递送胸腺素β4、类似物、同工型和其它衍生物的组合物和方法

专利名称：递送胸腺素β4、类似物、同工型和其它衍生物的组合物和方法
技术领域：
本发明涉及用于递送多肽药物的组合物和方法领域。
背景技术：
多肽药物在治疗各种疾病方面可以成为极其有效的药剂。由于多肽药物的生产非常昂贵，因此本领域中需要用于递送多肽药物的改进组合物和方法。

发明内容
根据本发明，组合物包含基本纯化的组分，所述基本纯化的组分包括粘合剂和包含氨基酸序列LKKTET或其保守变体的多肽。递送多肽至一定部位的方法包括将上述组合物引入所述部位。
具体实施例方式
本发明提供利用包含氨基酸序列LKKTET或其保守变体的肌动蛋白螯合肽如胸腺素β4(Tβ4)和其它肌动蛋白螯合肽或肽片段的组合物和方法。所包括的是N-或C-端变体，如KLKKTET和LKKTETQ。这些肽和肽片段在促进伤口愈合和其它生理用途方面有用。
胸腺素β4最初被鉴定为体外内皮细胞迁移和分化过程中上调的蛋白质。胸腺素β4为在多种组织中鉴定到的43个氨基酸、4.9kDa的普遍存在的多肽。该蛋白质的几种功能包括在内皮细胞分化和迁移、T细胞分化、肌动蛋白螯合(actin sequestration)和血管形成期间的作用。
胸腺素β4是在多种组织和细胞类型中发现的高度保守的极性5-kDa多肽的β-胸腺素家族成员。最初纯化自胸腺并认为是胸腺激素的胸腺素β4随后被发现参与多种生化过程。作为主要的G-肌动蛋白螯合肽，其在细胞增殖、迁移和分化期间对肌动蛋白组装的调节发挥重要作用。大量研究表明胸腺素β4对癌变、炎症、血管生成和创伤愈合起调节作用。发现胸腺素β4表达通过基于肌动蛋白的细胞骨架组构来调节癌细胞系中的致肿瘤性和转移活性。发现胸腺素β4在形成管的内皮细胞中增高；这增加内皮细胞的附着、扩散和迁移，从而促进血管生成。还发现胸腺素β4在溃疡提取物和伤口流体中以高浓度存在，并被认为作为抗菌因子起作用。胸腺素β4在伤口愈合中的刺激作用在一些动物模型研究中得以证实。当局部加入或腹腔内施用时，胸腺素β4在大鼠全层厚度模型中增强皮肤创伤的愈合。还在db/db糖尿病小鼠、类固醇免疫抑制小鼠和老年小鼠中观察到胸腺素β4加速皮肽创伤愈合的能力。还表明胸腺素β4加速烧伤后角膜上皮的愈合，并下调多种减轻炎症反应的角膜细胞因子和趋化因子。
血管损伤时凝血级联系统的激活导致将纤维蛋白原转化为纤维蛋白的凝血酶生成。纤维蛋白自发聚合形成封闭受损部位的血栓，从而防止血液流失。纤维蛋白还作为临时基质，随后的创伤愈合过程中，各种细胞类型附着于其上、迁移和分化，将纤维蛋白替换为正常组织。作为血浆谷氨酰胺转移酶的因子XIIIa共价交联纤维蛋白栓以增强其结构。而且，因子XIIIa还将可调节纤维蛋白基质性质的大量生理活性蛋白质交联到纤维蛋白上。例如，共价引入α2-抗纤维蛋白溶酶增加基质抗纤维蛋白溶解性，而引入纤连蛋白可影响基质支撑细胞附着和迁移的能力。组织谷氨酰胺转移酶可选择性引入胸腺素β4到纤维蛋白中。
胸腺素β4是组织谷氨酰胺转移酶的特异性底物，可以通过组织谷氨酰胺转移酶选择性地交联到胶原、肌动蛋白、纤维蛋白原和纤维蛋白、同样参与上述过程的蛋白质。在以凝血酶活化血小板之后，胸腺素β4以时间和钙依赖性方式释放并交联到纤维蛋白上。血小板因子XIIIa由受刺激的血小板共释放。血小板释放的胸腺素β4与纤维蛋白的交联似乎由因子XIIIa介导，提供了提高血块和组织损伤部位附近的胸腺素β4局部浓度的机制，以促进伤口愈合、血管生成和炎性反应。
纤维蛋白原是含有两个相同亚单元的化学二聚物，其中每一个均由通过大量二硫键结合在一起的三条多肽链Aα、Bβ和γ组成。所有六条链的二硫键合NH2端部分形成中央E区，而COOH端部分形成两端的D区和两个αC域。当纤维蛋白原转化为纤维蛋白时，凝血酶介导的NH2端血纤维蛋白肽A和B从纤维蛋白原的移除和NH2端血纤维蛋白肽A和B从纤维蛋白原Aα和Bβ链的移除导致其活性序列(聚合位点)暴露，使相邻分子的E和D区之间能够相互作用(DDE相互作用)以形成纤维蛋白聚合物。所述聚合物由因子XIIIa通过纤维蛋白α和γ链的COOH-端部分交联。相邻D区γ链的分子间交联快速发生，生成γ-γ二聚物，而α聚合物之间(αC结构域)的交联发生较慢，导致形成α聚合物。此外，α链用于将纤维蛋白与诸如纤连蛋白、α2-抗血纤维蛋白酶和PAI-2的蛋白质交联。因而，设想这些链亦可参与胸腺素β4的交联。
为了阐明将胸腺素β4引入纤维蛋白(原)的机理，在存在和不存在因子XIIIa的条件下利用纤维蛋白原、纤维蛋白及其重组片段(结构域)研究了其相互作用。研究表明虽然纤维蛋白(原)和胸腺素β4之间似乎没有表现出明显的非共价相互作用，但是因子XIIIa将胸腺素β4有效交联至纤维蛋白原和纤维蛋白，并且所述交联主要通过其包括残基392-610的αC结构域的COOH-端部分发生。
