具有降低的细胞毒性的免疫原性TNFα类似物及其制备方法

专利名称：具有降低的细胞毒性的免疫原性TNFα类似物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及治疗性免疫治疗领域，特别地涉及靶向下调自身蛋白质和其它弱免疫原性抗原的主动免疫治疗领域。因此，本发明提供了肿瘤坏死因子α(TNFα)的新改进的免疫原性、去毒的变异体及制备这种变异体必需的工具。本发明进一步涉及免疫治疗的方法及这种方法中所用的组合物。
背景技术：
在过去的20年，主动免疫治疗(“接种”)用做治愈或减轻疾病的方法已经受到日益增加的关注。值得注意的是，自最近70年报道了使用抗生育疫苗的第一批试验以来，对于以某种方式与病理学(或者其它不期望的)生理学状况有关的自身蛋白质，应用主动免疫治疗破坏机体对其的耐受性是已知的。
传统上，通过“免疫原化”相关的自身蛋白，例如通过化学偶联(“缀合”)大的外源和免疫原性载体蛋白(参看US 4,161,519)或者通过在自身蛋白和外源载体蛋白之间制备融合构建体(参看WO 86/07383)，制备了抗自身抗原的疫苗。在这种构建体中，免疫原性分子的载体部分负责提供T辅助淋巴细胞的表位(“TH表位”)，该表位使得可以引起自身耐受性的破坏。
最近的研究证明尽管这种策略实际上可以破坏针对自身蛋白的耐受性，但是遇到了大量的问题。最重要的事实是随着时间的过去，抗免疫原的载体部分的抗体在诱导的免疫应答中占优势，而抗自身蛋白的反应活性常常下降，当载体以前已经做为免疫原时，这种效果特别明显，这种现象称为载体抑制(参看Kaliyaperuma l等.1995.，Eur.J.Immunol 25，3375-3380)。然而，当使用治疗接种时，通常需要每年重复免疫几次并维持这种治疗许多年，这也引起了这样的一种状况抗载体部分的免疫应答将以牺牲抗自身分子的免疫应答为代价日益地占优势。
当使用半抗原载体技术破坏自身耐受性时，所涉及的进一步问题是载体对这种构建体中的自身蛋白质部分所施加的负空间效应由于简单的表位屏蔽或掩蔽，或者由于免疫原的自身部分中诱导的构象改变，所以可接近的类似于天然自身蛋白中观察到的构象模式的B细胞表位数量常常减少。最后，充分详细地表征半抗原载体常常是非常困难的。
WO 95/05849提供了上述半抗原载体策略的改进。证明其中只置换单一一个外源TH表位的自身蛋白能够破坏对自身蛋白的耐受性。焦点放在自身蛋白三级结构的保持上，以确保在外源TH元件的引入下免疫原中仍将保留最大数量的自身B细胞表位。由于诱导的抗体是广谱的及具有高的亲和性，并且免疫应答比用常规载体构建体免疫时观察到的免疫应答具有更早的开始和更高的效价，这个策略通常证明是极其成功的。
WO 00/20027提供了上述原则的扩充。发现在自身蛋白编码序列中引入单TH表位可以诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)，该细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)与表达自身蛋白的细胞特异性反应。WO 00/20027的技术也提供了联合治疗，其中既诱导抗体也诱导CTLs，在这些实施方式中仍然需要免疫原保留相当大部分的B细胞表位。
肿瘤坏死因子(TNF，TNFα ，恶液质素，TNFSF2)是炎性和免疫功能的有效旁分泌和内分泌介质。TNFα，特别是其联合γ干扰素时，对许多细胞是细胞毒性的。1975年最初鉴定了TNFα，并且证明其起始肿瘤坏死和消退。后来已经详细地研究了此抗癌效果，然而尽管仍有利用TNFα的癌症试验，但是此治疗方法做为癌症治疗还没有成功。后来，发现TNFα是恶液质的原因，并且发现TNFα通过受体介导的过程发挥它的功能。已经鉴定了两种不同的TNFα受体(TNFR55和TNFR75)，这些受体介导TNFα的细胞毒性和炎性作用。在慢性炎性疾病象类风湿性关节炎(RA)期间，TNFα诱导和维持炎性过程，并且猜测它在变态反应和银屑病中具有至关重要的作用。用可溶受体封闭TNFα信号、受体特异性的抑制剂、TNFα产生的下调或单克隆抗-TNFα抗体是对抗TNFα上调和信号传导的生物学作用的有吸引力的治疗形式。
从用可溶TNFα受体和单克隆抗-TNFα抗体治疗获得的结果显而易见，抗-TNFα治疗在几种疾病，象RA和局限性回肠炎中是成功的。抗-TNFα治疗被认为是安全有效的。
迄今，已经批准了两种TNFα拮抗剂，Remicade(Infliximab，Centocor/Johnson&Johnson)和Enbrel(Etanercept，Immunex)进行临床应用。
Remicade是嵌合的小鼠-人类单克隆IgG1抗体，其定向抗可溶和细胞相关的TNFα。Remicade阻断TNF与其内源细胞表面TNFα受体结合。美国食品及药物管理局(FAD)在1998年10月批准了Remicade在常规治疗方法难以治疗的中度到严重或成瘘的局限性回肠炎中使用。这种适应症被延伸到包括在氨甲蝶呤单独治疗难以治疗的类风湿性关节炎中与氨甲蝶呤的附加使用和在2002年7月在局限性回肠炎中进行的维持治疗。
Enbrel是重组蛋白质，其由融合至人类IgG1 Fc部分的人类TNFα受体的细胞外部分组成。Enbrel通过做为诱饵(decoy)TNFα受体抑制TNFα活性。FDA在1998年11月批准了在类风湿性关节炎中使用Enbrel。用这些TNFα拮抗剂治疗了超过350,000名患者。连续地进行了这些药剂的临床效力和安全性信息的评估，尽管对于TNFα拮抗剂主要关注感染和其它免疫相关的不利事件，但是FDA及专利医药产品委员会(CPMP)最近进行的售后经历安全性评估陈述到尽管需要标记改变，包括严重感染方面的改变，但是抗TNFα治疗具有有利的风险-利益平衡。
目前提出的TNFα免疫治疗与已经确立的抗TNFα治疗比较具有微克量接种和更少频率注射以保持与大量灌输单克隆抗体相当的体内高抗TNFα效价的优点。积极的结果是更低风险的副作用和较低的治疗费用。也认为天然的多克隆抗体应答将比其它抗TNFα治疗是更有效的TNFα下调剂。
TNFα被翻译成233个氨基酸前体蛋白质，并且做为三聚体类型II跨膜蛋白质分泌，其由特异的金属蛋白酶切割为三聚体可溶蛋白质，其中每个相同的单体亚基由157个氨基酸组成(在SEQ ID NO10中示出了其氨基酸序列，残基2-158)。人类TNFα是非糖基化的，而鼠源TNFα具有单一的N-糖基化位点。TNFα单体分子量是17kDa，而三聚体的理论MW是52kDa，但是在SDS-PAGE中交联三聚体做为43kDa移动。TNFα含有两个半胱氨酸，该半胱氨酸通过形成分子内二硫键来稳定结构。TNFα的N-和C-末端对于活性都是重要的。尤其是C-末端是敏感的，因为缺失3个、2个，甚至1个氨基酸都急剧地降低了可溶性和生物活性。重要的氨基酸是Leu157，其在三聚体中两个单体之间形成稳定化盐桥。另一方面，头8个氨基酸缺失增加了活性1.5-5倍，而头9个氨基酸的缺失将恢复全长活性。TNFα是被很好地研究了的蛋白质，并且已经鉴定了引起三聚体形成和受体结合的许多分子内和分子间相互作用。
因此，在自然界中，人类TNFα(SEQ ID NO10，残基2-158)做为二聚体和三聚体存在，但是这两种情况下的分子都非常适合做为本发明的候选靶。
WO 95/05849和WO 98/46642都披露了适于下调TNFα(肿瘤坏死因子α)活性的疫苗技术，TNFα是参与几种疾病诸如类型I糖尿病、类风湿性关节炎和炎性肠病病理学的细胞因子。两篇公开文献都教导了当该分子遇到免疫系统时，单体TNFα三级结构的保持。而且WO03/042244(还没有公开)披露了大量一般和特异的TNFα变异体。
尽管上述技术提供了非常有希望的结果，但是当评估抗击疾病时疫苗方法的耐久性时，存在几种开始起作用的因素。这些因素之一是免疫原性蛋白质的表达水平。
例如，为了使核酸疫苗起作用，用编码“免疫原化”(immunogenized)自身蛋白质的构建体体内转染的细胞必须能表达足够量的免疫原以诱导适宜的免疫应答。而且，基于多肽的疫苗要求可以通过工业发酵方法产生满意数量的免疫原性蛋白质。然而，常常观察到即使已知蛋白质氨基酸序列中轻微的改变也可能对可以回收的蛋白质数量具有明显的影响。
而且，遗传修饰的蛋白质序列的稳定性也可能不是最佳的(在贮藏期方面和体内稳定性方面)。
而且，当在TNFα的情况下期望下调的自身蛋白质是杂聚物或同聚物时，该蛋白质单体单元的变异体将不一定能够诱导对聚合体蛋白质天然构象具有足够特异性的抗体。
最后，TNFα是有毒物质，不幸地是已经观察到最佳折叠的TNFα免疫原性变异体保留了TNFα的天然毒性，因为这些变异体能形成生物学活性的三聚体(或者折叠成模拟三聚体结构的生物学活性的单体)。
发明目的本发明的目的是提供改进的免疫原性和去毒的人类TNFα类似物及提供用于诱导抗该蛋白质的体液免疫的改进的方法。而且，本发明的目的是提供培养可溶TNFα变异体及其它蛋白质变异体的改进的方法。最后，本发明的目的也是当制备或利用此改进的免疫原时，提供可以使用的其它方法和措施。
发明概述当在细菌宿主细胞中产生大规模数量的重组蛋白质时，常常希望表达产物可以做为细菌内部包涵体而获得。原因是下面几种例如当蛋白质表达为不溶包涵体时，正常地表达产量相当高，并且因为容易和方便地从细菌发酵物中将期望的表达产物和可溶蛋白质分离，所以蛋白质的纯化也方便。
然而，当重组蛋白质表达为不溶的包涵体时，常常需要使表达产物进行各种蛋白质重折叠过程，以获得其生物学活性形式，即使这个步骤引起了从来都不会折叠成正确生物学活性形式的总重组蛋白质的一定损失，但是这通常是可接受的。
然而，当产生非免疫原性自身蛋白质诸如TNFα的重组免疫原性变异体时，需要引入TH表位，因此当与天然自身蛋白质比较时，蛋白质产物的一级结构改变。本发明人经历过即使最微小的改变也使得包涵体表达后再折叠的常规方法不可行再折叠后，与天然自身蛋白质比较保留了满意部分的B细胞表位的蛋白质的产量常常非常低，并且这个问题随着目的蛋白质的复杂度而增加。
现在已经发现设计从细菌中以可溶蛋白质形式产生的蛋白质构建体并实现其表达是制备自身蛋白质免疫原性变异体的上佳方法，尽管由于必须移除其它可溶蛋白质，随后的纯化步骤更复杂，但是获得了比上述常规方法显著地更高产量的最终纯化和正确折叠的产物。并且，非常重要地，从这种类型表达获得的纯化蛋白质显示了迄今无先例的保留其来源的天然自身蛋白质的B细胞表位的能力。
简而言之，根据本发明，当最初筛选适于接种目的的自身蛋白质免疫原性变异体时，变异体蛋白质的可溶表达是优良的筛选标准。
为了获得这种免疫原化自身蛋白质(和在一级结构中已经引入改变的其它蛋白质)的可溶蛋白质表达的目的，可以改变几个参数可以产生难于装配的多聚体蛋白，方法是在单体水平上稳定它们的结构及制备TNFα多聚体的单体模拟物，并且可以根据这里所述的教导稳定简单的单体蛋白质。
另一个重要的因素是发酵条件——本发明人实验室中的发现已经表明例如在比正常地用于获得高水平表达的温度低的温度下发酵细菌大大地有利于可溶形式的变异体蛋白质的产生。
本发明人以前发现“单体化”或稳定形式TNFα的制备可以提供具有高稳定性、优良免疫原性和期望的生产特性的免疫原性分子。本发明致力于这些概念的改进，其中在变异体中引入了多个特异性去毒突变以使它们具有更高的患者依从性，而同时保持免疫原性。
除了去毒突变，本发明的TNFα变异体还在TNFα单体结构中包括多个变异，这些变异是充分地非毁坏性的以使得TNFα单体能正确折叠，而同时引入至少一个II类MHC结合氨基酸序列——在WO 03/042244中已经详细地公开了这些变异。例如，已经发现可以在天然TNFα中一个特定的环结构中进行外源TH表位的插入，而这对蛋白质的表达特征以及对单体形成功能性TNFα二聚体或三聚体的能力没有不利的影响。
因此，本发明的一方面涉及去毒的、免疫原性的人类TNFα类似物，其中该类似物包含至少一个外源II类MHC结合氨基酸序列并且还具有下面的特征-其是本发明的人类TNFα单体或hTNFα单体化类似物，其中在柔性环3中已经插入或置换入至少一个外源II类MHC结合氨基酸序列，和/或-其是本发明的人类TNFα单体或hTNFα单体化类似物，其中引入了至少一个稳定该TNFα单体3D结构的二硫键，和/或-其是本发明的人类TNFα单体或hTNFα单体化类似物，其中缺失了氨基末端氨基酸1，2，3，4，5，6，7，8和9之任一个，和/或-其是本发明的人类TNFα单体或hTNFα单体化类似物，其中在内含子位置向环1中插入或置换入至少一个外源II类MHC结合氨基酸序列，和/或-其是本发明的人类TNFα单体或hTNFα单体化类似物，其中在人类TNFαN-端中引入至少一个外源II类MHC结合氨基酸序列做为人工茎杆区(stalk region)的一部分，和/或-其是本发明的人类TNFα单体或hTNFα单体化类似物，其中引入至少一个外源II类MHC结合氨基酸序列，以通过增加三聚体相互作用界面的疏水性而稳定单体结构，和/或-其是本发明的人类TNFα单体或hTNFα单体化类似物，其中在TNFα氨基酸序列中插入或置换入侧翼具有甘氨酸残基的至少一个外源II类MHC结合氨基酸序列，和/或
-其是本发明的人类TNFα单体或hTNFα单体化类似物，其中在D-E环中插入或置换入至少一个外源II类MHC结合氨基酸序列，和/或-其是本发明的人类TNFα单体或hTNFα单体化类似物，其中在两个相同的人类TNFα亚序列(subsequence)之间插入或置换入至少一个外源II类MHC结合氨基酸序列，和/或-其是本发明的人类TNFα单体或hTNFα单体化类似物，其中已经加强或用二硫键置换了人类TNFα中至少一个盐桥，和/或-其是本发明的人类TNFα单体或hTNFα单体化类似物，其中通过引入模拟鼠TNFα晶体结构的突变增强了溶解性和/或对蛋白酶解的稳定性，其中通过引入至少一个选自Y87S，D143N和A145R的点突变降低或消除毒性，其中氨基酸编号起始于人类TNFα中N-末端V。
一般地，已经发现本发明所有最适的免疫原性类似物均在它们产生阶段时就是可溶蛋白质，并且以可溶形式从它们的重组宿主细胞分离。
本发明进一步提供了编码这种免疫原性类似物的核酸片段(诸如DNA片段)，也提供了包含这种DNA片段的载体。
本发明也提供了用于制备类似物的转化细胞。
本发明进一步提供了包含本发明类似物或载体的免疫原性组合物。
本发明也提供了治疗方法，其中下调多聚体蛋白以治疗与该特定多聚体蛋白相关的特定疾病。


图1是流程图，表示大肠杆菌(E.coli)生产TNFα蛋白质的上游加工。所示工作流程用于评估本发明TNFα变异体重组生产中各种发酵条件的相对效力。
发明详述定义下文将详细地定义和解释本发明说明书和权利要求书中所用的大量术语以阐明本发明的界限和范围。
术语“T淋巴细胞”和“T细胞”可互换地使用，指胸腺来源的淋巴细胞，它们负责各种细胞介导的免疫应答并在体液免疫应答中负责辅助细胞活性。同样，术语“B淋巴细胞”和“B细胞”可互换地使用，指产生抗体的淋巴细胞。
“聚合体蛋白”这里定义为包含至少两条多肽链的蛋白质，这两条多肽链没有通过肽键首尾连接在一起(术语“多聚体蛋白”可以与其互换使用)。因此，聚合体蛋白可以是由几条多肽组成的聚合体，这些多肽通过二硫键和/或非共价结合的方法以聚合体形式保持在一起。该术语中也包括加工的前体蛋白质和蛋白原，加工后它们包含至少两个自由C-末端和至少两个自由N-末端。最后，该术语中也包含至少两条多肽之间临时存在的复合物，该复合物可以形成不稳定但是具有生物学活性的分子实体，该分子实体具有明显的3维结构。
“免疫原性类似物”(或“免疫原化”类似物或变异体)这里指单链多肽，其包含完整聚合体蛋白中发现的序列信息的实质性部分。即，本发明的类似物蛋白质包含一条多肽链，而聚合体蛋白包含至少2条多肽链。应该注意到类似物可以是聚合体单体亚基结构的变异，但是在这种情况下，免疫原性类似物能形成类似于天然聚合体的聚合体蛋白质复合物。
在本发明范围内，聚合体蛋白的“单体化”类似物或变异体是单链多肽，其包含天然聚合体蛋白中发现的至少2条多肽链，其中这两条多肽链在“单体化”类似物或变异体中通过肽键共价连接，而在天然聚合体蛋白质中不通过肽键连接。
多聚体蛋白的单体单位的“实质性片段”指单体多肽中至少足以形成结构域的单体多肽的一部分，其中该结构域折叠成与多聚体蛋白中可以发现的3D构象基本相同的3D构象。
“TNFα多肽”这里指具有来源于人类和其它哺乳动物的TNFα蛋白质氨基酸序列的多肽。而且，该术语的范围内也包含原核生物系统中制备的非糖基化形式TNFα，同样由于使用了例如，酵母或其它非哺乳动物真核生物表达系统而具有不同糖基化模式的形式也包括在内。然而，应该注意到使用术语“TNFα多肽”时指当将所述多肽呈递给待处理的动物时，该多肽正常是非免疫原性的。换而言之，TNFα多肽是自身蛋白或是这种自身蛋白的异种类似物(xeno-analogue)，其正常将不会在所述动物中引起对抗TNFα的免疫应答。
“TNFα类似物”是其一级结构中已经经历改变和/或与来源于别种分子的元件结合的TNFα多肽。例如，这种改变可以是TNFα多肽与适合的融合配偶体的融合形式(即，一级结构的改变专门地涉及C-和/或N-末端氨基酸残基的添加)和/或它可以是TNFα多肽氨基酸序列的插入和/或缺失和/或置换形式。该术语也包含衍生的TNFα分子，参照下述有关TNFα修饰的讨论。
可以理解TNFα类似物也包括含有完整TNFα多聚体蛋白质的实质性部分的单体变异体。
当这里使用缩写“TNFα”时，用于指成熟或野生型TNFα的氨基酸序列(这里也表示为“TNFαm”和“TNFαwt”)。成熟的人类TNFα表示为hTNFα，hTNFαm或hTNFαwt，成熟的鼠类TNFα表示为mTNFα，mTNFαm或mTNFαwt。在DNA构建体包含编码前导序列或其它物质的信息的情况下，这将正常地排除于该范围。
本发明范围中的术语“多肽”指2到10个氨基酸残基的短肽，11到100个氨基酸残基的寡肽和100个以上氨基酸残基的多肽。而且，该术语也意在包括蛋白质，即包含至少一条多肽的功能性生物分子；当包含至少两条多肽时，它们可以形成共价连接的复合物或可以不共价连接。蛋白质中多肽可以被糖基化和/或脂质化和/或包含辅基。
