用于药物和细胞治疗的递送体系的制作方法

专利名称：用于药物和细胞治疗的递送体系的制作方法
技术领域：
本申请要求以下美国临时申请的权益2003年3月4日提交的序列号为60/451,245的美国临时申请；2003年5月5日提交的序列号为60/467,601的美国临时申请；2003年5月9日提交的序列号为60/469,017的美国临时申请和2003年8月15日提交的序列号为60/495,097的美国临时申请，将其所有内容以参考的方式引入本文。
本发明主要涉及用于直接在身体组织内或身体上进行治疗剂的全身递送或局部递送和用于组织工程的生物材料的开发。特别地，本发明致力于制造包含细胞、生物活性物质或其组合的生物相容的植入体的制造，本发明还致力于用于蛋白、肽和核酸等的递送的微粒基质材料。
背景技术：
术语“生物材料”已被交替用于描述来自生物来源的材料或描述用于对人体进行治疗的材料。本发明涉及后者。在本文使用的术语“生物相容的”是指材料本身或其与治疗剂(包括活细胞)的组合不产生异质身体反应或纤维化。
葡聚糖是通过一些微生物或生物化学方法合成的高分子量多糖。平均分子量约为75 kDa的葡聚糖具有与血浆类似的胶体渗透压，因此其水溶液在临床中作为血浆膨胀剂使用。珠子形式的交联葡聚糖是蛋白的GPC(凝胶渗透层析)中使用的“Sephadex”的基础并作为由Pharmacia研发的“Cytodex”的基础，该“Cytodex”用以满足微载体细胞培养物的特殊需要。例如，专利号为6,395,302和专利号为6,303,148的美国专利(Hennink等)披露了将各种生物材料附着到交联的葡聚糖微粒上。但是，由于应用了交联剂，使基于交联葡聚糖的珠子具有潜在的毒性，所以该珠子通常不能用于植入体的制造(Blain J.F.，Maghni K.，Pelletier S.和Sirois P.炎症研究(Inflamm.Res.)，48(1999)386～392)。
专利号为4,713,249的美国专利(Schroder)描述了用于生物活性物质的贮存基质的生产方法。根据该专利，所述的贮存基质据说由碳水化合物微粒组成，通过结晶使其稳定，这意味着使用了非共价键。以下是Schroder描述的生产所谓的结晶的碳水化合物微粒的方法。在一种或多种的亲水溶剂中形成碳水化合物聚合物和生物活性物质的溶液，然后在液体疏水介质中将所述的碳水化合物和生物活性物质的混合物乳化，以形成球形小滴。然后将该乳剂导入到含有丙酮、乙醇或甲醇的结晶介质中，以形成具有非共价键交联的结晶碳水化合物聚合物基质的球状体。所述基质混合有0.001重量％～50重量％的生物活性物质。因而，在使该球状体结晶前，在所述溶液中加入生物活性物质。Schroder并没有描述通过所述多步法制备的微粒的微结构。Schroder的多步法是复杂的，并且用到了对细胞具有潜在毒性并需要去除的有机溶剂。

发明内容
在哺乳动物中降低血糖的方法，该方法包括通过口服、注射或吸入等方式对哺乳动物施用治疗有效量的结晶的葡聚糖颗粒和胰岛素，以降低该哺乳动物的血糖。该组合物可以是单相或结构化的多相组合物，该组合物用于控释释放胰岛素或其它治疗剂。


图1是分子量为70.0kDa的葡聚糖在55.0重量％的水溶液中自发形成的结晶的葡聚糖微粒的照片。
图2A是在图1中显示的结晶的葡聚糖微粒的横截面照片。
图2B是在图2A中显示的微粒的横截面照片，在该照片中可以看到该微粒的微孔结构。
图3是结晶的葡聚糖微粒的聚集体的照片。
图4是皮下注射的植入体的照片，所述植入体包含在图3中显示的结晶的葡聚糖微粒。
图5是肌肉内注射的植入体的照片，所述植入体包含在图3中显示的结晶的葡聚糖微粒。
图6A、图6B和图6C是注射有包含结晶的葡聚糖微粒的植入体的小鼠肌肉的横截面的照片(分别为注射后第1天、第4天、第28天)。
图7A和图7B是注射有包含结晶的葡聚糖微粒的植入体的小鼠肌肉的横截面的照片(注射后180天)。
图8A、图8B、图8C、图8D、图8E、图8F和图8G是注射有包含结晶的葡聚糖微粒的植入体的小鼠皮肤的横截面的照片(分别为注射后第1天、第4天、第28天、180天、180天、一年和一年)。
图9是肌肉间注射后第14天时荧光标记大分子从包含结晶的葡聚糖颗粒的植入体缓慢释放到小鼠肌肉组织的照片。
图10是质粒DNA从植入体释放后报告基因在小鼠肌肉组织中的表达的照片。
图11是在葡聚糖(分子量为500kDa)水溶液中的PEG(聚乙二醇)水溶液的乳剂的照片，所述的葡聚糖水溶液含有图1中显示的结晶的葡聚糖微粒。
图12是在PEG水溶液中的葡聚糖(分子量为500kDa)水溶液的乳剂的照片，所述葡聚糖水溶液含有图1中显示的结晶的葡聚糖微粒。
图13是葡聚糖(分子量为500kDa)水溶液中的PEG水溶液的乳剂的肌肉内注射照片，所述葡聚糖水溶液含有图1中显示的结晶的葡聚糖微粒。
图14是葡聚糖(分子量为500kDa)水溶液中的PEG水溶液的乳剂的皮下注射照片，所述葡聚糖水溶液含有图1中显示的结晶的葡聚糖微粒。
图15A和图15C示意性地图解了在水性两相体系中不同类型颗粒和各相的分配行为。
图15B是基于两相体系的植入体结构的横截面照片。
图16A、图16B、图16C和图16D是海拉细胞(HeLa cells)和结晶的葡聚糖微粒在两相体系中的分配的照片。
图17和图18是示意性地图解按照本发明实施方案的细胞治疗方法。
图19、图20和图21是示意性地图解按照本发明实施方案的治疗剂的递送方法。
图22A和图22B是针对含有各种胰岛素的组合物的血糖浓度相对于时间的相对标准化曲线图。
具体实施例方式
A.微粒的形成本发明人通过实验发现，在20℃～90℃的温度范围内，在分子量为1.0kDa～200.0kDa的葡聚糖的浓缩水溶液(40重量％～65重量％)中自发形成平均直径为0.5微米～3.5微米的结晶的葡聚糖微粒。如果需要在室温形成微粒，可以使用2kDa～18kDa的葡聚糖溶液。当然，如果需要，也可以由2kDa～18kDa的葡聚糖溶液在高于室温的温度形成该微粒。该微粒可以在高于室温的温度(例如约40℃～约70℃)由较高分子量的葡聚糖的溶液(例如20kDa～75kDa的溶液)自发形成。该微粒可以具有诸如规则或不规则等适宜的任何形状，但是优选为球状，并且优选直径为10微米，或者更小，例如0.5微米～5微米。
透射电子显微术揭示了结晶的葡聚糖微粒的微孔结构(见图2A和图2B)。优选地，按体积计算该微粒的孔隙率至少为10％，例如约10％～约50％，更优选为约20％～约40％。因而，该结构包含具有位于颗粒之间的大孔性区域的微孔性微粒。
对结晶的葡聚糖微粒的水性悬浮液进行喷雾干燥证明了可以生产结晶的葡聚糖微粒的聚集体，所述聚集体基本上为球状，直径为10.0微米～150.0微米(见图3)。
以下是形成葡聚糖微粒的方法的非限制性的实施例。向500ml实验烧杯中的50.0g无菌蒸馏水中加入50.0g来自安森生物科学(AmershamBiosciences)的葡聚糖T40(分子量为40kDa)，以在层流下获得50重量％的溶液。将该混合物在60℃(水浴)中在磁力搅拌器上以50rpm(转/分)的转速进行搅拌，直到葡聚糖完全溶解，并获得澄清的溶液。可以通过抽真空去除该溶液中所包含的气体。盖上蒂维克盖(Tyveklid)后将该澄清的溶液放在60℃的实验烘箱中。在3.5小时后，作为结晶的葡聚糖微粒形成的结果，形成了混浊的粘性悬浮液。
为了去除非结晶的葡聚糖，用3×250ml的无菌蒸馏水通过离心(例如3,000g，30分钟)对该微粒进行洗涤，或者对稀释的微粒的悬浮液例如1份的微粒和10份的水(3×250ml的无菌蒸馏水通过除菌滤器)进行过滤。所述离心/洗涤是在层流下进行的。在将该微粒放入500ml的实验烧杯中并盖上蒂维克盖，并在60℃的实验烘箱中干燥8小时，使其水分含量达到约5％。所获得的干粉由平均直径约为2微米的颗粒组成。
B.基于结晶的葡聚糖微粒的植入体尝试将结晶的葡聚糖微粒及其聚集体的浓缩悬浮液作为小鼠实验的植入体，以测试它们在被注射到动物体内后的生物相容性。
图4和图5显示，皮下(图4)和肌肉内(图5)注射到实验动物(小鼠)中后组织中的植入体。在180天的期间内，没有在动物组织中检测到炎症反应。
图6A、图6B和图6C分别显示注射后1天、4天和28天肌肉组织中的植入体。图7A和图7B均显示注射后180天小鼠肌肉组织中的植入体。
图8A、图8B和图8C分别显示皮下注射后第4天、第11天和第28天的植入体。图8D和图8E均显示皮下注射后180天的植入体。图8F和图8G均显示皮下注射后1年的植入体。如图8G所示，在该植入体位置形成的是正常组织，而不是伤疤组织。
已经在实验中证明大分子从植入体中缓慢释放，其中，大分子在注射前被溶解在结晶的葡聚糖微粒或它们的聚集体的水性悬浮液中。
图9和图10显示，含有荧光标记的大分子(FITC-葡聚糖，分子量500kDa)的植入体和该大分子在肌肉间注射后第14天从该植入体缓慢释放到小鼠肌肉组织中(图9)和质粒DNA从该植入体释放后报告基因在小鼠肌肉组织中的表达(图10)。因而，所述的结晶的葡聚糖微粒可以用于标记(例如单独的荧光标记)或标记与治疗剂的组合的时控释放。
C.基于两相体系的植入体基于结晶的葡聚糖微粒和它们的聚集体的植入体的自组装结构可以在两相体统的基础上形成。
诸如油、脂质体、微粒和毫微粒的小滴的胶状体系可以分散在结晶的葡聚糖微粒的悬浮液中，并且可以进行注射以在被施用到哺乳动物中后形成释放治疗剂的植入体。
例如，在油的情况中，可以形成一种特殊类型的植入体结构，其中，油核被由结晶的葡聚糖微粒或其聚集体组成的外层包围，所述结晶的葡聚糖微粒或其聚集体分散在水中或诸如多糖(例如葡聚糖)的有机聚合物的水溶液中。所述结构可以称为囊。应该提到的是，所述外层可以包括当该囊被组织包围时所形成的粗糙的球状外层。但是，当该囊位于例如基质、骨头或肠壁等障壁的附近时，该囊所包括的核可以位于一个或更多个微粒壁的一侧与障壁的另一侧之间。而且，虽然将油用作示例性例子，但是所述核可以含有其它材料，例如其它聚合物、细胞等。