根据一个实施方案，提供包括粘合剂和含有氨基酸序列LKKTET或其保守变体的多肽的基本纯化组分。根据一个实施方案，所述粘合剂能够粘接至诸如支架(stent)的医疗器械。在特别优选的实施方案中，所述粘合剂能够粘接至活体如人类的组织。
在优选实施方案中，所述粘合剂是生物可降解粘合剂。当用于本文时，术语生物可降解粘合剂包括生物可吸收或可侵蚀(errodable)粘合剂。在优选实施方案中，所发明的组合物最初为流体或半流体状态，最优选为液体或半液体状态。在特别优选的实施方案中，应用后，所述粘合剂粘度上升并且在粘接至组织的同时最终部分固化。所述组合物可通过涂覆至层状区域，最优选通过喷雾或利用刷子来导入。
在优选实施方案中，用于本发明的粘合剂是纤维蛋白封接胶基质(纤维蛋白胶)。纤维蛋白胶是分离的纤维蛋白原和胸腺素/钙溶液的双组分体系。当所述两种溶液组合时，所得混合物模拟凝血级联的最终阶段形成纤维蛋白凝块。纤维蛋白原可临时由自体同源、单一供体或库藏血液制得。在欧洲，可购得的纤维蛋白胶品牌为Beriplast、Tissel和Tissucol。纤维蛋白胶广泛用于各种手术程序以在各个解剖部位修补、封接和附着组织。
因而，本发明提供将LKKTET多肽递送至活体一定部位的方法。在优选实施方案中，该部位是表面。本发明方法包括将本发明的组合物涂覆至所述部位。在优选实施方案中，所述部位是伤口，如急性或慢性伤口。
在优选实施方案中，所述粘合剂是纤维蛋白、纤维蛋白原、纤维蛋白胶、胶原、任意上述物质的片段或任意上述物质的混合物。可用的胶原粘合剂包括1、2、3、4和/或5型胶原。其它粘合剂包括肌动蛋白或整合素粘合剂。
在其它实施方案中，用于本发明组合物的生物可降解粘合剂是凝胶(例如粘性胶原凝胶)、凝胶/纤维蛋白混合物、粉末等。
在优选实施方案中，粘合剂共价结合至LKKTET肽，最为优选的是通过因子XIIIa结合。在特别优选实施方案中，粘合剂是纤维蛋白或纤维蛋白原的片段。
在优选实施方案中，LKKTET多肽包含氨基酸序列KLKKTET或LKKTETQ、胸腺素β4(Tβ4)、Tβ4的N-端变体、Tβ4的C-端变体、Tβ4的同工型、Tβ4的剪接变体、Tβ4、Tβ4亚砜、淋巴Tβ4、聚乙二醇改性(pegylate)Tβ4或任何其它的具有肌动蛋白结合结构域的肌动蛋白螯合或集束蛋白，或者包含或基本由氨基酸序列LKKTET或其保守变体组成的肽片段。通过引用并入本文的国际申请No.PCT/US99/17282公开了根据本发明有用的Tβ4同工型以及可用于本发明的氨基酸序列LKKTET及其保守变体。通过引用并入本文的国际申请No.PCT/GB99/00833(WO 99/49883)公开了可根据本发明利用的氧化胸腺素β4。虽然下文中主要针对Tβ4和Tβ4同工型来描述本发明，但是应该理解以下描述可同样适用于氨基酸序列LKKTET、LKKTETQ、包含或基本由LKKTET、LKKTETQ、其保守变体组成的肽和片段，以及氧化胸腺素β4。
接触损伤部位的实例包括用只包含粘合剂/Tβ4的组合物接触所述部位，或用包含粘合剂/Tβ4和增强Tβ4的渗透性或延迟或减慢Tβ4肽释放至待治疗区域的至少一种药剂的组合物接触所述部位。患者可以是哺乳动物，优选人。
Tβ4或其类似物、同工型或衍生物可以任意合适的有效量施用。例如，Tβ4的施用剂量可为约0.1-50微克的Tβ4，更优选为约1-25微克。
根据本发明的组合物可每日、隔日等施用，每天施用一次或多次，如每天施用2、3、4或更多次。
已鉴定出Tβ4同工型，其与Tβ4的已知氨基酸序列具有约70％或约75％或约80％或更高的同源性。所述同工型例如包括Tβ4ala、Tβ9、Tβ10、Tβ11、Tβ12、Tβ13、Tβ14和Tβ15。与Tβ4类似，Tβ10和Tβ15同工型以及Tβ4剪接变体已显示为螯合肌动蛋白。Tβ4、Tβ10和Tβ15以及其它同工型具有氨基酸序列LKKTET，该序列似乎参与介导肌动蛋白的螯合或结合。虽然不希望拘束于任何特定理论，但是Tβ4同工型的活性至少部分是由于调节肌动蛋白聚合所致。β-胸腺素似乎是通过螯合游离G-肌动蛋白来解聚F-肌动蛋白。因此，Tβ4调节肌动蛋白聚合的能力可全部或部分地由其通过LKKTET序列结合或螯合肌动蛋白所致。因此，如同Tβ4一样，其它结合或螯合肌动蛋白或调节肌动蛋白聚合的蛋白质，包括具有氨基酸序列LKKTET的Tβ4同工型，单独或如本文所述与Tβ4组合可能是有效的。
因此，具体考虑已知的Tβ4同工型，如Tβ4ala、Tβ9、Tβ10、Tβ11、Tβ12、Tβ13、Tβ14和Tβ15以及尚未鉴定的Tβ4同工型和Tβ4剪接变体对于本发明的方法将是有用的。这种Tβ4同工型在本发明方法(包括实施于患者的方法)中是有用的。因此，本发明还提供包含Tβ4与Tβ4同工型Tβ4ala、Tβ9、Tβ10、Tβ11、Tβ12、Tβ13、Tβ14、Tβ15以及药学上可接受的载体的药物组合物。
