制备疫苗组合物通过加入BVD抗原及增容剂将如实施例1所述而制备的AMPHIGEN制剂稀释至2.5％。使用搅拌棒代替使用均化器在实验台上掺合所得溶液。最终制品含以下组成BVD I型与II型抗原，2.5％的AMPHIGEN制剂(其含油、卵磷脂、SPAN、与TWEEN，如实施例1所述)及盐水。TWEEN 80与SPAN 80分别以0.18％及0.08％体积比存在于最终疫苗制品中。
实施例5基于非微流化与微流化AMPHIGEN制剂的BVD疫苗制品之间小滴大小分布的比较使用如实施例2所述而制备的基于非微流化AMPHIGEN制剂的疫苗、如实施例3所述而制备的基于微流化AMPHIGEN制剂的疫苗及如实施例4所述经实验台掺合而制造的制品，比较疫苗制品的小滴大小。将2毫升得自各制品的样品加入Malvern 2000激光衍射计且测定小滴大小分布。如图3所示，结果显示基于微流化AMPHIGEN制剂的疫苗制品具有约0.1微米的最大颗粒体积，而基于非微流化AMPHIGEN制剂的疫苗制品具有约1微米的最大颗粒分布体积。
实施例6疫苗相分离的降低将三种不同的疫苗制品如实施例2所述而制备的基于非微流化AMPHIGEN制剂的疫苗、如实施例3所述而制备的基于微流化AMPHIGEN制剂的疫苗及如实施例4所述经实验台掺合而制备的制品，并列比较以测定其在长期储存时的相分离性质。使所有这些制品在4℃静置约1个月，而且就疫苗制品上方乳状层出现而言监测相分离。如图4所示，基于微流化AMPHIGEN制剂的制品相较于其它两种制品无相分离。
实施例7对抗牛病毒性腹泻病毒的微流化及非微流化牛疫苗的制备将牛病毒性腹泻病毒抗原经微流化内部地掺入AMPHIGEN制剂中。术语“内部地掺入”指在微流化前将抗原加入AMPHIGEN制剂的过程。使抗原与佐剂制剂的成分一起经受微流化过程的物理力。在对照非微流化组中，抗原制品经掺合分散于AMPHIGEN制剂中。
对照及微流化制品的最终组成如下对gp53具有2535RU/剂量的灭活后ELISA滴度的BVD I型、对gp53具有3290RU/剂量的灭活后ELISA滴度的BVD II型、1.25毫克/剂量的浓度的Quil-A、1.25毫克/剂量的浓度的胆固醇、2.5％终浓度的AMPHIGEN制剂及0.009％终浓度的乙基汞硫代水杨酸钠。疫苗剂量为5毫升。
实施例8基于微流化AMPHIGEN制剂的疫苗制品中内部地掺入的BVD病毒抗原的长期稳定性进行此实验以测定内部地掺入的抗原在长期储存期间的稳定性。在微流化过程期间将已被杀死的BVD II型病毒抗原内部地掺入AMPHIGEN制剂中，而得到微流化疫苗制品(A907505)。以三种含相同抗原于非微流化AMPHIGEN制剂中的其它疫苗制品(A904369、A904370与A904371)作为对照。在非微流化制品中，将抗原混合AMPHIGEN制剂且使用Ross均化器经掺合混合。将所有四种疫苗制品在4℃储存2年。在储存期间的不同时间点(0、6、12或24个月)，使用所有四种制剂对三个月大的乳牛进行免疫接种。
在第0及21天，以2毫升疫苗制剂经皮下途径对三个月大的乳牛进行接种。在第35天采集得自接种动物的血清，经BVDV-E2 ELISA以抗体滴度计，测量对疫苗的血清学反应。如图5所示，微流化疫苗制品在所有测试的时间点(0、6、12和24个月)显示较高的抗体滴度，提示在微流化过程中将抗原内部掺入时不失去抗原制品的稳定性。此外，亦令人惊奇地发现，微流化疫苗制品在所有时间点诱发增强的免疫应答。
