蛋白激酶抑制剂的制作方法

专利名称：蛋白激酶抑制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及某些化合物在蛋白激酶的抑制中的用途，该抑制剂具体是促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族的抑制剂，更详细地讲是丝氨酸/苏氨酸激酶，促分裂原活化蛋白激酶激活的蛋白激酶2(MAPKAP-K2)抑制剂。描述了它们在医学上特别是在预防和/或治疗炎症和神经疾病上的用途。
背景技术：
蛋白激酶是一族催化蛋白质中的羟基磷酸化的酶。预计约2％的人类基因组编码的基因编码蛋白激酶。位于目标蛋白质上的特定的酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸残基的可逆磷酸化作用可以几种方式显著改变其功能，包括激活或抑制酶活性；创建或阻断其他酶的结合位点；改变亚细胞定位或控制蛋白质稳定性。因此蛋白激酶是多种细胞过程调节的枢纽，所述过程包括新陈代谢、细胞增殖、分化和存活。在已知需要蛋白激酶作用的许多不同的细胞功能中，一些代表用于治疗某些疾病的靶。
已知几种疾病可由异常的蛋白激酶活性导致或与其相关。已知人类的蛋白质酪氨酸激酶在许多疾病(包括糖尿病、癌症)的发展中具有重要的作用且已牵涉到多种先天性综合征。丝氨酸苏氨酸激酶也代表一类酶，其抑制剂可能与癌症、糖尿病和各种炎症的治疗有关。因此蛋白激酶活性的调节代表新治疗药设计的有吸引力的领域。
迄今为止已经鉴定了蛋白激酶抑制的三种可能的机理。这些包括假底物机理、腺嘌呤拟态机理和通过使用活性位点以外的表面将酶锁定为无活性构象。目前为止已经鉴定/设计的大多数抑制剂作用于ATP结合位点。这类ATP竞争性抑制剂已经通过它们靶向作用更差的保守区域ATP结合位点的能力来证明其选择性。
一种影响细胞调节的主要机理是通过细胞外信号跨膜转导而调节细胞内的生物化学途径。蛋白质磷酸化作用代表通过细胞内信号从分子传播到分子并最终导致细胞响应的过程。这些信号转导级联被高度调节且经常重叠，如许多蛋白激酶以及磷酸酶的存在所证明。目前认为许多疾病和/或病症是激酶级联的分子组分中异常活化或功能突变的结果。
MAPKAP-K2是在应激诱导的MAPK途径(

图1)中的直接操纵p38的下游的丝氨酸/苏氨酸激酶。
p38途径参与转导各种应激相关的细胞外刺激如热激、紫外光、细菌脂多糖和促炎细胞因子。该途径的激活导致转录和起始因子的磷酸化作用，并影响细胞分裂、凋亡、培养细胞的侵入力和炎症反应(Martin-Blanco，Bioessays 22，637-645(2000))。
p38本身激活许多除MAPKAP激酶以外的蛋白激酶，例如Mnkl/2、PRAK和MSK1(图1)。大多数这些下游靶的特定和/或重叠功能还有待分辨。该途径对新抗炎药的发现具有特别的重要性。过去的干预该途径的策略已包括开发p38本身的选择性抑制剂。这类抑制剂已经在抑制细胞模型中促炎细胞因子的产生方面证明有效，并在慢性炎症的动物模型中证明有效(Lee等发表于免疫药理学第47卷第185-201页(2000)的文献(Lee et al.，Immuno pharmacology 47，185-201(2000))。然而，小鼠模型中p38表达的敲除导致胚胎死亡，此外得自这类胚胎的细胞已经证明了一些对基础细胞响应的影响。这些观察表明应慎重对待涉及用p38抑制剂对人类长期给药的疗法。
一种可供选择的开发抗炎药的策略应是在MAPKAP-K2水平上的抑制该途径。人类MAPKAP-K2在其N-端具有两个富脯氨酸片段，其后是激酶域和C-端调节域。该激酶与除MAPKAP-K3和4以外的其他丝氨酸/苏氨酸激酶的同源性低。C端调节域包含二分核定位信号和核输出信号。已经解析出无活性MAPKAP-K2的晶体结构(Meng，W.等发表于生物化学杂志第277卷第37401-37405页(2002)的文献(Meng，W.et al.J.Biol.Chem.277，37401-37405(2002)))。MAPKAP-K2通过p38的激活是通过苏氨酸残基222和334的选择性磷酸化作用而发生(Stokoe et al.，EMBO J.11，3985-3994(1992))。MAPKAP-K2具有位于其C端区域中的两亲性A螺旋基序，所述基序可能阻断底物的结合。已经提出通过p38的双磷酸化作用来再定位该基序产生催化活性提高(You-Li等发表于生物化学杂志第270卷第202-206页(1995)的文献(You-Li et al.，J.Biol.Chem.270，202-206(1995)))。MPKAP-K2存在于未经刺激的细胞的细胞核中并在细胞激活时移位到细胞质中。已知这种激酶会磷酸化许多核转录因子以及胞质蛋白质例如热激蛋白质和5-脂加氧酶(Stokoe et al.，FEBS Lett.313，307-313(1992)，Werz，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97，5261-5266(2000)，Heidenreich，et al.，J.Biol.Chem.274，14434-14443(1999)，Tan，et al.，EMBO J.15，4629-4642(1996)，Neufeld，J.Biol.Chem.275，20239-20242(2000))。所有的这类底物包含通过MAPKAP-K2有效磷酸化所需的独特的氨基酸基序(XX-Hyd-XRXXSXX，其中Hyd为庞大的疏水残基)(Stokoe et al.，Biochem.J.296，843-849(1993))。
