用于放射治疗软组织疾病的钍－227的制作方法

专利名称：用于放射治疗软组织疾病的钍－227的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种放射治疗的方法，更特别地该方法包括钍-227在治疗软组织疾病中的应用。
背景技术：
杀死特定细胞对于成功治疗哺乳动物患者的各种疾病是必不可少的。典型例子是治疗恶性疾病比如肉瘤和癌。但选择性消灭某些细胞类型还在治疗其它疾病尤其是增生性和肿瘤疾病中起关键作用。
目前最常用的选择性治疗方法是手术、化疗和外束照射。然而，靶向的放射性核素疗法是一种有前途并且不断发展的领域，具有将高细胞毒性辐射释放至有害细胞类型的潜力。目前批准供人使用的最普通形式的放射性药物应用了β-发射和/或γ-发射放射性核素。但是，已对在治疗中使用α-放射放射性核素产生了兴趣，因为它们具有杀死更加特异性细胞的潜力。
在生理环境中，典型α放射体的辐射范围通常小于100微米，等于几个细胞的直径。这使得这些放射源很适合肿瘤包括微转移瘤的治疗，因为辐射能很少将穿越靶细胞并因此可最小程度地损害周围健康组织(参见Feinendegen等，Radiat Res148195-201(1997))。相反，β粒子在水中的射程为1mm或更长(参见Wilbur，Antibody Immunocon Radiopharm485-96(1991))。
与β粒子、γ射线和X-射线相比，α粒子的辐射能较高，通常是5-8MeV，或是β粒子的5至10倍以及γ射线能量的20倍或更多。因此，与γ和β射线相比，在非常短距离内沉积的大量能量赋予α-射线特别高的线性能量传递(LET)，高的相对生物效能(RBE)和低氧效应增强比(OER)(参见Hall，″Radiobiology for the radiologist″，Fifth edition，Lippincott Williams & Wilkins，Philadelphia PA，USA，2000)。这就解释了α放射的放射性核素的特殊细胞毒性并迫切需要提高对α放射的放射性核素分布的必要控制和研究水平以避免无法接受的副作用。
目前几乎没有α放射的放射性核素被认为适用于靶向分子疗法(例如参见上述的Feinendegen和Wilbur)。为了确定具体的核素是否合适，必须谨慎地基于候选者的物理特性、化学性质以及衰变产物(即，它们的子体核素)的性质进行评价。屡见不鲜的是，在潜在治疗的α-放射的放射性核素衰变时形成的子体核素仍是α放射体和/或当它们随后衰变时进一步生成α放射的同位素。因此评价α放射体的治疗寿命时，必需要考虑潜在的子体核素的性质。
下面的表1显示了迄今为止在文献中广泛地被建议可能具有治疗效能的α放射体的物理衰变性质。
表1
*半衰期迄今为止，主要的注意力集中于211At和213Bi并且已经在临床免疫疗法试验中研究了这两个核素。
所建议的几种放射性核素具有短寿命，即半衰期低于12小时。这样的短半衰期使得难以基于这些放射性核素使用商业方法制备并销售放射性药物。给药短寿命核素还增加了辐射剂量的比例，其将在达到靶点之前在体内放射。
在这方面，两个寿命较长的核素223Ra和225Ac具有良好的半衰期。这两个放射性核素均具有短寿命的子体产物(母体和子体总共发射四个α粒子)，如果母体和子体的衰变在同处发生就可生成强α级联。但是，如果，子体核素不包含在目标区内，那么这些核素有可能会向健康组织内释放大量的破坏性辐射。还有一个重要的基本问题是，α衰变后的子体核素的反冲是高能的。(以大约2％的光速释放氦原子核赋予了残留子体核素相当大量的动量)。
α-放射的反冲能将在很多情况下导致子体核素从母体的衰变位置释放。这些反冲能足以破裂许多子体核素，使其从本可以保持该母体的化学环境中放出，例如其中该母体与配体比如螯合剂相络合。即使其中的子体在化学上与相同配体相容，即可与相同配体络合，也可能发生上述情况。同样地，如果子体核素是气体，特别是稀有气体比如氡或在化学上与配体不相容，这种释放的影响将会更大。当子体核素的半衰期有若干秒时，它们可以扩散离开并进入血液系统，不受保持其母体的配位剂限制。这些游离的放射性子体因此能引起不希望的全身毒性。