实施例9微流化后疫苗诱发直肠温度增加的降低在第0天使用如实施例7所述而制造的微流化及非微流化疫苗制品对牛接种，及在接种前1天至接种后4天的时间段期间监测直肠温度。疫苗剂量为2毫升。以单或双剂量的疫苗接种各组。在第1天至第4天(含)每日测量并记录直肠温度。第0天的直肠温度是在施打测试物品前测量的。
如图6所示，结果显示以单或双剂量的非微流化疫苗制剂接种的动物的直肠温度在接种后约24小时内急剧上升。然而，在以微流化形式的疫苗接种的动物中，接种后直肠温度的上升仅极小且显著地低于以非微流化制剂接种的动物(图6)。
实施例10在以微流化疫苗制剂接种时注射部位反应体积较快地消退在第0天使用如实施例7所述而制造的微流化与非微流化疫苗制品对牛接种。包括于此研究的动物为杂交肉牛。各安慰剂治疗组(T01与T02)中有3只动物。T03至T06组各有6只动物。疫苗剂量为2毫升且各组在第0天以一或两份剂量的疫苗进行接种。在第0天，测试物是在右颈施打。接受双倍剂量(4毫升)的测试物品的动物(T02、T04与T06)是以一侧的单次注射接受整个双倍剂量。在第0天至第4天(含)及第6、9与14天，对颈的右侧进行注射部位观察，包括注射部位反应大小的估计。在第0天，在施打测试物品前观察注射部位。接种单或双剂量安慰剂的组未显示注射部位反应体积的任何显著增加，因此此资料未示于图7。在非微流化疫苗制剂的情形，单剂量与双剂量接种之间有注射部位反应体积的成比例增加。另一方面，在微流化疫苗制剂的情形，虽然单剂量诱发较大的注射部位反应体积，以第二剂量注射未造成任何进一步的增加。此外，在以微流化疫苗制剂注射的动物中，与以非微流化疫苗制剂注射的动物相比，注射部位反应部位体积以更快的速率消退。这些结果示于图7。
实施例11具有内部掺入的BVD病毒和钩端螺旋体抗原及免疫刺激分子如Quil A和DDA的基于微流化AMPHIGEN制剂的疫苗制品的制备将经福尔马林灭活的Leptospira hardjo-bovis CSL株以约1.4×109个生物体/5毫升剂量的直接计数调配于适当佐剂中。将经福尔马林灭活的波摩那钩端螺旋体(Leptospira Pomona)T262株调配为约2400比浊单位/5毫升剂量。比浊单位是基于处理前发酵液的比浊测量而计算的。BVD病毒I型是调配为约3000相对单位/5毫升剂量的E2 Elisa滴度。BVD病毒2型是调配为约3500相对单位/5毫升剂量的E2 Elisa滴度。相对单位是基于装配前灭活后整体流体的E2 ELISA滴度计算的。Quil-A及胆固醇均以每剂0.5毫克的浓度使用。乙基汞硫代水杨酸钠及AMPHIGEN制剂分别以0.009％及2.5％的终浓度使用。氢氧化铝(Rehydragel LV)是以2.0％的终浓度使用。在使用DDA作为免疫调节剂时，DDA包括于AMPHIGEN制剂内。AMPHIGEN制剂(即，40％Drakeol-卵磷脂储备溶液)含1.6毫克/毫升的DDA，而且在适当地稀释时，最终疫苗制品含2.5％的AMPHIGEN制剂与0.1毫克/毫升的DDA。
在不同疫苗制剂的制备中，将BVD部分、Leptos、Quil-A、胆固醇、乙基汞硫代水杨酸钠、AMPHIGEN制剂及作为增容剂的盐水加入Silverson均化器且以10,000±500RPM混合15分钟。然后使成分于10,000psi经200微米筛网微流化。
在疫苗制剂含氢氧化铝时，微流化是无氢氧化铝而进行。在微流化结束后，加入氢氧化铝且在4℃以搅拌棒混合过夜。