目前MAPKAP-K2是唯一的已经鉴定特定功能的p38底物。已经通过MAPKAP-K2缺陷小鼠(MAPKAP-K2-/-)表型有力地表明了MAPKAP-K2在介导炎症反应中的具体作用(Kotlyarov，et al.，NatureCell Biol.1，94-97(1999))。这种小鼠能生存并且正常，只是炎症反应显著减少。近来还表明MAPKAP-K2缺陷导致缺血性脑部损伤的显著的神经保护作用(Wang et al.，J.Biol Chem.277，43968-43972(2002))。MAPKAP-K2被认为调节重要的促炎细胞因子mRNA的翻译和/或稳定性。人们认为通过蛋白质的磷酸化作用来执行这项功能，所述蛋白质结合到发现于这些细胞因子的未经翻译区域内的富AU元件上。目前正在研究这些蛋白质的性质。
因此MAPKAP-K2代表了用于干扰炎症反应的应激诱导的激酶级联中的靶向作用点。
需要提供成为MAPKAP-K2激酶抑制剂的化合物。
发明公开作为旨在取得上述目标的大量勤奋研究的结果，本发明人发现由下式(I)表示的吡唑并[1，5-a]嘧啶衍生物和它们的药学上可接受的盐显示出极好的激酶抑制活性，并在这一发现基础上完成本发明。
换句话说，本发明提供以下(1)式(I)的化合物或其药学上可接受的盐或其他药学上可接受的生物水解衍生物，包括其酯、酰胺、氨基甲酸酯、碳酸酯、酰脲、溶剂化物、水合物、亲和试剂或前体药物在制备用于抑制蛋白激酶的药物中的用途 其中R1为氢R2为氢R3为C1-C8任选取代的烷基、C2-C8任选取代的烯基、C2-C8任选取代的炔基、C3-C8任选取代的环烷基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、任选取代的芳烷基、任选取代的杂芳烷基、任选取代的芳烯基、任选取代的杂芳烯基、任选取代的芳炔基或任选取代的杂芳炔基；R4为氢；R5为C1-C8任选取代的烷基、C2-C8任选取代的烯基、C2-C8任选取代的炔基、C3-C8任选取代的环烷基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、任选取代的芳烷基、任选取代的杂芳烷基、任选取代的芳烯基、任选取代的杂芳烯基、任选取代的芳炔基或任选取代的杂芳炔基、任选取代的杂环基或任选取代的杂环基烷基；R6为氢、C1-C8任选取代的烷基、C2-C8任选取代的烯基、C2-C8任选取代的炔基或C3-C8任选取代的环烷基；或R5和R6一起与连接它们的氮原子共同形成各环均为5-7元环的单环或双环杂环，并且除氮原子之外还任选含有一个或两个选自N、O和S的另外的杂原子，所述单环或双环杂环可任选被一个或多个取代基取代；(2)(1)的用途，其中R3为C1-C8任选取代的烷基、C2-C8任选取代的烯基、C2-C8任选取代的炔基、C3-C8任选取代的环烷基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、任选取代的芳烷基或任选取代的杂芳烷基。
(3)(2)的用途，其中R3为C2-C8任选取代的烯基、任选取代的芳基或任选取代的芳烷基。
(4)(1)-(3)中任一项的用途，其中R5为C1-C8任选取代的烷基、C2-C8任选取代的烯基、C2-C8任选取代的炔基、C3-C8任选取代的环烷基、任选取代的杂环基或任选取代的杂环基烷基。
(5)(4)的用途，其中R5为被NHR7取代的C3-C8环烷基，其中R7为任选取代的杂环基或任选取代的杂环基烷基。
(6)(1)-(5)中任一项的用途，其中R6为氢或C1-C8任选取代的烷基。
(7)(6)的用途，其中R6为氢。
(8)(1)-(7)中任一项的用途，其中药物用作MAPKAP-K2的抑制剂。
(9)(8)的用途，其中药物用于预防或治疗MAPKAP-K2介导的疾病。
(10)(9)的用途，其中MAPKAP-K2介导的疾病为神经疾病(包括痴呆症)、炎性疾病、调亡相关的疾病，特别是神经元调亡、中风、脓毒症、自身免疫性疾病、破坏性骨骼疾病、增生性疾病、癌症、传染病、变态反应、局部缺血再灌注损伤、心脏病发作、血管原性疾病、器官低氧症、血管增生症、心脏肥大症、凝血酶诱导的血小板凝集。
(11)(10)的用途，其中疾病为神经变性疾病。
(12)(11)的用途，其中神经变性疾病为痴呆症、阿耳茨海默氏病(Alzheimer′s disease)、帕金森病(Parkinson′s disease)、肌萎缩侧索硬化、杭廷顿氏舞蹈病(Huntington′s disease)、老年性舞蹈病、西德纳姆舞蹈病(Sydenham′s chorea)、低血糖、头部和脊髓创伤包括创伤性头部损伤、急性和慢性疼痛、癫痫症和癫痫发作、橄榄体脑桥小脑痴呆症、神经元细胞死亡、低氧症相关的神经变性、急性低氧症、谷氨酸盐毒性包括谷氨酸盐神经毒性、脑局部缺血、与脑膜炎和/或神经官能症相关的痴呆症、脑血管性痴呆症或HIV感染患者的痴呆症。
(13)(10)的用途，其中疾病由炎症导致。
(14)(13)的用途，其中疾病为肠炎、支气管炎、哮喘、急性胰腺炎、慢性胰腺炎、各种类型的变态反应或阿耳茨海默氏病。
(15)(10)的用途，其中疾病为自身免疫性疾病。
(16)(15)的用途，其中自身免疫性疾病为类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、肾小球肾炎、硬皮病、慢性甲状腺炎、格雷夫斯病(Graefe′sdisease)、自身免疫性胃炎、糖尿病、自身免疫性溶血贫血症、自身免疫性中性粒细胞减少症、血小板减少症、特异性皮炎、慢性活动性肝炎、重症肌无力、多发性硬化、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病(Crohn′sdisease)、银屑病或移植物抗宿主疾病。