此外，如在合适的螯合、结合、活动化或聚合分析中所验证或者通过介导肌动蛋白结合的氨基酸序列例如LKKTET的存在所鉴定的，具有肌动蛋白螯合和结合能力或能够使肌动蛋白活动或调节肌动蛋白聚合的其它蛋白质可类似地应用于本发明方法中。该蛋白质例如包括凝溶胶蛋白、维生素D结合蛋白(DBP)、微丝结合蛋白(profilin)、切丝蛋白(cofilin)、adsevertin、propomyosin、fincilin、蚕食蛋白(depactin)、DnaseI、绒毛蛋白(villin)、法安明(Fragmin)、肌割蛋白(severin)、加帽蛋白(cappingprotein)、β-辅肌动蛋白和acumentin。当该方法包括实施于患者的方法时，本发明还提供包含如本文所指出的凝溶胶蛋白、维生素D结合蛋白(DBP)、微丝结合蛋白(profilin)、切丝蛋白(cofilin)、蚕食蛋白(depactin)、DnaseI、绒毛蛋白(villin)、法安明(Fragmin)、肌割蛋白(severin)、加帽蛋白(capping protein)、β-辅肌动蛋白和acumentin的药物组合物。因而，本发明包括包含氨基酸序列LKKTET(可在其一级氨基酸序列内)及其保守变体的多肽的用途。
在此，术语“保守变体”或其语法变化指由另一生物学相似残基替代氨基酸残基。保守变异的例子包括将亲水残基如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或蛋氨酸替代为另一种，将极性残基替代为另一种，如将精氨酸替代为赖氨酸、将谷氨酸替代为天冬氨酸或谷氨酰胺替代为天冬酰胺等。
Tβ4位于许多组织和细胞类型中，因而刺激Tβ4生成的药剂可加入或包含影响Tβ4组织和/或细胞生成的组合物。这种药剂包括生长因子家族成员，如胰岛素样生长因子(IGF-1)、血小板衍生生长因子(PDGF)、表皮生长因子(EGF)、转化生长因子β(TGF-β)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、胸腺素α1(Tα1)和血管内皮生长因子(VEGF)。更优选的是，所述药剂为转化生长因子β(TGF-β)或TGF-β家族的其它成员。
此外，辅助或刺激愈合的药剂可连同Tβ4或Tβ4同工型一起加入组合物。该药剂包括血管生成药、生长因子、指导细胞分化的药剂。例如，但并非限制，单独或组合的Tβ4或Tβ4同工型可与一种或多种有效量的以下药剂组合加入VEGF、KGF、FGF、PDGF、TGFβ、IGF-1、IGF-2、IL-1、前胸腺素α和胸腺素α11。
治疗或防止炎症、损伤和退变的实际剂量、配方或组合物取决于多种因素，包括患者体形和健康状况。然而，本领域普通技术人员可以利用上述PCT/US99/17282和本文所引用的参考文献所公开的用于确定临床剂量的方法和技术的教导来确定合适的施用剂量。
在优选实施方案中，多肽浓度为约0.01-1摩尔多肽每摩尔粘合剂，更优选为约0.1-0.5摩尔多肽每摩尔粘合剂，最优选为约0.2-0.4摩尔多肽每摩尔粘合剂。
合适的配方包括浓度为约0.001-10重量％、约0.01-0.1重量％或甚至为约0.05重量％的Tβ4或Tβ4同工型。
本发明包括与Tβ4肽或其功能片段相互作用的抗体的用途。提供了基本由合并的具有不同表位特异性的单克隆抗体组成的抗体以及不同的单克隆抗体制剂。单克隆抗体是由含蛋白质片段的抗原通过本领域普通技术人员所公知的方法，如公开在上文的PCT/US99/17282中的方法所制备。本发明所用的术语抗体包括单克隆和多克隆抗体。
在又一实施方案中，本发明提供通过施加有效量的调节Tβ4基因表达的药剂来治疗患者的方法。术语“调节”是指当Tβ4过表达时抑制或阻遏Tβ4表达，当Tβ4表达低时诱导其表达。术语“有效量”是指有效调节Tβ4的基因表达产生有效治疗的Tβ4药剂的量。调节Tβ4或Tβ4同工型基因表达的药剂例如可以是多聚核苷酸。多聚核苷酸可以是反义、三联体药剂或核酶。例如，可以利用针对结构基因区或针对Tβ4的启动子区的反义药剂。
在另一实施方案中，本发明提供利用调节Tβ4活性的化合物的方法。影响Tβ4活性的化合物(例如拮抗剂和激动剂)包括肽、多模拟物、多肽、化学化合物、无机物如锌和生物试剂。
然而不拘泥于任何特定理论，本发明可促进愈合或预防炎症和损伤，这是通过诱导末端脱氧核苷转移酶(非模板指导的DNA聚合酶)以降低一种或多种炎性细胞因子或趋化因子的水平，并充当内皮细胞的趋化因子，从而促进愈合或预防由损伤或其它变性或环境因素引起的组织变性变化。
本发明由以下实施例进一步说明，以下实施例不具有限制性。