实施例12攻击研究的BVD病毒疫苗的制备用于此实验的疫苗制品含得自BVD病毒1型与BVD病毒2型的抗原。使用对gp53为2535RU/剂量的灭活后ELISA滴度的BVD1-5960抗原。使用对gp53为3290RU/剂量的灭活后ELISA滴度的BVD2-890抗原。Quil-A及胆固醇是以0.5毫克/毫升的浓度使用。乙基汞硫代水杨酸钠及AMPHIGEN制剂分别以0.009％及2.5％的终浓度使用。在使用DDA作为免疫调节剂时，DDA包括于AMPHIGEN制剂内。AMPHIGEN储备溶液(40％Drakeol-卵磷脂溶液)含不同量的DDA，而且在适当地稀释时，最终疫苗制品含2.5％的AMPHIGEN制剂与浓度范围从0.5毫克/剂量至2.0毫克/剂量的DDA。铝胶(Rehydragel-LV)是以2％的终浓度使用。GPI-0100是以2、3与5毫克/剂量的范围使用。
将所有成分加入Silverson均化器且以10,500rpm掺合15分钟。然后以10,000psi通过200微米室而微流化。在疫苗制剂含氢氧化铝时，微流化是无氢氧化铝而进行。在微流化结束后，加入氢氧化铝且在4℃以搅拌棒混合过夜。
实施例13以具有钩端螺旋体抗原的微流化Amphigen疫苗制剂接种后对抗钩端螺旋体攻击的保护作用表1-治疗组
表1显示在此研究中测试的疫苗制品中佐剂制剂的组成。疫苗制品是如实施例11所述而制备。每组有6只动物。约七个月大的肉用杂交小母牛用于此研究。接种是以5毫升疫苗体积经皮下途径在第0天及第21天完成。攻击是以得自NADC(国家农业疾病中心)的L.hardjo-bovis 203株完成。攻击是在第57-59天期间以1-毫升接种体完成。攻击是经眼结膜及阴道施打。攻击材料含5.0×106个钩端螺旋体/毫升。每周收集尿用于钩端螺旋体培养、FA及PCR。在第112及113天时进行肾采集。
表2-钩端螺旋体攻击研究的结果
表2显示得自钩端螺旋体攻击研究的资料。在测定受攻击动物中钩端螺旋体感染百分比时，使用以下的标准。如果仅一个样品的肾培养呈阳性，则此动物视为对钩端螺旋体呈阳性。如果动物对FA或PCR仅一个样品呈阳性，则此动物视为阴性。如果仅一个样品对FA与PCR两者均呈阳性，则其视为钩端螺旋体阳性。
表2的结果显示，基于所有三种检验，在所有疫苗组均有显著较短的尿液脱落持续时间。就尿液与肾定殖而言，无AlOH的含QAC的制剂与含DDA的制剂的效力相当。在此攻击研究中，AlOH未改善且甚至降低含QAC的疫苗或含DDA的疫苗的效力。
表3-攻击前峰几何平均滴度日(第35天)的显微凝集滴度范围
在接种动物中检测对抗疫苗制剂中两种钩端螺旋体抗原的血清学反应，在第35天记录到峰反应。血清学反应与对抗攻击的保护作用之间无关联。疫苗制剂中铝胶的存在降低保护水平，虽然血清学反应因疫苗中铝胶的存在而增强。
实施例14以含AMPHIGEN制剂和DDA的微流化疫苗制品免疫后引出对BVD病毒抗原的免疫应答及对抗BVD 2型病毒攻击的保护作用四至七个月大的血清阴性小牛用于此实验。有六个不同组且各组有十只动物(表4)。在第0天及第21天，各动物在大约肩胛骨与后头之间中间位置的侧颈部接受一剂2毫升皮下剂量的疫苗或安慰剂。
表4-治疗组
在研究的第44天，将5毫升剂量的攻击病毒制品(每个鼻孔约2.5毫升)鼻内施打。非细胞致病性BVD病毒2型，分离物#24515(Ellis株)，批号#46325-70用于此研究作为攻击株。在开始攻击时及结束时即刻滴定攻击材料的保留样品(每次滴定重复两次)。每5毫升剂量的平均活病毒滴度为攻击前5.3log10 FAID50/5毫升及攻击后5.4log10FAID50/5毫升(FAID等同于TCID50)。