(17)一种治疗或预防个体的MAPKAP-K2介导的疾病的方法，该方法包括给予所述个体至少一种如(1)-(7)中任一项所定义的化合物或(8)或(9)所定义的组合物。
(18)(17)的方法，其中MAPKAP-K2介导的疾病为神经疾病(包括痴呆症)、炎性疾病、调亡相关的疾病，特别是神经元调亡、中风、脓毒症、自身免疫性疾病、破坏性骨骼疾病、增生性疾病、癌症、传染病、变态反应、局部缺血再灌注损伤、心脏病发作、血管原性疾病、器官低氧症、血管增生症、心脏肥大症、凝血酶诱导的血小板凝集。
(19)(18)的方法，其中疾病为神经变性疾病。
(20)(19)的方法，其中神经变性疾病为痴呆症、阿耳茨海默氏病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化、杭廷顿氏舞蹈病、老年性舞蹈病、西德纳姆舞蹈病、低血糖、头部和脊髓创伤包括创伤性头部损伤、急性和慢性疼痛、癫痫症和癫痫发作、橄榄体脑桥小脑痴呆症、神经元细胞死亡、低氧症相关的神经变性、急性低氧症、谷氨酸盐毒性包括谷氨酸盐神经毒性、脑局部缺血、与脑膜炎和/或神经官能症相关的痴呆症、脑血管性痴呆症或HIV感染患者的痴呆症。
(21)(18)的方法，其中疾病由炎症导致。
(22)(21)的方法，其中疾病为肠炎、支气管炎、哮喘、急性胰腺炎、慢性胰腺炎、各种类型的变态反应或阿耳茨海默氏病。
(23)(18)的方法，其中疾病为自身免疫性疾病。
(24)(23)的方法，其中自身免疫性疾病为类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、肾小球肾炎、硬皮病、慢性甲状腺炎、格雷夫斯病、自身免疫性胃炎、糖尿病、自身免疫性溶血贫血症、自身免疫性中性粒细胞减少症、血小板减少症、特异性皮炎、慢性活动性肝炎、重症肌无力、多发性硬化、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、银屑病或移植物抗宿主疾病。
(25)(18)-(24)中任一项的方法，其中一种或多种活性剂与该化合物同时、先后或序贯给予个体。
(26)确定(1)-(7)中任一项所定义的化合物的活性的方法，该方法包括提供分析活性和分析(1)-(7)中任一项所定义的化合物的活性的系统。
(27)(26)的方法，其中分析是化合物的蛋白激酶抑制活性分析。
(28)抑制蛋白激酶活性或功能的方法，该方法包括将蛋白激酶暴露于(1)-(7)中任一项所定义的化合物中。
(29)抑制MAPKAP-K2活性或功能的方法，该方法包括将MAPKAP-K2暴露于(1)-(7)中任一项所定义的化合物中。
(30)(29)的方法，该方法在研究模型中、体外、计算机芯片上或体内例如动物模型内进行。
附图简述图1显示在应激诱导的MAPK途径中p38级联。图2显示制备式I的化合物的常规反应方案。现在将通过以下非限定性实施例举例说明本发明。
实施本发明的最佳模式为了本发明的目的，烷基涉及具有1-8个碳原子的直链和支链烷基，包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、正戊基和正己基。该术语还包括C3-C8碳原子的环烷基，包括但不限于环丙基、环丁基、CH2-环丙基、CH2-环丁基、环戊基或环己基。
术语“烯基”是指2-8个碳原子且包含一个或多个碳碳双键的直链或支链烯基，包括但不限于乙烯基、正丙烯1-基、正丙烯2-基、异丙烯基等。
术语“炔基”是指2-8个碳原子的且包含一个或多个碳碳三键的直链或支链炔基，包括但不限于乙炔基、2-甲基乙炔基等。
“芳族”是指包含一个环或稠合为一个或多个饱和或不饱和环的3-10元芳烃，包括但不限于苯基、萘基、蒽基(anthracenyl)或菲基(phenanthracenyl)。
“杂芳基”是指包含一个或多个选自N、O或S的杂原子且包含一个环或稠合为一个或多个饱和或不饱和环的3-10元芳基；且
“杂环基”是指包含一个或多个选自N、O或S的杂原子且包含杂芳基的3-10元环系统。杂环基系统可包含一个环或可稠合为一个或多个饱和或不饱和环；杂环基可完全饱和、部分饱和或不饱和，包括但不限于杂芳基和杂碳环基。碳环基或杂环基的实例包括但不限于环己基、苯基、吖啶、苯并咪唑、苯并呋喃、苯并噻吩、苯并噁唑、苯并噻唑、咔唑、噌啉、二噁英、二氧六环、二氧戊环、二噻烷、二噻嗪、二噻唑、二硫杂环戊烷、呋喃、咪唑、咪唑啉、四氢咪唑、吲哚、二氢吲哚、吲嗪、吲唑、异吲哚、异喹啉、异噁唑、异噻唑、吗啉、萘啶、噁唑、噁二唑、噁噻唑(oxathiazole)、噁噻唑烷(oxathiazolidine)、噁嗪、噁二嗪(oxadiazine)、吩嗪、吩噻嗪、吩噁嗪、酞嗪、哌嗪、哌啶、蝶啶、嘌呤、吡喃、吡嗪、吡唑、吡唑啉、吡唑烷、哒嗪、吡啶、嘧啶、吡咯、吡咯烷、吡咯啉、喹啉、喹喔啉、喹唑啉、喹嗪、四氢呋喃、四嗪、四唑、噻吩、噻二嗪、噻二唑、噻三唑、噻嗪、噻唑、硫代吗啉、硫萘(thianaphthalene)、噻喃、三嗪、三唑和三噻烷。
卤素是指F、Cl、Br或I。
合适的取代基包括烷基、环烷基、杂环基、烯基、炔基、烷氧基、芳氧基、卤素、羟基、NO2、CN、CO2R14、CONR14R15、NR14(CO)nR15、S(O)mR14；其中R14和R15可以相同或不同，为氢、烷基或芳基；n为0、1；m为0、1或2。
优选R3为C1-C8任选取代的烷基、C2-C8任选取代的烯基、C2-C8任选取代的炔基、C3-C8任选取代的环烷基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、任选取代的芳烷基或任选取代的杂芳烷基。