最近锕-225已引起人们的注意；但是对该核素的研究已经受到原料的低利用率妨碍。已显示225Ac可以与单克隆抗体相连并用于瞄向包含抗原的组织。但是迄今为止，研究显示225Ac标记抗体在动物试验中是高毒性的。
已被提及作为医学上α放射体疗法的其它候选核素包括224Ra和226Ra(T1/2＝1600年)，其在上世纪早期广泛应用但后来由于负面的长期效果(包括骨癌)而被抛弃。这两个镭核素具有氡子核，其是气体且快速地扩散远离母体核素所占据的位点。而且普遍缺乏合适的联结物将镭连接于分子靶向剂。此外，从辐射安全和污染危害观点看，226Ra的极长半衰期是非常严重的问题。
大部份α-放射的放射性核素因此通常被认为是不适合的，因为不适当的半衰期或因为它们的衰变产物被认为与医学应用不相容，例如因为子体核素是亲骨的(参见Mausner，Med Phys20，503-509(1993))。因此，例如，镭，作为钙类似物，是特别强的骨-靶向物且如果在体内由227Th释放已知其子体核素223Ra(参见Muller，Int J Radiat Biol 20233-243(1971))将在骨骼中不良积聚从而可以预期明显的骨髓毒性。
根据Feinendegen等(″Alpha-emitters for medical therapy″SecondBiAnnual Workshop，Toronto，June 1998，US Dept.of Energy Report No.DOE/NE-0116)，存在两个治疗性候选放射性核素，其通过至少三个α放射子体而衰变。这两个放射性核素是225Ac和223Ra。在动物模型内使用锕-225(T1/2＝10.0天)放射免疫缀合物的治疗研究已表明6.3kBq的注射剂量(假定平均动物体重为25g，大约为250kBq/kg)可有力地改善带有散布的淋巴瘤异种移植物的小鼠的存活率。锕-225系释放四种α粒子，该系中最初的三个α放射体的半衰期低于5分钟，而该系中最后一个α放射体，铋-213的半衰期为46分钟。
文献中尚未记载证明223Ra抗肿瘤效果的体内数据。该核素的优点在于短寿命的子体，即来自219Rn(T1/2＝3.96秒)的子体在数秒内释放两个以上α粒子，同时，该系中的最后一个α放射体，211Bi，除了在211Pb(T1/2＝36.1分钟)之后，半衰期为2.17分钟且可扩散远离223Ra。但是，该四个α放射体中的三个将在母体核素近处与223Ra以及225Ac一起衰变。这与227Th完全相反，其子体放射四个α粒子，所有均在11.4天半衰期的223Ra子体之后。223Ra子体的长半衰期可能导致这些子体与母体227Th核素相比几乎完全改变了位置，并由此导致难以控制这四个α放射的位置且因此导致不良副作用的高发生率。
但是，近来已建议钍-227作为治疗放射性核素(参见WO01/60417和WO02/05859)，条件是所用的载体系统使得子体核素保留在封闭环境。在一个例子中，将该放射性核素置于脂质体内，脂质体的较大体积(与反冲距离相比)有助于将子体核素保留在脂质体内。在第二个例子中，使用了该放射性核素的亲骨性络合物，其渗入骨基质中并由此限制了子体核素的释放。这些都可能是非常有利的方法，但在一些情况下给药脂质体可能并不合适，在许多软组织疾病中无法以矿化基质包围放射性核素从而保留子体同位素。
在缺乏保留钍-227的镭子体的具体方法的情况下，关于镭毒性的公开的已有资料表明不能使用钍-227作为治疗药物，因为从钍-227衰变获得疗效所需的剂量将导致高毒性以及由于镭子体衰变可能导致致死剂量，即没有治疗窗带。
因此非常需要开发对于软组织的其它放射性核素治疗，其允许使用α放射体治疗恶性和非恶性疾病而不引起无法接受的副作用，尤其是骨髓毒性。