为了形成囊结构，可以应用两相水性体系。当不同聚合物的水溶液以高于某浓度进行混合时，它们经常形成不相溶液体的两相溶液。各相通常含有超过90％的水，其可以被缓冲并且变为等渗。如果将细胞悬浮液或颗粒悬浮液加到该体系中，经常会发现该细胞或颗粒在各相间进行不均分配。由于在这些体系中的分配直接取决于细胞或颗粒的表面特性，所以可以利用这种优先分配行为作为基础对不同细胞群或颗粒进行分离。具有不同表面特性的细胞或颗粒显示出足够不同的分配行为。
所述的两种聚合物相的竞争性吸附取决于聚合物的化学特性。两相聚合物法已被应用于细胞、蛋白质、核酸和矿物质的分离或分配(“在水性两相体系中的分配(Partitioning in Aqueous Two-Phase Systems)”，1985，H.Walter，D.Brooks和D.Fisher编辑，Academic Press出版)。
结晶的葡聚糖微粒在来自例如葡聚糖/聚乙二醇(PEG)的混合物的相系中的分布实验显示，如在图11和图12中显示的那样，葡聚糖微粒优先处在葡聚糖相中，而另外的PEG相可以分散在该葡聚糖相中，以形成W/W乳剂，并且当PEG相的体积大于葡聚糖相的体积时，反过来也是成立的。
图11是在葡聚糖水溶液中的PEG水溶液的乳剂的照片，所述葡聚糖水溶液含有结晶的葡聚糖微粒。在图11的结构中，PEG相的体积小于葡聚糖相的体积。该葡聚糖相含有葡聚糖和结晶的葡聚糖微粒。因而，该PEG相形成由葡聚糖/葡聚糖微粒外层包围的一个或多个球状核(即，封闭的孔结构)。
图12是在PEG水溶液中的葡聚糖水溶液的乳剂的照片，所述葡聚糖水溶液含有结晶的葡聚糖微粒，其中，PEG相的体积大于葡聚糖相的体积。在这种情况中，葡聚糖相形成一个或多个由PEG相包围的含有葡聚糖微粒的球状核(即当PEG消散在组织液中时，在体内形成的开放的孔结构)。如图12所示，较小体积(小滴)的葡聚糖相形成大的球状的葡聚糖/葡聚糖微粒的核(图12的右边底侧)，含有葡聚糖/葡聚糖微粒的较小的球状体加入到该核上，并与之融合。
因而，当第一相(例如PEG相及其内含物如治疗剂)与第二相(例如葡聚糖相及其内含物如葡聚糖微粒)的体积比小于1时，便自组装形成由第二相(外层)包围的第一相(核)的囊。如果该组合物含有诸如胰岛素等优先分配入PEG相的治疗剂，则该治疗剂便选择性地分配入PEG核中，而颗粒通过自组装选择性地进行分配并形成包围在该PEG核周围的外层。
可以通过将分开制备的葡聚糖相和PEG相混合来制备乳剂，两者均可以是分别优先处在PEG相或处在葡聚糖相中的不同类型颗粒的悬浮液。其原理是，分子(例如大分子、DNA、质粒等)或分子聚集体(例如微粒、细胞、脂质体、蛋白等)在不同聚合物相中的分配取决于它们的表面结构和颗粒在该聚合物溶液中的界面能。
用含有结晶的葡聚糖微粒的水性的两相体系对实验动物组织进行的注射显示了如图13和图14所示的具有囊结构的植入体的形成。在该两相体系中，葡聚糖相的体积大于PEG相的体积。图13和图14均显示，具有PEG核和葡聚糖/葡聚糖微粒外层的囊在体内通过自组装形成(即注射到哺乳动物组织后)。该外层含有在相邻的微粒间的大孔区和在微粒本身中的微孔区。
以下是由两相体系形成囊结构的方法的非限制性实施例。将10g的葡聚糖T40(分子量为40kDa)和2g的PGE溶解在88ml含有1,000UI的胰岛素(Actrapid)的溶液中，所述溶液中加有25g结晶的葡聚糖微粒。这些步骤在层流条件下进行。在磁力搅拌器上，将该混合物在室温以100rpm搅拌30分钟，以形成均匀的混合物(即悬浮液)。1.0g的该悬浮液含有8UI的胰岛素。
应该提到的是，葡聚糖微粒可以由提供在两相体系中的葡聚糖溶液分子量不同的葡聚糖溶液来制备。因而，可以在分子量比提供到两相体系中的葡聚糖溶液低的葡聚糖溶液(例如2kDa～20kDa的溶液)中形成该结晶的葡聚糖微粒，所述在两相体系提供中的葡聚糖溶液可以是40kDa～500kDa的葡聚糖溶液，例如可以是40kDa～75kDa的溶液。这样是有利的，因为较高分子量的葡聚糖溶液(例如40kDa～70kDa的溶液)得到了更广泛的规章的认可，并且可以在较低浓度下形成囊的外层。虽然较低分子量的溶液可用以降低结晶时间，但是实际上并没有在体内提供较低分子量的葡聚糖溶液。而且，较低分子量的颗粒在体内可更容易溶解。
由两相体系形成的囊结构是有利的，因为该囊结构使治疗剂从核内的释放比从包含含有微粒的单相的组合物中的释放更均匀、更持续。而且，据信通过使用囊结构，需要较少的微粒就可以获得比使用单相体系相同的或更好的治疗剂的时控释放。而且，据信可以通过控制在两相体系中的微粒量，从而控制该微粒的外层的厚度。在两相体系中，微粒量越大，得到的外层就会越厚。因而，可以通过控制外层的厚度来控制治疗剂从囊核中释放的量、持续时间和/或时机。因此，可以针对每位患者或每组患者定制治疗剂的释放概况。
应该提到的是，虽然将PEG和葡聚糖用作两相体系的材料的例子，但是可以使用显示以下分配行为的任何其它适宜材料进行替换。图15A示意性地图解在水性的两相体系中不同类型颗粒的分配特性。例如，在图15A中显示了三种类型的分子或分子聚集体的优选颗粒10、12、14，以及相16和相18两相。但是，可以是两种类型或超过三种类型的颗粒。这些颗粒可以是由有机材料和/或无机材料、脂质体、活细胞、病毒或大分子制得的微粒，例如微球体或纳米球体。第一类型的颗粒10优先分离入第一相16。第二类型的颗粒12优先分离到第一相16和第二相18的界面。第三类型的颗粒14优先分离入第二相18中。因而，通过模拟以前的非限制性例子，第一颗粒10可以包含治疗剂，第二颗粒12和/或第三颗粒14可以包含结晶的葡聚糖微粒，第一相16可以包含PEG相，而第二相18可以包含葡聚糖相。
如图15A的区域20所示，如果在较大量的第二相18中提供较小量的第一相16，便形成位于第二相18中的囊型结构，该囊型结构包含第一相16的离散球状体，所述第一相16含有一定浓度的第一类型颗粒10。第二类型颗粒12可以位于相16和相18的界面，并起到囊外层的作用。颗粒14分散到第二相18中和/或形成囊外层。
相反地，如图15A的区域22所示，如果在较大量的第一相16中提供较小量的第二相18，便形成位于第一相16中的囊型结构，该囊型结构包含第二相18的离散球状体，所述第二相18含有一定浓度的第三类型的颗粒14。第二类型颗粒12可以定位于相16和相18的界面，并起到囊外层的作用。颗粒10分散到第一相16中和/或形成囊外层。可以将两相体系20和22用作植入体，例如将其通过注射、外科手术植入或口服等递送到哺乳动物(例如动物或人)中。因而，该囊形成结构化的三维植入体，该植入体具有作为贮存池或贮存库的核，以对治疗剂经过外层进行控释。相反地，微粒均匀分布的植入体是未结构化的植入体。应该提到的是，所形成的用于通过口服递送的两相体系的结构一般可以描述为含有PEG分散相和葡聚糖连续相的结构化的悬浮液。
而且，颗粒(即分子聚集体)10、12和14可以由选择性分配入各相之一的液体材料(例如油)或大分子替换。例如，诸如胰岛素的治疗剂可以分配入PEG/葡聚糖两相体系的PEG相中。由于胰岛素选择性地分配到PEG相中，所以该PEG相形成囊结构的含有胰岛素的核。应该提到的是，尽管特定的颗粒和治疗剂进行选择性分配，但是术语“选择性地分配”并不一定意为100％的该颗粒或治疗剂都分配到其中一相中。但是，多数的选择性分配物质，优选80％的该分配物质，分配到其中一相中。例如，虽然多数的胰岛素分配到PEG相，但是一部分胰岛素可以保留在葡聚糖相中。
图15B显示植入体结构的横截面的扫描电子显微图，所述植入体结构基于在图15A中进行示意性图解的两相体系。将含有葡聚糖第一相、PEG第二相和结晶的葡聚糖微粒的两相水性组合物注射到琼脂糖凝胶中。该凝胶组成通过防止结晶的葡聚糖微粒从注射侧扩散来模拟哺乳动物组织。图15B中的图显示核-外层植入体结构的形成。该核包括被外层34包围的区30和区32。在切开凝胶进行横截面SEM(扫描电子显微)成像前，区30为填充有PEG相区的空间。在横切的过程中，凝胶被切开时PEG相区从凝胶中滴出。区32是位于结晶的葡聚糖微粒中的含有PEG小滴的核的外部。区34是含有结晶的葡聚糖微粒的外层，其包围含有PEG的核并维持含有PEG的核的位置。
虽然不希望受到特定的理论束缚，但发明人认为，如图15B所示的核-外层结构通过如在15C示意性显示的自组装而形成。当第一相16和第二相18(例如不同的不相溶聚合物的水溶液)处在适宜的贮存容器19(例如玻璃烧杯或小瓶)中时，相16升到另一相18的上面。当该两相组合物被注入诸如哺乳动物组织或基质材料(如模拟组织的凝胶)等的限制相16和相18自由流动的材料中时，该组合物自组装成所述的核-外层结构。首先，体积较小的一相形成如图15C中间部分所示的近似球形的球状体。然后，如图15C底部所示，球状体结合以形成被另外一相的外层包围的一个相的近似球形的核。虽然显示了多相体系的两相体系的例子，但是如果需要，多相体系可以多于两相。
D.细胞治疗用哺乳动物细胞所进行的实验已经表明用刚才描述的技术将被结晶的葡聚糖微粒聚集体(图3和图12)表面吸附或被大孔性结构(见图11)或囊(见图13和图14)的内部相同表面吸附的细胞递送到体内的可能性。
通常，基于在胶状体系中自发装配的用于治疗的自装配材料用于可以含有结晶的葡聚糖微粒或其它颗粒，例如PLA、PLGA、PMMA、藻酸盐、细胞等。例如，图16A～图16D显示海拉细胞和结晶的葡聚糖微粒在葡聚糖-PEG两相体系中的分配。在图16A中显示的是两相体系。在图的上部显示的是包含含有细胞的PEG相的核，在图的下部显示的是葡聚糖/葡聚糖微粒(“CDM”)外层。在核和外层的边界显示的是从该外层分离进入核的PEG相小滴。图16B显示葡聚糖微粒在PEG/葡聚糖两相体系中的分配。PEG相16在顶部，含有葡聚糖微粒的葡聚糖相18在底部。图16C和图16D显示在含有结晶的葡聚糖微粒的葡聚糖相的表面上的海拉细胞。