术语“亚序列”意指分别直接地来源于天然TNFα氨基酸序列或核酸序列的任何一段连续的具有至少3个氨基酸，或者相应地具有至少3个核苷酸的链。
本发明范围中的“去毒突变”定义为TNFα氨基酸序列中突变(例如，点突变)，该突变使所得到的分子在相关动物模型中(或在该TNFα氨基酸序列所来源的自身宿主中)具有显著减少的毒性。然而，可以理解去毒突变不应该是显著地干扰TNFα分子正确折叠的突变，因为期望保持B细胞表位。
在本发明范围中术语“动物”一般指动物物种(优选地，哺乳动物)，诸如人类(Homo sapiens)，家犬(Canis domesticus)等，而不仅指一个单一动物。然而，该术语也指这种动物物种的群体，因为根据本发明方法免疫的个体都具有允许用相同的免疫原进行免疫的基本相同的TNFα是重要的。例如，如果在不同人类群体中存在TNFα的遗传变异体，则可能必须在这些不同的群体中使用不同的免疫原以便能够破坏每个群体中对TNFα的自身耐受性。本领域技术人员将清楚本发明范围中的动物是具有免疫系统的生物。优选地动物是脊椎动物，诸如哺乳动物。
这里用术语“下调”意指(例如，通过干扰TNFα蛋白质和该分子的生物学重要结合偶配体之间的相互作用)降低活生物体中TNFα的生物学活性。可以通过几种机理获得下调在这些机理中，通过抗体结合简单地干扰多聚体蛋白中的活性位点是最简单的。然而，通过抗体结合引起清除细胞(诸如巨噬细胞和其它吞噬细胞)将多聚体蛋白移除也在本发明的范围内。
“向免疫系统呈递…”的表述意指动物的免疫系统以可控方式受到了免疫原性攻击。从下面的讨论将清楚，可以以多种方式完成免疫系统的这种攻击，其中最重要的方法是用含有多肽的“治疗性疫苗(pharmaccine)”(即，通过给药以治疗或改善正在发展的疾病的疫苗)接种，或核酸治疗性疫苗(pharmaccine)接种。获得的重要结果是动物中免疫活性细胞以免疫学有效的方式遇到抗原，而获得该结果的确切方式对于构成本发明基础的发明要点并不太重要。
术语“免疫原性有效量”具有本领域通常的含义，即能诱导免疫应答的免疫原的量，其中该免疫应答可以显著地抗击与免疫原具有共同免疫学特征的病原体。
当这里使用TNFα已经被“修饰”的表述时指构成该自身蛋白的骨架的多肽的化学修饰。例如，这种修饰可以是氨基酸序列中一些氨基酸残基的衍生化(例如，烷化，酰化，酯化作用等)，但是从下面的讨论可以清楚，优选的修饰包括氨基酸序列一级结构的改变(或添加)。
当讨论“对TNFα的自身耐受性”时，应理解，因为TNFα在待接种的群体中是自身蛋白，所以种群中正常个体不产生抗它的免疫应答；然而，这不能排除动物群体中偶尔的个体可能能够产生抗天然TNFα的抗体，例如做为自身免疫病的一部分。在任何情况下，动物物种正常地只对其自己的TNFα产生自身耐受，但是不能排除所述动物也耐受来源于其它物种或来源于具有不同表型的群体的类似物。
“外源T细胞表位”(或“外源T淋巴细胞表位”)是能结合MHC分子和在动物物种中刺激T细胞的肽，因此是可互换使用的术语。本发明中优选的外源T细胞表位是“泛主”(promiscuous)(或“通用”或“宽范围”)表位，即与动物物种或群体中特定类别MHC分子的实质性部分结合的表位。仅仅非常有限数量的这种泛主T细胞表位是已知的，并且下面将详细地讨论它们。应该注意为了使本发明所用的免疫原尽可能在动物群体的尽可能大部分个体中有效，可能必需1)在同一类似物中插入几个外源T细胞表位或2)制备几种类似物，其中每种类似物插有不同的泛主表位。也应该注意外源T细胞表位的概念也包含隐蔽性T细胞表位的使用，所述隐蔽性T细胞表位是来源于自身蛋白并且只在以分离形式，而不是所述自身蛋白的一部分存在时才显示免疫原性行为的表位。
“外源T辅助淋巴细胞表位”(外源的TH表位)是结合II类MHC分子和可以与II类MHC分子结合而被呈递至抗原呈递细胞(APC)表面上的外源T细胞表位。
“与多聚体蛋白异源的II类MHC结合氨基酸序列”因此是TNFα中不存在的II类MHC结合肽。如果这种肽对含有多聚体蛋白的动物物种也是真正外源的，那么这种肽就是外源TH表位。
本发明范围中(生物)分子的“功能性部分”意指负责分子所发挥的至少一种生物化学或生理学作用的分子部分。本领域公知许多酶和其它效应分子具有活性位点，该活性位点负责所述分子所发挥的作用。分子的其它部分可以起到稳定或者增加溶解度的目的，因此如果在本发明一些实施方式中不涉及这些目的，则可以将其省去。然而，根据本发明，优选使用该多聚体分子的尽可能多的部分，因为使用这里所述的单体时，实际上已经证明了增加的稳定性。
术语“佐剂”具有疫苗技术领域通常的含义，即，1)本身不能引起抗疫苗中的免疫原的特异性免疫应答，但是2)能增加抗免疫原的免疫应答的物质或组合物。或者，换而言之，单独用佐剂接种不提供抗免疫原的免疫应答，用免疫原接种可以或不可以产生抗免疫原的免疫应答，但是用免疫原和佐剂联合接种则比单独用免疫原接种可以诱导更强的抗免疫原的免疫应答。
本发明范围中分子“靶向”意指一旦分子被引入到动物中后，分子偏好地出现在某些组织中或者偏好地与某些细胞或细胞类型相关。可以用多种方式实现该效果，所述方式包括将分子配制在有利于靶向的组合物中或者在分子中引入有利于靶向的基团。下面将详细地讨论这些方面。
“刺激免疫系统”意指物质或组合物显示了一般的，非特异性免疫刺激效果。大量的佐剂和推定的佐剂(诸如一些细胞因子)都具有刺激免疫系统的能力。使用免疫刺激剂的结果是免疫系统增加的“警觉性”，这意味着用免疫原进行同时或随后的免疫将比单独使用免疫原诱导显著更有效的免疫应答。
本发明去毒的免疫原性TNFα类似物的特征如果本发明的免疫原性类似物在实质性片段中显示了在天然生物学活性TNFα中发现的实质性部分的B细胞表位，这是有利的。实质性部分的B细胞表位在这里意指在抗原性表面相对于其它蛋白质表征TNFα的一部分B细胞表位。优选地，实质性片段显示在构成多聚体蛋白的一部分时相应TNFα单体中发现的基本上所有B细胞表位，当然在单体TNFα序列中引入微小改变可能是必需的。例如，如上所述，可以通过氨基酸插入、置换、缺失或添加的方法修饰来源于单体单位的氨基酸序列，以便与天然蛋白质比较减少TNFα类似物的毒性和/或引入II类MHC结合氨基酸序列，如果将该序列放置在接头中是不期望的或是不恰当的。
特别优选的实施方式提供了本发明免疫原性TNFα类似物，其中每个实质性部分都基本上包含每个单体TNFα单位的完整氨基酸序列作为一个连续序列或者作为包含插入的序列。也就是类似物中只省去单体TNFα单位序列的无关紧要的部分，例如在这种序列没有有助于单体单位的三级结构或TNFα的四级结构的情况下。然而，只要维持多聚体TNFα蛋白的3D结构，这种实施方式就允许单体的置换或插入。因此，特别有利的是免疫原性TNFα类似物中显示了TNFα的所有单体单位的氨基酸序列，并且如果类似物以未被打断的序列形式或者以包含插入物的序列形式包括构成TNFα的(所有)单体的完整氨基酸序列，则是尤其有利的。
因此明显地优选在类似物中基本上保持完整天然生物学活性TNFα的3维结构。
可以用几种方法证明进行这里所述修饰的TNFα保持了实质性部分的B细胞表位或者甚至是3维结构。一种方法是简单地制备抗天然TNFα的多克隆抗血清(例如，在兔中制备的抗血清)，此后(例如，在竞争性ELISA中)使用该抗血清做为检测产生的此修饰蛋白质的检测试剂。与天然分子相比和抗血清反应的程度相同的修饰形式(类似物)被认为与天然分子具有相同的3D结构，而显示了与这种抗血清的有限(但仍旧是显著和特异性的)反应性的类似物被认为维持了实质性部分的原始B细胞表位。
做为可替代的方案，可以制备与天然TNFα上不同表位反应的单克隆抗体选集，并且用作测试板。这种方法有下面的优点允许1)TNFα的表位作图和2)在制备的类似物中维持的表位的作图。
当然，第三种方法是比较天然TNFα的解析3D结构和所制备的类似物的解析三维结构。可以借助于X射线衍射和NMR-光谱学解析三维结构。关于三级结构的进一步信息可以在一定程度上从圆二色性研究获得，该圆二色性研究具有只需要纯化形式多肽以提供关于给定分子的三级结构的有用信息的优点(而X射线衍射需要提供结晶多肽，NMR需要提供多肽的同位素变异体)。然而，最终必需X射线衍射和/或NMR获得结论性数据，因为圆二色性研究只能通过二级结构元件的信息提供正确3维结构的间接证据。
本发明的免疫原性TNFα类似物可以包含肽接头，该肽接头包含或有助于类似物中存在与多聚体蛋白异源的至少一个II类MHC结合氨基序列。在不希望改变对应于TNFα中单体单位的氨基酸序列的情况下，这特别有用。做为可替代的方案，肽接头可以没有和不参与TNFα蛋白质所来源的动物物种中II类MHC结合氨基酸序列的存在；在需要使用非常短的接头的情况下，或者如本发明中需要通过例如在活性位点中引入II类MHC结合元件来去毒可能有毒的类似物的情况下，可以方便地实施该方案。
优选该II类MHC结合氨基酸序列结合多聚体蛋白所来源的动物物种的大部分II类MHC分子，即，该II类MHC结合氨基酸序列是通用的或泛主结合的。
在打算将免疫原用做疫苗组分的物种中该序列充当T细胞表位当然是重要的。存在大量天然的“泛主”T细胞表位，这些T细胞表位在动物物种或动物群体的大部分个体中具有活性，并且优选地将它们引入到疫苗中，由此减少在同一疫苗中对非常大量的不同类似物的需要。因此，所述至少一种II类MHC结合氨基酸序列优选地选自天然的T细胞表位和人工的MHC-II结合肽序列。特别优选的序列是选自如下的天然T细胞表位破伤风类毒素表位诸如P2(SEQ ID NO2)或P30(SEQ ID NO4)，白喉类毒素表位，流感病毒血凝素表位和恶性疟原虫(P.falciparum)CS表位。
过去的许多年已经鉴定了大量其它的泛主T细胞表位。特别地，已经鉴定了能结合大部分由不同HLA-DR等位基因编码的HLA-DR分子的肽，并且这些均是可能引入到本发明所用类似物中的T细胞表位。也参见下面文献中所述的表位，这里将所有这些文献并入为参考文献WO 98/23635(Frazer IH等，转让给The University of Queensland)；Southwood S等，1998，J.Immunol.1603363-3373；Sinigaglia F等，1988，Nature 336778-780；Chicz RM等，1993，J.Exp.Med17827-47；Hammer J等，1993，Cell 74197-203；和Falk K等，1994，Immunogenetics 39230-242。后面的参考文献也涉及HLA-DQ和-DP配体。这5篇参考文献中所列出的所有表位适于作为本发明中所用的候选天然表位，与这些表位具有共同基序的表位也同样适宜。
做为可替代的方案，表位可以是能结合大部分II类MHC分子的任何人工T细胞表位。在该范围中，WO 95/07707和相应的Alexander J等，1994，Immunity 1751-761论文中(这里将这两篇公开文献并入为参考文献)描述的泛DR表位肽(“PADRE”)是本发明待要使用的表位的有趣候选者。应该注意到这些论文中公开的最有效的PADRE肽在C-和N-末端中带有D-氨基酸以改进给药时的稳定性。然而，本发明的主要目的在于掺入相关表位做为类似物的部分，然后在APCs的溶酶体区室内部将其酶促分解以便允许随后在MHC-II分子背景中呈递，因此在本发明所用的表位中掺入D-氨基酸不是有利的。
一种特别优选的PADRE肽是具有氨基酸序列AKFVAAWTLKAAA(SEQID NO6和8)或其免疫学有效亚序列的肽。这个表位和同样缺少MHC限制的其它表位是优选的T细胞表位，它们应该存在于本发明方法中所用的类似物中。这种超泛主的表位将允许本发明最简单的实施方式，其中只有单一一种修饰的TNFα被呈递给接种的动物免疫系统。
本发明优选的实施方式包括通过引入至少一种外源的免疫优势TH表位进行修饰。TH表位的免疫优势取决于所述的动物物种，这是可以理解的。这里所用的术语“免疫优势”简单地指表位在接种个体中引起了显著的免疫应答，但是公知的事实是在一个个体中是免疫优势的TH表位不一定在相同物种的另一个个体中也是免疫优势的，即使它可能能够结合后一个体中的MHC-II分子。
如上所述，通过引入至少一个氨基酸插入、添加、缺失或置换可以完成外源T细胞表位的引入。当然，正常的情况是在氨基酸序列中引入一个以上的改变(例如，完整T细胞表位的插入或置换)，但是所要达到的重要目的是当抗原呈递细胞(APC)加工类似物时，该类似物将产生在II类MHC分子背景中被呈递在APC表面上的这种T细胞表位。因此，如果单体单位适当位置中的氨基酸序列包含也可以在外源TH表位中发现的多个氨基酸残基，那么通过氨基酸插入、添加、缺失和置换方法提供外源表位的剩余氨基酸可以完成外源TH表位的引入。换而言之，不必通过插入或置换引入完整的TH表位。
根据本发明，类似物也可以形成更大分子的一部分，其中它偶联至少一个功能性部分，该功能性部分的存在不以显著程度负面地干扰类似物的抗体可及性。这种部分(其可以融合类似物)的性质可以是将修饰的分子靶向抗原呈递细胞(APC)或者B淋巴细胞，以刺激免疫系统，和优化类似物向免疫系统的呈递。
靶向部分方便地选自B淋巴细胞特异性表面抗原或APC特异性表面抗原的基本特异性结合配偶体，诸如B淋巴细胞或APC上存在受体的半抗原或碳水化合物。免疫刺激部分可以选自细胞因子、激素和热激蛋白质。优化呈递的部分可以选自脂质基团，诸如棕榈酰基、肉豆蔻基、法尼基、牻牛儿-牻牛儿基、GPI锚、N-酰基甘油二酯基团。
适合的细胞因子是干扰素γ(IFN-g)、Flt3L、白细胞介素1(IL-1)、白细胞介素2(IL-2)、白细胞介素4(IL-4)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素12(IL-12)、白细胞介素13(IL-13)、白细胞介素15(IL-15)和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)或是它们中任何一种的有效部分。
优选的热激蛋白质是HSP70、HSP90、HSC70、GRP94和钙网蛋白(CRT)，或是它们中任何一种的有效部分。
优选地，氨基酸插入、缺失、置换或添加的数量是至少2个，诸如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21和25个插入、置换、添加或缺失。进一步优选氨基酸插入、置换、添加或缺失的数量不超过150个，诸如最多100个、最多90个、最多80和最多70个。特别优选置换、插入、缺失或添加的数量不超过60个，特别地该数量不应该超过50个或者甚至40个。最优选的是不超过30个的数量。关于氨基酸添加，应该注意当所获得的构建体是融合多肽形式时，这些氨基酸添加常常相当大地高于150个。
本发明优选的实施方式包括通过引入至少一个外源免疫优势的TH表位(＝“外源II类MHC结合氨基酸序列”)进行修饰。可以理解TH表位的免疫优势问题取决于所述的动物物种。这里所用的术语“免疫优势”简单地指表位在接种个体中引起显著的免疫应答，但是公知的事实是在一个个体中是免疫优势的TH表位不一定在相同物种的另一个个体中也是免疫优势的，即使它可能能够结合后一个体中的MHC-II分子。
另一个重要的点是TH表位的MHC限制问题。一般地，天然出现的TH表位是MHC限制的，即，构成TH表位的一些肽将只有效地结合II类MHC分子的亚群。这接着具有下面的效果在大多数情况下一种特异性TH表位的使用将产生只在一部分群体中有效的疫苗成分，并且取决于该部分群体的大小，在相同分子中包含更多的TH表位可能是必要的，或者可替代的方案是制备多成分的疫苗，其中这些成分是可以通过引入的TH表位的性质互相区分的变异体。
如果所用T细胞的MHC限制是完全未知的(例如，在接种的动物的MHC组分欠明确的情况下)，可以用下面公式确定动物群体中被特定疫苗组合物所覆盖的部分 -其中pi是群体中对疫苗组合物中存在的第i种外源T细胞表位产生应答的应答者的频率，n是疫苗组合物中外源T细胞表位的总数。因此，在群体中分别具有0.8，0.7和0.6应答频率的含有3种外源T细胞表位的疫苗组合物将产生1-0.2×0.3×0.4＝0.976即，群体中的97.6％将在统计学上对该疫苗产生MHC-II介导的应答。
在所用肽的或多或少精确的MHC限制模式已知的情况下，上面的公式不适用。例如，如果某种肽只结合HLA-DR等位基因DR1，DR3，DR5和DR7所编码的人类MHC-II分子，那么这种肽与结合HLA-DR等位基因所编码的剩余的MHC-II分子的另一种肽一起使用将完成对所述群体的100％覆盖。同样，如果第二种肽只结合DR3和DR5，这种肽的添加将根本不增加覆盖率。如果单纯地基于疫苗中T细胞表位的MHC限制来计算群体应答，则可以通过下面公式确定特定疫苗组合物所覆盖的群体百分数 其中j是群体中编码如下MHC分子的等位基因单元型的频率总和，其中所述MHC分子结合疫苗中任何一种T细胞表位，并且属于3种已知HLA基因座中(DP、DR和DQ)的第j种；实际上，首先确定疫苗中每一种T细胞表位将由何种MHC分子识别，此后根据类型(DP、DR和DQ)列出这些MHC分子，然后，针对每种类型将列出的各不同等位基因单元型的频率加和起来，由此得出1、2和3。
可以出现公式I中pi值超过相应的理论值ηiηi=1-Πj=13(1-Vj)2---(III)]]>-其中vj是群体中编码如下MHC分子的等位基因单元型的频率总和，该MHC分子结合疫苗中第i种T细胞表位，并且属于3种已知HLA基因座(DP、DR和DQ)的中的第j种。这意味着在1-ηi群体中，存在f残余-i＝(pi-ηi)/(1-ηi)的应答者频率。因此，可以调整公式II以产生公式IV
-其中术语1-f残余-i如果是负值则设定为0。应该注意公式V要求所有的表位都已经对照相同组的单元型进行了单元型作图。