本发明者现已出乎意料地发现钍-227存在治疗窗带，可给药患者(通常为哺乳动物)治疗有效量的靶向钍-227放射性核素而不生成足以引起不可接受骨髓毒性量的镭-223。
发明概要从一方面看，本发明因此提供了一种治疗哺乳动物患者(优选人或犬患者)软组织疾病的方法，所述方法包括给药所述患者治疗有效量的钍-227和络合剂的靶向软组织络合物，其中所述量使得在体内由所给药的钍-227核衰变生成可接受非骨髓毒性量的镭-223。
从另一方面看，本发明提供了钍-227用于制备药物的用途，该药物包含用于软组织疾病治疗方法中的钍-227和络合剂的靶向软组织络合物。
从另一方面看，本发明提供了一种药物组合物，包括钍-227和络合剂的靶向软组织络合物，与至少一种药学载体或赋形剂。
从另一方面看，本发明还提供了钍-227和络合剂的靶向软组织络合物。
为了区别非放射活性的钍络合物，应理解本文所要求保护的钍络合物以及其组合物包括高于天然相对丰度的钍-227，例如至少超过20％。这并未影响本发明方法的定义，其中明确要求了治疗有效量的钍-227。
从另一方面看，本发明还提供了用于根据本发明方法的试剂盒，所述试剂盒包钍-227和络合剂的靶向软组织络合物的溶液以及将所述溶液用于根据本发明方法的说明书。
从另一方面看，本发明还提供了用于根据本发明方法的试剂盒，所述试剂盒包含可络合钍离子的络合剂；其中所述络合剂不是靶向软组织的络合剂，一种靶向软组织的化合物，任选还有一种连接化合物，可与所述络合剂缀合从而得到靶向软组织络合物；以及制备钍-227和络合剂的靶向软组织络合物，和任选所述络合物在根据本发明的方法中应用的说明书。
附图简单说明

图1表明由于钍-227衰变放射活性随时间下降，以及给药根据本发明钍-227络合物后由于镭-223衰变放射活性随时间增加。
发明详述本文中的“靶向软组织”意指所讨论的物质，当为钍络合物形式时，用以将钍移至需要其放射活性衰变的软组织位点。这可依靠络合剂组分连接于疾病感染细胞或疾病感染细胞的周边细胞上存在的细胞表面标记物(例如，受体)(例如，在疾病细胞表面较健康细胞表面表达更多的蛋白或在生长期或复制期较静息期在细胞表面表达更多的蛋白)，或依靠连接于其它软组织结合试剂的组分(此时，其它试剂将首先给药，作为钍络合物的“探针(parthfinder)”)。可替换地，可靶向与靶细胞相关但不直接与其相连的抗原。这样的抗原通常存在于靶细胞之间的基质内，这样被疾病组织所包围。例如基质抗原比如细胞粘合素，其与脑瘤相关但表达在细胞间基质内。可直接靶向这样的基质抗原或具有初步结合试剂，如上所述。
本文所用的术语“软组织”是指不含“硬”矿化基质的组织。具体地，本文所用的软组织可以是除骨组织以外的任何组织。因此，本文所用的“软组织疾病”是指在本文所用的“软组织”中发生的疾病。本发明特别适用于治疗癌症和“软组织疾病”，因此包含在任何“软”(即，非矿化的)组织中发生的癌、肉瘤、骨髓瘤、白血病(lukemias)、淋巴瘤和混合型癌，以及该组织的其它非癌性疾病。癌性“软组织疾病”包括在软组织中发生的实体瘤以及转移性和微转移性肿瘤。实际上，软组织疾病可包含软组织的初级实体瘤以及同一患者的至少一种转移瘤。另一方面，“软组织疾病”仅由实体瘤或仅由成为骨骼疾病的初级瘤转移所组成。
如本文所用，术语“可接受的非骨髓毒性”用于表明，最重要的是，所生成的镭量通常不足以直接导致患者死亡。但是，本领域技术人员清楚骨髓损坏量(以及致死反应的概率)将是该治疗可接受的副作用，其将根据所治疗疾病的类型、治疗方案的目标以及患者的预后而显著不同。尽管对于本发明的优选患者是人类，但其它哺乳动物特别是狗将受益于本发明的应用。可接受的骨髓损坏水平还将反应患者种属。可接受的骨髓损坏水平通常在治疗恶性疾病中将高于非恶性疾病中。一种公知的骨髓毒性水平的测量方法是嗜中性白细胞计数，在本发明中，可接受的非骨髓毒性的223Ra量通常是受控制的量，以至最低点(最低值)的嗜中性白细胞组分不低于治疗前计数的10％。优选地，可接受的非骨髓毒性的223Ra量将是最低点处嗜中性白细胞组分至少为20％的量，且更优选至少30％。最优选最低点嗜中性白细胞组分至少40％。