所述植入体可以是“贮存库”型植入体，而且可以被用于细胞置换治疗。“贮存库”型植入体可以改善药代动力学(没有“突然破裂效果”)，并且保证生物活性物质的持续释放。除了“装载”有细胞的植入体结构外，该“贮存库”型植入体的“核”还可以包含任何类型的活性物质。所述核可以含有治疗性肽和蛋白、核酸、疫苗、病毒和细胞。
图17示意性地显示基于自装配材料的细胞置换治疗的治疗原理的例子。例如，基于结晶的葡聚糖微粒的封闭核的植入体可以用于I型糖尿病治疗、癌症治疗、帕金森症治疗和其它基于使用治疗性蛋白和肽的适宜疗法。在图17中，植入体40含有结晶的葡聚糖微粒12、14以及包封有移植细胞42的囊或外层。可以使用任何适宜的细胞，例如产生胰岛素的β-细胞、K细胞、胰腺细胞或干细胞。如在图17中所示，结晶的葡聚糖微粒囊对于血糖44(以及氧、营养物质和其它刺激物)是能透过的，但是对于免疫系统细胞是不能透过的，由于该免疫系统细胞太大，以至于不能进入囊中对产生胰岛素的细胞进行攻击。血糖44透过结晶的葡聚糖微粒囊并刺激产生胰岛素的细胞产生胰岛素46。然后该胰岛素穿过结晶的葡聚糖微粒囊扩散到血液48中。
因而，可以将包封有产生胰岛素的细胞的结晶的葡聚糖微粒植入哺乳动物(例如人)中，以治疗糖尿病。所述结晶的葡聚糖微粒囊可以在体内形成而不需要进行外科手术。该技术在该领域中被称为是“可注射的组织工程”。而且，所述结晶的葡聚糖微粒囊不需要使用有毒的化学交联试剂。植入体可优选用于提供长效胰岛素制剂以抑制肝糖的产生，并且在禁食状态中保持近乎正常的血糖值，其时间-效应图是无峰的。
应该提到的是，所述细胞治疗可以用于治疗其它的疾病。例如，如在图18中示意性地显示那样，包封有产生多巴胺的细胞的结晶的葡聚糖微粒可以用于治疗帕金森症。而且，如图18所述，结晶的葡聚糖微粒囊的结构可以反过来，例如，在哺乳动物组织50中，细胞42形成包封微粒12、14的外层。例如，可以使患者自身的细胞或干细胞位于微粒外。相反地，可以使来自患者以外来源的细胞(例如来自供体的细胞)位于在如图17所示的微粒外层中，以保护该细胞免于受到患者的自体免疫反应。这开创了用于治疗疾病(例如糖尿病和其它疾病)的体内组织工程的可能性。
E.骨移植物替代品骨移植方法涉及使用取自患者的自体移植物组织，或使用取自捐赠者或尸体的同种异体移植物组织。用于判断成功移植物的两条基本的标准是骨传导和骨诱导。
自体移植物组织的获取需要在供体部位进行外科手术，其可能会引起供体部位本身的并发症，例如炎症、感染和慢性疼痛。可以获取的骨组织量也是有限的，因而也会出现供应问题。
同种异体移植排除了供体部位的发病和组织供应受限，从而避免了一些自体移植的缺点。但是，同种异体移植同样存在危险。尽管许多方法可以减少疾病传染的危险，但是用于组织消毒的处理除掉了蛋白和因子，从而降低或者消除了该组织的骨诱导性。
而且，针对自体移植和同种异体移植，已经发展了多种选择方法。许多这些选择方法使用了包括天然或合成聚合物、陶瓷和复合物等多种材料。其它选择方法包括基于因子或细胞的策略，该策略单独使用，或者与其它材料结合使用。
许多骨移植物替代品是天然的或合成的，可以单独使用或与重组生长因子结合使用，所述重组生长因子例如转化生长因子(TGF)、血小板来源的生长因子(PDGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)和骨形态形成蛋白(BMP)。基于细胞的骨移植物替代品单独使用细胞来产生新组织或被接种到支持基质上(例如间充质干细胞)。
基于聚合物的骨移植物替代品，不管是可降解的聚合物还是非降解的聚合物，均被单独使用或与诸如来自Orthovita公司的Cortoss开孔性多聚乳酸聚合物(OPLA)的其它材料结合使用。可降解的合成聚合物与天然的聚合物一样被身体再吸收。植入体被身体再吸收的好处在于该身体本身可以彻底愈合，不残留异质体。为了达到这一目的，多家公司已使用诸如多聚乳酸和多聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)等可降解的共聚物作为独立器件以及作为自体移植物和同种异体移植物的增补剂。例如，骨技术公司(Bone Tec.Inc)通过微粒浸出方法诱发孔隙性，已开发出多孔性PLGA泡沫基质。骨生物公司(OsteoBiologics Inc.)具有ImmixExtender，其为用作移植物增补剂的微粒PLGA产品。
在本实施方案的一个优选方面，将以前实施方案中描述的多孔性的结晶的葡聚糖微粒与治疗剂结合用作骨移植物替代品，所述治疗剂可以在所述的身体的特别部位提供骨的形成。可以使用适宜的用于骨形成的任何治疗剂，例如肽、干细胞或蛋白，包括但不限于以上提到的间充质干细胞、TGF、PDGF、FGF和BMP。所述治疗剂可以位于多孔性微粒的孔隙中。例如，可以将该治疗剂提供到结晶后的结晶的葡聚糖微粒的孔隙中。
在本实施方案的另一个优选方面，用于体内植入体形成的方法包括在第一液相中制备微粒的悬浮液；在与第一液相不混溶的第二液相中制备微粒的悬浮液；制备乳剂，在该乳剂中，第一液相是连续相而第二液相是分散相；和将该乳剂注射到哺乳动物体内。优选地，将该乳剂用作骨移植物的替代品。
优选地，第一液相中的微粒和第二液相中的微粒是不同的。例如，第一相中的微粒可以是非聚合物微粒，例如多孔性陶瓷微粒，而第二相中的微粒可以是聚合物微粒，例如上述提到的多孔性的结晶的葡聚糖微粒。如果需要，第二液相可以含有在身体特别部位提供骨形成的治疗剂。该治疗剂可以位于该多孔性微粒的孔隙中。
F.口服胰岛素递送载体在本发明的一个另外优选实施方案中，本发明人发现，多孔性(如微孔性)微粒的组合可以用作蛋白(例如胰岛素)的口服递送载体。该多孔性微粒可以是任何适宜的微孔性微粒，其使得口服施用胰岛素后能显著降低血糖，例如在口服施用60分钟内降低例如30％。优选地，所述微粒为生物附着性微粒，例如为至少暂时附着在哺乳动物肠壁上以使胰岛素通过肠壁进行递送的颗粒。最优选地，所述多孔性微粒含有上述的结晶的葡聚糖微粒。
在图19中显示了本发明的一个优选实施方案，本发明人已发现，对哺乳动物53(例如兔子)进行口服施用的结晶的葡聚糖微粒12、14和胰岛素46的水性悬浮液在降低血糖水平方面与肌肉内单独注射胰岛素几乎等效。图19示意性地显示了胰岛素46从含有微粒的口服施用的组合物54透过哺乳动物53的肠52的壁。由于兔子是药物试验中人的常用模型，所以本发明人认为，含有结晶的葡聚糖微粒和胰岛素的诸如水性悬浮液、溶液、药片或胶囊等的液体或固体的组合物54在口服施用时也可以有效地降低人类的血糖水平。
以下实施例阐明用结晶的葡聚糖微粒进行的口服胰岛素的递送。本研究涉及秘鲁兔(Chinchilla)(2.3±0.2kg)并观察它们对口服施用的由根据在此描述的方法制得的结晶的葡聚糖微粒和人重组胰岛素组成的水性悬浮液的反应。
在2.0g的水中溶解3.0g的葡聚糖T20(Pharmacia，Uppsala，瑞典)，并放入60℃的盒子中。3小时后，用3×5.0ml的水通过在3000g离心对结晶的葡聚糖微粒进行洗涤。然后将该结晶的葡聚糖微粒悬浮在2.0ml的水中，并在室温将其干燥。用获得的干燥粉末制备含有胰岛素的悬浮液以用于口服胰岛素递送实验。通过混合250mg的所述微粒、0.3ml(12UI)或0.6ml(24UI)的胰岛素(NovoNordisk Actrapid HM Penfill，40UI/ml)和蒸馏水以使体积达到2.0ml，制备含有胰岛素的悬浮液。
用导管将该悬浮液(2.0ml)样品导入兔子的喉咙，然后导入10.0ml的饮用水。在悬浮液导入前3小时不让动物进食。从兔子的耳静脉采血样，并用于葡萄糖浓度分析。采用葡萄糖氧化酶法通过准确校准的“单触系统葡萄糖分析仪(One-touch System Glucose Analyzer)”(LifescanJohnson & Johnson，Milpitas，CA，美国)分析血液中的葡萄糖。
实施例1～8是涉及8只兔子的比较例。实施例9～14是涉及5只兔子的本发明实施例。
在比较例1和比较例2中(对照实验#1总结在表I中)，将人重组胰岛素以每只动物12 UI的剂量通过肌肉内(i.m.)导入到2只兔子中。在比较例3和比较例4中(对照实验#2总结在表II)，未对兔子进行处理(即没有对这两只兔子进行胰岛素或其它注射)。在比较例5和比较例6中(对照实验#3总结在表III中)，通过口服对两只兔子提供没有胰岛素的结晶的葡聚糖微粒的悬浮液。在比较例7和比较例8中(对照实验#4总结在表IV中)，通过口服对两只兔子提供商购获得的具有胰岛素(24UI)的Sephadex G-150微粒的悬浮液。根据安森生物科学(AmershamBiosciences)网站，Sephadex G-150微粒是通过将葡聚糖和表氯醇进行交联制得的具有直径为20微米～150微米的成珠的凝胶微粒。在根据本发明优选实施方案的实施例9～实施例14中(总结在表V中)，通过口服对5只兔子提供具有胰岛素(24UI)的结晶的葡聚糖微粒的悬浮液。这些结果总结在下表I～V中。
表I

表II

表III

表IV

表V

表I～V中的数据显示，当通过肌肉内注射施用12UI的胰岛素(实施例1～实施例2)时和当通过经口(即口服)施用24UI胰岛素和结晶的葡聚糖微粒(实施例9～实施例14)时，在哺乳动物的血液中糖(即葡萄糖)的平均降低是相当的。在口服施用后60分钟，葡萄糖的最大降低约为35％～约60％。在注射递送方式和口服递送方式中，葡萄糖浓度概况实际上是相同的。应该提到的是，可以施用其它量的胰岛素。例如，可以施用30 UI的胰岛素。一般地，与注射胰岛素的量比较，口服2倍～3倍的胰岛素在长达3小时中所产生的血糖降低量是类似的。