因此，当筛选待引入本发明类似物中的T细胞表位时，包括可获得的表位的所有知识是重要的1)群体中应答每个表位的应答者的频率，2)MHC限制数据，和3)相关单元型在群体中的频率。
应该注意本发明优选的类似物包含导致如下多肽的修饰，该多肽包含一段序列，该序列与TNFα相应的单体单位或者其至少10个氨基酸长度的亚序列具有至少70％序列同一性。优选更高的序列同一性，例如至少75％或甚至至少80％或85％。蛋白质和核酸的序列同一性可以计算为(Nref-Ndif)·100/Nref，其中Ndif是两条序列对齐时序列中不相同残基的总和，其中Nref是序列之一的残基的总和。因此，DNA序列AGTCAGTC与序列AATCAATC将具有75％的序列同一性(Ndif＝2和Nref＝8)。
最后，为了结论性地证实本发明的TNFα类似物做为免疫原确实有效，可以进行各种检测以提供必需的证实。在此，可以参考WO00/65058中有用的IL5类似物的鉴定讨论，这篇公开的文献可以用于证实(IL5来源或不是IL5来源的)本发明技术的类似物的有用性。
优选的TNFα类似物选自1)通过肽接头首尾连接的2个或3个完整的TNFα单体，其中至少一个肽接头包含至少一个II类MHC结合氨基酸序列，和2)通过惰性肽接头首尾连接的2个或3个完整的TNFα单体，其中至少一个单体包含至少一个外源II类MHC结合氨基酸序列，或其中至少一个外源II类MHC结合氨基酸序列，可选地通过惰性接头，融合到N-或C-末端单体上。
特别有趣的是具有高度稳定性的免疫原性TNFα分子，因为发明人早先已发现单体TNFα构建体倾向于相对不稳定，参看下面的讨论。
先前已经产生了通过表位和/或惰性肽接头连接在一起的3个TNFα亚基的编码基因。目的是产生其构象尽可能地接近天然TNFα三聚体的变异TNFα分子。设计该变异体以有效地激发抗wtTNFα的中和抗体。发现最适合的TNFα变异体是在可能破坏蛋白质构象的去污剂或其它种类添加剂不存在的情况下可溶和稳定的蛋白质。
下面的讨论关注TNF的优选的修饰，该修饰本身不涉及去毒。
通过表达利用接头和TH表位连接在一起做为一条单一多肽链的3个单体，意欲制备比以前的变异TNFα免疫原更稳定的TNFα变异体。通过在稳定化氢键、盐桥或二硫键外引入必需的TH表位，这允许保留TNFα结构。
从TNFα的X射线晶体结构观察到N末端最初的5个残基柔性太大以至于不允许结构确定。而C-末端接近单体界面的中部，并且柔性较低。Arg-6和Leu-157的Cα原子之间距离是10，这是3-4个氨基酸残基的距离。因此，看起来可能直接将单体亚基连接在一起，但是因为C-末端位于一个微妙位点，使用柔性接头，例如甘氨酸接头进行这种连接是有利的。
现在为止，利用“单体化三聚体”方法已经设计了5个变异体。对照TNF_T0(0号TNFα三聚体，在WO 03/042244中SEQ ID NO22)，由通过2个单独甘氨酸接头(GlyGlyGly)直接连接在一起的3个单体。设计TNF_T0以使它如同野生型三聚体蛋白质一样稳定。当然，可以使用蛋白质化学领域中已知的其它惰性柔性接头而不是使用上述甘氨酸接头，重要的特征是柔性接头不不利地干扰单体化蛋白质折叠成与生理学活性wtTNFα的3D结构相似的3D结构的能力。
在大肠杆菌(E.coli)中TNF_T0构建体表达为可溶蛋白质，并且它已经用于制备示例性构建体TNF_T4(参看WO 03/042244)，TNF-T4是其中引入PADRE II类MHC结合肽(SEQ ID NO6)的变异体。在该构建体中，单体单位和外源表位之间的比率是每3个单体一个表位，而现有技术中依赖于免疫原化单体蛋白质的变异体为每个单体一个表位(WO 03/042244中SEQ ID NO55也如此)。这个事实对三聚体稳定性提供了可能的积极影响。这种方法的后代是TNF_C2变异体(参看WO 03/042244)，其是在与TNF_T4中相同的位置中具有PADRE表位的TNFα单体。
平行地，在每个接头区中含有一个表位的TNF_T1和TNF_T2变异体(参见WO 03/042244)和含有一个C-末端表位和在第二接头区中含有一个表位的TNF_T3(参见WO 03/042244)已经使用了破伤风类毒素P2和P30表位(分别是SEQ ID NOs2和4)。蛋白质多半从N-末端向C-末端折叠。构成TNF_T3的想法是当最初两个N-末端结构域折叠时，它们将作为被表位所围绕的第三结构域(单体)的内部侣伴蛋白起作用。
除了上述详细描述的多聚体蛋白“单体化”技术外，WO 03/042244中还公开了TNFα(和可能地许多其它的多聚体蛋白)允许如下单体的产生，该单体1)包含至少一个稳定化突变，和/或2)包含至少一个非TNFα来源的II类MHC结合氨基酸序列，其中这些TNFα单体变异体能正确地折叠成三级结构，随后该三级结构允许具有正确四级结构的二聚体和三聚体TNFα蛋白的形成(如通过它们具有受体结合活性所证明的)。因此，在这些构建体中，可以制备单体TNFα的变异体，这些变异体不一定需要做为单体化三聚体产生，因为单体序列中引入的改变仅有限地破坏单体三级结构，以致于仍可以形成二或三聚体。根据构成本发明的观点，已经进一步发现所有这些变异体都可以从细菌细胞以可溶蛋白质形式表达。
因此，已经证明可以根据下面的策略制备免疫原性TNFα变异体，这些策略可以联合，并且它们可以进一步联合已经讨论过的本发明“单体化方法”(因为所有这些特定修饰本质上都是非破坏性的)。
柔性环策略本发明人已经发现PADRE表位(SEQ ID NO6)插入到环3中位置Gly108-Ala109是有希望制备具有非常象天然TNFα分子的结构的TNFα变异体的方法。从TNFα晶体结构已经推导出直接插入到该位置的TH表位将没有紧靠发生相互作用的任何邻近氨基酸残基。用TNF34进行研究(参见WO 03/042244)——根据该方法制备的第一个PADRE构建体——已经证明当在37℃生长细菌宿主细胞时，在大肠杆菌(E.coli)约5％表达的蛋白质TNF34中是可溶的，并且95％ TNF34表达为包涵体，但是改变发酵过程使发酵温度为25℃后，来源于该发酵的可溶蛋白质的产率接近100％。因此，生长条件的优化可以增加可溶蛋白质的产率。
已经制备了大量的其它构建体(TNF35-TNF39，参见WO03/042244)，其中所有这些构建体只依赖于柔性环3中PADRE的引入。本发明进一步考虑可以在环3的其它部分中或刚好在环3外部进行外源表位的引入。特别地，插入被认为是有意义的，并且在人类TNFα中氨基酸95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117和118的任何一个之后，可以有利地进行外源表位诸如PADRE或P2或P30的插入。然而，TNFα相同区域中的置换也被认为是有利的，如涉及相同范围氨基酸的置换(即，人类TNFα中氨基酸95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117和118中的单一一个或几个连续氨基酸的置换)。
稳定性增强突变柔性环3中TH表位的引入可以潜在地使TNFα变异体的结构去稳定。然而，通过将形成二硫键的半胱氨酸引入而稳定结构可以抵消这种潜在的去稳定作用。至今已经在变异体TNF34-A和TNF34-B中在两个不同位置引入了胱氨酸对(参见，WO 03/042244)。而且，可以平行地删除已知减少受体相互作用强度的柔性N-末端(最初的8个氨基酸)，因此得到变异体TNF34-C(参见，WO 03/042244)。二硫键被引入单体中以与天然出现的二硫键(Cys-67 Cys-101)一起稳定表位插入位点。认为该策略也同样地稳定TNFα单体和单体化的二或三聚体。
其它构建体在将是可溶表达产物的变异体设计中使用了几种不同的策略。TNFX1.1-2(参见，WO 03/042244)是基于TNFα第一环中PADRE的插入，其中插入位点位于内含子位置上。在TNFX2.1(参见，WO 03/042244)中，产生了人工“茎杆”区，其含有PADRE插入。
TNFα的突变已经表明指向三聚体界面中的大的疏水性氨基酸置换稳定了三聚体结构。TNFX3.1和TNFX3.2(参见，WO 03/042244)是稳定现存TNF34变异体的建议。TNFX4.1(参见，WO 03/042244)利用二甘氨酸接头以减少PADRE肽对整体TNF34结构的结构限制。TNFX5.1(参见，WO 03/042244)利用在TNF家族成员BlyS中发现的环结构做为插入点。TNFX6.1-2，TNF7.1-2和TNF8.1(参见，WO 03/042244)是进一步的变异体。TNFX9.1和TNFX9.2(参见，WO 03/042244)是TNF34变异体，其在表位前后利用了4-6个氨基酸的相同重叠TNFα序列。最后，两种变异体(WO 03/042244中SEQ ID NOs46和47)是PADRE肽位于与TNF34中相同的位置的P2/P30双变异体。
而且，从TNFα的晶体结构可以观察到在TNFα单体中残基Lys-98和Glu-116之间存在一个稳定化盐桥。盐桥的定义是Asp或Glu中侧链氧与Arg，Lys或His中正电荷原子侧链氮之间静电相互作用，原子间距离小于7.0埃。通过用Arg或His在该位置对Lys-98进行位点定向置换突变并用Asp置换Glu116，可以提高该盐桥稳定性和由此提高三聚体分子稳定性。也可以用上述方式以二硫键交换这些盐桥。
已经观察到在溶解性和蛋白酶解方面，鼠类TNFα比人类的TNFα显著地更稳定。TNFα变异体的改进包括进行位点定向突变以模拟鼠类TNFα晶体结构，以获得在蛋白酶解方面更稳定的TNFα产物。
从人类和鼠类TNFα的X射线结构可以看到三聚体中心(三个TNFα单体的中间)由于疏水力保持在一起，而三聚体顶部和底部由于天然存在的盐桥连接在一起。因此，通过筛选具有更强连接的这些盐桥，将也可以改进TNFα三聚体的稳定性。
总之，至今已经制备了下面特定的TNFα变异体


所使用的编号是从SEQ ID NO10的N-末端V开始的(即，从SEQ IDNO10中第2位氨基酸开始的)。在一些序列中在N-末端缬氨酸之前是用于翻译起始的甲硫氨酸。
根据本发明去毒所有上述WO 03/042244中公开的TNFα变异体。
本领域已知可以去毒TNFα或至少大幅度地减少毒性的多种点突变。如果必要，这些点突变将被引入到本发明的变异体中。特别优选的突变是对应于成熟TNFα的Ser对Tyr-87，Asn对Asp-143和Arg对Ala-145的置换。而且Loetscher，H.，Stueber，D.，Banner，D.，Mackay，F.和Lesslauer，W.1993 JBC 268(35)26350-7中提到的所有有效的突变也是本发明去毒实施方式中有意义的实施方式。这些点突变可以与WO 03/042244中公开任何一种特定构建体一起使用。
因此，本发明最优选的蛋白质构建体是由SEQ ID NOs12，13，14，16，17和18中任何一个序列及来源于其的只包含保守性氨基酸改变的任何氨基酸序列表示的构建体。
无论如何，重要实施方式是上述所有这些TNFα变异体从细菌细胞诸如大肠杆菌(E.coli)中表达为可溶蛋白质。
当目的是从大肠杆菌(E.coli)表达时，优选的载体是pET28b+，p2Zop2F (WO 03/042244中SEQ ID NO60)是用于昆虫细胞表达的载体，pHP1(或其商售“孪生”pCI)是用于在哺乳动物细胞中表达的载体。
本发明提供的一般疗法本发明提供了可以以非常有利的方式下调TNFα的方法。
一般地，提供了下调自体宿主中TNFα的方法，该方法包括向动物免疫系统呈递免疫原性有效量的至少一种本发明免疫原性TNFα类似物。优选地，自体宿主是哺乳动物，最优选地是人类。
可以用大量方法实施该方法，其中蛋白质疫苗给药是一种选择，但是核酸接种策略或活疫苗接种策略也具有很大意义。
蛋白质/多肽接种和制剂当通过向动物给药类似物的方法实现向动物免疫系统呈递类似物时，多肽制剂遵循本领域公认的原理。
如美国专利4,608,251；4,601,903；4,599,231；4,599,230；4,596,792；和4,578,770所示例的，本领域一般熟知含有肽序列做为活性组分的疫苗的制备，这里将所有这些专利文献并入为参考文献。典型地，这些疫苗被制备为液体溶液或悬浮液的注射剂；也可以制备适于注射前溶解在或悬浮在液体中的固体形式。制剂也可以被乳化。活性免疫原性组分常常与赋形剂混合，所述赋形剂是药物学可接受的，并且可与活性组分相容。例如，适合的赋形剂是水、盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等及它们的组合。此外，如果希望，疫苗可以含有微量的辅助物质诸如湿润剂或乳化剂，pH缓冲剂或增强疫苗有效性的佐剂；参见下面佐剂的详细讨论。
常规地，非胃肠道地通过注射，例如皮下、皮内或肌内施用疫苗。适于其它给药方式的其它制剂包括栓剂和在一些情况下的口服、口腔、舌下、腹膜内、阴道内、肛门、硬膜外、脊柱和颅内制剂。对于栓剂，常规的粘合剂和载体可以包括例如聚烷二醇(polya1kalene glycol)或甘油三酯；可以从含有0.5％到10％，优选地1-2％活性组分的混合物形成这种栓剂。口服制剂包含正常使用的赋形剂，例如药物学等级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。这些组合物采用溶液、悬浮液、片剂、丸剂、胶囊、持续释放制剂或粉末形式，并且含有10-95％活性组分，优选地25-70％活性组分。对于口服制剂，霍乱毒素是有意义的制剂配偶体(也是可能的缀合偶配体)。
多肽可以制成中性或盐形式的疫苗。药物学可接受的盐包括与无机酸诸如，盐酸或磷酸或者与有机酸如醋酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等形成的酸加成盐(与肽的自由氨基形成)。与自由羧基形成的盐也可以来源于无机碱诸如，氢氧化钠、钾、铵、钙或铁，和有机碱诸如异丙胺、三甲基胺，2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因(procaine)等。
以与剂量制剂相匹配的方式及治疗有效和免疫原性的量给药疫苗。要施用的量取决于待治疗个体，包括，例如个体免疫系统引发免疫应答的能力和期望的保护程度。适合的剂量范围是每次接种约几百微克活性组分，优选的范围从约0.1μg到2,000μg(尽管可以考虑1-10mg范围的更高量)，诸如从约0.5μg到1,000μg的范围，优选地从1μg到500μg的范围，特别是约10μg到100μg的范围。用于最初给药和加强接种的适宜方案也可以变化，但是典型的是在最初给药后接着是随后的接种或其它给药。
施用的方式可以变化很大。任何常规施用疫苗的方法都可以应用。这些方法包括在固体生理学可接受基质上或者在生理学可接受的分散体中口服施用，非胃肠道地通过注射等方式施用。疫苗的剂量将取决于给药的途径，并且将随着待要接种的个体的年龄和抗原制剂而变化。
一些疫苗类似物在疫苗中具有足够免疫原性，但是，对于一些其它疫苗类似物，如果疫苗进一步包含佐剂物质，免疫应答将得到加强。
已知在疫苗中获得佐剂效果的各种方法。在″The Theory andPractical Application of Adjuvants″，1995，Dun-can E.S.Stewart-Tull(编辑)，John Wiley & Sons Ltd，ISBN 0-471-95170-6中和在″VaccinesNew Generation Immunological Adjuvants″，1995，Gregoriadis G等.(编辑)，Plenum Press，New York，ISBN0-306-45283-9中详述了一般的原理和方法，这里将这两篇文献并入为参考文献。
尤其优选使用可以被证明有利于打破对自身抗原的自身耐受性的佐剂。适合的佐剂的非限制性例子选自免疫靶向佐剂；免疫调节佐剂诸如毒素、细胞因子和分枝杆菌衍生物；油制剂；聚合物；微团形成佐剂；皂苷；免疫刺激性复合物基质(ISCOM基质)；颗粒；DDA；铝佐剂；DNA佐剂；γ-菊粉(r-inulin)；和包囊化佐剂(eneapsulatingcdjnvant)。通常应该注意，涉及可用作类似物中第一、第二和第三部分的化合物和试剂的上述公开加以必要的变更也指它们在本发明疫苗的佐剂中的应用。
佐剂的施用包括使用试剂诸如氢氧化铝或磷酸铝(明矾)(通常使用缓冲盐水中0.05到0.1％的溶液)，与0.25％溶液形式的糖合成聚合物(例如，Carbopol)混合，通过70℃到101℃之间的温度热处理30秒到2分钟进行疫苗中蛋白质的聚集，用交联剂的方法也可以进行聚集。也可以利用胃蛋白酶处理的抗白蛋白抗体(Fab片段)进行再激活而聚集，与细菌细胞诸如短小棒状杆菌(C.parvum)或者革兰氏阴性细菌的内毒素或脂多糖成分混合，在生理学可接受的油载体诸如二缩甘露醇单油酸酯(Aracel A)中乳化或用20％全氟化碳溶液(Fluosol-DA)作为嵌段替代物(block substitute)进行乳化。还优选与油如鲨烯和IFA混合。
根据本发明，DDA(溴化二甲基双十八烷基铵)及DNA和γ-菊粉是感兴趣的佐剂候选物，此外，弗氏完全和不完全佐剂及quillaja皂苷诸如QuilA和QS21以及RIBI也是有意义的。另外的可能性是单磷酰脂A(MPL)，上述C3和C3d和胞壁酰二肽(MDP)。
也已知脂质体制剂可以赋予佐剂效果，因此根据本发明优选脂质体佐剂。
并且，根据本发明免疫刺激复合物基质类(ISCOM基质)佐剂也是优选的选择，尤其是因为已经证明这种类型佐剂能上调APC的II类MHC表达。ISCOM基质由(可选地分级分离的)来源于皂皮树(Quillaja saponaria)的皂苷(三萜系化合物)、胆固醇和磷脂组成。当与免疫原性蛋白质混合时，所得到的颗粒性制剂就称为ISCOM颗粒，其中皂苷占60-70％w/w，胆固醇和磷脂占10-15％w/w，和蛋白质占10-15％w/w。例如，不仅在涉及佐剂的上述教科书中可以发现关于免疫刺激复合物的组成和应用的详细情况，而且Morein B等，1995，Clin.Immunother.3461-475以及Barr IG和Mitehell GF，1996，Immunol.and Cell Biol.748-25(这里将这两篇文献并入为参考文献)也提供了有关完整免疫刺激复合物制备的有用说明。