实施例蛋白质和试剂去除纤维蛋白原、纤连蛋白和von Willebrand因子的人纤维蛋白溶解原购自Enzyme Research Laboratories(South Bend，IN)。对应于人纤维蛋白原αC-结构域(残基Aα221-610)的重组αC-片段和其对应于NH2和COOH-端一半(分别是残基Aα221-391和Aα392-610)的截短变体使用pET20b表达载体在E.coli中生成。包含人纤维蛋白原γ链中残基148-411的重组γ-模块使用相同的表达载体在E.coli生成。
牛凝血酶(1000NIHu/mg)、抑肽酶(4.4TIU/mg)、抗兔IgG-辣根偶联物和荧光素异硫氰酸酯(FITC)购自Sigma。重组因子XIII由Zymogenetics，Inc.(西雅图，WA)赠送。合成胸腺素β4由Regenerx Biopharmaceuticals，Inc.(Bethesda，MD)赠送。抗胸腺素β4血清根据公知方法制备。
因子XIII的活化因子XIII溶于含0.15M NaCl的25mM Tris缓冲液，pH8.0(TBS)，利用凝血酶或利用CaCl2将其活化；CaCl2的制备应避免可潜在激活纤维蛋白原的凝血酶的存在。通过加入终浓度为25NIH u/ml的牛凝血酶和2.5CaCl2mM来制备凝血酶激活的FFXIII[FXIIIa(THr)]。通过加入终浓度为50mM的CaCl2来制备Ca2+-激活的凝血酶[FXIIIa(Ca)]。在两种混合物中FXIII的终浓度为1.5mg/ml；两种混合物在实验之前室温孵育10分钟。
用FITC标记胸腺素β4通过与荧光素异硫氰酸酯(FITC)反应来荧光标记胸腺素β4。通过在NAP5Sephadex G-25柱(Amersham Biosciences)上凝胶过滤，将胸腺素β4转移至pH9.5的0.1M NaHCO3缓冲液中，随后加入1.2摩尔过量的FITC并在黑暗中于37℃下孵育该混合物2小时。在NAP5柱上除去未反应的FITC。山所述分光光度分析确定的标记程度为0.9摩尔FITC每摩尔胸腺素β4。
固相结合分析通过使用塑料微升板进行ELISA研究在存在或不存在FXIIIa下，胸腺素β4和纤维蛋白(原)及其片段之间的相互作用。在-4℃下，以均溶于pH8.3的0.1M NaHCO3缓冲液中10μg/ml纤维蛋白原和纤维蛋白或20μg/ml重组体片段将微升板孔包被过夜。通过向孔中加入含10μg/ml纤维蛋白原、1NIH u/ml凝血酶和400u/ml抑肽酶的混合物并随后在+4℃下孵育过夜来制备纤维蛋白。随后通过在37℃下与Super Blocker(Pierce)孵育1小时来封闭孔。用含0.05％Tween-20的TBS(TBS-Tween)洗后，将指示浓度的胸腺素β4、FXIII、FXIIIa(Thr)和FXIIIa(Ca)加入孔中并在37℃下孵育2-2.5小时。通过与兔抗胸腺素β4血清和偶联过氧化酶的抗兔IgG反应来检测结合(引入)的胸腺素β4。将TMB Microwell Peroxidase Substrase加入孔中，并且在450nm分光光度分析法测量引入的胸腺素β4。
将胸腺素β4引入纤维蛋白原和纤维蛋白在Eppendorf管中进行将FITC标记和未标记的胸腺素β4引入纤维蛋白原和纤维蛋白中的反应，所述Eppendorf管含有溶于加有2.5mM CaCl2的100μL TBS的3mg/mL(9μM)纤维蛋白原和150μg/L(30μM)胸腺素β4或FITC标记胸腺素β4的混合物。通过添加FXIIIa(Ca)或FXIIIa(Thr)至终浓度30μg/mL的来起始反应。在含FXIIIa(Thr)的混合物中凝血酶的终浓度为2.5NIHu/mL，足以快速形成肉眼可见的纤维蛋白凝块。与FITC标记的胸腺素β4的反应在37℃下于黑暗中持续4小时，通过在沸水中加热5分钟使酶热失活来终止反应，期间纤维蛋白原和纤维蛋白变性并沉淀。将沉淀物离心并在TBS中洗涤3次，随后溶解。采用吸收摩尔系数E2801％＝15.0和ε495＝72,000M-1cm-1通过分光光度分析测定溶解的沉淀物中纤维蛋白(原)和FITC标记的胸腺素β4的量。为了制备通过SDS-PAGE和Western blot分析用的具有未标记胸腺素β4的样品，将反应混合物在指示时间如上热失活并通过加入含有SDS和还原剂的样品缓冲液(Invitrogen)而溶解。
动力学分析为了分析将胸腺素β4引入不同的纤维蛋白(原)片段的动力学，将所述片段固定在微升板的孔上(如上所述，除了所有片段的浓度为20μg/mL)并且在存在10μg/L凝血酶激活因子XIIIa的情况下与几种浓度的胸腺素β4孵育。在1小时的孵育期间，通过每15分钟加入碘乙酰胺至终浓度10mM来抑制孵育混合物，并用上述兔抗胸腺素β4血清检测每个时间点引入的胸腺素β4。不同胸腺素β4浓度下引入(V)反应的初始速率由反应时间进程图的斜率得到并且表示为tanα＝A450/t(分钟)，其中A450表示450nm处以光学单位(o.u)表示的吸光度，其正比于引入胸腺素β4的量。表观Michaelis常数Km得自lineweaver-Burk作图，1/V(min/o.u.)对1/[S](μM-1)，其中[S]为胸腺素β4的浓度。