自第3天至第58天每日监测动物。在第42天至第58天，基于可归因于BVD2感染的临床征象，对各动物作0、1、2或3的临床疾病评分。第44天的评分在攻击前记录。在第0、21、35、44与58天自各动物收集血样(两个13毫升血清分离管，SST)以测定BVD 1型与BVD 2型病毒中和抗体的血清滴度。
在第42天至第58天(含)自各动物收集血样且测定软层细胞中BVD病毒的存在。在第44天，在攻击前取得样品。
为了测定白细胞计数，在第42天至第58天(含)自各动物收集血样(一个4毫升EDTA管)。在第44天，在攻击前取得样品。
白细胞减少定义为WBC计数自基线(自攻击前2日至攻击日的攻击前WBC计数的平均值)减少40％或更大。
使用临床疾病评分如下界定疾病状态如果评分≤1，则疾病＝否；如果评分＞2，则疾病＝是。
如表5与6所示，以含BVD病毒抗原与AMPHIGEN制剂，QuilA或DDA且微流化的疫苗接种的组，对BVD 1型及BVD 2型病毒均以显著的血清病毒中和滴度发生血清转化。在这些组中，攻击后显示病毒血症的动物百分比亦显著减少，而对照组中100％的动物为病毒血症(表7)。此外，在接种组中，疾病频率亦显著地降低(表8)。类似地，在接种组中，显示白细胞减少的动物百分比亦减少，而且白细胞减少的降低在含DDA组中比含Quil A组中更为显著(表9)。在对照组中，相较于接种组，体重增加有显著的下降(表10)。
血清学在第0天接种前，此研究的所有动物对BVD病毒1与2型的抗体为血清阴性(SVN＜1∶2)(资料未示)。第二次接种后14天(第35天)，所有施打安慰剂的动物(T01)对BVD病毒1与2型的抗体仍为血清阴性；而所有以ITA(调查性测试抗原)接种的动物(T02、T03、T04、T05与T06)对BVD病毒1与2型的抗体均为血清阳性(SVN≥1∶8)。一只施打以AMPHIGEN制剂及2毫克/剂量的DDA为佐剂的疫苗的动物在第35天对BVD病毒2型的抗体的SVN滴度为3(表11与12)。
在第44天攻击前，所有对照(T01)，除了一只以外，对BVD病毒1与2型的抗体均为血清阴性(SVN＜1∶2)(现在显示资料)。一个对照(#2497)对BVD病毒1型的抗体为血清阳性(SVN＝10)且对BVD病毒2型的抗体为血清阴性。攻击后14天，此研究的所有动物对BVD病毒1与2型的抗体均为血清阳性。
表5. BVD病毒1型几何平均血清病毒中和滴度
表6. BVD病毒2型几何平均血清病毒中和滴度
表7.攻击后的BVD病毒分离
表8.攻击后的BVD疾病的临床征象
表9.攻击后的白细胞减少
表10.研究期间的体重及体重增加
病毒分离如表13的资料所示，在攻击期间(第44至58天)，对照(T01)的所有十只动物都为病毒血症(在一天或更多天分离到BVD病毒)。在施打ITA的组中，各十只的组(分别为T02、T03、T04、T05与T06)中病毒血症动物的频率为1、0、3、2及2只。对照与施打ITA的组之间的差异为统计上显著(P≤0.05)。相较于施打ITA的组(0.0至0.5天)，对照的病毒血症的最小二乘方平均天数量亦显著更大(10.4天)。
临床疾病具有2或3的临床征象评分的动物视为展现BVD疾病的迹象。如表14所示，具BVD病毒疾病临床征象的动物频率在对照(T01)为10只中的9只，在施打ITA的各组(分别为T02、T03、T04、T05与T06)为10只中的1、2、0、0与0只。对照与施打ITA的组之间的差异为统计上显著(P≤0.05)。