众所周知的事实是，单独的胰岛素受到肠酶的降解，在穿过胃肠黏膜时不能被完好无损地吸收(Amidon GL，Lee HJ，Absorption of peptideand peptidomimetic drugs，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.1994；34321-341)。但是，实施例9～实施例14表明，结晶的葡聚糖微粒可以用作蛋白(例如胰岛素)的口服递送的载体，因为获得的低血糖效果是显著的。不希望被特定的理论或作用模式所束缚，但是本发明人认为，在水性悬浮液中将多孔性的结晶的葡聚糖微粒用作胰岛素的递送基质保护了胰岛素免受肠酶的显著降解，并使得胰岛素在穿过胃肠黏膜时可以被完好无损地吸收。胰岛素可以位于多微孔微粒中的微孔中和/或微粒间的大孔中。相反地，含有胰岛素的交联的Sephadex G-150葡聚糖微粒的使用(表IV，实施例7～实施例8)没有产生血糖浓度的明显下降。
如实施例9～实施例14所证明的那样，对哺乳动物施用含有结晶的葡聚糖微粒和胰岛素的组合物后60分钟，该哺乳动物中的血糖浓度降低至少5％，优选至少30％(即施用悬浮液后60分钟，哺乳动物中的血糖值比刚施用该悬浮液之前测得的值降低至少5％，优选至少30％)。优选地，对哺乳动物施用该组合物后30分钟，该哺乳动物中的血糖浓度降低至少5％，例如至少30％，优选约35％～约40％。优选地，对哺乳动物施用该悬浮液后60分钟，该哺乳动物中的血糖浓度降低约35％～约60％，例如35％～45％。更优选地，对哺乳动物施用该组合物后，在30分钟～240分钟(例如30分钟～120分钟)的整个期间内，与刚施用该组合物之前测得的值相比，该哺乳动物中的血糖浓度降低。例如，对该哺乳动物施用该组合物后，在30分钟～240分钟的时间内，优选在30分钟～120分钟的时间内，哺乳动物中的血糖浓度最好降低至少10％，优选至少30％，更优选至少35％，例如35％～45％。
因而，本发明的一个优选实施方案提供通过口服施用治疗有效量的含有结晶的葡聚糖微粒和胰岛素的组合物而降低哺乳动物中的血糖的方法。可以通过正在治疗的疾病、损伤或紊乱的有害状态或症状的防止或改善来确定该组合物的“治疗上有效”的量。优选地，该组合物含有平均直径为约0.5微米～约5微米的结晶的葡聚糖微粒和胰岛素的水性悬浮液。而且，该微粒优选为在将胰岛素加入到悬浮液之前即已结晶的多孔性微粒，这样使得胰岛素与该微粒的表面接触和/或位于微粒的孔隙中。
结晶的微粒优选含有通过多个氢键、范德华力和/或离子键集合在一起的葡聚糖分子(即聚合物分子)并且在葡聚糖分子间基本上没有共价键。因而，微粒中的分子优选没有特意地进行交联(即不进行交联步骤)并且该微粒在分子间不含有共价键或者在分子间含有低于10％的共价键。
虽然在图19中显示了含有胰岛素和微粒的单相组合物54，但是也可以使用上述在图13、图14、图15A、图15B、图15C和图16B中显示的两相组合物。例如，可以使用含有葡聚糖相、PEG相、结晶的葡聚糖微粒和胰岛素的两相组合物。在体内，该组合物具有自组装的囊结构，该囊结构包含含有结晶的葡聚糖微粒的壁或外层和含有PEG和胰岛素的核。
优选地，接受口服施用胰岛素的哺乳动物包括需要降低血糖的人，例如糖尿病患者。因此，本发明的优选方案提供通过口服施用上述的胰岛素和结晶的葡聚糖微粒的悬浮液而在需要治疗的人中治疗糖尿病的方法。
可以对所述的哺乳动物施用任何治疗有效量的胰岛素。胰岛素的量因哺乳动物(例如人或兔子)的类型、哺乳动物的体重、悬浮液的组成、需要的血糖降低量和其它因素而异。胰岛素在悬浮液中的含量的一个非限制性例子是每克悬浮液中为约10UI～约2500UI的人重组胰岛素，例如约12UI～约30UI，例如24UI的人重组胰岛素。但是，该量可以根据需要而变化。
不应认为本发明限于上述的优选实施方案。可以将其它基质材料，例如有机的或无机的微孔性颗粒用于口服胰岛素的递送。优选地，该颗粒是促进胰岛素透过胃肠黏膜和/或使组合物稳定的微粒。而且，虽然该悬浮液优选只含有水溶剂、基质和胰岛素溶液或悬浮液，但是该递送体系还可以含有另外的材料。例如，该组合物可以含有两相体系的第二相，例如PEG相。因而，本发明的另外一个优选方面包括降低哺乳动物血糖的方法，该方法包括对哺乳动物施用含有治疗有效量的胰岛素和基质材料的组合物，使得在对哺乳动物施用悬浮液后60分钟，该哺乳动物的血糖至少降低30％。本发明的另一个优选方面为对哺乳动物施用悬浮液的方法，所述方法包括对哺乳动物口服施用结晶的葡聚糖微粒和治疗有效量的胰岛素的水性悬浮液。
如上所述，用于胰岛素或其它基于蛋白的药物的口服施用的作为基质材料的结晶的葡聚糖微粒可以通过任何适宜的方法进行制备(例如，见图1)。优选地，该微粒通过本文描述的任何优选实施方案的方法进行制备。优选但非必须，该微粒在没有使用有机溶剂的水溶液中形成。因而，在本发明的一个优选方面，在所述微粒经过结晶后，将治疗有效量的胰岛素和结晶的该葡聚糖微粒在水中结合，以形成胰岛素和结晶的葡聚糖微粒的悬浮液。可以在将胰岛素加入水之前、同时和/或之后，将该微粒加入水中。而且，可以将该微粒在形成其的溶剂中对哺乳动物进行口服施用。可选择地，可以将该微粒从形成其的溶剂中取出，并加入水中或加入其它用于口服施用的水溶液中或干燥且以固体形式提供，例如用于口服施用的药片或胶囊。
优选将结晶的葡聚糖微粒和治疗有效量的胰岛素(或其它适宜的胰岛素和基质材料的悬浮液，例如胰岛素和微孔性微粒的悬浮液)的水性悬浮液作为定制剂量(dosed)的药物组合物来提供，将所述组合物的剂量定制为适于(dosed for)对人进行口服施用。在本发明的一个优选方面，将该组合物装在容器内，容器内的量定制为适于对人进行单次口服施用的剂量。该容器可以包括任何可以容纳悬浮液的器具，例如塑料瓶或玻璃瓶、管子、滴管、喷嘴、袋子和/或其它适宜的容器。该容器装有足以用于单剂口服剂量组合物的悬浮液。
在本发明的另一个优选方面，该组合物装在任何适宜的容器中，组合物的量为适合于多次口服施用的剂量。该容器内带有用于对人进行口服剂型施用的说明书。该说明书可以印在该容器上如直接印在容器上或印在贴到该容器的标签上，或者与该容器附在一起如印在纸板盒或药袋中与该容器附在一起的一张纸上。在说明书中可以描述每剂应该服用的组合物量、该剂量应该服用的频度、如何估量用于口服施用的组合物的剂量和/或任何其它针对管理卫生保健的从业者和/或需要该药物的患者的适合于口服药物的指导。替换性地，该说明书可以包括电子或声音存取的关于剂量和施用说明的指导，例如含有该说明的站点的链接或电话号码或提供该说明的声音记录。
在本发明的另一个优选方面，将装在容器中的结晶的葡聚糖微粒和治疗有效量的胰岛素的水性悬浮液以药物组合物试剂盒形式来提供，该药物组合物试剂盒带有用于对需要该组合物的人进行口服施用该组合物的说明书。该试剂盒可以包括印在该容器上的说明书或贴到该容器的标签上的说明书或印在与该容器附在一起的一张纸上的说明书，例如在包括瓶子(即容器)和所述说明书的纸板盒或药袋中。
应该提到的是，所述的用于口服施用的组合物可以是水性悬浮液形式，但是也可以使用其它形式以降低哺乳动物中的血糖。例如，多孔性的结晶的葡聚糖微粒和胰岛素可以以药片或胶囊的形式口服施用。
为了将该组合物以固体形式口服施用至哺乳动物(例如人)，首先干燥(例如冻干)结晶的葡聚糖微粒和胰岛素的溶液，以形成粉末。然后将该粉末与任意的的药学上可接受的赋形剂一起压制成药片，或者将该粉末放在药学上可接受的胶囊中。
在本发明的另一个优选方面，可以通过例如吸入对哺乳动物(例如人)施用含有结晶的葡聚糖微粒和治疗有效量的胰岛素的组合物。在这种情况中，可以将所述的组合物置于适用于通过吸入对哺乳动物施用药物组合物的容器中，例如当被挤或压时提供定量供应剂量的组合物的吸入器。优选地，通过将溶液或悬浮液形式的组合物从所述吸入器中喷入哺乳动物的口腔来对该哺乳动物提供该组合物。优选地，将所述的组合物递送到哺乳动物的肺中(即肺部递送)。
G.可注射胰岛素的递送载体本发明人已发现，将结晶的葡聚糖微粒和胰岛素的组合物注射入哺乳动物，例如大鼠和兔子中，与单独注射相同剂量的相同胰岛素相比，意外地延长了胰岛素的效力持续时间。图20示意性地图解了用注射器56通过注射含有微粒12、14和胰岛素46的单相组合物，植入体40在哺乳动物53中的形成。图21示意性地图解了通过注射包括葡聚糖相18和PEG相16的两相组合物，结构化的植入体40在哺乳动物53中的形成，所述葡聚糖相18含有选择性分配的结晶的葡聚糖微粒12、14，所述的PEG相16含有选择性分配的含有胰岛素的治疗剂10。所述葡聚糖相18形成位于所述PEG相16核周围的外层。由于大鼠和兔子是在药物试验中人的常用模型，所以本发明人认为，当被注入成人和小孩中时，含有结晶的葡聚糖微粒和胰岛素的组合物也将有效地延长胰岛素的效力持续时间。
实施例15～实施例22显示了与单独注射胰岛素相比，使用结晶的葡聚糖微粒作为可注射胰岛素的递送载体的优势。该实验涉及小鼠并观察它们对皮下注射由结晶的葡聚糖微粒和人重组胰岛素(NovoNordiskActrapid HM Penfill，40UI/ml)制备水性悬浮液的反应。
所述悬浮液按以下方法进行制备。在20.0g的水中溶解5.0g的葡聚糖T10(Pharmacia，Uppsala，瑞典)。用0.22μm的过滤器(Millipore，Bedford，MA)过滤该溶液，并将其并冻干。将3.0g所得的粉末溶解在3.0g的无菌水中，并放入温度为60℃的盒子中。6小时后，用3×5.0ml的无菌水通过在3000g离心对结晶的葡聚糖微粒进行洗涤。最后，将制得的结晶的葡聚糖微粒悬浮液与胰岛素水溶液混合，并用于小鼠的实验中。将该悬浮液的样品导入小鼠的腿中，并从各小鼠的尾巴采集动物血样，对葡萄糖浓度进行分析。采用葡萄糖氧化酶法通过正确校准的“单触系统葡萄糖分析仪(One-touch system glucose analyzer)”(LifescanJohnson & Johnson，Milpitas，CA，美国)对血糖进行测定。