Western印迹分析如下所述检测引入至纤维蛋白(原)及其片段的胸腺素β4。将如上所述制备的样品电泳并如早先所述电迁移至硝酸纤维膜(Invitrogen)。将膜用酪蛋白封闭剂封闭1小时，并且通过与兔抗胸腺素β4血清和偶联过氧化物酶的抗兔IgG反应来检测胸腺素β4。通过制造商推荐的使用supersignal west pico化学发光底物的程序进行过氧化物酶标记的蛋白带的可视化。
ELISA检测胸腺素β4向纤维蛋白原和纤维蛋白的引入为了测试因子XIIIa可介导胸腺素β4与纤维蛋白(原)的交联并阐明该交联的机理，我们在存在或不存在重组体因子XIII的情况下进行了对胸腺素β4与纤维蛋白原和纤维蛋白的相互作用的直接研究。应该注意的是重组体因子XIII包含两个a亚单位(a2)，与对应于血小板形成因子XIII的血浆因子XIII相反。
在ELISA实验中，当将150μg/ml(30μM)胸腺素β4与固定的纤维蛋白原孵育时，不存在因子XIII和存在未激活的因子XIII时仅观察到低信号，说明它们之间的相互作用如果有的话也是非常弱。当在不存在或存在未激活的因子XIIIa的条件下将胸腺素β4与固定的纤维蛋白孵育时，信号明显增加，说明因子XIIIa介导胸腺素β4向纤维蛋白原的结合(引入)，所述未激活的因子XIIIa通过加入CaCl2而被激活，从而避免纤维蛋白原在孔中转化为纤维蛋白。采用固定的纤维蛋白观察到相似的情况，只是引入水平要高于向纤维蛋白原的引入。两种情况下的引入均为剂量依赖的。当因子XIII由凝血酶而非Ca2+激活时，在纤维蛋白上的引入进一步增加。该差异可能是这两种因子XIIIa物质不同的比活性所致。这些结果说明激活的XIII与组织转谷氨酰胺酶类似，介导胸腺素β4向纤维蛋白原和纤维蛋白中的引入。所述结果还说明胸腺素β4与纤维蛋白原和纤维蛋白之间均无明显的非共价相互作用。
胸腺素β4引入至纤维蛋白原和纤维蛋白的进一步分析为了进一步表征因子XIIIa介导的胸腺素β4向纤维蛋白(原)的引入，通过免疫印迹法在不同时间点分析混合物的凝血酶、因子XIII、胸腺素β4和纤维蛋白。如实验程序所述制备分析用的混合物和样品。将样品电迁移至硝酸纤维膜并且以抗胸腺素β4血清作为探针检测。免疫分析结果表明因子XIIIa将胸腺素β4共价引入纤维蛋白，类似于组织转谷氨酰胺酶，且引入(交联)胸腺素β4的量似乎在4小时后达到饱和。选择该时间以评价引入程度。为此，以FITC发色基团标记胸腺素β4，该发色基团可以在纤维蛋白原/胸腺素β4和纤维蛋白/胸腺素β4混合物中直接测量。基于由Werstern印迹分析所揭示的引入模式，该修饰并不影响其引入至纤维蛋白原或纤维蛋白。如上所述但具有FTIC标记的胸腺素β4的类似混合物孵育4小时，然后基于分光光度分析测定的每个样品中纤维蛋白(原)和引入的FITC标记胸腺素β4的量来评价引入程度。结果表明在包括生理浓度(9μM)纤维蛋白原的选定条件下，因子XIIIa分别引入大量的FITC-胸腺素β4，约0.2-0.4摩尔每摩尔纤维蛋白原和纤维蛋白。
胸腺素β4向单独的纤维蛋白(原)链引入为了确定三条纤维蛋白(原)链中哪一条参与同胸腺素β4的交联，我们通过SDS-PAGE和Western印迹法分析了存在或不存在胸腺素β4的条件下因子XIIIa介导的纤维蛋白原和纤维蛋白交联的时间进程。众所周知，在纤维蛋白中，因子XIIIa快速交联γ链的COOH端部分以生成γ-γ二聚体，随后交联α链形成α-二聚体、三聚体和α-聚合物；纤维蛋白原以相同方式但较慢速率交联。当通过SDS-PAGE在还原条件下分析时，分别对应于单独的纤维蛋白原和纤维蛋白多肽链Aα、Bβ、γ和α、β、γ的条带被充分溶解。纤维蛋白原与因子XIIIa的孵育导致对应于γ-γ二聚体和Aα-Aα二聚体与三聚体的条带逐渐消失；开始时还观察到出现最可能对应于Aα聚合物的一些物质。当纤维蛋白原与因子XIIIa在胸腺素β4存在下孵育时，在对应于单独链和其交联变体的条带强度方面未发现明显差异。用纤维蛋白得到了类似结果，只是其α和γ链的交联发生得更为快速，与预期一样，起始时物质量较高。随后的Western印迹实验表明孵育30分钟之后，大量胸腺素β4被引入纤维蛋白原Aα链，孵育150分钟后，一些胸腺素β4被引入Aα-Aα二聚体中。胸腺素β4想象纤维蛋白α链和α-α二聚体的引入更为快速，并且在孵育150分钟后，胸腺素β4物质在更高分子量形式的α链(α聚合物)中观察到。这些结果说明纤维蛋白原Aα和纤维蛋白α链含有用于共价引入胸腺素β4的主要位点。同时，150分钟孵育后，迁移率在γ-γ和α-α二聚体之间的低强度条带的出现表明胸腺素β4也可以引入到纤维蛋白γ链(γ-γ二聚体)。作为选择，该条带可对应于α-α二聚体的蛋白水解的截短变体。