更优选R3为C1-C8任选取代的烯基、任选取代的芳基或任选取代的芳烷基。
优选R5为C1-C8任选取代的烷基、C2-C8任选取代的烯基、C2-C8任选取代的炔基、C3-C8任选取代的环烷基、任选取代的杂环基或任选取代的杂环基烷基。
更优选R5为被NHR7取代的C3-C8环烷基，其中R7为任选取代的杂环基或任选取代的杂环基烷基。
优选R6为氢或C1-C8任选取代的烷基。更优选R6为氢。
作为本发明式I中优选的R1-R6的实例提及的基团的优选组合，可以提及的是以下组合1)和2)。
1)式I中，其中R1为氢，R2为氢，R3为C6-C14任选取代的芳基，R4为氢，R5为C3-C8任选取代的环烷基且R6为氢。
2)式I中，其中R1为氢，R2为氢，R3为C6-C14任选取代的芳基，R4为氢，R5为任选取代的杂环基且R6为氢。
用于第一方面的化合物可以盐的形式提供，优选式I的化合物的药学上可接受的盐。这些化合物的药学上可接受的盐的实例包括衍生自有机酸(例如乙酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、乳酸、草酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、安息香酸、水杨酸、苯乙酸、扁桃酸、甲磺酸、苯磺酸和对甲苯磺酸)和无机酸(例如盐酸和硫酸等)，分别得到甲磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐、盐酸盐和硫酸盐等或衍生自碱(例如有机和无机碱)的盐。用于形成本发明化合物的盐的合适的无机碱的实例包括铵、锂、钠、钙、钾、铝、铁、镁、锌等的氢氧化物、碳酸盐和碳酸氢盐。也可用合适的有机碱来形成盐。这类适于与本发明化合物形成药学上可接受的碱加成盐的碱包括有机碱，所述有机碱无毒且到足以成盐。这类有机碱为本领域所熟知并可包括氨基酸(例如精氨酸和赖氨酸)、一、二或三羟基烷基胺(例如一、二和三乙醇胺)、胆碱、一、二和三烷基胺(例如甲胺、二甲胺和三甲胺)、胍；N-甲基葡糖胺；N-甲基哌嗪；吗啉；乙二胺；N-苯甲基苯乙胺；三(羟甲基)氨基甲烷等。
可以采用本领域熟知的方法以常规方式制备盐。所述碱性化合物的酸加成盐可通过将本发明第一和第二方面的游离碱化合物溶解于水溶液或含水乙醇溶液或其他合适的包含所需酸的溶剂中而制得。当本发明化合物包含酸性官能团时，则所述化合物的碱盐可通过将所述化合物与合适的碱反应而制得。酸或碱盐可直接分离或可通过浓缩溶液(例如蒸发)而制得。本发明的化合物也可以溶剂化物或水合物形式存在。
本发明还延伸到上述化合物的前体药物如上述化合物的酯或酰胺的用途。前体药物为任何可在生理条件下或通过溶剂分解作用被转化为本发明化合物或本发明化合物的药学上可接受的盐的任何化合物。前体药物在给予患者时可无活性但在体内被转化为本发明的活性化合物。
本发明使用的化合物可包含一个或多个不对称碳原子并可以外消旋形式和光学活性形式存在。本发明化合物可以反式或顺式形式存在。本发明的第一方面涵盖了所有此类化合物的用途。
作为上述式I的化合物的具体实例，可以提及的化合物列于下表A。
其中“Me”和“Ph”分别是指“甲基”和“苯基”。
表A


















此处所定义的化合物相称地为MAPKAP-K2的抑制剂。为了本发明的目的，抑制剂为任何降低或阻止MAPKAP-K2酶活性的化合物。
“MAPKAP-K2介导的疾病”为任何MAPKAP-K2起作用的疾病或病症。实例包括神经疾病(包括痴呆症)、炎性疾病、调亡相关的疾病，特别是神经元调亡、中风、脓毒症、自身免疫性疾病、破坏性骨骼疾病、增生性疾病、癌症、传染病、变态反应、局部缺血再灌注损伤、心脏病发作、血管原性疾病、器官低氧症、血管增生症、心脏肥大症、凝血酶诱导的血小板凝集。
此处所定义的化合物特别适用于预防或治疗神经变性疾病。特别是由调亡和/或炎症导致的神经变性疾病。神经变性疾病的实例为痴呆症、阿耳茨海默氏病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化、杭廷顿氏舞蹈病、老年性舞蹈病、西德纳姆舞蹈病、低血糖、头部和脊髓创伤包括创伤性头部损伤、急性和慢性疼痛、癫痫症和癫痫发作、橄榄体脑桥小脑痴呆症、神经元细胞死亡、低氧症相关的神经变性、急性低氧症、谷氨酸盐毒性包括谷氨酸盐神经毒性、脑局部缺血、与脑膜炎和/或神经官能症相关的痴呆症、脑血管性痴呆症或HIV感染患者的痴呆症。
此处所定义的化合物也可用于预防或治疗由炎症导致的疾病。这些包括例如肠炎、支气管炎、哮喘、急性胰腺炎、慢性胰腺炎、各种类型的变态反应以及可能为阿耳茨海默氏病。也可用本发明化合物治疗或预防的自身免疫性疾病包括类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、肾小球肾炎、硬皮病、慢性甲状腺炎、格雷夫斯病、自身免疫性胃炎、糖尿病、自身免疫性溶血贫血症、自身免疫性中性粒细胞减少症、血小板减少症、特异性皮炎、慢性活动性肝炎、重症肌无力、多发性硬化、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、银屑病或移植物抗宿主疾病。
本发明所用化合物可按以下方法制备通过将式II、III或VI的化合物如下反应，其中R1-R6如上所定义1)将式II的化合物 在不存在或存在金属催化的情况下在例如Buchwald条件下与式R5R6NH的化合物反应(J.Am.Chem.Soc.116，7901-7902(1994))，并用例如CF3CO2H来脱除保护基(例如见述于Protective Groups InOrganic Synthesis(有机合成中的保护基，第三版)，John Wiley & SonsInc)。