获得佐剂效果的另一种高度有意义(因此优选的)的可能方案是使用Gosselin等，1992中所述的技术(这里将这篇文献并入为参考文献)。简而言之，通过缀合抗原和抗单核细胞/巨噬细胞上Fcγ受体的抗体(或抗原结合抗体片段)可以增强相关抗原诸如本发明抗原的呈递。尤其已经证明对于接种目的，抗原和抗FcγRI之间的缀合可以增强免疫原性。
其它的可能性涉及权利要求中提到的靶向和免疫调节物质(尤其是细胞因子)用做蛋白质构建体的部分。在这点上，细胞因子的合成诱导物象聚IC也是可能的。
合适的分枝杆菌衍生物选自胞壁酰二肽、完全弗氏佐剂、RIBI和海藻糖二酯诸如TDM和TDE。
合适的免疫靶向佐剂选自CD40配体和CD40抗体或者其特异性结合片段(参见上述)，甘露糖、Fab片段和CTLA-4。
合适的聚合物佐剂选自碳水化合物诸如葡聚糖、PEG、淀粉、甘露聚糖和甘露糖；塑性聚合物；胶乳诸如胶乳珠。
调节免疫应答的另一种感兴趣的方法是在“虚拟淋巴结”(VLN)(ImmunoTherapy，Inc.，360 Lexington Avenue，New York，NY10017-6501开发的一种专利医疗装置)中包含免疫原(可选地以及佐剂和药物学可接受的载体和赋形剂)。VLN(细管状装置)模拟了淋巴结的结构和功能。VLN插入到皮肤下面产生了无菌发炎位点，同时细胞因子和趋化因子高涨。T和B细胞及APC快速应答此危险信号，返回发炎位点并且在VLN多孔基质内部积累。已经证明当使用VLN时，引起对抗原的免疫应答所需的必需抗原剂量减少，并且利用VLN接种赋予的免疫保护超过了使用Ribi做为佐剂的常规免疫。在Gelber C等，1998，“利用命名为虚拟淋巴结的新医疗装置激发对小量免疫原的强细胞和体液免疫应答”，在″From the Laboratory to the Clinic，书摘，1998年10月12日到15日，Seascape Resort，Aptos，California″中简要描述了该技术。
预期一年应该至少施用一次疫苗，诸如一年至少1，2，3，4，5，6和12次。更具体地，预期每年1-12次，诸如每年向需要的个体给药1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11或12次。以前已经表明使用本发明优选的自身疫苗诱导的记忆免疫不持久，因此需要用类似物定期地攻击免疫系统。
由于遗传变异，不同的个体可能以不同的免疫应答强度与相同多肽发生反应。因此，本发明的疫苗可以包含几种不同的多肽以增强免疫应答，也参见关于外源T-细胞表位引入选择的上述讨论。疫苗可以包含两种或多种多肽，其中所有多肽都是如上述所定义的。
因此，疫苗可以包含3-20种不同的类似物，诸如3-10种类似物。然而，正常地，将试图保持类似物的数量达到最小值诸如1或2种类似物。
核酸接种做为经典肽疫苗给药的一个非常重要的替代方案，核酸接种技术(也称为“核酸免疫”，“遗传免疫”和“基因免疫”)提供了大量具有吸引力的特征。
首先，与传统疫苗接种方法相反，核酸接种不需要消耗大规模产生免疫原性剂的资源(例如，产生蛋白质的微生物的工业规模发酵)。而且，不需要纯化装置和免疫原重新折叠的方案。最后，因为核酸接种依赖于接种个体的生物化学机器以产生所引入核酸的表达产物，所以预期可以出现最适宜的表达产物翻译后加工；在自身接种的情况下，这特别重要，因为如上所述，聚合物的相当大部分的原始B细胞表位应该被保留在修饰的分子中，并且因为原理上B细胞表位可以由任何(生物)分子(例如，碳水化合物、脂质、蛋白质等)的部分组成。因此，免疫原的天然糖基化和脂质化模式对于总的免疫原性可能具有非常重要的作用，并且预期这可以通过使宿主产生免疫原的方式来确保实现。
应该注意，用目前公开的一些类似物观察到的增加的表达水平对DNA接种效力非常重要，因为体内表达水平是DNA疫苗的免疫原性效力的决定性因子之一。
因此，本发明优选的实施方式包括通过向动物细胞中引入编码类似物的核酸，由此使得细胞体内表达引入的核酸，以实现本发明类似物向免疫系统的呈递。
在这个实施方式中，引入的核酸优选地是DNA，该DNA可以是裸DNA，用带电荷或不带电荷的脂质配制的DNA，配制在脂质体中的DNA，包含在病毒载体中的DNA，用有利于转染的蛋白质或多肽配制的DNA，用靶向蛋白质或多肽配制的DNA，用钙沉淀剂配制的DNA，偶联惰性载体分子的DNA，封装在聚合物囊，例如PLGA(参见WO 98/31398中描述的微囊化技术)或壳多糖或脱乙酰壳多糖中的DNA和用佐剂配制的DNA。在此，注意实际上涉及在常规疫苗制剂中应用佐剂的所有考虑因素都适用于DNA疫苗制剂。因此，本文中涉及在多肽疫苗中使用佐剂的所有文献都可以加以必要的修改后将它们应用在核酸接种技术中。
对于上面详述的多肽疫苗的给药途径和给药方案，它们也可以应用于本发明的核酸疫苗，并且上述涉及多肽的给药途径和给药方案的所有讨论都可以加以必要的修改以应用于核酸。应该补充的是核酸疫苗可能适于静脉内和动脉内给药。而且，本领域公知可以通过使用所谓的基因枪施用核酸疫苗，因此这个方式和等同的给药方式也被认为是本发明的一部分。最后，已经报道了核酸给药中应用VLN可以产生好的效果，因此特别地优选这种特别的给药方式。
而且，用做免疫剂的核酸可以含有编码权利要求中指出的部分的区域，例如所述部分是上述的免疫调节物质形式，诸如讨论用做有用佐剂的细胞因子。这种实施方式的优选形式包括在不同读框中或至少在不同启动子控制下具有类似物的编码区和免疫调节剂的编码区。由此避免了类似物或表位做为免疫调节剂的融合配偶体产生。做为可替代的方案，可以使用两个分开的核苷酸片段，但是不太优选这种方式，因为当同一分子中具有两个编码区时，具有确保共表达的优点。
因此，本发明也涉及诱导产生抗TNFα抗体的组合物，该组合物包含-本发明的核酸片段或载体(参见下面核酸和载体的讨论)，和-如上所述药物学和免疫学可接受的赋形剂和/或载体和/或佐剂。
在正常情况下，以载体形式引入核酸，其中核酸的表达受病毒启动子控制。对于本发明的载体和DNA片段的更详细的讨论参见下文。而且，可以获得涉及核酸疫苗的制剂和应用的详细公开文献，参见Donnelly JJ等，1997，Annu.Rev.Immunol.15617-648和DonnellyJJ等，1997，Life Sciences 60163-172。这里将这两篇文献并入为参考文献。
活疫苗用于实现本发明类似物向免疫系统呈递的第三个可替代的方案是活疫苗技术的应用。在活疫苗接种中，通过向动物给药非致病性微生物实现向免疫系统的呈递，其中已经用编码本发明类似物的核酸片段或用掺入这种核酸片段的载体转化了所述的非致病性微生物。非致病性微生物可以是任何适合的减毒细菌株(通过传代的方法或者通过用重组DNA技术移除致病性表达产物的方法减毒)，例如牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)BCG、非致病性链球菌属种(Streptococcusspp.)、大肠杆菌(E.coli)、沙门氏菌属种(Salmonella spp.)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、志贺氏菌属种(Shigella)等。可以在例如Saliou P，1995，Rev.Prat.451492-1496和Walker PD，1992，Vaccine 10977-990中发现关于本领域现有技术活疫苗制备的综述，这里将这两篇文献并入为参考文献。关于这种活疫苗中使用的核酸片段和载体的细节参见下文讨论。
做为细菌活疫苗的可替代方案，可以将下文讨论的本发明核酸片段掺入到非强毒性病毒疫苗载体诸如痘菌病毒株或任何其它适合的痘病毒中。
正常地，只向动物给药一次非致病性微生物或病毒，但是在一些情况下，在一生中可能必需给药微生物一次以上以维持保护性免疫。甚至可以考虑当使用活疫苗或病毒疫苗时，上述用于多肽接种的免疫方案将是有用的。
做为可替代的方案，活疫苗或病毒疫苗接种与先前或随后的多肽和/或核酸接种联合。例如，可以用活疫苗或病毒疫苗实现初次免疫，接着利用多肽或核酸方法进行加强免疫。
可以用核酸转化微生物或病毒，所述核酸含有编码上述部分，例如上述的免疫调节物质，诸如讨论用做有用佐剂的细胞因子的区域。这种实施方式的优选形式包括在不同读框或至少在不同启动子控制下具有类似物的编码区和免疫调节剂的编码区。由此避免了类似物或表位做为免疫调节剂的融合配偶体产生。做为可替代的方案，两个分开的核苷酸片段可以用做转化试剂。当然，在相同读框中具有这些佐剂部分可以以表达产物形式提供本发明类似物，并且这种实施方式是本发明尤其优选的。
联合治疗实施本发明的一种尤其优选的方式包括使用核酸接种做为第一次(初次)免疫，随后用上述多肽疫苗或活疫苗进行第二次(加强)免疫。
本发明方法在疾病治疗中的用途涉及的疾病/病症是类风湿性关节炎、青少年慢性关节炎、脊椎关节病、多肌炎、皮肌炎、脉管炎、银屑病(斑块状)、银屑病关节炎、Mb.Crohn、慢性阻塞性肺疾病、骨髓增生异常综合征、类风湿性关节炎中的葡萄膜炎、急性肺功能障碍、(急性和慢性)哮喘、韦格纳肉芽肿病、应激性肠疾病、颞下颌疾病(下颌关节疼痛)、Stomatitisosteoporosis和癌恶病质及其它炎性疾病和与TNFα副作用有关的本领域中通常明了的其它病症。因此，通过利用本发明方法下调多聚体蛋白的活性可以治疗或改善与这些疾病中任何一种疾病相关的症状。
本发明的组合物本发明也涉及用于实施本发明方法的组合物。因此，本发明也涉及免疫原性组合物，其包含免疫原性有效量的上述类似物，所述组合物进一步包含药物学和免疫学可接受的稀释剂和/或运载体和/或载体和/或赋形剂和可选地佐剂。换而言之，本发明的这部分涉及基本上如上所述的类似物制剂。佐剂、载体和运载体的选择与以上提到用于肽接种的类似物制剂时已经讨论的相应一致。
通常根据本领域公知的方法制备类似物。正常地，用重组基因技术制备更长的多肽，该方法包括向适合的载体中引入编码类似物的核酸序列，用载体转化适合的宿主细胞，表达核酸序列(通过在适合的条件下培养宿主细胞)、从宿主细胞或它们的培养物上清液回收表达产物和随后的纯化及可选的进一步修饰，例如重新折叠或衍生化。不仅可以在标题为“本发明的核酸片段和载体”的下文中而且可以在实施例中发现涉及必需工具的细节。在这部分中也描述了类似物重组制备的优选的方法，即，低温发酵大肠杆菌(E.coli)以获得可溶的TNFα变异体。
最近肽合成技术的进展已经使得能够通过这些方法产生全长的多肽和蛋白质，因此，用公知的固相或液相肽合成技术制备长的构建体也在本发明的范围内。
本发明的核酸片段和载体从上述讨论可以理解不仅可以用重组基因技术，而且可以用化学合成或半合成方法制备修饰的多肽；当修饰是或者包括与蛋白质载体(诸如KLH、白喉类毒素、破伤风类毒素和BSA)和非蛋白质分子诸如碳水化合物聚合物偶联时，以及当然当修饰包括向聚合物来源的肽链添加侧链或侧基团时，后两项技术是尤其适当的。从上述可以理解，这些实施方式不是优选的实施方式。
对于重组基因技术目的，当然也对于核酸免疫目的，编码类似物的核酸片段是重要的化学产物(它们的互补序列也是)。因此，本发明的一个重要部分涉及编码这里所述类似物，即，如上所详述的聚合物来源的人工聚合物多肽的核酸片段。本发明的核酸片段是DNA或RNA片段。
本发明最优选的DNA片段包含如下核酸序列，该核酸序列选自编码SEQ ID NOs12、13、14、16、17和18中任何一个序列的核酸序列或与这些序列中任何一个序列互补的核酸序列。
正常地，本发明的核酸片段将插入到适合的载体中以形成带有本发明核酸片段的克隆或表达载体；这种新的载体也是本发明的部分。在下面有关转化细胞和微生物的部分中将讨论本发明这些载体构建的细节。根据应用的目的和类型，载体可以是质粒、噬菌体、粘粒、微型染色体或病毒，并且只在某些细胞中瞬时表达的裸DNA也是重要的载体(并且可以在DNA接种中使用)。本发明优选的克隆和表达载体能够自主复制，由此使得能够获得用于高水平表达或便于随后克隆的高水平复制目的的高拷贝数。
本发明载体的一般轮廓按5′→3′方向包括下面可操作连接的特征驱动本发明核酸片段表达的启动子，可选地编码前导肽的核酸序列(该前导肽使多肽片段能够向细胞外相或在可应用的情况下向周质分泌或者整合到膜中)，本发明的核酸片段和可选地编码终止子的核酸序列。当在生产株系或细胞系中操作表达载体时，为了转化细胞遗传稳定的目的，优选地，引入到宿主细胞中的载体整合到宿主细胞基因组中。相反，当操作用于在动物体中实现体内表达的载体时(即，当在DNA接种中使用载体时)为了安全原因，优选地载体不能整合在宿主细胞基因组中；通常地，使用裸DNA或非整合的病毒载体，本领域普通技术人员公知这种选择。
本发明的载体用于转化宿主细胞以产生本发明修饰的TNFα多肽。这种转化细胞也是本发明的一部分，它们可以是用于本发明核酸片段和载体扩增或用于本发明修饰的TNFα多肽重组产生的培养细胞或细胞系。做为可替代的方案，转化细胞可以是适合的活疫苗株，其中已经被插入(单一一个或多个拷贝)核酸片段以实现修饰的TNFα的分泌或整合到细菌细胞膜或细胞壁中。
本发明优选的转化细胞是微生物诸如细菌(如，埃希氏杆菌属(Escherichia)(例如大肠杆菌(E.coli))，芽孢杆菌属(bacillus)(例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis))，沙门氏菌属(Salmonella)或分枝杆菌属(Mycobacterium)(优选非致病性的，例如牛分枝杆菌(M.bovis)BCG))，酵母(诸如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)))和原生动物。做为可替代的方案，转化细胞来源于多细胞生物体诸如真菌、昆虫细胞、植物细胞或哺乳动物细胞。最优选的是来源于人类的细胞，参见下文细胞系和载体的讨论。最近的结果已经表明使用商购果绳(Drosophila melanogaster)细胞系(来自于Invitrogen的Schneider 2(S2)细胞系和载体系统)进行本发明TNFα类似物的重组产生有很大希望，因此特别优选这个表达系统，因此一般地此类系统也是本发明优选的实施方式。
对于克隆和/或最佳化表达的目的，优选地转化细胞能复制本发明的核酸片段。表达核酸片段的细胞是本发明优选使用的实施方式；它们可以用于小规模或大规模地制备类似物，或者在非致病性细菌的情况下，用做活疫苗中的疫苗组分。
当通过转化细胞的方法产生本发明的类似物时，尽管完全不是必要的，但是表达产物被向外运输到培养基中或由转化细胞表面携带是方便的，因为这两种可选方案都有利于随后表达产物的纯化。
当鉴定了有效的生产者细胞时，优选地在其基础上建立稳定的细胞系，该稳定细胞系带有本发明载体并表达编码修饰的TNFα的核酸片段。优选地，该稳定的细胞系分泌或带有本发明TNFα类似物，因此有利于其纯化。
一般地，与宿主结合使用含有复制子和控制序列的质粒载体，其中该复制子和控制序列来源于与宿主细胞相容的物种。载体通常带有复制位点及标记序列，该标记序列能在转化细胞中提供表型筛选标记。例如，通常利用来源于大肠杆菌(E.coli)物种的质粒pBR322转化大肠杆菌(E.coli)(参见，例如Bolivar等，1977)。pBR322质粒含有氨苄青霉素和四环素抗性基因，因此提供了鉴定转化细胞的容易方法。pBR质粒或其它微生物质粒或噬菌体必需也含有，或者被修饰而含有可以被原核微生物用于表达的启动子。
在原核生物重组DNA构建体中最常使用的启动子包括B-内酰胺酶(青霉素酶)和乳糖启动子系统(Chang等，1978；Itakura等，1977；Goeddel等，1979)和色氨酸(trp)启动子系统(Goeddel等，1979；EP-A-0 036 776)。尽管这些是最常用的启动子，但是已经发现和使用了其它微生物的启动子，并且已经公开了关于它们的核苷酸序列的细节，这使得普通技术人员能够将它们与质粒载体功能性地连接在一起(Siebwenlist等，1980)。来源于原核生物的一些基因可以从它们自己的启动子序列有效地在大肠杆菌(E.col)中被表达，而不需要通过人工方法添加另外的启动子。
根据本发明，优选地原核生物细胞中TNFα类似物的制备引起可溶蛋白质的提供，参见实施例9，并且尤其优选地用于生产的宿主细胞是大肠杆菌(E.col)细胞。
本发明人现在已经证明可以相对容易和方便地在降低的温度下在大肠杆菌(E.col)中制备可溶TNFα变异体。大肠杆菌(E.col)发酵的常规方法正常地利用约37℃的温度，但是本发明人发现通过在32℃以下温度发酵可以获得增加产量的可溶TNFα变异体，尽管重组蛋白质总产量比在约37℃时发酵的总产量低，但是最适宜变异体的产量显著更高，并且不需要不溶的变性蛋白质的重折叠。
简而言之，本发明典型的发酵方法包括下面步骤用转化的细菌接种发酵罐，随后发酵以获得足够数量的生物量，接着诱导重组表达，最后收获重组蛋白质。使用诱导型系统不是必须的，但是这更方便。
因此，本发明的一个重要方面涉及细菌中，尤其是大肠杆菌(E.col)中本发明TNFα变异的重组产生，其中至少在诱导重组TNFα类似物产生后的阶段(即，使用诱导型系统的情况下)实行小于32℃的温度。然而，实施例9证明了当在这种低温下进行所有发酵(诱导前后)时得到最高产量的可溶性重组TNFα类似物。
优选地，在发酵的两个阶段(诱导前和后)中任一阶段中该降低的温度是30℃以下，诸如29，28，27，26，25，24，23，22，21或20℃。优选地，温度范围在20和30℃之间，更优选地范围在22和28℃之间，最优选地温度是约25℃。如实施例9所示，当在该温度发酵时，已经获得了接近100％的可溶TNFα类似物的产率。