胸腺素β4向重组纤维蛋白(原)片段的引入充分认识到形成αC结构域和γ模块的纤维蛋白原Aα和γ链的COOH端蛋白质包含反应性Gln和Lys残基，所述残基通过因子XIIIa交联在纤维蛋白中，因此可能参与同胸腺素β4的交联。为了验证这一点，并进一步定位胸腺素β4在纤维蛋白(原)中的交联位点，通过SDS-PAGE和Western印迹法分析胸腺素β4向重组体γ-模块(残基148-411)和αC-结构域(Aα221-391和Aα392-610亚片段)的引入。在胸腺素β4存在下将αC-结构域和γ-模块与因子XIIIa孵育导致有效交联，并出现较高分子量形式、二聚体、三聚体和寡聚体。同时，分别含有主要受体Gln和供体Lys残基的Aα221-391和Aα392-610亚片段的交联效率大大下降。当样品电迁移至硝酸纤维膜并用抗胸腺素β4血清做为探针检测时，在αC-结构域、γ-模块和其较高分子量形式的变体、二聚体、三聚体和寡聚体中检测到大量的胸腺素β4。向Aα392-610亚片段单体和寡聚体中的引入也是明显的，而在Aα221-391寡聚体中仅检测到少量的胸腺素β4。该结果表明胸腺素β4可以交联至αC-结构域和γ-模块，并且前者Aα392-610区中的反应性Lys残基参与交联。
通过ELISA证实了上述观察。当胸腺素β4在因子XIIIa存在下与固定的γ-模块和αC-结构域变体孵育时，其有效引入到γ-模块中，并引入到αC-结构域和Aα392-610亚片段中，而向Aα221-391的引入非常慢。应该注意在所有研究的浓度下，γ-模块的引入几乎比αC-结构域变体低两倍。当胸腺素β4在未激活的因子XIII存在或不存在下与相同的固定物质孵育时，在所有情况下引入都非常慢。这表明和纤维蛋白和纤维蛋白原情况一样，在胸腺素β4和重组片段之间没有明显的非共价相互作用。
之前显示因子XIIIa交联纤维蛋白γ链表现出表观Michaelis行为。假设因子XIIIa表现为Michawlis酶，当交联胸腺素β4至固定的γ-模块和αC-结构域变体时，可以确定该交联的动力学参数。动力学数据的分析给出以下数值的引入反应的表观Michawlis常数(Km)胸腺素β4向γ-模块的引入为183±29μM；胸腺素β4向αC-结构域和其Aα392-610亚片段的引入分别为17.6±2.5μM和8.6±3.7μM。γ-模块的Km值远高于αC-结构域及其亚片段的值，这说明胸腺素β4向αC-结构域的交联更为有效。就此而论，Aα392-610亚片段的Km与之前测定的因子XIIIa介导的γ-γ交联的Km＝6.2μM相当。αC-结构域和Aα392-610亚片段的Km值的两倍差异可解释为胸腺素β4的反应性Gln残基和Aα392-610区之间的竞争，即αC-至-αC和胸腺素β4-至-αC的交联之间的竞争。一致地，对αC-结构域和其Aα392-610亚片段的双倒数作图显示出竞争抑制的特征性模式。
总体而言，所述结果表明因子XIIIa有效地将胸腺素β4交联至包含残基Aα392-610的分离的αC-结构域的COOH-端部分，而向分离的γ-模块的引入效率较低，并且在纤维蛋白原和纤维蛋白中所述引入主要发生在αC-结构域。
纤维蛋白(原)通过与生理活性蛋白质和细胞受体的相互作用在伤口愈合中发挥重要作用。具体而言，纤维蛋白基质刺激炎性反应和由内皮细胞的毛细血管形成(血管生成)，这是伤口愈合过程中的基本步骤，分别通过与白细胞整合素Mac-1和内皮细胞受体VE-钙粘着蛋白的相互作用进行。其还以高亲和力与碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和血管内皮生长因子(VEGF)相互作用，将这些强的血管生成刺激剂共定位在纤维蛋白沉积部位和使其促进伤口愈合。纤维蛋白也可保留在胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFPB-3)处，形成与IGF-1的复合体。胸腺素β4作为强的血管生成和伤口愈合因子，还可以通过组织转谷氨酰胺酶引入纤维蛋白并且明显进一步增加纤维蛋白基质的伤口愈合潜力。
虽然所有的转谷氨酰胺酶催化相同的反应，在反应性Gln和Lys残基之间共价的γ-谷氨酰-ε-赖氨酰异肽键的形成、其对底物的特异性可以不同。例如，作为血浆转谷氨酰胺酶的因子XIIIa在纤维蛋白中特异性交联γ和α链分别得到γ-γ二聚体和α-聚合物，而组织转谷氨酰胺酶具有较低特异性并且还可以生成α-γ链交联。丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpin)PAI-2对于纤维蛋白(原)的交联模式对于组织转谷氨酰胺酶和因子XIIIa也发现是不同的。最初显示胸腺素β4通过几内亚猪的肝组织转谷氨酰胺酶引入纤维蛋白中；假设其通过因子XIIIa向纤维蛋白的引入是基于凝血酶激活的血小板共释放因子XIII和胸腺素β4以及胸腺素β4交联纤维蛋白。本研究中，直接证实胸腺素β4可通过因子XIIIa引入纤维蛋白原和纤维蛋白中。此外，发现引入程度相当高，分别为0.2-0.4摩尔胸腺素β4每摩尔纤维蛋白原和纤维蛋白。由于纤维蛋白原在血浆中的浓度为约9uM，因此纤维蛋白在纤维蛋白沉积处的局部浓度应该高得多。考虑到胸腺素β4在0.1nM-1μM浓度下表现出前血管生成活性，该引入程度明显在生理上是显著的，应该足以增加纤维蛋白凝块的伤口愈合潜力。