白细胞减少如表15所示，在攻击期间(第44至58天)，对照(T01)的所有十只动物为白血病(白细胞计数自攻击前基线减少40％，第42-44天)。患白血病的动物频率在施打ITA的各组(分别为T02、T03、T04、T05与T06)为10只动物中的6、2、4、3与2只。对照与施打以0.5毫克/剂量DDA及氢氧化铝的AMPHIGEN制剂为佐剂的疫苗的组(T03)之间的差异为统计上显著(P≤0.05)。相较于施打ITA的组(0.2至1.2天)，对照的最小二乘方平均白血病天数显著地更大(7.8天)。
实施例15以含GPI-0100的微流化疫苗制剂免疫后诱出对BVD病毒抗原的免疫应答及对抗BVD 2型病毒攻击的保护作用依照如实施例14所述的一组实验条件且进行Quil A与GPI-0100之间的直接比较。如表11与12所示，以含Quil A或GPI-0100的基于微流化AMPHIGEN制剂的制品中的BVD抗原接种的动物对BVD1型与BVD 2型病毒均具有显著的抗体滴度。对BVD 1型病毒的抗体滴度比对BVD 2型病毒的高得多。然而，BVD 2型病毒后续攻击显示强烈保护，而且在以含GPI-0100的基于微流化AMPHIGEN制剂的疫苗制品接种的小牛中疾病发病率显著地减小。
表11. BVD病毒1型几何平均血清病毒中和滴度
表12. BVD病毒2型几何平均血清病毒中和滴度
表13.攻击后的BVD病毒分离
表14.攻击后BVD疾病的临床征象
表15.攻击后的白细胞减少
总之，接种动物无不良反应或死亡率证明各疫苗的安全性。在100％的接种动物中的血清转化(对BVD-1与BVD-2的SVN抗体滴度＞1∶8)证明各疫苗的效用。仅以2毫克GPI-0100为佐剂的疫苗展示令人满意的攻击抗性。
实施例16含微囊化抗原于微流化水包油乳剂中的疫苗制品将3克的海藻糖(Fluka)加入水中而得333毫克/毫升的海藻糖溶液的原液。将溶于0.8％SDS溶液的重组PauA抗原(SDS/rPauA)加入海藻糖溶液而得494微克rPauA/毫升的终浓度。在下一步骤中，将10克的聚丙交酯羟乙酸(polylactide glycolic acid，PLG-ResomerRE 503h，Boeringher Ingelheim)溶于200毫升的二氯甲烷(MeCl2)。将所得PLG/MeCl2溶液与在第一步骤中制备的SDS-rPauA/海藻糖溶液合并。使此合并溶液经受微流化(使用得自Microfiuidics ModelM110EH的微流化器)且将微流化制品喷雾干燥(使用Temco SprayDryer Model SD-05)。使用500微米滤网收集喷雾干燥的材料。
使用Western印迹分析定量此喷雾干燥材料中的rPauA浓度。将1.04毫克的喷雾干燥材料溶于50微升的丙酮且在室温以13,200rpm离心10分钟。将上清液去除。使上清和沉淀部分在生物安全性通风橱中干燥2.5小时。将沉淀重悬于47.43微升的样品溶液(25微升的样品缓冲液+10微升的还原剂+65微升的水)。将干燥的上清部分以20微升的样品溶液重悬。在Western分析中，使用纯化PauA作为标准品定量喷雾干燥材料的rPauA含量。
通过将100克的甘露糖醇(Sigma)溶于500毫升的注射用水(WFI)中而制备20％甘露糖醇储备溶液。以热板/搅拌器将溶液加热至40℃且冷却至30℃。使溶液经0.22微米无菌滤器(Millipore)过滤除菌。通过将12.5克的羧甲基纤维素(Sigma)溶于500毫升的WFI中，及在4℃混合过夜，而制备2.5％羧甲基纤维素溶液。使溶液在121℃高压灭菌。
由喷雾干燥得到的粉末在含5％的甘露糖醇、0.3％的羧甲基纤维素与1∶5000的乙基汞硫代水杨酸钠的溶液中重组。将最终溶液等分至3毫升小瓶中且使用冻干机(USIFROID)冻干。冻干粉末表示微囊化rPauA。将微囊化亚单位蛋白质抗原重悬于2毫升含AMPHIGEN制剂的微流化水包油乳剂(如实施例20所述的微流化乳剂)且用作为疫苗。