应该注意本发明人认为用于本发明可溶TNFα变异体生产的低温条件可以一般性地应用于可溶性免疫原性蛋白质变异体的重组生产，尽管用这种发酵方法获得的总蛋白质产量比例如通过37℃发酵获得的总蛋白质产量低，但是当使用互低温条件时，具有有用的3D结构的蛋白质的最终产率显著更高，并且重要地，可以避免随后再折叠过程消耗的时间和资源。或者，简而言之，具有期望构象的变异体蛋白质的产率更高。
因此，本发明也表明使用上述低温发酵条件的策略是产生有用免疫原性蛋白质变异体的一般可应用的方法。
除了原核生物，还可以使用真核微生物诸如酵母培养物，并且这里启动子应该能驱动表达。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiase)或普通的面包酵母是最常用的真核微生物，尽管通常可以得到大量其它的株系。为了在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiase)中表达，例如通常使用质粒YRp7(Stinchcomb等，1979；Kingsman等，1979；Tschemper等，1980)。该质粒已经含有trpI基因，该基因提供了筛选突变酵母株系，例如ATCC No.44076或PEP4-1(Jones，1977)的筛选标记，其中所述突变酵母株系缺少在色氨酸中生长的能力。此trpI损伤的存在，作为酵母宿主细胞基因组的一个特征，为通过在没有色氨酸的情况下生长来检测转化提供了一个有效环境。
酵母载体中适合的启动子序列包括3-磷酸甘油酸激酶(Hitzman等，1980)或其它糖酵解酶(Hess等，1968；Holland等，1978)，诸如烯醇酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、果糖磷酸激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、丙糖磷酸异构酶、葡糖磷酸异构酶和葡糖激酶的启动子。在构建适合的表达质粒时，与这些基因相关的终止序列也被连接到表达载体中位于期望被表达的序列的3’，以提供mRNA的聚腺苷酸化和终止。
具有通过生长条件控制转录的另外优点的其它启动子是醇脱氢酶2、异细胞色素C、酸性磷酸酶、与氮代谢相关的降解酶和前述甘油醛-3-磷酸脱氢酶及负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子区。含有酵母相容的启动子、复制起点和终止序列的任何质粒都是合适的。
除了微生物，来源于多细胞生物体的细胞的培养物也可以用做宿主。原则上，任何这种细胞培养物都是可用的，而无论这种细胞培养物来源于脊椎动物或非脊椎动物培养物。然而，脊椎动物细胞最有意义，并且最近几年脊椎动物培养(组织培养)增殖已经成了常规方法(Tissue Culture，1973)。这种有用宿主细胞系的例子是VERO和Hela细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系和W138、BHK、COS-7 293、草地夜蛾(SF)细胞(可做为完整表达系统从Protein Sciences，1000Research Parkway，Meriden，CT 06450，U.S.A.和从Invitrogen商购获得)、和MDCK细胞系。在本发明中，特别优选的细胞系是可从Invitrogen，PO Box 2312，9704 CH Groningen，The Netherlands商购得到的昆虫细胞系S2。
这种细胞的表达载体通常包含(如果必要)复制起点、位于待表达基因前面的启动子及任何必需的核糖体结合位点、RNA剪接位点、聚腺苷酸化位点和转录终止子序列。
为了在哺乳动物细胞中使用，常常由病毒材料提供表达载体上的控制功能。例如，常用的启动子来源于多瘤病毒、腺病毒2，并且最常见的是来源于猴病毒40(SV40)或巨细胞病毒(CMV)。SV40病毒的早晚期启动子特别有用，因为这两种启动子都容易做为片段从病毒获得，其也含有SV40病毒复制起点(Fiers等，1978)。只要SV40片段包含从HindIII位点延伸到位于病毒复制起点的BglI位点的约250bp序列，就可以使用较小或较大的SV40片段。而且，可以并且常常希望使用与期望的基因序列正常连接的启动子或控制序列，只要这种控制序列与宿主细胞系统相容。
通过载体构建以包含外源复制起点，诸如可以来源于SV40或其它病毒(例如，多瘤病毒、腺病毒、VSV、BPV)的复制起点，可以提供复制起点，或者通过宿主细胞染色体复制机理可以提供复制起点。如果载体整合到宿主细胞染色体中，后者常常是满足需要的。
实施例1TNFα变异体的制备编码野生型人类TNFα单体多肽(SEQ ID NO10)的合成DNA序列“SMTNFWT3”(SEQ ID NO9)由Entelechon GmbH作为连接产物而提供。根据密码子使用数据库，通过排除大肠杆菌(E.coli)中10％以下频率的所有密码子，人类hTNFα的DNA序列被优化用于在大肠杆菌(E.coli)中表达。而且，设计该序列以包含用于随后克隆步骤的5，NcoI限制位点。
SMTNFWT3连接产物被引入到pCR 4 TOPO平端载体中，并且转化大肠杆菌(E.coli)DH10B细胞。纯化来源于10个所得到的SMTNFWT3TOPO克隆的质粒DNA，并且选择(当通过限制酶(RE)消化分析时)含有期望片段的5个克隆。
来源于5个可能正确的SMTNFWT3TOPO克隆的NcoI/EcoRI DNA片段被分离和转移给pET28b(+)载体，并且测序。4个克隆中鉴定到插入、缺少或置换，而一个克隆看起来是正确的。随后使用该正确的构建体SMTNFWT3pET28做为模板以产生所有单个的TNFα变异体。
实施例2TNF34的构建参见下文，PanDR表位氨基酸序列(SEQ ID NOs6和8)被人工地“逆翻译”为优化用于在大肠杆菌(E.coli)中表达的DNA序列(SEQID NO7)并且通过SOE PCR被插入到环3中。
所得到的构建体(编码WO 03/042244中SEQ ID NO19的DNA序列)被放置在pET28b+载体中以产生TNF34-pET28b+。
实施例3单体化三聚体的构建单体化三聚体构建体基于3个TNFα编码区，这3个TNFα编码区被三甘氨酸接头和/或表位编码区隔开。
做为3个单独的实体合成TNFα基因。通过SOE PCR装配这3个片段，并且装配的基因(WO 03/042244中SEQ ID NO21)被克隆到pCR2.1-TOPO中。经序列验证后，分离正确的克隆。然后，将hTNFT_0基因(WO 03/042244中的SEQ ID NO21，编码TNFα-GlyGlyGly-TNFα-GlyGlyGly-TNFα，WO 03/042244中的SEQ IDNO22，即通过2个三甘氨酸接头隔开的3拷贝SEQ ID NO17)转移给pET28b+以产生hTNFT_0-pET28b+。分离正确的克隆，验证该序列，并且转化到大肠杆菌(E.coli)株系BL21-STAR，BL21-GOLD和HMS174中。
用hTNFT_0-pET28b+做模板以通过SOE PCR产生下面4个单体化三聚体变异体hTNFT_1，hTNFT_2，hTNFT_3和hTNFT_4(WO 03/042244中SEQ ID NOs49，51，57和59)。用相似的方法可以制备另一种变异体(WO 03/042244中SEQ ID NO53)。
hTNFT_1，hTNFT_2和hTNFT_3是包含破伤风类毒素表位P2和P30(分别是SEQ ID NOs2和4)的变异体，需要2轮SOE PCR装配它们。hTNFT_4是具有PADRE(SEQ ID NO6)插入的变异体，并且可以通过单轮SOE PCR装配它。用相似的方法可以制备另一种变异体(WO03/042244中SEQ ID NO55)。
用上述方法构建hTNFT_4，并且在TOP 10细胞中发现了hTNFT_4-pET28b+的正确克隆，及将该构建体转移给BL21-STAR和HMS174细胞。
为了产生hTNFT_1，hTNFT_2和hTNFT_3，用SOE PCR将表位插入到非常小的三聚体片段中，通过RE切割和连接将该三聚体片段插入到hTNFT_0-pET28b+中。
实施例4稳定TNF34突变体为了进一步稳定上述TNF34-pET28b+变异体，构建含有引入的额外二硫键的变异体及缺失突变体。构建3种不同的突变体TNF34-A-pET28b+含有置换Q67C和A111C，TNF34-B-pET28b+含有A96C和I118C，TNF34-C-pET28b+含有8个最N-端的氨基酸的缺失，表达产物的氨基酸序列如WO 03/042244中SEQ ID NOs20，30和31中所述。
利用SOE PCR制备所有3种构建体，并且克隆到BL21-STAR，BL21-GOLD和HMS174中，随后进行序列验证。
实施例5柔性环变异体为了发现与TNF34-pET28b+变异体比较可能显示改进特征的变异体，制备其中在TNFα分子柔性环3中来回移动PADRE插入物(SEQ IDNO6)的构建体。
所有这些TNF35-pET28b+、TNF36-pET28b+、TNF37-pET28b+、TNF38-pET28b+、TNF39-pET28b+，和具有放置在分子C-末端的PADRE的变异体；TNFC2-pET28b+，都用SOE PCR技术制备并且克隆到BL21-STAR，BL21-GOLD和HMS174中，接着进行序列验证。表达产物的氨基酸序列如WO 03/042244中SEQ ID NOs23，24，24，26，27和28中所示。
为了也评估利用昆虫细胞做为表达系统的可能性，TNFWT、TNF34、TNF35、TNF36、TNF37、TNF38、TNF39和TNFC2被转移到p2Zop2f载体中(参见PCT/DKI02/00764中图1)，并且在S2昆虫细胞中表达。
实施例6其它构建体已经制备了大量其它TNFα变异体，所有这些变异体命名为TNFX，参见上文。通过SOE PCR制备了编码这些变异体的DNA序列，并且直接克隆到pET28b+中。
正确的TNFX克隆已经被转化到BL21-STAR和HMS174中，并且随后验证序列。
实施例7外周质表达LTB前导序列已经被直接添加到TNF34-pET28b+中WO 03/042244的SEQ ID NO16上游以将表达导向外周质间隙。
实施例8哺乳动物表达为了检测哺乳动物中的表达，WO 03/042244的SEQ ID NO16和编码TNF34的DNA已经被转移给pHP1载体，该载体是商购pCI载体(Promega Corporation)的变异体。pHP1包含卡那霉素抗性基因代替pCI的AmpR基因做为标记。
实施例9大肠杆菌(E.coli)中可溶性蛋白质的优化生产序言因为当从大肠杆菌(E.coli)细胞表达时，TNFα和其变异体的最初表达只产生非常有限数量的可溶蛋白质，所以任务是显著地改进TNFα变异体的表达水平和溶解性以确保快速和方便的蛋白质表达系统。
方法最初的实验是在摇瓶中进行的，当使用发酵罐工作时，利用所获得的经验。同时运转3个发酵罐，在发酵期间取出样品进行细胞生长、TNFα产生和降解水平的分析。
目的该研究的目的是确定免疫原性TNFα变异体在确定成分生长培养基中在HMS174大肠杆菌(e.coli)细胞中表达时表达的最适宜生长条件。
材料和方法原始材料用于采用确定成分基本培养基发酵的起始材料


培养基和缓冲液组成主培养基的制备

项目1-8按照书写顺序溶解在约50％终体积的去离子水中，充分混合直到完全溶解它们。然后将体积调整到终体积(减去高压灭菌后添加的体积)，并且转移到发酵罐中，通过高压灭菌进行消毒杀菌。
项目9-11被混合并且无菌地转移到冷却的发酵罐中(37℃)。将pH调整到7。
预培养基的制备

期望体积的贮存液项目1-9被转移到1L测定烧瓶中。添加RO水达到955ml。测定pH，如果必要将pH调整到7.0。搅拌溶液，并且将它转移到4个1000ml烧瓶中，每个烧瓶238ml。高压灭菌后，不能高压灭菌的成分项目10-12被无菌地添加到烧瓶中。
微量盐溶液的制备

在约20％终体积中混合成分。添加酸化(pH＝1)RO水达到1000ml。搅拌溶液直到所有的盐都溶解。将溶液转移到1L蓝盖瓶中，对它进行高压灭菌。
硫酸亚铁溶液的制备

氯化铁(Ferro chloride)溶液的制备

设备

Infors Labfors发酵罐系统由6个2L发酵罐和主控制单元组成，每个发酵罐都有0.5-1.6L的工作体积，主控制单元连接安装有数据获得和处理软件(Iris NT 4.1 for Windows)的计算机。
方法在以约200rpm/min振荡的培养箱中，在含有丰富培养基w/60μ/ml卡那霉素的250ml摇瓶中做最初的实验以评估表达的可溶蛋白质的百分数。
用Western印迹和考马斯亮蓝染色SDS PAGE评估HMS174和BL21Star株系中TNFα蛋白质表达。通过裂解细胞，在离心步骤(20,000xg，10分钟)前后从上清液移除样品评估总的和可溶的TNFα表达。通过“目测”Western印迹估测可溶TNFα的百分数。
检测了不同的温度组合大多数情况下，诱导后在37℃产生生物质，并且检测了25℃(37/25)或37℃(25/37)的表达温度。
TNF37(A145R)(SEQ ID NO13)被选作表达的模式变异体，然后利用37/25℃的组合，在含有确定成分培养基的摇瓶中检测它。
建立研究细胞库通过用来自含有60μg/ml卡那霉素的酵母培养基(YEM)中250mlON培养物的25ml培养物接种预先在37℃温热的含有225YEM的1L带挡板的摇瓶，在37℃以200rpm生长3.5小时，在含有60μg/ml卡那霉素的酵母培养基(YEM)中建立TNF37(A145R)的研究细胞库(Research Cell Bank，RCB)。通过混合60ml指数生长的细胞培养物和140ml 86％甘油，并且以1ml等份等分制备相同的甘油冷冻贮存液。在-80℃贮藏这些等份试样，并且在发酵前，单个的等份试样用于预培养。
为了测定RCB的质量，用每个RCB等份试样接种含有250ml预培养基w/60μg/ml卡那霉素的3个预培养烧瓶，测定OD600。
接种后直到11小时培养物都有相同的表现，其中它们达到了约3.2的OD600。决定在所有下面的实验中，用在上述条件下已经生长11小时的50ml预培养物接种1L发酵罐。
优化发酵罐条件为了确定最适宜的发酵条件，从Inforss发酵罐中生长培养物取出样品，并且用分光光度计分析OD600，利用定量TNF特异性ELISA测定TNF表达水平，用Western印迹测定TNF降解。
在不同的温度组合，25℃/25℃，25℃/25℃/16℃，37℃/25℃和37℃/37℃测试发酵。
检测大量样品的OD600和TNF表达，并且用Western印迹进一步分析几种代表性样品的TNF表达以测定降解。
图解说明一般工艺参数

具体工艺参数

IPTG浓度是1mM，而且除了37℃/37℃和25℃/25℃方法外，将诱导时的温度从37℃降低至25℃。总的发酵时间是37℃/37℃方法为14和18小时之间，并且25℃/25℃和37℃/25℃方法不超过61小时，包括增值、诱导和蛋白质产生。总的发酵时间取决于培养物的生长。如从接种培养物中OD所计算的，发酵罐中OD600开始是0.1-0.3之间(预培养物中2-6)。在OD600＝20±1-2或接种后9到11小时进行37℃/25℃方法的诱导。蛋白质产生进行了20-24小时。在OD600＝10±1-2或接种后22-24小时进行25℃/25℃方法的诱导。蛋白质产生进行了24-36小时。
TNFα变异体表达通过取出2×1ml样品并且贮藏在-20℃检测TNF表达水平。然后在冰上融解样品，并且超声处理3×30秒，其中两次之间至少有30秒是放在冰上以防止样品加热。以20,000×g离心样品10分钟，利用TNFα定量ELISA检测上清液的TNFα含量。
该方法的一般概述可以参见图1的流程图。
结果和讨论该研究中进行的试验表明当在25℃下在摇瓶和发酵罐中表达TNFα时，可溶TNF的表达显著增加了。
摇瓶试验用5ml ON培养物接种100ml丰富培养基，并且在37℃生长。当培养物达到OD600时，用1mM IPTG诱导培养物。同时，37℃生长的培养物或者保持在37℃过夜生长，或者移动到25℃过夜生长。第二天，收集细胞，裂解细胞和分析总的和可溶的TNFα变异体表达。
结果表明在诱导点将温度从37℃转变到25℃对表达的可溶TNFα的量具有显著积极的作用，因此决定在下面的试验中保持这种温度转变。
选择的变异体如上所述检测所有的变异体，并且由于足够高水平的表达，选定TNF34、TNF34A、TNF37、TNFX5.1、TNFX2.1和TNF_T2用于进一步研究。
当可获得去毒形式的上述构建体时，检测这些变异体的表达，并且结果表明与非去毒形式相似的表达水平。
发酵罐中表达为了检测确定成分培养基中TNFα变异体表达，我们在摇瓶中进行了初步的试验，条件与上述条件相同(37℃/25℃)。过夜诱导的培养物显示了满意水平的TNFα变异体表达，因此我们决定检测发酵罐中表达以优化所表达的TNFα变异体量，并且也试图最小化在表达的变异体中仍旧可以观察到的变异体降解。
细胞生长如上所述制备研究细胞库，并且我们使用这种预培养物，用50mlOD600约是3-4的预培养物接种1L发酵罐。发酵罐被预加热到选定的温度(37℃或25℃)以最小化温度震扰。在37℃发酵罐的情况下，细胞继续指数生长，没有任何延滞期。当37℃预培养物被接种到25℃发酵罐中时，细胞在以较慢速率开始指数生长前有约17小时的延滞期。预测这种情况是细胞受到温度震扰的结果。
当我们在临诱导前转变37℃培养物到25℃时观察到了相同的延滞期。我们试图在1个多小时逐渐将温度从37℃转变到25℃(每10分钟2℃)没有减少延滞期。