2)将式III的化合物 与式R5R6NH的化合物反应。
3)将式III的化合物
与式((CH3)3COCO)2O的化合物反应(例如见述于有机合成中的保护基，第三版，John Wiley & Sons Inc)。
4)将式IV的化合物 与式R3NH2或R3NHAc的化合物反应。
式I的化合物可经过一个或多个进一步的反应来提供不同的式I化合物。例如化合物可经过还原、氧化、消除、取代和/或加成反应。
式IV的化合物为已知或可通过类似于已知的制备类似的已知化合物的方法来制备。式II和III的化合物包括新的化合物且这类新的化合物形成本发明的另外的方面。
其他方法以及制备起始材料和中间体的方法对本领域化学家是显而易见的。实例也阐明了各种制备本发明化合物以及起始材料和中间体的方法。
此处所定义的药物也可包含一种或多种另外的活性剂，例如抗炎剂(例如p38抑制剂、谷氨酸盐受体拮抗剂或钙通道拮抗剂)、化疗剂和/或抗增生剂。
合适的载体和/或稀释剂为本领域所熟知，并包括药品级淀粉、甘露糖醇、乳糖、硬脂酸镁、糖精钠、滑石粉、纤维素、葡萄糖、蔗糖(或其他糖)、碳酸镁、明胶、油、醇、清洁剂、乳化剂或水(优选无菌)。组合物可为一种组合物的混合制剂或可为同时、分别或按顺序使用(包括给药)的联用制剂。
药物可通过任何方便的方法给药，例如通过口服(包括通过吸入)、胃肠外、粘膜(例如口腔、舌下、鼻)、直肠或透皮给药且组合物相应地调整。
对口服给药，组合物可配制为液体或固体，例如溶液、糖浆、混悬剂或乳化液、片剂、胶囊和锭剂。
液体制剂一般由化合物或生理学上可接受的盐在合适的水或非水的液体载体(例如水、乙醇、甘油、聚乙二醇或油)中的悬浮液或溶液组成。该制剂也可包含悬浮剂、防腐剂、调味剂或着色剂。
片剂形式的组合物可通过使用通常用于制备固体制剂的任何合适的药物载体制得。这类载体的实例包括硬脂酸镁、淀粉、乳糖、蔗糖和微晶纤维素。
胶囊形式的组合物可通过采用常规胶囊化方法来制备。例如包含活性成分的散剂、颗粒或小丸可通过使用标准载体并随后填充到硬明胶胶囊中制得。或者，分散剂或混悬剂可通过使用任何合适的药物载体(例如含水树胶、纤维素、硅酸盐或油)，且分散剂或混悬剂随后填充到软明胶胶囊中制得。
可以设计口服给药组合物使其在通过消化道时保护活性成分不受降解，例如通过在片剂或胶囊制剂上外包衣。
典型的胃肠外组合物由化合物或生理学上可接受的盐在无菌水或非水的载体或胃肠外可接受的油(例如聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、卵磷脂、花生油或芝麻油)的溶液或悬浮液组成。或者，溶液可被冻干并随后在给药前与合适的溶剂重新构建。
鼻腔或口服给药的组合物可方便地配制为气雾剂、滴剂、凝胶剂和散剂。气雾剂制剂通常包含活性物质在生理学上可接受的水或非水溶剂中的溶液或稳定悬浮液，且通常以密闭容器中单剂量或多剂量数量的无菌形式存在，所述密闭容器可为药筒形式或用雾化器再填充使用。或者，密闭容器可为单次撒布装置，例如单剂量鼻吸入器或配备计量阀的气雾剂分样器，所述分样器在容器的内容物耗尽时丢弃。当剂型包含气雾剂分样器时，它将包含药学上可接受的抛射剂。气雾剂剂型也可为泵雾化器形式。
适合口腔或舌下给药的组合物包括片剂、锭剂和软锭剂，其中活性成分用载体例如糖和阿拉伯胶、黄芪胶或明胶和甘油来配制。
直肠或阴道给药的组合物可方便地以栓剂(包含常规的栓剂基质例如可可脂)、阴道环、阴道片、泡沫或灌肠剂的形式。
适合透皮给药的组合物包括软膏剂、凝胶剂、贴剂和针剂(包括粉针剂)。
组合物方便地为单位剂量形式例如片剂、胶囊剂或安瓿剂。
药物的制备可采用本领域熟知的标准方法进行。组合物可为包括片剂、液体制剂、胶囊剂和散剂的任何形式或为食品的形式，例如功能食品。在后一种情况中，食品本身可用作药学上可接受的载体。
此处所定义化合物可与一种或多种其他活性剂(例如抗炎剂(如p38抑制剂)、谷氨酸盐受体拮抗剂、钙通道拮抗剂、化疗剂或抗增殖剂)同时、先后或序贯给药。例如对急性治疗，可在给予患者本发明化合物之前给予p38抑制剂。
此处所定义化合物通常以日剂量方案(对成人患者而言)给药，例如1mg-2000mg，优选30mg-1000mg(例如10-250mg)的口服剂量，或0.1mg-100mg，优选0.1mg-50mg(例如1-25mg)的式(I)的化合物或其生理学上可接受的盐(以游离碱形式计算)的静脉内、皮下或肌内剂量，化合物每天给药1-4次。化合物适当地按连续的治疗周期给药，例如一周或更长。
第二方面，本发明提供了治疗或预防个体的MAPKAP-K2介导的疾病的方法，该方法包括给予所述个体此处所定义的化合物。活性化合物优选以累积的有效量给药。个体可为需要治疗或预防的。以上讨论的任何MAPKAP-K2介导的疾病可为治疗或预防的主体。一种或多种其他活性剂可与该化合物同时、先后或序贯给予个体。其他活性剂可为抗炎剂(例如p38抑制剂)、谷氨酸盐受体拮抗剂、钙通道拮抗剂、化疗剂或抗增生剂。
第三方面，本发明提供了确定此处所定义化合物活性的分析，包括提供分析活性和分析化合物活性的系统。优选分析化合物的MAPKAP-K2抑制活性。此处所定义的化合物可在体外、体内、在计算机芯片上或在初级细胞培养物或细胞系进行分析。活体外分析包括确定激活的MAPKAP-K2激酶活性的抑制作用的分析。或者，体外分析可定量化合物结合MAPKAP-K2的能力，并可通过在结合前放射性标记化合物并随后分离抑制剂/MAPKAP-K2复合体并确定所结合的放射性标记的量来测定，或通过进行竞争实验来测定，其中新抑制剂用结合到已知的放射性配体的MAPKAP-K2孵育。可用的分析的实例为闪烁亲近测定法(SPA)，优选使用放射性标记的ATP。另一个实例为ELISA。在这些分析中可以使用任何类型或同工型的MAPKAP-K2。