在比较例15中，没有将胰岛素注入小鼠中。在比较例16、17和21中，只将胰岛素(0.5UI)注入3只小鼠中。在实施例18～实施例20和实施例22中，将胰岛素(0.5UI)和结晶的葡聚糖微粒的植入体注入4只小鼠中。该结果总结在表VI中。
表VI

当0.5UI的胰岛素与或不与结晶的葡聚糖微粒一起进行i.m.(肌肉内注射)应用时，动物血液中的糖(即血糖)的平均降低量非常不一样。如表VI所示，注射后的前45分钟期间，比较例16、17或21的小鼠中的葡萄糖水平与实施例18～实施例20和实施例22的小鼠中的葡萄糖水平几乎相同或较低。注射后120分钟，比较例16、17或21的小鼠中的葡萄糖水平与实施例18～实施例20和实施例22的小鼠中的葡萄糖水平几乎相同。但是，注射后210分钟～390分钟，比较例16、17或21的小鼠中的葡萄糖水平比实施例18～实施例20和实施例22的小鼠中的葡萄糖水平高约3倍。实际上，注射后120分钟～390分钟，实施例18～实施例20和实施例22的小鼠中的葡萄糖水平基本上没有上升(即升高没有超过10％，保持相同水平或下降)。相反地，注射后120分钟～390分钟，比较例16、17或21中注射了相同量胰岛素的小鼠中的葡萄糖水平确实显著上升。与单独注射相同剂量的胰岛素相比，注射结晶的葡聚糖微粒/胰岛素能更长时间地降低血糖。因而，含有结晶的葡聚糖微粒和胰岛素的组合物可以用于注射给药。
以下对兔子进行的实验也证明了与单独注射相同剂量的相同胰岛素相比，注射结晶的葡聚糖微粒/胰岛素如何降低血糖以及如何使血液中的胰岛素的基础水平保持较长的时间。皮下注射含有Actrapid HM短效胰岛素和结晶的葡聚糖微粒的组合物，意外地发现该短效胰岛素的效力持续时间延长到超过单独皮下注射的长效胰岛素Monotard HM的效力持续时间。
术语“效力持续时间”的意思是独立于引起血糖峰的外部因素(例如进食)，使血糖浓度降低到所需水平和/或使血液中的胰岛素浓度的基础水平保持在所需水平。因而，术语“效力持续时间”是将胰岛素和微粒的组合物的效力与单独的相同剂量的相同胰岛素的效力相比较的相对术语。换句话说，效力持续时间是作用持续时间或药理学效果的持续时间，该持续时间可以通过在患者禁食状态比较胰岛素和微粒的组合物的效力和单独的相同剂量的相同胰岛素的效力来进行测定。
如图22A和22B所示，与单独的Actrapid HM胰岛素的约2小时～约8小时(图22B)的效力持续时间和单独的“Monotard HM”长效胰岛素的约17小时～24小时的效力持续时间(图22A)相比，含有ActrapidHM短效胰岛素和结晶的葡聚糖微粒的组合物延缓了对胰岛素的吸收，并延长了降低血糖效果(即，胰岛素的效力持续时间)到至少24小时，例如约28小时～约31小时。Actrapid HM胰岛素和Monotard HM胰岛素都是Novo Nordisk的产品，获自该公司的信息宣传这些胰岛素组合物在人体内的效力持续时间分别是8小时和24小时。
在图22A和22B中，上面的线显示未处理(即，没有施用胰岛素)的兔子的对照线。图22A和22B的y-轴是对于相同的8UI剂量的胰岛素的血糖浓度的相对标准化刻度。图中数据都经过调整以将各图显示在一张曲线图中，该数据显示了注射胰岛素后动物血液中的血糖水平。
在图22A和图22B中显示的数据是按如下获得的。监测秘鲁(Chinchilla)兔(2.3±0.3kg)对注射由结晶的葡聚糖微粒和ActrapidHM短效胰岛素组成的制剂的反应。该制剂样品通过皮下注射到兔子中。将没有微粒的Monotard HM长效胰岛素(40UI/ml)和Actrapid HM短效胰岛素通过皮下注射到不同的兔子中作为对照。从兔子的耳静脉采集动物血样，并对葡萄糖浓度进行分析。利用经正确校准的葡萄糖分析仪(One-touchLifescan，Johnson & Johnson，Milpitas，CA，美国)测定血糖浓度。
在比较例23和比较例24中，2只兔子没有被提供任何胰岛素。在比较例25和比较例26中，Monotard HM长效胰岛素的水溶液以8 IU的剂量通过皮下导入到2只兔子中。在实施例27～实施例29中，结晶的葡聚糖微粒和Actrapid HM短效胰岛素的悬浮液以8UI的剂量通过皮下导入到3只兔子中。该实验的结果总结在表VII中。
表VII

以上的实施例27～实施例29证明，Actrapid HM短效胰岛素和结晶的葡聚糖微粒的组合物提供了超过Monotard HM长效胰岛素效果的延长效果，并且据认为与来自安万特(Aventis)(见www.aventis-us.com/Pls/lantus TXT.html)的长效(一天给药一次)胰岛素glargine Lantus的效果相当。另外，不能将Lantus胰岛素与任何其它胰岛素或溶液进行稀释或混合。如果稀释或混合Lantus胰岛素，Lantus胰岛素和/或该混合胰岛素的药学动力学/药效的概况(即作用的起始、到达效果峰的时间)可能以不可预测的方式发生改变。相反地，结晶的葡聚糖微粒和胰岛素的组合物就没有受到这些限制，因为可以使用任何适宜的胰岛素，例如人胰岛素。在所述结晶的葡聚糖微粒和胰岛素的组合物中，可以根据需要而改变胰岛素和微粒的比例。而且，可以使用任何适宜的胰岛素以对个别的患者定制适当的胰岛素疗法。因而，在所述组合物中使用ActrapidHM作为典型胰岛素的说明性例子，但是该组合物并不限于该品牌的胰岛素。
如实施例23～实施例29所示，与没有微粒的相同剂量的相同胰岛素相比，含有结晶的葡聚糖微粒和胰岛素的组合物在保持胰岛素的效力持续方面是有效的，其持续时间至少延长30％，例如至少延长100％，优选延长100％～400％。与没有微粒的相同剂量的相同胰岛素相比，含有微粒的胰岛素组合物在保持血液中胰岛素和血糖浓度的所需基础水平方面是有效的，其基础水平持续时间至少延长30％，例如延长100％～400％。因而，含有微粒的组合物的效力持续时间至少为24小时，这样使得在哺乳动物(例如需要的人)中每天只需注射一次。
耐久的胰岛素的结晶的葡聚糖微粒组合物比现有技术中的耐久的胰岛素组合物更安全，因其不用象现有技术的组合物那样使用更多剂量即可以获得耐久的效力。例如，如果8UI剂量的短效胰岛素在医药上已被确定为对患者是安全的而没有显著的用药过量危险，那么，含有相同的短效胰岛素和结晶的葡聚糖微粒的组合物在短效胰岛素的剂量同样为8IU时，即便所有的这些胰岛素立刻在患者中释放，也可以提供作用更长的作用时间而没有显著的用药过量危险。而且，因为该组合物在没有增加胰岛素的量的情况下延长了其效力，所以与现有技术的组合物相比，该组合物节省了费用。目前现有技术的长效的糖尿病疗法使用了胰岛素的类似物，例如，来自安万特的Lantus。相反地，含有结晶的葡聚糖微粒的组合物优选含有安全概况已经确认的人重组胰岛素。因而，该组合物降低了不良反应的危险性，并减少了对糖尿病患者的注射次数，据此提高了糖尿病患者的生命质量。
所述可注射组合物可以包含含有胰岛素和微粒的单相体系或包含形成PEG和胰岛素的核以及葡聚糖和葡聚糖微粒外层的两相体系，该两相体系用于使效力持续时间甚至更长。而且，该组合物包含注入哺乳动物相对容易的流动性的单相或多相的胶状体系(即悬浮液或乳剂)。
以下实施例显示了含有葡聚糖相、PEG相、胰岛素和结晶的葡聚糖微粒的可注射两相组合物的用途。据认为当注入哺乳动物中时，该组合物形成具有三维囊结构的结构化的贮存库型植入体。在该囊结构中，所述微粒选择性地分配到葡聚糖相中，而胰岛素则被选择性地分配到PEG相中。含有微粒的葡聚糖相在包含PEG相的核的周围形成外层，所述PEG相含有胰岛素。该结构化的植入体使得从核中通过外层可以进行控释释放。
在比较例30中，将0.5UI的Actrapid HM胰岛素(100UI/ml)通过皮下注入到小鼠中。在实施例31中，将0.4g的结晶的葡聚糖微粒分散在0.6ml的20％(重量比)的分子量为70kDa的葡聚糖(Pharmacia，瑞典)的水溶液中以形成悬浮液。将10mg的分子量为6kDa的PEG(Fluka)溶解在0.1ml的Actrapid HM胰岛素(100UI/ml)中以形成溶液。将0.05ml的PEG和胰岛素溶液与0.15ml的微粒和葡聚糖悬浮液混合，以形成两相组合物或混合物。将0.02ml含有0.5UI的胰岛素的所述两相混合物通过皮下注射到小鼠中。结果显示在表VIII中。
表VIII

如表VIII所见，所述的两相组合物的效力持续时间长于单独的胰岛素的效力持续时间。而且，该两相组合物对血糖浓度的降低作用比单独的胰岛素更缓慢。尽管没有期望受到特定理论的束缚，据认为这些效果是由于胰岛素从囊结构的核中控释释放的缘故。
而且，可以通过调整胰岛素和/或微粒的量来为每位患者定制含有微粒的组合物，使得可以在每天的同一时间将该组合物注射给该患者(即每24小时一次，每48小时一次，等等)。因而，用于每位患者的所述组合物的效力持续时间是可调的。对于两相体系，胰岛素从囊核中的释放概况可以通过控制微粒的量以控制该囊外层的厚度来进行调节。
虽然发明人不期望受到特定理论的束缚，但是据认为相同剂量的与结晶的葡聚糖微粒在一起的胰岛素在小鼠和兔子中的耐久效果可以通过该胰岛素分子从基于结晶的葡聚糖微粒的植入体中的扩散(即胰岛素的自我控制释放)来解释。由于小鼠和兔子是药物试验中人的共同模型，显示在上表VI～表VIII中的数据表明，通过使用基于结晶的葡聚糖微粒的植入体，可以开发药效动力学特性和药代动力学特性得到改善的控释释放递送体系，从而更好地满足基础胰岛素患者(例如人)的需要。
H.材料术语“胰岛素”应该解释为包括胰岛素类似物、天然提取的人胰岛素、重组体产生的人胰岛素、牛源和/或猪源提取的胰岛素、重组体产生的猪和牛的胰岛素以及任何这些胰岛素产品的混合物。该术语意欲包括通常用于治疗糖尿病的充分纯化形式的多肽，但使用该术语包括其商购的药物形式，这种商购的药物形式包含另外的赋形剂。所述胰岛素优选为重组产生的并且可以是脱水的(完全干燥)或在溶液中。