TNFα变异体表达水平通过TNFα特异性定量ELISA测定表达水平观察到的最高水平是25℃/25℃方法，获得了约250mg/l的水平。这些试验仍旧是单个验证，并且诱导后15h和35h之间的时间还待分析。
37℃/37℃的方法只产生了非常有限量的约15mg/l的可溶TNFα变异体，37℃/25℃方法看似在约100mg/l达到峰值。
结论基于从总共超过100次发酵得到的结果，(从总共6个中)选定了生产可溶TNFα变异体蛋白质的2个上游方法。在确定成分的基本培养基中进行发酵(参见下文所述)。选定的发酵方法基于温度研究，其中检测了4个不同的温度组合。所检测的TNFα变异体是在大肠杆菌(e.coli)株系HMS174中的TNF37-145。
在诱导前后都采用25℃已经获得了最佳结果。最佳的收集时间还有待测定。
实施例10选择测定法直接受体ELISA和多克隆ELISA及具有KD-4和Wehi细胞的细胞毒性测定法用做首选的测定法以进行筛选和纯化。在受体和细胞毒性测定法中将产生的抗TNFα变异体的抗体用于抑制wtTNFα结合以测定抗体质量。
实施例11纯化方法在该实施例中，详细地描述了TNFα变异体之一(TNF37)的重组产生和随后的纯化。然而，根据本发明，该纯化方法是优选的纯化方法，并且也可应用于(对每种变异体有些小相关的调整)本发明的其它TNFα变异体。
然而，目前本发明人正在研究尤其适于TNFα变异体大规模发酵的改进的纯化方案。基本上，使用了下述相同的单个步骤，但是顺序相反以在SP-琼脂糖凝胶(Sepharose)和Q-琼脂糖凝胶层析步骤后用羟磷灰石层析步骤结束纯化。
在5ml LB培养基(60mg卡那霉素/L LB)中重悬浮来源于LB卡那霉素平板(60mg卡那霉素/L含有1.5琼脂的LB培养基)的大肠杆菌(E.coli)BL21STAR/TN37菌落，并且在37℃过夜生长(16小时)，同时在New Braunswick振荡器中以220RPM振荡。
2×2ml这种培养物被转移到2个2L带挡板摇瓶中1L LB(60mg卡那霉素/L)中，使得细胞在New Braunswick振荡器中以220RPM生长到OD436＝0.6-0.8。在示例性温度37℃和25℃已经进行了这个步骤，但是该温度可以对每种培养物进行优化。
向每个摇瓶添加1ml 1M IPTG，并且允许细胞生长16-20小时。诱导前，将温度调整到25℃，如果这不是发酵温度的话。
利用Sorvall离心机中SLA-3000转头，以5000RPM离心15分钟，在离心管(500ml)中收集细胞。
利用0.9％ NaCl将细胞转移到一个500ml预先称重的离心管中，并且如前所述通过离心收集细胞。
弃去上清液，称重该管以测定细胞重量(应该是7-11g)。
添加200ml 50mM Na2HPO4，pH＝7.0(如果细胞被重悬浮，应该直接使用它们，否则可以冷冻细胞)。
细胞破坏、离心和过滤在效力、稳定性和选择后续纯化步骤中必需的任何缓冲液能力方面，细胞的机械破碎比酶促破碎提供了几个优点。通过在使用前向样品室添加冰水并且在两次样品通过之间让冰水流过机械，在操作期间保持APV-100冷却。离心和过滤用以在蛋白质层析分离前，从溶液除去任何颗粒或聚集物。应该在同一天完成细胞破碎和HA层析，因为这可能因层析步骤中与蛋白酶活性分离的结果而最小化明显的蛋白酶活性。破碎、分离和过滤的方法如下仔细重悬浮的细胞材料被转移给细胞破碎器(APV-1000)。利用700巴反压力(在该点，溶液应该是清澈的)使细胞悬浮液小心地两次通过破碎器(每次通过后在冰上冷却，并且两次通过之间让冰水流过APV-1000)。
破碎的细胞被转移到500ml离心管中，利用SLA-3000转头，在Sorvall离心机中以10000RPM离心45分钟。
将提取物(约225ml)通过0.22μm过滤器。
羟磷灰石(HA)层析羟磷灰石Bio-Gel HTP凝胶(BIO-RAD；目录#130-0420)是磷酸钙的晶体形式，已经证明了它本身是蛋白质诸如单克隆抗体和不能用其它方法分离的其它蛋白质分离中独特的工具。然而，根据我们的经验，这种物质的流动特性在某种程度上是关键的，因为高于2ml/min的流速升高了压力达到了不可接受的高水平。而且，当如制造商所建议，试图用氢氧化钠再生时，这种物质已经毁坏了几次。
缓冲液和柱子缓冲液A+B的贮存液1M Na2HPO4×2H2O，pH＝7.0(用HCl调整pH到7)。由储存液稀释制备缓冲液A+B，缓冲液A50mM Na2HPO4×2H2O，pH＝7.0缓冲液B0.3M Na2HPO4×2H2O，pH＝7.0。
利用缓冲液A中悬浮液和XK 26/40(Amersham Biosciences)柱子，填充柱子使其带有约50-60ml羟磷灰石Bio-Gel HTP凝胶(BIO-RAD；目录#130-0420)。
层析程序清洗系统20ml，30ml/min流速。
平衡以2ml/min流速的4CV缓冲液A。
以2ml/min流速，通过泵(在BioCad上入口F)(如果在管道里需要样品，约225+5-10ml)加载样品。
用1.5CV缓冲液A以2ml/min流速洗涤柱子。
洗脱用4CV 0％到100％梯度的缓冲液B，以2ml/min流速洗脱蛋白质。
用2CV缓冲液B以2ml/min流速清洗柱子。
用4CV缓冲液A以2ml/min流速再平衡。
选定级分，收集并且用15×体积20mM Tris-HCl，0.075M NaCl，pH8.0，在4℃透析ON。
HA层析后选择含有TNF37的级分HA层析洗脱级分分布图基本上由“流过的”级分和可以被分成几个峰的一个洗脱峰组成。必须根据完整峰的考马斯染色凝胶选择含有TNF37的级分，因为含有TNF37的峰不是直接可被鉴定的。然而，由于随后的纯化步骤，在这个点选择级分不太重要，并且在该方法的以后步骤中可以除去杂质。因此，不太谨慎的级分选择确保了最大的变异体产量。
最初用“点印迹”检查“流过的”级分的任何TNF37。这产生了阳性结果，该结果在理论上应该表明相当大部分的变异体不结合柱子。然而，当对“流过的”级分进行非常有效的SP-琼脂糖凝胶阳离子交换层析(参见下一步)，并且用考马斯染色凝胶分析级分时，它们不含有任何可检测到的TNF37变异体，表明在“点印迹”中有些假阳性反应或者一部分变异体完全不同地结合SP-琼脂糖凝胶。
SP-琼脂糖凝胶阳离子交换层析因为与wtTHFα pI 7.8比较，变异体有相当高的计算的pI 9.4，所以SP-琼脂糖凝胶是选定的基本阳离子交换步骤。这种pI的增加是通过PADRE表位引入2个赖氨酸的结果。这种层析法对于TNF37变异体是非常有效的和快速的，并且预期其可以用于大量其它TNFα环变异体。
在继续SP-琼脂糖凝胶层析前，应用的样品应该具有低于8mS/cm的导电率，pH应该至少是7.7，因为按我们的经验与此相偏离已经使蛋白质的结合特性不时地不同。
缓冲液和柱子缓冲液A+B的贮存液1M Tris-HCl，pH＝8.0。
缓冲液A20mM Tris-HCl，0.075M NaCl，pH＝8.0。
缓冲液B20mM Tris-HCl，1M NaCl，pH＝8.0。
利用缓冲液A中悬浮液和XK 26/40(Amersham Biosciences)柱子，填充柱子使其带有约60ml SP-琼脂糖凝胶FF(AmershamBiosciences；目录#17-0729-01)。
层析程序清洗系统20ml，30m1/min流速。
平衡以4ml/min流速的4CV缓冲液A。
以4ml/min流速，通过泵(在BioCad上入口F)(如果在管道里需要样品，样品+10ml)加载样品。
用1.5CV缓冲液A以4ml/min流速冲洗柱子。
洗脱用4CV 0％到100％梯度的缓冲液B，以4ml/min流速洗脱蛋白质。
用2CV缓冲液B以4ml/min流速清洗柱子。
用4CV缓冲液A以4ml/min流速再平衡。
选定级分，收集并且用15×体积20mM Tris-HCl，0.075M NaCl，pH8.0，在4℃透析ON。
SP琼脂糖凝胶层析后选择含有TNF37的级分分布图基本上由“流过的”级分和含有蛋白质的几个峰组成。然而，两个峰含有带有一些杂质的变异体。在这一点，不要包含峰α右侧的许多级分是重要的，因为按我们的经验这包含了许多杂质，而在随后的层析步骤中不容易除去该杂质。
Q-琼脂糖凝胶阴离子层析Q-琼脂糖凝胶是选定的基本阴离子交换步骤，用于除去具有高的再现性跟随在包括HA层析和SP-琼脂糖的TNF37纯化之后的主要杂质蛋白质。TNF37变异体本身不结合柱子，但是主要未知杂质结合柱子。然而，可以用避免该杂质的方式在SP-琼脂糖凝胶中早已以严谨的方式选择级分。然而，与纯化方法中使用Q-琼脂糖凝胶时比较，这损失了TNF37变异体的产量，并且因为在该步骤中也除去其它少量的杂质，所以在总的方法中优选地包括该步骤。总之Q-琼脂糖凝胶步骤在变异体37的纯化中是重要的，并且以高产量提供了甚至更好的终产物。
缓冲液和柱子缓冲液A+B的贮存液1M Tris-HCl，pH＝8.0。
缓冲液A20mM Tris-HCl，0.075M NaCl，pH＝8.0。
缓冲液B20mM Tris-HCl，1M NaCl，pH＝8.0。
利用缓冲液A中悬浮液和XK 26/40(Amersham Biosciences)柱子，填充柱子使其带有约50-60ml Q-琼脂糖凝胶FF(AmershamBiosciences；目录#17-0510-01)。
层析程序清洗系统20ml，30ml/min流速。
平衡以4ml/min流速的4CV缓冲液A。
以2ml/min流速，通过泵(在BioCad上入口F)(如果在管道里需要样品，样品+10ml)加载样品。
用3CV缓冲液A以4ml/min流速冲洗柱子。
洗脱用2CV 100％缓冲液B，以4ml/min流速洗脱剩余的蛋白质。
用4CV缓冲液A以4ml/min流速再平衡。
选定级分，收集并且直接应用在SP-琼脂糖凝胶柱子上。
洗脱分布图基本上由“流过的”级分和含有蛋白质的几个峰组成。“流过的”级分有时可以分成几个完全分辨的峰，所有这些峰都含有TNF37变异体，因此收集所有的峰。当解决了明显的蛋白酶降解问题时，就可能解决了TNF37的这种异质性。
实施例12免疫研究材料盐水(无菌水中0.9％ NaCl，Fresenius Kabi Norge AS，Norway)，弗氏完全佐剂(Sigma，F-5881，39H8926)，弗氏不完全佐剂(Sigma，F-5506，60K8937)，Alhydrogel 2％[10mg Al/ml](Brenntag Biosector，Batch 96(3176))，Adjuphos[5mg Al/ml](Brenntag Biosector，Batch 2(8937))，野生型人类TNF(Invitrogen目录号10062-024)，KYM-1D4A.Meager(A.Meager，J.Immunol.Methods 1991，144141-143)提供，WEHI 164克隆13T.Espevik(T.Espevik和J.Nissen-Myer，J.Immunol.Methods 1986，9599-105)提供，四唑鎓盐(MTS，CeliTiter 96一种水溶液；Promega，G3581)，旋转棒(Rotamix，Heto，Denmark)，
涡漩机(Vortex)(OLE DICH instrumentmakers ApS，Denmark)。
制剂/佐剂的选择(20mM Tris-HCl，0.075M NaCl，pH＝8.0中)纯化的TNFα变异体蛋白质被盐水(0.9％NaCl)稀释到0.5mg/ml，分成批次(375μg/小瓶)，并且在用于免疫前在-20℃贮藏。
对于每种TNFα变异体，用两种佐剂进行免疫1)弗氏完全佐剂(CFA，用于初次免疫)和弗氏不完全佐剂(IFA，用于加强免疫)和2)Alhydrogel或Adjuphos(分别是现有技术氢氧化铝和磷酸铝佐剂)-这两种佐剂用于初次和加强注射。
初次免疫前，做出选择Alhydrogel或Adjuphos做为TNF变异体佐剂的决定。选定具有最好吸附TNFα变异体能力的佐剂以在免疫试验中进一步使用。在两个小瓶中，两等份TNFα变异体与等体积的Alhydrogel和Adjuphos混合。室温下在旋转棒上轻轻混合小瓶30分钟。然后以13000g离心小瓶15分钟，在梯度(4-12％)SDS凝胶上检测上清液中可溶TNFα变异体含量。然后选择含有最少自由变异体(即，其中更多的变异体已经结合了铝颗粒)的佐剂/变异体等份为最好的佐剂。
抗原/佐剂emulgate的制备通过下面的方法制备CFA/IFA emulgates融解具有TNFα变异体的小瓶
，转移到10ml无菌小瓶中，并且与等体积的CFA或IFA混合。然后在20℃，在涡漩机上以3300rpm进一步混合小瓶30分钟。
通过下面的方法制备Alhydrogel/Adjuphos emulgates用盐水将Alhydrogel/Adjuphos稀释到1.4mg Al/ml。融解具有TNFα变异体的小瓶
，转移到10ml无菌小瓶中，并且与等体积的Alhydrogel[1.4mg Al/ml]或Adj upho s[1.4mg Al/ml]混合。然后，在20℃，在旋转棒上进一步混合小瓶30分钟。
动物模型的选择用TNFα变异体重复免疫6至8周龄Balb/Ca雌性小鼠。以不同的时间间隔收集血液样品，并且研究分离血清的抗wtTNFα抗体效价。小鼠定购于Taconic Farms，Inc.Acquires M&B A/S，Denmark。开始试验前，小鼠在Pharmexa的动物研究室养一周。
免疫方案和剂量用CFA/IFA和Alhydrogel/Adjuphos中的每种TNFα变异体分别免疫几组10+10只小鼠。20+20只小鼠用于野生型TNFα免疫。
初次免疫时，皮下注射佐剂中的50μg蛋白质。初次免疫后2，6和10周，所有小鼠都将接受用佐剂中25μg蛋白质的另外皮下加强免疫。
紧临第一次免疫前和每次加强免疫后1周收集血液样品。
使用的测定法利用WEHI 164克隆13-或KYM-1D4-细胞进行细胞毒性生物测定这种测定法用于测定本发明TNFα变异体的毒性。在滴定量的TNFα变异体存在的情况下，培养细胞48小时，并且通过添加四唑鎓盐(MTS)检测细胞死亡，该四唑鎓盐通过活细胞被生物还原成有色的甲(formazan)产物。比较TNFα变异体与人类野生型TNFα的细胞毒性。
利用WEHI 164克隆13-或KYM-1D4-细胞进行细胞毒性抑制生物测定该测定法用于研究在TNFα免疫的小鼠中产生的抗血清中和野生型TNFα细胞毒性作用的能力。细胞与滴定量的抗血清和恒定浓度的野生型人类TNFα一起被培养48小时，在抗血清不存在的情况下这足以诱导细胞中50％细胞死亡。如上所述，用MTS测定细胞死亡。比较来源于TNFα变异体免疫的小鼠的血清与获自用人类野生型TNFα免疫小鼠的血清的中和能力。
体外研究利用WEHI 164克隆13-或KYM-1D4-细胞进行细胞毒性生物测定利用WEHI 164克隆13-或KYM-1D4-细胞进行细胞毒性抑制生物测定。
最好的免疫原性构建体的选择标准TNFα变异体应该显示最小的细胞毒性。与获自人类野生型TNFα免疫的小鼠的血清比较，用TNFα变异体免疫小鼠应该产生具有更好或同等中和WEHI-或KYM-1D4-细胞中人类野生型TNFα介导的细胞毒性能力的抗血清。
序列表<110>Pharmexa A/S<120>具有降低的细胞毒性的免疫原性人类TNFα类似物及其制备方法<130>15454PCT00<160>18<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>破伤风类毒素P2表位<220>
<221>CDS<222>(1)..(45)<400>1cag tac atc aaa gct aac tcc aaa ttc atc ggc atc acc gaa ctg45Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu1 5 10 15<210>2<211>15<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>破伤风类毒素P2表位<400>2Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu1 5 10 15<210>3<211>63<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>破伤风类毒素P30表位<220>
<221>CDS<222>(1)..(63)<400>3
ttc aac aac ttc acc gtt tcc ttc tgg ctg cgc gtt cca aaa gtt tcc48Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser1 5 10 15gct tcc cac ctg gaa63Ala Ser His Leu Glu20<210>4<211>21<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>破伤风类毒素P30表位<400>4Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser1 5 10 15Ala Ser His Leu Glu20<210>5<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>泛DR结合肽(PADRE)<220>
<221>CDS<222>(1)..(39)<400>5gcc aag ttc gtg gcc gct tgg acc ctg aag gcc gca gct 39Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala1 5 10<210>6<211>13<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>泛DR结合肽(PADRE)<400>6Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala1 5 10