第四方面，本发明提供了抑制MAPKAP-K2的活性或功能的方法，该方法包括将MAPKAP-K2暴露于本发明第一或第四方面的化合物或组合物中。该方法可在研究模型、体外、在计算机芯片上或体内(例如动物模型)中进行。合适的动物模型可为大鼠或小鼠的红藻氨酸模型、大鼠的创伤性脑损伤模型或小鼠的MPTP模型。
每个方面的所有特性在细节上作必要的修改后可应用到所有其他方面。
实施例本发明现在将通过以下实施例更为详细地加以说明，可以理解本发明的范畴不会在任何意义上限制于这些实施例中。
实施例1[合成通式(III)的吡唑并[1，5-a]嘧啶的常规方法]a)将胺R3NH2(1或1.1当量)加入到5，7-二氯吡唑并[1，5-a]嘧啶(IV)(2g)和三乙胺(2当量)的2-丙醇(20ml)溶液中，将此混合物在室温下搅拌过夜。将混合物在真空中浓缩并随后将残留物在水和二氯甲烷之间分配。有机相用水洗涤两次，合并的水相用二氯甲烷反萃取。将合并的有机层合并用盐水洗涤并用Na2SO4干燥。真空脱除溶剂得到前体(III)。(正常情况下产物不需要任何进一步的纯化，如果它们需要纯化，则它们被重结晶。用NMR、HPLC和MS进行分析。)如果上述室温下的反应未令人满意地发生，则可以采用以下b)将胺R3NH2(1.2当量)加入到5，7-二氯吡唑并[1，5-a]嘧啶(IV)(2g)的包含N，N-二异丙基乙胺(2当量)的2-丙醇(25ml)溶液中。反应物在80℃下加热过夜并用真空脱除溶剂。残余物在水和二氯甲烷之间分配，有机相用水、盐水洗涤两次并用MgSO4干燥。真空脱除溶剂得到产物。
在R3NH2为受阻胺或弱亲核的苯胺的情况下，可以采用以下方法c)在室温下将氢化钠(3mmol)加入2-甲基乙酰苯胺(2.2mmol)的甲苯(3ml)溶液中。加毕，将混合物加热直到泡腾停止为止，溶液变得均匀。加入5，7-二氯吡唑并[1，5-a]嘧啶(IV)(1mmol)并将混合物加热回流5h。(在此期间溶液变得不均匀)。冷却后，谨慎地加入乙酸(1ml)和水(1ml)并将混合物搅拌15分钟。真空脱除溶剂，残余的乙酸用甲苯(3x)共沸蒸发而脱除。残余物在水和乙酸乙酯之间分配。(用水和盐水)洗涤有机相并干燥。真空脱除溶剂，残余物用色谱法制得所需的化合物(III)。典型的未优化产率为c)50-70％。起始材料(IV)和产物(III)的Rf在色谱上无法分辨，使得难以确定完全反应。看起来似乎需要至少5h来出现显著的反应。

实施例2[合成通式(II)的吡唑并[1，5-a]嘧啶的常规方法]
将二碳酸二叔丁酯(2当量)的1，4-二氧六环(10ml)溶液加入以上形成的前体(III)(2g)的1，4-二氧六环(10ml)溶液，随后加入4-二甲基氨基吡啶(催化剂)。反应在室温下搅拌过夜，如果用TLC检测到起始材料，则反应进行更长时间。混合物在真空中浓缩，随后将残余物在水和二氯甲烷之间分配。有机相用10％的柠檬酸、水和盐水洗涤并用MgSO4干燥。真空脱除溶剂得到Boc保护的中间体(II)。(用过滤柱脱除任何残留的4-二甲基氨基吡啶来进行纯化。用NMR、HPLC和MS进行分析。)

实施例3[合成通式(I)的吡唑并[1，5-a]嘧啶的常规方法]a)将Boc保护中间体(II)(100mg)和反式-1，4-环己二胺(1.5g)充分混和的混合物在80-85℃下加热90分钟，然后冷却。随后将原料在二氯甲烷和饱和NaHCO3溶液之间分配。分离出有机相并用水洗涤。用MgSO4干燥并真空浓缩。将原料溶解于二氯甲烷(10ml)和三氟乙酸(5ml)。在室温下搅拌1h，随后真空蒸发。残余物在饱和NaHCO3和二氯甲烷之间，分离有机相，用MgSO4干燥并随后经硅胶进行柱色谱。洗脱液为二氯甲烷，随后进行梯度洗脱直到95％二氯甲烷+5％(10M NH3的甲醇溶液)。典型的纯化产量为20mg。
b)将Boc保护中间体(II)(100mg)和反式-1，4-环己二胺(1.5g)充分混和的混合物在80-85℃下加热18小时，然后冷却。随后将原料在二氯甲烷和饱和NaHCO3溶液之间分配。分离出有机相并用水洗涤。用MgSO4干燥并真空浓缩。将原料经硅胶进行柱色谱。洗脱液为二氯甲烷，随后进行梯度洗脱直到95％二氯甲烷+5％(10M NH3的甲醇溶液)。典型的纯化产量为20mg。
c)将中间体(II)(0.1mmol)溶解于甲苯(1ml)中并加入胺(1.2当量)。在氮气存在下按顺序加入三(二亚苄基丙酮)二钯(0)(2mol％)、2，2′-双(二苯膦基)-1，1′-联萘(4mol％)和叔丁醇钠(1.2当量)。反应物在80℃下加热并搅拌过夜，然后反应物通过0.45微米过滤器进行过滤。真空脱除溶剂，将残余物重悬于二氯甲烷(2ml)。加入三氟乙酸(0.8ml)，并使反应在室温下进行1小时。将混合物真空蒸发到干燥，将所得的残余物溶解于N，N-二甲基甲酰胺(1ml)，过滤并用制备HPLC纯化得到产物(I)。(用LC/MS进行分析。)d)通式(I)的化合物进一步精制i)用酰卤、磺酰卤、异氰酸酯和异硫氰酸酯酰化将三乙胺(1.1当量)加入化合物2(50mg)的二氯甲烷(10ml)溶液中，随后滴加酰卤、磺酰卤、异氰酸酯或异硫氰酸酯(1.05当量)。将混合物搅拌1-2小时随后用水洗涤，用MgSO4干燥，真空脱除溶剂随后将残余物经硅胶进行柱色谱。洗脱液为二氯甲烷，随后进行梯度洗脱直到95％二氯甲烷+5％(10M NH3的甲醇溶液)来得到化合物，例如