术语“胰岛素类似物”、“单体胰岛素”等在这里交互使用，并且意欲包括任何形式的如上所述的“胰岛素”，其中，该多肽链中的一个或多个氨基酸已被替换氨基酸所置换和/或其中一个或多个氨基酸已缺失或其中一个或多个另外的氨基酸已被添加到该多肽链或氨基酸序列上，所述多肽链或氨基酸序列作为胰岛素在降低血糖水平中起作用。一般地，在本发明的优选实施方案中的术语“胰岛素类似物”包括专利号为No.5,547,929的美国专利所披露的“速效胰岛素(胰岛素lispro)类似物”，将所述专利的全部内容以参考的方式引入本文；胰岛素类似物包括LysPro胰岛素和优泌乐(humalog)胰岛素，以及其它“超胰岛素类似物”，其中，与传统的胰岛素和在肝中比在脂肪组织中更有活性的肝选择性胰岛素相比，所述胰岛素类似物影响血清中的葡萄糖水平的能力得到相当大的提高。优选的类似物是单体胰岛素类似物，其为用于与胰岛素的主要目的相同的胰岛素样化合物，例如，胰岛素lispro，即通过施用以降低血糖水平的化合物。
术语“类似物”是指与被认为是与其相当的分子具有共同功能活性并且通常具有共同结构特征的分子。
术语“重组体”是指任何类型的在原核细胞中表达的克隆的治疗剂或遗传工程分子或可以被处理成为另一种状态以形成另一个组合文库的组合分子文库，尤其是含有提高该治疗剂的物理化学的、药理学的和临床上的安全性的保护基团的分子。
而且，在此处描述的治疗剂不限于胰岛素。任何适宜的治疗剂可以与所述微粒一起用于口服递送、吸入递送、注射递送和外科手术植入递送。
例如，适宜的治疗剂可以包含肽、多肽或分子量为0.5kDa～150kDa的蛋白。特别地，所述的肽、多肽或蛋白治疗剂包括糖尿病助剂，如上述提到的胰岛素和胰岛素类似物等；胰岛淀粉样多肽(amylin)；胰高血糖素；表面活性剂；免疫调节肽和蛋白，例如细胞因子、趋化因子和淋巴因子；紫杉醇；白细胞介素，例如白细胞介素-1、白细胞介素-2，以及干扰素；红细胞生成素；血栓溶解剂和肝素；抗蛋白酶、抗胰蛋白酶和氨氯吡脒；rhDNase(重组人脱氧核糖核酸酶)；抗生素和其它抗感染剂；激素和生长因子，例如甲状旁腺激素、LH-RH(促黄体激素释放激素)和GnRH(促性腺激素释放激素)类似物等；核酸；DDAVP(去氨加压素)；降钙素；环孢霉素；病毒唑；酶；肝素；血细胞生成因子；环孢霉素；疫苗；免疫球蛋白；血管作用肽；抗敏剂；寡核苷酸和核酸类似物。其它适宜的治疗剂包括病毒、细胞、基因和具有治疗性质的其它物质，例如其它适宜的疫苗和分子治疗剂。
术语“胰岛淀粉样多肽”包括天然的人胰岛淀粉样多肽，牛、猪、大鼠和兔子的胰岛淀粉样多肽，还包括合成的、半合成的或重组的胰岛淀粉样多肽或胰岛淀粉样多肽类似物，包括淀粉不溶素(pramlintide)和其它胰岛淀粉样多肽激动剂。
术语“免疫调节蛋白”包括细胞因子、趋化因子、淋巴因子补体成分、生长激素、免疫系统辅助和黏附分子以及它们的人或非人动物的特异性受体。有用的例子包括GM-CSF、G-CSF、IL-2、IL-12、OX40、OX40L(gp34)、淋巴细胞趋化因子、CD40、CD40L。有用的例子包括白细胞介素，例如白细胞介素1～白细胞介素15；α干扰素、β干扰素和γ干扰素；肿瘤坏死因子、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、趋化因子，例如嗜中性粒细胞激活蛋白(NAP)；巨噬细胞化学引诱和激活因子(MCAF)、RANTES、巨噬细胞炎性肽MIP-1a和MIP-1b、补体成分和它们的受体、或辅助分子，例如B7.1、B7.2、ICAM-1、ICAM-2和ICAM-3以及细胞因子受体。OX40和OX40-配体(gp34)是免疫调节蛋白的又一些有用例子。免疫调节蛋白可以用于各种目的，具有人或非人动物特异性；并且可以用于当前目的，视具体情况而定和视方便而定，由以下表述胞外域和具有天然存在蛋白的结合活性的其它片段以及它们的突变型蛋白，以及它们与其它的多肽序列(例如免疫球蛋白的重链恒定区)的融合蛋白。当将编码一种以上的免疫调节蛋白的核苷酸序列插入时，它们可以包含例如一种以上的细胞因子或细胞因子与辅助/黏附分子的组合。
此处使用的术语“干扰素”或“IFN”是指抑制病毒复制和细胞增殖并调节免疫反应的高度同源的种属特异性蛋白的家族。根据干扰素细胞起源和抗原性可以被归为3组，即α干扰素(白细胞)、β干扰素(成纤维细胞)和γ干扰素(免疫补体细胞)。已经建立起各组的重组形式和类似物，并且可以通过商购获得。各组的亚型是基于抗原/结构的特性。通过对编码这些肽的DNA进行分离和测序，至少有24种具有不同氨基酸序列的α干扰素(归入亚型A到亚型H)已经被确认。术语“α-干扰素”、“α干扰素”“干扰素α”、“人白细胞干扰素”和“IFN”在此处可以被互换使用，以描述该组的诸多成员。以这种方式制备的人白细胞干扰素包含具有不同氨基酸序列的人白细胞干扰素的混合物。
术语“红细胞生成素”适用于合成的、半合成的、重组的、天然的、人的、猴的，或其它动物的或微生物学分离的多肽产品，该产品具有天然存在的红细胞生成素的部分的或全部的一级结构构象(即氨基酸残基的连续序列)和一种或一种以上的生物特性(例如免疫学特性以及体内和体外的生物学特性)，包括它们的等位基因变体。这些多肽还被独特地特征性描述为通过基因组DNA克隆或cDNA克隆或基因合成得到的外源DNA序列在原核或真核宿主(例如在培养物中的细菌、酵母和哺乳动物细胞)中进行表达的产物。在脊椎动物(如哺乳动物和鸟类)细胞中的微生物表达的产物可以进一步被特征性描述为不与人蛋白或其它污染物相结合，所述污染物与天然的哺乳动物细胞环境中的红细胞生成素有关，或与细胞外液(如血桨或尿)中的红细胞生成素有关。典型的酵母(例如啤酒酵母(Saccaromyces cerevisiae))或原核生物(例如大肠杆菌(E.coli))宿主细胞的产物不与任何的哺乳动物蛋白结合。决定于所使用的宿主，本发明的多肽可以是用哺乳动物的碳水化合物或其它真核生物的碳水化合物进行糖基化，或者可以没有进行糖基化。多肽还可以包括起始的甲硫氨酸残基(在-1位点)。本发明的新的糖蛋白产物包括以下糖蛋白产物，其一级结构构象充分复制天然存在的(例如人)红细胞生成素的一级结构构象以使该糖蛋白产物具有所述天然存在的红细胞生成素的一种或一种以上的生物活性和具有区别于天然存在(例如人)的红细胞生成素的平均碳水化合物成分。
术语“肝素”和“血栓溶解剂”包括诸如肝素、低分子量的肝素、组织纤溶酶原活化因子(TPA)、尿激酶(Abbokinase)和其它用于控制凝集的因子等抗凝集因子。
术语“抗蛋白酶”和“蛋白酶抑制剂”可以被互换使用，并适用于与受体起反应的或作为抗体、酶或核酸的物质，这些物质可为合成的、半合成的、重组的、天然出现的或非天然出现的、可溶性的或固定的。这些物质包括调节体液免疫应答的受体、调节细胞免疫应答的受体(例如T-细胞受体)和调节神经反应的受体(例如谷氨酸受体、甘氨酸受体、γ-氨基丁酸(GABA)受体)。这些物质包括细胞因子受体(涉及关节炎、感染性休克、移植排斥反应、自体免疫疾病和炎症)、与将抗原呈递到细胞毒性T细胞受体和/或T辅助细胞受体(涉及自体免疫疾病)有关的主要组织相容性(MHC)类型I和类型II受体和凝血酶受体(涉及凝集作用和心血管疾病)。还包括识别自身抗原的抗体(例如涉及自体免疫紊乱的抗体)和识别病毒(例如HIV、单纯疱疹病毒)和/或微生物抗原的抗体。
术语“激素”和“生长因子”包括来自天然的、人的、猪的、牛的、羊的、合成的、半合成的或重组来源的激素、释放激素，例如生长激素、甲状腺激素、甲状腺释放激素(TRH)、促性腺释放激素(GnRH)、促黄体生成激素、促黄体生成激素释放激素(LHRH，包括超激动剂和拮抗剂，例如亮丙瑞林(leuprolide)、deltirelix、gosorelin、那法瑞林、达那唑(Danazol)等)。这些物质还包括诸如奥曲肽(善宁)等促生长素抑制素类似物。在这种生物治疗剂范畴的其它物质包括用于子宫收缩的药物(例如催产素)、用于利尿的药物(例如加压素)、用于中性粒细胞减少症的药物(例如GCSF)、用于呼吸障碍的药物(例如超氧化物歧化酶)、用于呼吸困难综合症的药物(RDS)(例如可任意地包括脱辅基蛋白质的表面活性剂)等。
术语“酶”包括诸如DNAse(Genentech)等重组的脱氧核酸酶；蛋白酶(例如，诸如胰蛋白酶和凝血酶的丝氨酸蛋白酶)；聚合酶(例如，RNA聚合酶、DNA聚合酶)；反转录酶和激酶；涉及关节炎、骨质疏松症、炎症、糖尿病、变态反应、器官移植排斥反应、癌基因激活(例如二氢叶酸还原酶)、信号转导、自循环调节、转录、DNA复制和修复的酶。
术语“核酸”包括含有天然的或非天然出现的核苷酸的DNA或RNA的任何片段，或其它的类蛋白物质，所述类蛋白物质通过互补氢键结合能够特异地结合到其它核酸或寡核苷酸并且还能够结合到非核酸配基。
术语“疫苗”是指分离的或通过抗原呈递细胞的用于刺激体液免疫应答和细胞免疫应答的治疗性组合物，所述抗原呈递细胞例如能够激活T-细胞以产生抗特定抗原的多价细胞免疫应答的激活的树突细胞。有效的抗原呈递细胞通过将其在体外接触多肽复合物而被刺激。所述多肽复合物可以包括树突细胞结合蛋白和多肽抗原，但是优选地，该多肽抗原是组织特异性肿瘤抗原或癌基因产物。但是，据知例如病毒抗原等其它抗原可以被用于该组合中以产生免疫刺激应答。在另外一个优选的实施方案中，形成免疫刺激多肽复合物的一部分的树突细胞结合蛋白是GM-CSF。在进一步的优选实施方案中，形成该复合物的一部分的多肽抗原是肿瘤特异性抗原前列腺酸性磷酸酶。在另外的优选实施方案中，所述多肽抗原可以是任何一种癌基因产物肽抗原。所述多肽复合物还可以包含树突细胞结合蛋白和多肽抗原之间的连接肽。所述多肽复合物可以包括共价连接到多肽抗原的树突细胞结合蛋白，例如优选由树突细胞结合蛋白(优选为GM-CSF)与多肽抗原形成的多肽复合物。该多肽抗原优选为诸如前列腺酸性磷酸酶(PAP)的组织特异性肿瘤抗原或诸如Her2、p21RAS和p53的癌基因产物。但是，例如病毒抗原的其它实施方案也包含在本发明的范围内。