<210>7<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>泛DR结合肽(PADRE)<220>
<221>CDS<222>(1)..(39)<400>7gcg aag ttc gtt gca gct tgg acc ctg aag gcc gct gca 39Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala1 5 10<210>8<211>13<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>泛DR结合肽(PADRE)<400>8Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala1 5 10<210>9<211>477<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人类wt TNF(密码子优化的)<220>
<221>CDS<222>(1)..(477)<220>
<221>misc_feature<222>(4)..(474)<223>成熟TNF序列<400>9atg gtg cgc tca agc tcg cgc acg ccg agt gac aaa cca gta get cat48Met Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His1 5 10 15
gtt gtg gcc aac cct cag gcg gaa ggc cag ctc caa tgg tta aat cgt 96Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg20 25 30cgc gcg aac gcc ctg ctg gcg aac ggc gtg gaa ctg cgt gat aac cag 144Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln35 40 45ctg gtg gtc ccc agc gag ggg ctg tat ctg atc tat tca cag gtg ttg 192Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu50 55 60ttt aag ggt cag ggt tgt ccg agc acc cac gtt ctg ctg acg cat acc 240Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr65 70 75 80att tct cgt att gct gta tct tat caa act aaa gtc aat tta ctt tcg 288Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser85 90 95gcg atc aaa tcc ccg tgc caa cgt gag acc cct gaa gga gcg gaa gcc 336Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala100 105 110aaa cct tgg tac gaa ccg atc tat ctg ggg ggc gtt ttt cag ctc gaa 384Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu115 120 125aaa ggt gat cgg ctg agc gcc gaa att aat cgc ccg gac tac ctt gat 432Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp130 135 140ttc gca gag tcc ggt cag gtc tac ttc ggc att atc gca ttg taa 477Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu145 150 155<210>10<211>158<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人类wt TNF(密码子优化的)<400>10Met Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His1 5 10 15Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg20 25 30Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln35 40 45
Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu50 55 60Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr65 70 75 80Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser85 90 95Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala100 105 110Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu115 120 125Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp130 135 140Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu145 150 155<210>11<211>169<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>插入了12个PADRE氨基酸的hTNF<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(109)<223>hTNF氨基酸1-109<220>
<221>MUTAGEN<222>(109)..(121)<223>PADRE<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(122)..(169)<223>hTNF氨基酸110-157<400>11Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val1 5 10 15
Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg20 25 30Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu35 40 45Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe50 55 60Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile65 70 75 80Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala85 90 95Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Lys Phe Val100 105 110Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu115 120 125Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu130 135 140Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly145 150 155 160Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu165<210>12<211>169<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>带有PADRE插入和去毒突变的TNF-α<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(108)<223>人类TNF-alpha，残基1-108<220>
<221>MUTAGEN<222>(109)..(121)<223>PADRE
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(122)..(169)<223>人类TNF-alpha，残基110-157<220>
<221>MUTAGEN<222>(155)..(155)<223>Asp到Arg突变<400>12Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val1 5 10 15Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg20 25 30Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu35 40 45Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe50 55 60Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile65 70 75 80Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala85 90 95Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Lys Phe Val100 105 110Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu115 120 125Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu130 135 140Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Arg Phe Ala Glu Ser Gly145 150 155 160Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu165<210>13<211>169<212>PRT
<213>人工序列<220>
<223>带有PADRE插入和去毒突变的TNF-α<220>
<221>MIS_FEATURE<222>(1)..(108)<223>人类TNF-alpha，残基1-108<220>
<221>MIS_FEATURE<222>(122)..(169)<223>人类TNF-alpha，残基110-157<220>
<221>MUTAGEN<222>(157)..(157)<223>Ala到Arg突变<400>13Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val1 5 10 15Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg20 25 30Ala Asn Ala Leu Leu Ala ASn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu35 40 45Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe50 55 60Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile65 70 75 80Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala85 90 95Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Lys Phe Val100 105 110Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu115 120 125Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu130 135 140
Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Arg Glu Ser Gly145 150 155 160Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu165<210>14<211>169<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>带有PADRE插入和去毒突变的TNF-α<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(108)<223>人类TNF-alpha，残基1-108<220>
<221>MUTAGEN<222>(87)..(87)<223>Tyr到Ser突变<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(122)..(169)<223>人类TNF-alpha，残基110-157<400>14Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val1 5 10 15Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg20 25 30Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu35 40 45Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe50 55 60Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile65 70 75 80Ser Arg Ile Ala Val Ser Ser Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala85 90 95
Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly A la Lys Phe Val100 105 110Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Glu Ala Lys1 Pro Trp Tyr Glu115 120 125Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu130 135140Ser A la Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly145 150 155 160Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu165<210>15<211>170<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>具有插入的PADRE和额外二硫键的hTNF<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(108)<223>hTNF氨基酸1-108<220>
<221>DISULFID<222>(67)..(124)<220>
<221>MUTAGEN<222>(67)..(67)<223>Leu到Cys突变<220>
<221>MUTAGEN<222>(109)..(121)<223>PADRE<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(122)..(170)<223>hTNF氨基酸109-157<220>
<221>MUTAGEN<222>(124)..(124)<223>Ala到Cys突变<400>15
Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val1 5 10 15Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg20 25 30Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu35 40 45Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe50 55 60Lys Gly Cys Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile65 70 75 80Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala85 90 95Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Lys Phe Val100 105 110Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Ala Glu Cys Lys Pro Trp Tyr115 120 125Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg130 135 140Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser145 150 155 160Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu165 170<210>16<211>170<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>带有PADRE插入和去毒突变的TNF-α<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(108)<223>人类TNF-alpha，残基1-108
<220>
<221>DISULFID<222>(67)..(124)<220>
<221>MUTAGEN<222>(67)..(67)<223>Leu到Cys突变<220>
<221>MUTAGEN<222>(109)..(121)<223>PADRE<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(122)..(170)<223>人类TNF-alpha，残基109-157<220>
<221>MUTAGEN<222>(124)..(124)<223>Ala到Cys突变<220>
<221>MUTAGEN<222>(156)..(156)<223>Asp到Arg突变<400>16Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val1 5 10 15Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg20 25 30Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu35 40 45Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe50 55 60Lys Gly Cys Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile65 70 75 80Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala85 90 95Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Lys Phe Val100 105 110
Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Ala Glu Cys Lys Pro Trp Tyr115 120 125Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg130 135 140Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Arg Phe Ala Glu Ser145 150 155 160Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu165 170<210>17<211>170<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>带有PADRE插入和去毒突变的TNF-α<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(108)<223>人类TNF-alpha，残基1-108<220>
<221>MUTAGEN<222>(67)..(67)<223>Leu到Cys突变<220>
<221>DISULFID<222>(67)..(124)<220>
<221>MUTAGEN<222>(109)..(121)<223>PADRE<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(122)..(170)<223>人类TNF-alpha，残基109-157<220>
<221>MUTAGEN<222>(124)..(124)<223>Ala到Cys突变<220>
<221>MUTAGEN<222>(158)..(158)<223>Ala到Arg突变
<400>17Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val1 5 10 15Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg20 25 30Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu35 40 45Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe50 55 60Lys Gly Cys Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile65 70 75 80Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala85 90 95Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Lys Phe Val100 105 110Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Ala Glu Cys Lys Pro Trp Tyr115 120 125Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg130 135 140Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Arg Glu Ser145 150 155 160Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu165 170<210>18<211>170<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>带有PADRE插入和去毒突变的TNF-α<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(108)<223>人类TNF-alpha，残基1-108
<220>
<221>DISULFID<222>(67)..(124)<220>
<221>MUTAGEN<222>(67)..(67)<223>Leu到Cys突变<220>
<221>MUTAGEN<222>(87)..(87)<223>Lys到Ser突变<220>
<221>MUTAGEN<222>(109)..(121)<223>PADRE<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(122)..(170)<223>人类TNF-alpha，残基109-157<220>
<221>MUTAGEN<222>(124)..(124)<223>Ala到Cys突变<400>18Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val1 5 10 15Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg20 25 30Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu35 40 45Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe50 55 60Lys Gly Cys Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile65 70 75 80Ser Arg Ile Ala Val Ser Ser Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala85 90 95Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Lys Phe Val100 105 110
Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Ala Glu Cys Lys Pro Trp Tyr115 120 125Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg130 135 140Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser145 150 155 160Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu165 170
权利要求
1.人类TNFα蛋白质的免疫原性类似物，其中所述类似物包含a)通过肽接头首尾连接的2个或3个完整的TNFα单体，其中至少一个肽接头包含至少一个II类MHC结合氨基酸序列，或b)通过惰性肽接头首尾连接的2个或3个完整的TNFα单体，其中至少一个单体包含至少一个外源II类MHC结合氨基酸序列或者其中至少一个外源II类MHC结合氨基酸序列，可选地通过惰性接头，融合到N-或C-末端单体，或c)人类TNFα单体或者a或b中所限定的类似物，其中柔性环3中已经插入或置换入至少一个外源II类MHC结合氨基酸序列，或d)人类TNFα单体或者a或b中所限定的类似物，其中已经引入了稳定TNFα单体3D结构的至少一个二硫键，或e)人类TNFα单体或者a或b中所限定的类似物，其中缺失了氨基末端氨基酸1，2，3，4，5，6，7，8和9中任何一个氨基酸，或f)人类TNFα单体或者a或b中所限定的类似物，其中在内含子位置向环1内插入或置换入至少一个外源I I类MHC结合氨基酸序列，或g)人类TNFα单体或者a或b中所限定的类似物，其中在人类TNFαN-末端中作为人工茎杆区的一部分引入至少一个外源II类MHC结合氨基酸序列，或h)人类TNFα单体或者a或b中所限定的类似物，其中引入至少一个外源II类MHC结合氨基酸序列，以通过增加三聚体相互作用界面的疏水性而稳定单体结构，或i)人类TNFα单体或者a或b中所限定的类似物，其中在TNFα氨基酸序列中插入或置换入侧翼为甘氨酸残基的至少一个外源II类MHC结合氨基酸序列，或j)人类TNFα单体或者a或b中所限定的类似物，其中在D-E环中插入或置换入至少一个外源II类MHC结合氨基酸序列，或k)人类TNFα单体或者a或b中所限定的类似物，其中在两个相同的人类TNFα亚序列之间插入或置换入至少一个外源II类MHC结合氨基酸序列，或1)人类TNFα单体或者a或b中所限定的类似物，其中已经加强或用二硫桥置换人类TNFα中至少一个盐桥，或m)人类TNFα单体或者a或b中所限定的类似物，其中通过引入模拟鼠TNFα晶体结构的突变增强了溶解性或对蛋白酶解的稳定性，其中通过引入至少一个点突变降低或消除了可能的毒性，该点突变选自Y87S，D143N或A145R，氨基酸编号从人类TNFα中N-末端缬氨酸开始。
2.如权利要求1所述的免疫原性类似物，其中II类MHC结合氨基酸序列可结合此多聚体蛋白所来源的动物物种的大多数II类MHC分子。
3.如权利要求2所述的免疫原性类似物，其中至少一种II类MHC结合氨基酸序列选自天然T细胞表位和人工MCH-II结合肽序列。
4.如权利要求3所述的免疫原性类似物，其中该天然T细胞表位选自破伤风类毒素表位诸如P2或P30、白喉类毒素表位、流感病毒血凝素表位和恶性疟原虫(P.falciparum)CS表位。
5.如权利要求1至4中任一权利要求所述的免疫原性类似物，其中类似物的氨基酸序列选自SEQ I D NO12、13、14、16、17和18，以及只包含其保守性氨基酸改变的任何氨基酸序列。
6.如前述任一权利要求所述的免疫原性类似物，其可以由细菌细胞表达为可溶性蛋白质。
7.编码前述任一权利要求所述免疫原性类似物的核酸片段，或与其互补的核酸片段。
8.如权利要求7所述的核酸片段，其是DNA片段。
9.如权利要求7或8所述的核酸片段，其包含核酸序列，该核酸序列选自编码SEQ ID NO12、13、14、16、17和18中任何一种序列的核酸序列，或与其互补的核酸序列。
10.一种下调宿主动物中自身TNFα的方法，该方法包括向该动物免疫系统呈递免疫原性有效量的至少一种权利要求1至6中任一权利要求所述的免疫原性类似物。
11.如权利要求10所述的方法，其中自身宿主是哺乳动物，诸如人类。
12.如权利要求10或11所述的方法，其中通过向自身宿主给药权利要求1至6中任一权利要求所述的免疫原性类似物实现呈递，可选地所述的免疫原性类似物与佐剂混合。
13.如权利要求12所述的方法，其中佐剂选自免疫靶向佐剂；免疫调节佐剂诸如毒素、细胞因子和分枝杆菌衍生物；油制剂；聚合物；微团形成性佐剂；皂苷；免疫刺激性复合物基质(ISCOM基质)；颗粒；DDA；铝佐剂；DNA佐剂；γ-菊粉；和包囊化佐剂。
14.如权利要求10至13中任一权利要求所述的方法，其中通过选自肠胃外途径，诸如真皮内、皮下和肌内途径；腹膜途径；口服途径；口腔途径；舌下途径；硬膜外途径；脊柱途径；肛门途径；和颅内途径的途径向动物给药免疫原性有效量的类似物。
15.如权利要求14所述的方法，其中有效量是0.5μg到2,000μg之间。
16.如权利要求14或15所述的方法，该方法包括每年至少一次给药，诸如每年至少2次，至少3次，至少4次，至少6次和至少12次给药。
17.如权利要求10所述的方法，其中通过向动物细胞中引入编码类似物的核酸，并由此获得所述细胞对所引入核酸的体内表达，实现类似物向免疫系统的呈递。
18.如权利要求17所述的方法，其中所引入的核酸选自裸DNA，与带电荷或不带电荷的脂质配制的DNA，脂质体中配制的DNA，包含在病毒载体中的DNA，与有利于转染的蛋白质或多肽配制的DNA，与靶向蛋白质或多肽配制的DNA，与钙沉淀试剂配制的DNA，与惰性载体分子偶联的DNA，封装在壳多糖或脱乙酰壳多糖中的DNA和与佐剂，诸如权利要求13中所定义的佐剂配制的DNA。
19.如权利要求17或18所述的方法，其中通过动脉内、静脉内或通过权利要求14中所定义的途径给药该核酸。
20.如权利要求17至19中任一权利要求所述的方法，该方法包括每年至少一次给药核酸，诸如每年至少2次，至少3次，至少4次，至少6次，和至少12次给药核酸。
21.如权利要求10所述的方法，其中通过给药携带有编码和表达类似物的核酸片段的非致病性微生物或病毒实现向免疫系统的呈递。
22.如权利要求21所述的方法，其中该病毒是非强毒痘病毒诸如痘苗病毒。
23.如权利要求22所述的方法，其中该微生物是细菌。
24.如权利要求21至23中任一权利要求所述的方法，其中向动物单次给药该非致病性微生物或病毒。
25.用于诱导抗多聚体蛋白抗体产生的组合物，该组合物包含-如权利要求1至6中任一权利要求所述的免疫原性类似物，和-药物学和免疫学上可接受的载体和/或赋形剂和/或佐剂。
26.用于诱导抗多聚体蛋白抗体产生的组合物，该组合物包含-如权利要求7至9中任一权利要求所述的核酸片段，和-药物学和免疫学可接受的载体和/或赋形剂和/或佐剂。
27.如权利要求25或26所述的组合物，其中如权利要求30或31所述配制类似物。
28.一种制备权利要求1至7中任一权利要求所述的类似物的方法，该方法包括在有利于权利要求7至9中任一权利要求所述的核酸片段表达的条件下，培养用该核酸片段转化的宿主细胞，随后从培养物回收做为蛋白质表达产物的类似物。
29.如权利要求28所述的方法，其中该宿主细胞是细菌宿主细胞。
30.如权利要求29所述的方法，其中该类似物是可溶性表达产物。
31.如权利要求28或29所述的方法，其中在宿主细胞产生表达产物的实质性时间段期间，在32℃以下的温度下培养宿主细胞。
32.如权利要求31所述的方法，其中该温度是约25℃。
33.如权利要求31或32所述的方法，其中在宿主细胞培养的完整时间段期间，温度基本上保持恒定。
全文摘要
本发明提供了人类TNFα蛋白质的免疫原性类似物，其中所述类似物包含免疫原化的单体TNFα多肽或TNFα二或三聚体，并且其中该类似物进一步包含降低或消除毒性的突变，该突变选自从人类TNFα中N－末端缬氨酸开始编号的Y87S，D143N或A145R。本发明也提供了编码该类似物的核酸片段及在该类似物制备中使用的载体和转化细胞。也公开了在需要的个体中下调TNFα的方法。
文档编号A61K48/00GK1784421SQ200480012635
公开日2006年6月7日 申请日期2004年5月6日 优先权日2003年5月9日
发明者T·布拉特, S·克吕斯纳, F·尼尔森, S·莫里岑, B·沃尔德博格 申请人:法默卡有限公司