实施例17含细菌全细胞抗原与重组蛋白质抗原于水包油乳剂中的微流化疫苗制剂的制备制造两种疫苗制品，其含重组乳房链球菌PauA蛋白质与大肠杆菌细菌细胞两者，内部地加入如实施例2和3所述的水包油乳剂中。重组PauA抗原为每剂量100微克的浓度，而大肠杆菌细胞为每剂量4×109个的最终计数。两种疫苗制剂的乳剂佐剂组成示于表16。
表16.含重组蛋白质与全大肠杆菌细胞两者的疫苗制剂
实施例18对含rPauA与全细胞细菌剂于水包油乳剂中的微流化疫苗的免疫应答成年乳牛用于此实验。登记时动物处在其第一或第二授奶期结束时。将2毫升的各疫苗制剂皮下地施打三次，在无奶时(D＝0)一次，28天后(D＝28)，及生小牛后4至10天(C+4-C+10)再一次。第一及第三剂是在颈的左侧施打，第二剂是在颈的右侧施打。在每次接种前及第三次接种后约14天和32天采集血液。对大肠杆菌及rPauA抗原的抗体滴度经由ELISA测定。如图8所示，结果显示在以含GPI-0100作为免疫刺激剂的疫苗制剂接种的组中对rPauA的抗体滴度较高，而且在初始接种后第70天达到峰值。对大肠杆菌抗原的抗体滴度示于图9。对大肠杆菌抗原的抗体滴度在两种疫苗制剂中相似，虽然相较于以DDA作为免疫刺激的制剂，GPI-0100作为免疫剂激剂的存在诱发相对更高的抗体滴度。
实施例19基于微流化AMPHIGEN制剂的疫苗制品的杀病毒活性的分析为了测定微流化是否将病毒灭活，测定三种基于微流化AMPHIGEN制剂的疫苗制品的杀病毒活性。此三种制品含三种不同的牛感染性病毒，即，牛疱疹病毒(BHV)、副流感病毒3(PI3)及牛呼吸道合胞病毒(BRSV)。
三种疫苗制品中的杀病毒活性的检测是依照USDA 9CFR.113.35要求进行的。
表17所示的结果表明，基于AMPHIGEN制剂的疫苗制品的微流化不造成疫苗制品的任何显著灭活。
表17.微流化疫苗的杀病毒活性的分析
A＝胆固醇以650毫升/分钟加入B＝胆固醇以28毫升/分钟加入C＝胆固醇以5毫升/分钟加入M200＝以200微米筛网微流化M75＝以75微米筛网微流化M75@37C＝液体在微流化前加热至37℃高于0.7的值为杀病毒效应的指示。
实施例20微流化AMPHIGEN制剂的制备通过合并DRAKEOL卵磷脂油溶液(具有25％卵磷脂的轻质矿物油)与TWEEN 80(终浓度为0.18％)与Span 80(终浓度为0.08％)且在36±1℃混合8-22小时而制备AMPHIGEN制剂。然后藉助Ross(Hauppauge，NY 11788)乳化器，以约3400rpm将油混合物加入盐水。继而使混合物于4500±500psi通过具200微米相互作用室的微流化器一次。图10A与10B显示微流化AMPHIGEN制剂的稳定性。如激光衍射所测量，在开始起初时间点的粒度分布(图10A)与4℃储存22个月后的粒度分布(图10B)几乎完全相同。
权利要求
1.一种可用作为疫苗佐剂的亚微米水包油乳剂，其包含轻烃不可代谢性油、表面活性剂及水性成分，其中所述油分散于所述水性成分中，且平均油小滴大小小于1微米。
2.根据权利要求1的乳剂，其中所述油为轻质矿物油且为1％至50％v/v的量，所述表面活性剂包含卵磷脂且为0.01％至10％v/v的量，且其中所述油分散于所述水性成分中且平均油小滴大小为0.1微米至0.5微米之间。
3.一种可用作为疫苗佐剂的亚微米水包油乳剂，其包含约40％v/v的矿物油、约10％w/v的卵磷脂、约.18％v/v的TWEEN-80、约0.08％v/v的SPAN-80及水相，其中所述油分散于所述水相中且平均油小滴大小为0.1微米至0.5微米之间。