已知因子XIIIa将多种血浆蛋白、α2-抗纤维蛋白溶酶、PAI-2、纤连蛋白、凝血栓蛋白和von Willebrand因子引入纤维蛋白中。仅确定了其中一些的引入机理。例如，纤连蛋白在共价交联因子XIIIa之前以高亲和力非共价结合纤维蛋白αC-结构域；每个蛋白质中的识别位点和反应性Gln和Lys残基位于不同区域，提供合适的交联位点取向。此外，因子XIIIa与αC-结构域的相互作用还增加了反应的特异性。为了验证非共价结合的胸腺素β4是否进行与纤维蛋白的交联，研究了有和没有非激活因子XIII存在下其与固定的纤维蛋白原和纤维蛋白的相互作用。与对纤维蛋白表现出高亲和力的其它促血管生成因子如bFGF和VEGF不同，在所有情况下都没有观察到与胸腺素β4的明显非共价相互作用。仅在活化因子XIIIa存在下观察到引入，说明共价交联可能是在纤维蛋白凝块中保留胸腺素β4的唯一机制。
所述结果清楚表明虽然胸腺素β4可通过因子XIIIa引入分离的γ-模块和αC-结构域变体中，但是在纤维蛋白(原)中它主要交联到αC-结构域中，亦即交联到其Aα392-610区中。胸腺素β4和纤维蛋白(原)中鉴定到的反应性Lys和Gln残基分布的分析对该发现提供了合理的解释。胸腺素β4含有反应性氨基供体Lys38和两个氨基受体Gln23和Gln36，其可能参与同其它蛋白质的交联反应。在γ链中仅有两个反应性残基参与分子间γ-γ交联，即Gln398(或Gln399)和Lys406，二者均位于γ-模块中。当分离的γ-模块用因子XIIIa处理时，交联似乎随机发生，得到二聚体、三聚体/寡聚体；胸腺素β4引入至所有这些物质中。在纤维蛋白中，这些区域通过DD:E相互作用以反平行方式排列，促进一条链中Gln398/399和另一条链中Lys406之间交联形成γ-γ二聚体。该交联反应效率远高于这些残基和胸腺素β4之间的交联反应，因此在本研究中观察到很少或没有胸腺素β4被引入到纤维蛋白γ链并不令人惊奇。
与γ链相反，Aα链含有多个反应性谷氨酰胺和赖氨酸残基。发现以下残基参与纤维蛋白中α链或重组αC-结构域之间的交联Gln221、237、328和366以及Lys508、539、556、580和601。Aα链Lys303表现为充当因子XIIIa介导的交联丝氨酸蛋白酶抑制剂与纤维蛋白(原)交联的氨基供体。该Lys对另一丝氨酸蛋白酶抑制剂PAI-2并无反应性，其利用组织转谷氨酰胺酶和因子XIIIa通过其它Aα链赖氨酸残基148、176、183、230、413和457来交联。以合成肽模拟α2-抗纤维蛋白溶酶交联区的研究表明其通过12个反应性赖氨酸残基引入到纤维蛋白α链中，12个反应性赖氨酸残基是占总活性78％的Lys418、448、508、539、556和580以及较低反应性的Lys208、Lys219和/或224、Lys427、429、601和606。纤维蛋白(原)Aα368-610区内的至少10个赖氨酸残基涉及与纤连蛋白的交联反应。上述分析表明纤维蛋白中鉴定到的大部分反应性残基位于其αC-结构域中，即αC-结构域的392-610区，胸腺素β4优选交联至该区域，该区域包含至少11个反应性Lys残基，并且这些残基中仅有半数被用于α-α交联。还表明虽然胸腺素β4可以竞争参与α-α交联的反应性赖氨酸残基，但是其与αC-结构域的交联的发生可不依赖于其分子间α-α交联，从而提供其向纤维蛋白的有效引入。因而，αC-结构域的反应性赖氨酸残基不仅用于α-α交联，而且同时容纳有助于伤口愈合和其他生理与病理过程的纤维蛋白基质性质的生理活性蛋白质，包括胸腺素β4。
纤维蛋白原以可控方式聚合生成易于粘附至不同细胞、无免疫原性且生物可降解的凝块。这使其成为理想的止血剂和生物粘附剂(纤维蛋白封接剂)，其已经逐渐作为用于止血的止血剂而用于大量外科应用，辅助组织封接和伤口愈合。纤维蛋白封接剂在伤口愈合和其他治疗中的用途可以通过加入生物活性药剂得到增强。例如，在细胞和动物模型中表明纤维蛋白可用作局部递送抗生素和生长因子的载体。当由纤维蛋白包封的抗生素由于低溶解度而缓慢释放时，通过生长因子与纤维蛋白之间高亲和力的相互作用或通过生长因子直接共价交联至纤维蛋白而实现生长因子在纤维蛋白中的保留。胸腺素β4通过与因子XIIIa交联而引入纤维蛋白(原)中的能力可用于将其固定在纤维蛋白封接剂上。该研究证明了向纤维蛋白原和纤维蛋白引入的高效率，支持该方法。