术语“免疫球蛋白”包括涉及宿主防御机制的多肽寡核苷酸，所述机制例如编码一个或一个以上基因载体以及由一个或一个以上基因载体编码、连接宿主防御细胞的核酸的各种结合部分、或与表达载体相偶联而有助于治疗人或动物受试对象。包含在此类多肽内的药物包括单独的或相互结合的IgG、IgE、IgM、IgD。
其它适宜的治疗剂包括促肾上腺皮质激素、表皮生长因子、血小板衍生生长因子(PDGF)、促乳激素、促黄体素释放素、促黄体生成激素释放激素(LHRH)激动剂、LHRH拮抗剂、胃泌素、四肽胃泌素、五肽胃泌素、尿抑胃素、胰泌素、脑啡肽、内啡肽、血管紧张素、肿瘤坏死因子(TNF)、神经生长因子(NGF)、肝素酶、骨形态形成蛋白(BMP)、hANP(人心房利钠肽)、胰高血糖素样肽(GLP-1)、白细胞介素-11(IL-11)、VEG-F(血管内皮生长因子)、重组的乙型肝炎表面抗原(rHBsAg)、肾素、缓激肽、杆菌肽、多粘菌素、粘菌素、短杆菌酪肽、短杆菌肽，以及它们的合成类似物、变体和药学活性片段；酶、细胞因子、抗体和疫苗。
术语“葡聚糖微粒”包括未取代的葡聚糖微粒和取代的葡聚糖微粒。例如，取代的葡聚糖微粒包括用适当基团(例如甲基)取代的葡聚糖，其取代程度达到不损害该葡聚糖微粒的结晶(例如高至3.5％或更低百分比的分支)的程度。微粒的平均直径优选为约0.5微米～约5微米，更优选为约1微米～约2微米。
而且，虽然优选与治疗剂一起使用多孔的非交联的葡聚糖微粒(例如结晶的微粒)，但是也可以替代性使用其它适宜的有机或无机微粒，例如其它的聚合物微粒，包括多糖、PLA、PLGA、PMMA、聚酰亚胺、聚酯、丙烯酸酯、丙烯酰胺、乙酸乙烯酯或其它聚合材料；生物材料微粒例如海藻酸盐和细胞；或者无机颗粒例如二氧化硅、玻璃或磷酸钙。优选该微粒是生物可降解的。优选地，使用多孔性微粒。最优选地，该微粒具有足够的孔隙度，以将治疗剂容纳孔中，并提供该治疗剂从孔隙中的时控释放。换句话说，该治疗剂随着时间进程从孔隙中释放，例如超过5分钟，优选超过30分钟，最优选超过1小时，例如数小时到数天，而不是突然释放。因此，可以基于所用的治疗剂类型、进行递送所需的治疗剂的体积、治疗剂的递送持续时间、药剂将要被递送到的环境以及其它因素，对颗粒材料、孔径和孔隙体积进行选择。
因而，在本发明的一个优选方面，治疗剂至少部分地位于该多孔性微粒的孔隙中。优选地，治疗剂没有被包封在微粒中(即，该微粒没有作为其中装有治疗剂核的外层)并且没有被附到该微粒的表面上。但是，如果需要，除了位于该多孔性微粒的孔隙中外，一部分治疗剂也可以被包封在微粒外层中和/或被附到微粒的表面上。治疗剂在孔隙中的定位提供了该治疗剂最适宜的时控释放。相反地，附到微粒表面的治疗剂通常释放过快，而包封在微粒中的治疗剂经常释放得不够快，并且当该微粒外层崩解时突然释放。在两相体系中，至少80％的治疗剂优选位于被含有该微粒的壁或外层包围的核中。
I.制备方法可以通过任何适宜的方法制备所述微粒。优选地，在该微粒形成后，将该微粒与治疗剂组合。这样，通过任何适宜的方法形成微粒(例如结晶的葡聚糖微粒)，然后通过任何适宜的方法将治疗剂与该微粒组合。相反地，在一些现有技术方法中，通过在溶液中提供颗粒前体材料和治疗剂，然后将该前体材料(例如单体或寡聚体材料)进行结晶或交联以将治疗剂核包封在微粒外层中，从而将治疗剂封装在微粒外层中。
优选地，微粒形成后，将治疗剂提供到该多孔性微粒的孔隙中。这样，首先形成多孔性微粒，然后将治疗剂提供到含有该微粒的溶液中，以使治疗剂渗入该微粒的孔隙中。当然，在该过程中，一些治疗剂也可以变为附着在该微粒的表面。
因而，制备非交联的多孔性的结晶的葡聚糖微粒的方法包括制备葡聚糖溶液(例如水性葡聚糖溶液)，进行结晶步骤以形成结晶的多孔性的葡聚糖微粒，并且如果需要，从溶液中分离出结晶的多孔性葡聚糖微粒。通过将治疗剂提供到含有微粒的结晶溶液中或通过将该分离的微粒和该治疗剂提供到另外的溶液中(例如另外的水性溶液)中，从而将该治疗剂渗入该微粒的孔隙中。例如，可以在第一低分子量葡聚糖水溶液中(例如2kDa～20kDa的葡聚糖溶液)形成结晶的葡聚糖微粒。然后将该微粒从第一溶液中取出，将其放入分子量较高的葡聚糖的第二葡聚糖水溶液中，例如40kDa～500kDa的溶液，例如，40kDa～75kDa的溶液。第二溶液可以含有两相体系中的第一相，然后将所述第一相与第二相(例如含有治疗剂的PEG相)组合。类似的方法可以用于其它多孔性微粒，其中，通过任何适宜的微粒形成方法(包括但不限于结晶)形成多孔性微粒后，将该治疗剂渗入该微粒的孔隙中。可以将该组合物的诸如胰岛素、微粒和一种或多种水性相等成分按任何适宜的顺序或同时进行组合。
优选地，所述微粒在不含有有机溶剂和有机反应促进剂的溶液中通过自组装形成，其中所述有机溶剂和有机反应促进剂在微粒中留下有机残留。因而，例如，葡聚糖微粒优选由葡聚糖水溶液通过自组装形成。但是，如果需要，也可以使用有机溶剂和/或有机反应促进剂。在这种情况中，可以在后续使用之前对该微粒进行纯化，以去除有害的有机残留。
如上所述，具有第一相核和第二相壁或外层的囊结构可以由两相组合物在体内或体外形成。该组合物可以是干燥的粉末，例如作为粉末或多孔性块状物贮存的冻干粉末。当准备将该组合物施用至哺乳动物时，将其与水化合并通过口服或注射施用至哺乳动物。
优选地，当将包含所述微粒和治疗剂的所述组合物的剂量定制成适于注射时，所述包括乳剂和悬浮液的组合物是流动性的胶状体系。所述流动性的胶状体系的例子包括可利用常规型号的注射器或针容易地注入至哺乳动物中的乳剂和悬浮液。相反地，一些现有技术的组合物包含在葡聚糖水凝胶中或交联的葡聚糖基质中的治疗剂。如果没有进行特定制备的话，葡聚糖水凝胶和交联的葡聚糖基质不是流动性的组合物。
在本发明的另一个优选方面，所述微粒包括对哺乳动物黏膜具有粘附性的微粒。优选地，所述粘附性微粒为上述的多孔性微粒。这进一步促进了所述治疗剂的有效递送。
在本发明的另一个优选方面，所述微粒包括其表面经过特别改进的微粒以提高所述治疗剂对该微粒表面的粘附性并优化该治疗剂的递送。该微粒表面可以含有适宜的提高该治疗剂的粘附性的任何改进。
提供本发明的上述描述的目的是进行例证和说明，而非旨在穷尽或将本发明限于所披露的精确形式，并且在上述的教导下可以进行修改和变化，或可以从本发明的实践中获得修改和变化。选择附图和描述的目的是对本发明的原理及其实际应用进行解释。本发明的范围意欲由所附权利要求和其等同物来限定。
本说明书中引用的所有的出版物和专利申请和专利都以参考的方式引入本文。
权利要求
1.一种流动性的药物组合物，该组合物包含用于提供至哺乳动物身体内或身体上的生物可降解的和生物相容的成分，该成分适合于形成生物可降解的生物相容的三维的结构化的对象，所述组合物包含多相的流动性胶状体系和治疗剂，以在所述的身体内或身体上提供局部的或全身的治疗效果。
2.一种用于提供至哺乳动物身体内或身体上的药物组合物，该药物组合物包含第一相；第二相；适合于优先分配到所述第一相中的第一分子或分子聚集体；和适合于优先分配到所述第二相中的第二分子或分子聚集体；其中，当将所述组合物提供到哺乳动物身体内时，所述的第二分子或分子聚集体自组装成与第一分子或分子聚集体相邻的壁。
3.如权利要求1所述的组合物，其中，所述的胶状体系是含有微粒的液体悬浮液或乳剂。
4.如权利要求2所述的组合物，其中所述的第一分子或分子聚集体包含治疗剂；所述的第二分子或分子聚集体包含微粒；所述的壁包含微粒外层，所述外层位于含有治疗剂的核的周围。
5.如权利要求3或4所述的组合物，其中，所述的微粒是多孔性微粒，并且其中所述的组合物是通过注射而被提供到所述哺乳动物身体内的。
6.如权利要求5所述的组合物，其中，所述的多孔性微粒是聚合物微粒。
7.如权利要求6所述的组合物，其中，所述的多孔性微粒是平均直径为0.5微米～5.0微米的结晶的葡聚糖微粒。
8.如权利要求1～7任一项所述的组合物，该组合物是含有微粒混合物的液体两相体系。
9.如权利要求8所述的组合物，其中，所述的两相体系在被提供到体内时形成囊结构，该囊结构含有第一相核和包围在所述核周围的第二相外层。
10.如权利要求9所述的组合物，其中，所述的治疗剂选择性地分配到所述核液相中，并且所述的微粒选择性地分配到所述外层液相中。
11.如权利要求8～10任一项所述的组合物，其中，所述的治疗剂选自肽、蛋白、核酸、病毒、细胞或它们的组合。
12.如权利要求9～11任一项所述的组合物，其中，所述的核包含PEG水性相和选择性地分配的胰岛素，所述外层包含葡聚糖水性相和选择性地分配的结晶的葡聚糖微粒。
13.如权利要求2所述的组合物，其中所述组合物包含流动性的组合物或可以通过与水化合而变为流动性的干燥组合物；所述的第一分子或分子聚集体选自微粒、大分子、细胞、脂质体、DNA、质粒或蛋白；和所述的第二分子或分子聚集体选自微粒、大分子、细胞、脂质体、DNA、质粒或蛋白。
14.一种生物相容的植入体的体内形成方法，该方法包括形成流动性的药物组合物，该药物组合物包含多相的胶状体系和治疗剂；将所述的流动性的药物组合物注射到哺乳动物身体中；和在哺乳动物身体内通过自组装形成生物可降解的和生物相容的结构化的植入体。
15.一种在哺乳动物身体内或身体上提供药物组合物的方法，该方法包括提供药物组合物，该药物组合物包含第一相；第二相；适合于优先分配到所述的第一相中的第一分子或分子聚集体；和适合于优先分配到所述的第二相中的第二分子或分子聚集体；和将所述的药物组合物提供到哺乳动物身体内或身体上，其中，当将所述组合物提供到所述哺乳动物的身体内或身体上时，所述的第二分子或分子聚集体自组装成与第一分子或分子聚集体相邻的壁。