4.一种制备亚微米水包油乳剂的方法，其包括(a)通过组合轻烃不可代谢性油、表面活性剂及水性成分而制备混合物；(b)使所述混合物经受初步乳化过程而制造平均油小滴大小为1.0微米至1.1微米的水包油乳剂；及(c)使在(b)中制备的水包油乳剂经受微流化而制造所述亚微米水包油乳剂，其中亚微米乳剂具有小于1微米的平均油小滴大小。
5.根据权利要求4的方法，其中所述油为轻质矿物油且为1％至50％v/v的量，所述表面活性剂包含卵磷脂且为0.01％至10％v/v的量，且其中所述亚微米乳剂的平均油小滴大小为0.1微米至0.5微米之间。
6.一种疫苗组合物，其包含水包油乳剂与抗原，其中所述抗原分散于所述乳剂中，所述乳剂包含轻烃不可代谢性油、表面活性剂及水性成分，且其中所述乳剂的平均油小滴大小小于1微米。
7.根据权利要求6的疫苗组合物，其中所述油为轻质矿物油且以1％至20％v/v的量存在于所述疫苗组合物中，所述表面活性剂包含卵磷脂且以0.01％至10％v/v的量存在于所述疫苗组合物中，且其中所述平均油小滴大小为0.1微米至0.5微米之间。
8.根据权利要求6的疫苗组合物，其中所述抗原为病毒抗原或细菌抗原。
9.根据权利要求8的疫苗组合物，其中所述病毒抗原包含已被杀死的牛病毒性腹泻病毒1型或2型，且其中所述细菌抗原包含灭活钩端螺旋体菌苗、重组乳房链球菌PauA蛋白质或大肠杆菌细胞制品中的至少一种。
10.一种制备疫苗组合物的方法，其包括(a)通过组合轻烃不可代谢性油、表面活性剂及水性成分而制备混合物；(b)将抗原加入在(a)中形成的混合物；(c)使在(b)中形成的含所述抗原的混合物经受初步乳化过程而制造具有1.0微米至1.1微米的平均油小滴大小的水包油乳剂；及(d)使在(c)中形成的乳剂经受微流化而制造所述疫苗组合物，其中此组合物具有小于1微米的平均油小滴大小。
11.根据权利要求10的方法，其中所述油为轻质矿物油且以1％至20％v/v的量存在于疫苗组合物中，所述表面活性剂包含卵磷脂且以0.01％至10％v/v的量存在于所述疫苗组合物中，且其中所述平均油小滴大小为0.1微米至0.5微米之间。
12.根据权利要求10的方法，其中所述抗原为病毒抗原或细菌抗原。
13.根据权利要求12的方法，其中所述病毒抗原包含已被杀死的牛病毒性腹泻病毒1型或2型，且其中所述细菌抗原包含灭活钩端螺旋体菌苗、重组乳房链球菌PauA蛋白质或大肠杆菌细胞制品中的至少一种。
14.一种疫苗组合，其包含微囊化抗原及水包油乳剂，其中所述微囊化抗原分散于所述乳剂中，且所述乳剂包含轻烃不可代谢性油、表面活性剂及水性成分，且其中所述乳剂的平均油小滴大小小于1微米。
15.根据权利要求14的疫苗组合物，其中所述油为轻质矿物油且以1.0％至20％v/v的量存在于所述疫苗组合物中，所述表面活性剂包含卵磷脂且以0.01％至10％v/v的量存在于所述疫苗组合物中，所述抗原为病毒抗原或细菌抗原且包封于粒状载体中，且其中所述载体包含聚丙交酯羟乙酸。
全文摘要
本发明提供可用作为增强抗原免疫原性的疫苗佐剂的亚微米水包油乳剂。本发明亦提供包含与这种乳剂内部或外部组合的抗原的疫苗组合物。本发明还提供制备所述乳剂及疫苗的方法。
文档编号A61K39/12GK1767854SQ200480008618
公开日2006年5月3日 申请日期2004年3月22日 优先权日2003年4月4日
发明者P·J·多米诺夫斯基, P·K·克鲁斯, R·L·克雷布斯, R·M·曼南 申请人:辉瑞产品公司