总而言之，实验研究证实作为生物活性肽的胸腺素β4可通过与因子XIIIa共价交联而引入纤维蛋白中，证明了在组分的生理浓度下其引入至纤维蛋白原和纤维蛋白的高效率，并定位了纤维蛋白(原)αC-结构域的Aα392-610区内的引入位点。实验数据支持引入生理显著量的胸腺素β4到纤维蛋白封接剂中，以递送至创伤愈合处。
组织转谷氨酰胺酶和可能的血浆转谷氨酰胺酶、因子XIIIa可将生理活性肽胸腺素β4引入纤维蛋白(原)中。为了阐明该引入的机理，通过免疫印迹法和ELISA研究了胸腺素β4与纤维蛋白原、纤维蛋白和其重组体片段、γ-模块(γ链残基148-411)和αC-结构域(Aα链残基221-610)以及其截短变体的相互作用。不存在活化的因子XIIIa时检测不到它们之间明显的非共价相互作用，而在其存在时，胸腺素β4被有效引入到纤维蛋白中，较小程度地引入到纤维蛋白原中。在纤维蛋白(原)和因子XIIIa的生理浓度下引入是显著的，其中胸腺素β4与纤维蛋白原和纤维蛋白的摩尔引入比分别为0.2和0.4。进一步的实验表明虽然活化的因子XIIIa将胸腺素β4引入到分离的γ-模块和αC-结构域中，但是在纤维蛋白中αC-结构域用作主要的引入位点。该位点进一步定位至αC-结构域的COOH-端部分，包括残基392-610。
权利要求
1.一种包含基本纯化组分的组合物，所述基本纯化组分包括粘合剂和含有氨基酸序列LKKTET或其保守变体的多肽。
2.权利要求1的组合物，其中所述粘合剂能够粘附于活体组织。
3.权利要求2的组合物，其中所述粘合剂是生物可降解的。
4.权利要求1的组合物，其中所述粘合剂是纤维蛋白、纤维蛋白原、纤维蛋白胶、胶原、其片段或其混合物。
5.权利要求4的组合物，其中所述粘合剂和所述多肽共价结合在一起。
6.权利要求5的组合物，其中所述粘合剂和所述多肽通过因子XIIIa共价结合。
7.权利要求6的组合物，其中所述粘合剂是纤维蛋白或纤维蛋白原的片段。
8.权利要求1的组合物，其中所述多肽包含氨基酸序列KLKKTET或LKKTETQ、胸腺素β4(Tβ4)、Tβ4的N-端变体、Tβ4的C-端变体、Tβ4的同工型、Tβ4的剪接变体、氧化的Tβ4、Tβ4亚砜、淋巴Tβ4和聚乙二醇改性Tβ4。
9.权利要求1的组合物，其中所述多肽是重组的或合成的。
10.权利要求1的组合物，其中所述多肽是抗体。
11.权利要求10的组合物，其中所述抗体是多克隆的或单克隆的。
12.权利要求4的组合物，其中所述多肽的浓度为约0.01-1摩尔所述多肽每摩尔所述粘合剂。
13.权利要求12的组合物，其中所述多肽的浓度为约0.1-0.5摩尔所述多肽每摩尔所述粘合剂。
14.权利要求13的组合物，其中所述多肽的浓度为约0.2-0.4摩尔所述多肽每摩尔所述粘合剂。
15.一种递送多肽至一定部位的方法，包括将权利要求1的组合物引入所述部位。
16.权利要求15的方法，其中所述组合物通过喷雾应用于所述部位。
17.权利要求16的方法，其中所述部位是伤口。
18.权利要求15的方法，其中所述粘合剂能够粘附于活体组织。
19.权利要求18的方法，其中所述粘合剂是生物可降解的。
20.权利要求15的方法，其中所述粘合剂是纤维蛋白、纤维蛋白原、纤维蛋白胶、胶原、其片段或其混合物。
21.权利要求20的方法，其中所述粘合剂和所述多肽共价结合。
22.权利要求21的方法，其中所述粘合剂和所述多肽通过因子XIIIa共价结合。
23.权利要求22的方法，其中所述粘合剂是纤维蛋白或纤维蛋白原的片段。
24.权利要求1的方法，其中所述多肽包含氨基酸序列KLKKTET或LKKTETQ、胸腺素β4(Tβ4)、Tβ4的N-端变体、Tβ4的C-端变体、Tβ4的同工型、Tβ4的剪接变体、氧化的Tβ4、Tβ4亚砜、淋巴Tβ4和聚乙二醇改性Tβ4。
25.权利要求15的方法，其中所述多肽是重组的或合成的。
26.权利要求15的方法，其中所述多肽是抗体。
27.权利要求26的方法，其中所述抗体是多克隆的或单克隆的。
28.权利要求20的方法，其中所述多肽的浓度为约0.01-1摩尔所述多肽每摩尔所述粘合剂。
29.权利要求28的方法，其中所述多肽的浓度为约0.1-0.5摩尔所述多肽每摩尔所述粘合剂。
30.权利要求29的方法，其中所述多肽的浓度为约0.2-0.4摩尔所述多肽每摩尔所述粘合剂。
全文摘要
利用包括粘合剂和含有氨基酸序列LKKTET或其保守变体的多肽的基本纯化组分的组合物和方法。
文档编号A61K47/42GK1852727SQ200480008892
公开日2006年10月25日 申请日期2004年3月31日 优先权日2003年3月31日
发明者艾伦·L·戈尔茨坦 申请人:雷金纳克斯生物制药公司