ii)还原氨基化将环己酮(1.1当量)加入化合物2(50mg)的四氢呋喃(5ml)溶液中，反应在60℃加热过夜。随后将氰基硼氢化钠(5当量)加入冷却的混合物中并在环境温度下搅拌2小时。将混合物真空蒸发至干燥，将所得的残余物溶解于水和乙酸乙酯中。分离有机相，用MgSO4干燥并随后经硅胶进行柱色谱。洗脱液为二氯甲烷，随后进行梯度洗脱直到95％二氯甲烷+5％(10M NH3的甲醇溶液)，得到20mg熔点为85-87℃的化合物134。
用以上方法制备的通式(I)的化合物记录于表B。表B中的每个化合物指定的数字对应于上述表A中作为具体实例列出的化合物的编号。各化合物通过采用具有电喷雾离子源的单四极杆的质谱来鉴定。M+H表示捕获质子(H)的化合物分子质量(M)的值，M-H表示失去质子(H)的化合物分子质量(M)的值。熔点(mp)未经修正。(d)表示在熔点或接近熔点时分解。不是固体的化合物为树胶。
表B







MAPKAP-激酶2分析[化合物制备]将各化合物溶解于DMSO中，浓度为3Mm，并以等分试样在-20℃下储备。将这些储备的等分试样的化合物的DMSO溶液稀释于30％的DMSO中得到1mM和3mM的初始工作储备溶液。随后将这两种储备溶液在30％DMSO中按1∶10连续稀释来制备3000、1000、300、100、30、10、3、1、0.1、0.01μM储备溶液。每50μl反应使用5μl的每种储备溶液来得到300、100、30、10、3、1、0.3、0.1、0.01、0.001μM的最终分析浓度。
激酶反应在圆底聚丙烯96孔板中进行。将MAPKAP-K2用稀释缓冲液(50mM Tris/HCl。pH7.5，0.1mM EGTA，0.1％(体积/体积)β-巯基乙醇，1mg/ml BSA)稀释到25mU/μl。在每个孔中加入5μl化合物或30％DMSO，随后再加入25μl底物合剂(cocktail)(10μM ATP，30μM肽(KKLNRTLSVA)，0.5μCi33P-γ-ATP的50mM Tris pH7.5溶液，0.1mM EGTA，10mM乙酸镁，0.1％BME)。通过加入20μl酶溶液/孔或20μl无酶稀释溶液来起始反应。将板振摇10秒并随后在室温下放置30分钟。用50μl150mM的磷酸终止反应。随后将90μl反应混合物转移到96孔P81滤板(Millipore)并在室温下培养5分钟。随后将滤板在板多头抽真空装置(Millipore)上用200μl 75mM的磷酸/孔洗涤4次并在烘箱中干燥2-3小时。随后在每个孔加入PackardMicroScint′0′(30μl)，将板混合30分钟并在Packard TopCount上进行液体闪烁计数。
％对照＝(X-B)/(Tot-B)×100％抑制＝100-％对照X＝试验化合物孔的每分钟计数(cpm)B＝无酶孔的每分钟计数Tot＝仅具有DMSO载体的孔的每分钟计数表B中的化合物抗激酶的功效见表C。(根据在典型的1-100μM进行的分析，将活性表示为+、++或+++，代表有活性、较高活性和非常高活性。)
表C






工业应用性式I的吡唑并[1，5-a]嘧啶衍生物和它们的药学上可接受的盐显示出极好的激酶抑制活性(特别是MAPKAP-K2抑制活性)。包含作为有效成分的化合物的药物因此预期可用作蛋白激酶介导的疾病(其中涉及激酶)的治疗剂或预防剂，例如炎性疾病、自身免疫性疾病、破坏性骨骼疾病、癌症和/或肿瘤生长。
权利要求
1.一种式(I)的化合物或其药学上可接受的盐或其他药学上可接受的生物水解衍生物，包括其酯、酰胺、氨基甲酸酯、碳酸酯、酰脲、溶剂化物、水合物、亲和试剂或前体药物在制备用于抑制蛋白激酶的药物中的用途 其中R1为氢R2为氢R3为C1-C8任选取代的烷基、C2-C8任选取代的烯基、C2-C8任选取代的炔基、C3-C8任选取代的环烷基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、任选取代的芳烷基、任选取代的杂芳烷基、任选取代的芳烯基、任选取代的杂芳烯基、任选取代的芳炔基或任选取代的杂芳炔基；R4为氢；R5为C1-C8任选取代的烷基、C2-C8任选取代的烯基、C2-C8任选取代的炔基、C3-C8任选取代的环烷基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、任选取代的芳烷基、任选取代的杂芳烷基、任选取代的芳烯基、任选取代的杂芳烯基、任选取代的芳炔基或任选取代的杂芳炔基、任选取代的杂环基或任选取代的杂环基烷基；R6为氢、C1-C8任选取代的烷基、C2-C8任选取代的烯基、C2-C8任选取代的炔基或C3-C8任选取代的环烷基；或R5和R6一起与连接它们的氮原子共同形成各环均为5-7元环的单环或双环杂环，并且除氮原子之外还任选含有一个或两个选自N、O和S的另外的杂原子，所述单环或双环杂环可任选被一个或多个取代基取代。
2.权利要求1的用途，其中R3为C1-C8任选取代的烷基、C2-C8任选取代的烯基、C2-C8任选取代的炔基、C3-C8任选取代的环烷基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、任选取代的芳烷基或任选取代的杂芳烷基。
3.权利要求2的用途，其中R3为C2-C8任选取代的烯基、任选取代的芳基或任选取代的芳烷基。
4.权利要求1-3中任一项的用途，其中R5为C1-C8任选取代的烷基、C2-C8任选取代的烯基、C2-C8任选取代的炔基、C3-C8任选取代的环烷基、任选取代的杂环基或任选取代的杂环基烷基。
5.权利要求4的用途，其中R5为被NHR7取代的C3-C8环烷基，其中R7为任选取代的杂环基或任选取代的杂环基烷基。