16.如权利要求14所述的方法，其中，所述的胶状体系是含有微粒的液体悬浮液或乳剂。
17.如权利要求15所述的方法，其中所述的第一分子或分子聚集体包含治疗剂；所述的第二分子或分子聚集体包含微粒；所述的壁包含微粒外层，所述微粒外层位于含有治疗剂的核的周围。
18.如权利要求16或17所述的方法，其中，所述的微粒是聚合物微粒，并且所述的哺乳动物身体包括人或动物的身体。
19.如权利要求18所述的方法，其中，所述的聚合物微粒是多孔性微粒。
20.如权利要求19所述的方法，其中，所述的多孔性微粒是平均直径为0.5微米～5.0微米的结晶的葡聚糖微粒。
21.如权利要求14～20任一项所述的方法，其中，所述的组合物是含有微粒的两相体系。
22.如权利要求21所述的方法，其中，所述的两相体系在被提供到体内时形成囊结构，该囊结构包含第一相核和包围在所述核周围的第二相外层。
23.如权利要求22所述的方法，其中，所述的治疗剂选择性地分配到所述核中，并且所述的微粒选择性地分配到所述外层中。
24.如权利要求21～23任一项所述的方法，其中，所述的治疗剂选自肽、蛋白、核酸、病毒或细胞。
25.如权利要求22～24任一项所述的方法，其中，所述的核包含PEG水性相和选择性地分配的胰岛素，所述外层包含葡聚糖水性相和选择性地分配的结晶的葡聚糖微粒。
26.如权利要求15所述的方法，其中所述组合物包含流动性的组合物或在被提供到哺乳动物身体内之前可以通过与水化合而变为流动性的干燥组合物；所述的第一分子或分子聚集体选自微粒、大分子、细胞、脂质体、DNA、质粒或蛋白；和所述的第二分子或分子聚集体选自微粒、大分子、细胞、脂质体、DNA、质粒或蛋白。
27.流动性组合物，该组合物包含生物可降解的和生物相容的微粒的胶状悬浮液或乳剂以及流体中的标记物。
28.如权利要求27所述的组合物，其中所述的微粒包含结晶的葡聚糖微粒；所述标记物包括荧光大分子，当所述的荧光大分子位于哺乳动物身体内时，该荧光大分子从所述组合物中进行可控的释放。
29.如权利要求27所述的组合物，其中，所述的胶状悬浮液包括具有第一相外层和第二相核的囊，所述的第一相外层包含选择性地分配的标记物，所述第二相核包含选择性地分配的微粒。
30.一种生物相容的植入体的体内形成方法，该方法包括提供组合物，该组合物包含生物相容的和生物可降解的微粒的胶状悬浮液或乳剂以及流体中的标记物；和将所述的药物组合物导入哺乳动物身体内。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述的微粒包含结晶的葡聚糖微粒；所述的结晶的葡聚糖微粒与哺乳动物身体是生物相容的，并且在该哺乳动物体内是生物可降解的；和所述的标记物包含荧光大分子。
32.如权利要求30所述的方法，其中，所述的胶状悬浮液在被导入哺乳动物身体内时自组装成具有第一相核和第二相外层的囊，所述的第一相核包含选择性地分配的标记物，所述的第二相外层包含选择性地分配的微粒。
33.一种细胞治疗方法，该细胞治疗方法包括在需要的哺乳动物中提供被包封在结晶的葡聚糖微粒的囊中的或与结晶的葡聚糖微粒的囊的外表面接触的细胞。
34.如权利要求33所述的方法，其中所述的细胞被包封在所述的囊中，从而该细胞包含所述囊的核，并且所述的微粒包含包封有所述核的外层；和所述外层对于氧和营养物质是能透过的，但对于免疫系统细胞是不能透过的。
35.如权利要求34所述的方法，其中，所述细胞包含产生胰岛素的细胞，该细胞在对血糖渗透入所述囊的应答中产生胰岛素并将胰岛素穿过所述囊释放到哺乳动物血液中以降低血糖。
36.如权利要求34所述的方法，其中，所述细胞包含不是来自待施用所述组合物的哺乳动物的细胞。
37.如权利要求33所述的方法，其中所述细胞与所述囊的外表面接触；和所述细胞包含来自待施用所述组合物的哺乳动物的细胞。
38.一种骨移植物替代品，该骨移植物替代品包含多孔性的结晶的葡聚糖微粒。
39.如权利要求38所述的骨移植物替代品，该骨移植物替代品还包含位于所述微粒的孔隙中的治疗剂，该治疗剂在身体的特定部位提供骨的形成。
40.一种形成骨移植物替代品的方法，该方法包括将多孔性的结晶的葡聚糖微粒提供到哺乳动物身体中的骨移植物部位，并形成包含所述的多孔性的结晶的葡聚糖微粒的骨移植物替代品。
41.如权利要求40所述的方法，该方法还包括在第一液相中制备多孔性的结晶的葡聚糖微粒的悬浮液；在与第一液相不混溶的第二液相中制备第二微粒的悬浮液；制备乳剂，其中所述第二液相是连续相，而第一液相是分散相；和将该乳剂注射到哺乳动物身体内。
42.如权利要求41所述的方法，其中第二微粒包含陶瓷微粒；和在身体的特定部位提供骨形成的治疗剂位于所述多孔性的结晶的葡聚糖微粒的孔隙中。
43.一种方法，该方法包括提供结晶的葡聚糖微粒；和在该葡聚糖微粒已结晶后，将治疗有效量的胰岛素和所述结晶的葡聚糖微粒在溶液中组合，以形成胰岛素和结晶的葡聚糖微粒的悬浮液。
44.如权利要求43所述的方法，该方法还包括将所述悬浮液施用至哺乳动物。
45.如权利要求44所述的方法，其中所述结晶的葡聚糖微粒包含平均直径为0.5微米～5微米的微粒；提供所述微粒的步骤包括在非有机溶剂中形成所述微粒；所述溶液包含水性溶液；和所述的哺乳动物包括人。
46.如权利要求44所述的方法，该方法还包括将所述悬浮液干燥，以提供包含所述结晶的葡聚糖微粒和所述胰岛素的组合物。
47.一种制备非交联的结晶的多孔性的葡聚糖微粒的方法，该方法包括(a)制备没有有机溶剂的葡聚糖水性溶液；(b)在高于室温的温度进行结晶步骤以形成葡聚糖微粒；和(c)从该溶液中分离非交联结晶的多孔性的结晶的葡聚糖微粒。
48.如权利要求47所述的方法，其中所述的葡聚糖溶液包含分子量为2kDa～200kDa的葡聚糖；和所述的结晶步骤是在40℃～99℃的温度进行的。
49.如权利要求48所述的方法，其中所述的微粒是在所述溶液中自发形成的；所述的葡聚糖溶液包含分子量为20kDa～75kDa的葡聚糖；和所述的结晶步骤是在40℃～70℃的温度进行的。
50.如权利要求47所述的方法，该方法还包括将所述微粒与胰岛素组合。
51.一种在微粒孔隙中含有治疗剂的多孔性的结晶的葡聚糖微粒的制备方法，该方法包括提供包含已形成的多孔性的结晶的葡聚糖微粒的悬浮液；和将所述治疗剂提供到所述悬浮液中，从而该治疗剂渗透入所述多孔性微粒的孔隙中。
52.如权利要求51所述的方法，其中，提供悬浮液的步骤包括制备葡聚糖水溶液；进行结晶步骤以形成多孔性的结晶的葡聚糖微粒；从该溶液中分离所述的微粒；和将该微粒提供到含有所述治疗剂的胶状体系中。
53.如权利要求52的方法，其中所述的治疗剂包含胰岛素；和所述的胶状体系包含含有胰岛素和所述微粒的悬浮液。
54.一种组合物，该组合物包含胰岛素；和多孔性的结晶的葡聚糖微粒；其中，所述微粒是在将胰岛素和该微粒在所述组合物进行组合中之前形成的。
55.如权利要求54所述的组合物，其中，该组合物包含流动性的胶状组合物，并且所述的微粒包含平均直径为0.5微米～5微米的微粒。
56.如权利要求54所述的组合物，其中，所述胰岛素位于所述结晶的葡聚糖微粒的孔隙中，而不是被包封在各个微粒内。
57.如权利要求54所述的组合物，其中，所述胰岛素选择性地分配到第一聚合物相中，所述微粒选择性地分配到第二聚合物相中，这样当该组合物被导入哺乳动物体内后形成结构化的植入体。
58.一种组合物，该组合物包含胰岛素；第一聚合物；与第一聚合物不相容的第二聚合物；和微粒。
59.如权利要求58所述的组合物，其中，该组合物包含流动性的胶状组合物，并且所述微粒包含平均直径为0.5微米～5微米的结晶的葡聚糖微粒。
60.如权利要求59所述的组合物，其中，所述第一聚合物包含葡聚糖，所述第二聚合物包含PEG。
61.如权利要求60所述的组合物，其中，所述的胰岛素选择性地分配到PEG相中，所述的微粒选择性地分配到葡聚糖相中，这样当该组合物被导入哺乳动物体内后形成结构化的植入体，该结构化的植入体包含PEG相核和葡聚糖相外层。
62.一种在哺乳动物中降低血糖的方法，该方法包括对哺乳动物提供治疗有效量的含有结晶的葡聚糖微粒和胰岛素的组合物以降低该哺乳动物的血糖，其中，所述的微粒是在将所述胰岛素和该微粒在所述的组合物中组合之前形成的。
63.如权利要求62所述的方法，其中，所述的组合物包含流动性的胶状组合物，并且所述的微粒包含平均直径为0.5微米～5微米的结晶的葡聚糖微粒。
64.如权利要求63所述的方法，其中所述的组合物包含两相组合物，该两相组合物含有葡聚糖相和PEG相；所述的胰岛素选择性地分配到PEG相中，所述微粒选择性地分配到葡聚糖相中；和该组合物在被导入哺乳动物体内后形成结构化的植入体，该结构化的植入体含有PEG相核和葡聚糖相外层。
65.如权利要求64所述的方法，该方法还包括基于接受所述组合物的哺乳动物的身体而控制所述外层的厚度以控制胰岛素从植入体中的释放。
66.如权利要求62所述的方法，其中，对糖尿病病人提供所述组合物，以降低所述病人的血糖浓度。
67.一种吸入器，该吸入器包括适用于通过吸入对哺乳动物施用一剂药物组合物的容器；和装在所述容器中的药物组合物，该药物组合物包含结晶的葡聚糖微粒和治疗有效量的胰岛素。
68.一种在哺乳动物中降低血糖的方法，该方法包括通过吸入对哺乳动物施用治疗有效量的含有结晶的葡聚糖微粒和胰岛素的组合物，以降低该哺乳动物的血糖。
全文摘要
本发明涉及在哺乳动物中降低血糖的方法，该方法包括以口服、注射或吸入等方式对哺乳动物施用治疗有效量的结晶的葡聚糖微粒和胰岛素，以降低该哺乳动物的血糖。所述的组合物可以是单相或结构化的多相组合物，该组合物用于控释释放胰岛素或其它治疗剂。
文档编号A61K9/00GK1767849SQ200480009181
公开日2006年5月3日 申请日期2004年3月4日 优先权日2003年3月4日
发明者弗拉迪米尔·萨比特斯凯 申请人:技术发展有限公司