6.权利要求1-5中任一项的用途，其中R6为氢或C1-C8任选取代的烷基。
7.权利要求6的用途，其中R6为氢。
8.权利要求1-7中任一项的用途，其中所述药物用作MAPKAP-K2的抑制剂。
9.权利要求8的用途，其中所述药物用于预防或治疗MAPKAP-K2介导的疾病。
10.权利要求9的用途，其中所述MAPKAP-K2介导的疾病为包括痴呆症的神经疾病、炎性疾病、调亡相关的疾病，特别是神经元调亡、中风、脓毒症、自身免疫性疾病、破坏性骨骼疾病、增生性疾病、癌症、传染病、变态反应、局部缺血再灌注损伤、心脏病发作、血管原性疾病、器官低氧症、血管增生症、心脏肥大症、凝血酶诱导的血小板凝集。
11.权利要求10的用途，其中所述疾病为神经变性疾病。
12.权利要求11的用途，其中所述神经变性疾病为痴呆症、阿耳茨海默氏病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化、杭廷顿氏舞蹈病、老年性舞蹈病、西德纳姆舞蹈病、低血糖、头部和脊髓创伤包括创伤性头部损伤、急性和慢性疼痛、癫痫症和癫痫发作、橄榄体脑桥小脑痴呆症、神经元细胞死亡、低氧症相关的神经变性、急性低氧症、谷氨酸盐毒性包括谷氨酸盐神经毒性、脑局部缺血、与脑膜炎和/或神经官能症相关的痴呆症、脑血管性痴呆症或HIV感染患者的痴呆症。
13.权利要求10的用途，其中所述疾病由炎症导致。
14.权利要求13的用途，其中所述疾病为肠炎、支气管炎、哮喘、急性胰腺炎、慢性胰腺炎、各种类型的变态反应或阿耳茨海默氏病。
15.权利要求10的用途，其中所述疾病为自身免疫性疾病。
16.权利要求15的用途，其中所述自身免疫性疾病为类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、肾小球肾炎、硬皮病、慢性甲状腺炎、格雷夫斯病、自身免疫性胃炎、糖尿病、自身免疫性溶血贫血症、自身免疫性中性粒细胞减少症、血小板减少症、特异性皮炎、慢性活动性肝炎、重症肌无力、多发性硬化、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、银屑病或移植物抗宿主疾病。
17.一种治疗或预防MAPKAP-K2介导的疾病的方法，该方法包括给予所述个体至少一种如权利要求1-7中任一项所定义的化合物或权利要求8或9所定义的组合物。
18.权利要求17的方法，其中所述MAPKAP-K2介导的疾病为包括痴呆症的神经疾病、炎性疾病、调亡相关的疾病，特别是神经元调亡、中风、脓毒症、自身免疫性疾病、破坏性骨骼疾病、增生性疾病、癌症、传染病、变态反应、局部缺血再灌注损伤、心脏病发作、血管原性疾病、器官低氧症、血管增生症、心脏肥大症、凝血酶诱导的血小板凝集。
19.权利要求18的方法，其中所述疾病为神经变性疾病。
20.权利要求19的方法，其中所述神经变性疾病为痴呆症、阿耳茨海默氏病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化、杭廷顿氏舞蹈病、老年性舞蹈病、西德纳姆舞蹈病、低血糖、头部和脊髓创伤包括创伤性头部损伤、急性和慢性疼痛、癫痫症和癫痫发作、橄榄体脑桥小脑痴呆症、神经元细胞死亡、低氧症相关的神经变性、急性低氧症、谷氨酸盐毒性包括谷氨酸盐神经毒性、脑局部缺血、与脑膜炎和/或神经官能症相关的痴呆症、脑血管性痴呆症或HIV感染患者的痴呆症。
21.权利要求18的方法，其中所述疾病由炎症导致。
22.权利要求21的方法，其中所述疾病为肠炎、支气管炎、哮喘、急性胰腺炎、慢性胰腺炎、各种类型的变态反应或阿耳茨海默氏病。
23.权利要求18的方法，其中所述疾病为自身免疫性疾病。
24.权利要求23的方法，其中所述自身免疫性疾病为类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、肾小球肾炎、硬皮病、慢性甲状腺炎、格雷夫斯病、自身免疫性胃炎、糖尿病、自身免疫性溶血贫血症、自身免疫性中性粒细胞减少症、血小板减少症、特异性皮炎、慢性活动性肝炎、重症肌无力、多发性硬化、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、银屑病或移植物抗宿主疾病。
25.权利要求18-24中任一项的方法，其中所述一种或多种活性剂与该化合物同时、先后或序贯给予个体。
26.测定权利要求1-7中任一项所定义的化合物的活性的方法，该方法包括提供分析活性和分析权利要求1-7中任一项所定义的化合物的活性的系统。
27.权利要求26的方法，其中所述分析是化合物的蛋白激酶抑制活性分析。
28.一种抑制蛋白激酶活性或功能的方法，该方法包括将蛋白激酶暴露于权利要求1-7中任一项所定义的化合物中。
29.一种抑制MAPKAP-K2活性或功能的方法，该方法包括将MAPKAP-K2暴露于权利要求1-7中任一项所定义的化合物中。
30.权利要求29的方法，该方法在研究模型中、体外、计算机芯片上或体内进行。
全文摘要
式I代表的吡唑并[1，5－a]嘧啶衍生物及其药学上可接受的盐显示出极好的激酶抑制活性。因此，包含作为有效成分的化合物的药物有望用作蛋白激酶介导的涉及激酶的疾病的治疗剂或预防剂，所述疾病例如炎性疾病、自身免疫性疾病、破坏性骨骼疾病、癌症和/或肿瘤生长。
文档编号A61P37/02GK1784410SQ20048001236
公开日2006年6月7日 申请日期2004年3月11日 优先权日2003年3月11日
发明者片冈健一郎, 小杉知巳, 今井穰, D·R·米切尔, D·J·辛普森, N·J·丘奇, 铃木直贵, 山越优子 申请人:帝人制药株式会社