此外，包含227Th的化合物可用于高剂量方案，其中所生成的223Ra的骨髓毒性通常是不可耐受的，此时包括干细胞支持或类似的康复方法。在此情况下，嗜中性白细胞计数在最低点可降至10％以下且异常地将降至5％或如果必要低于5％，假定采取合适的预防措施并随后得到干细胞支持。本领域已知这样的技术。
钍-227相对易于制备，可从被中子照射的226Ra间接制备，其将包含227Th的母体核素，即，226Ac(TI/2＝22年)。锕-227可以相当容易地从226Ra靶标分离并用作227Th的发生器。必要时，该过程可放大至工业规模，因此可避免供应的难题，该难题存在于大多数其它被视为分子靶向放射治疗候选物的α放射体中。
钍-227经由镭-223衰变。在这种情况下，该初级子体的半衰期为11.4天。从纯227Th源，在开始几天内只生成中等量的镭。但是223Ra的潜在毒性高于227Th，因为α粒子从223Ra发射后几分钟内从短寿命子体中又发射三个α粒子(参见下表2，其阐明了钍-227衰变系)表2
部分因为生成了有潜在害处的衰变产物，钍-227(TI/2＝18.7天)未被广泛地接受可用于α粒子疗法。
本发明人最早确定了钍-227可以以足以提供所需疗效的量给药，而不产生大量的镭-223以致引起无法耐受的骨髓抑制。
假定主要是钍-227而非其子体引起肿瘤细胞杀死作用，通过与其它α放射体相比可确立该同位素的可能治疗剂量。例如，对于砹-211，在动物中的治疗剂量通常为2-10MBq/每千克。通过校正半衰期和能量，钍-227相应的剂量至少为36-200kBq/每千克体重。这将设定227Th量的低限，给药该量将产生预期疗效。该算法假定砹和钍的相对保留时间。然而，显然钍的18.7天半衰期很可能导致该同位素在衰变之前多数已清除了。因此，该计算剂量通常被视为最低有效量。以术语完全保留的227Th(即，227Th不从体内清除)表达的治疗剂量通常至少为18或25kBq/kg，优选至少为36kBq/kg且更优选至少75kBq/kg，例如100kBq/kg或更高。较大量的钍预期具有更好疗效，但如果产生不可耐受的副作用则不能给药。同样地，如果钍以具有短的生物半衰期的形式(即，在从体内清除之前仍保有该钍的半衰期)给药，那么达到疗效需要较大量的放射同位素，因为大量的钍在其衰变之前将被清除。然而，所生成的镭-223的量将相应减少。当该同位素完全保留时，上述给药钍-227的量易于与具有较短生物半衰期的等价物剂量相关。下面的实施例1和2中给出了这样的算法。
例如，假定在靶点处的保留可忽略，可计算相当于具体的完全保留剂量的227Th的计算量。在这种情况下Dret=DaddTTh((TBio)-1+(TTh)-1)]]>其中Dadd是给药剂量；Dret是等价的，完全保留剂量；TTh是227Th的物理半衰期(18.7天)；且TBio是所给药的钍络合物的生物半衰期。
由此可方便地估算钍络合物的最低有效剂量。此外，生物半衰期不必使用钍络合物的放射活性形式就可以测定。
如果放射性标记化合物释放子体核素，可行的话，知晓这些放射性子体核素的最终结果是很重要的。对于227Th，主要的子体核素是223Ra，因为其亲骨性正处于临床评价中。镭-223快速地离开血液，并或者浓集于骨骼或者通过肠和肾途径排泄(参见Larsen，J Nucl Med 43(5，Supplement)160P(2002))。因此，于体内由227Th释放的镭-223可能对健康的软组织影响程度不大。在Müller于Int.J.Radiat.Biol.20233-243(1971)中对溶解的柠檬酸盐形式227Th分布的研究中，发现由227Th生成的223Ra易于重新分布于骨中或被排泄。已知的223Ra毒性，特别是对于骨髓，因此可能是在体内使用227Th时的限制性因素。
本发明人已确定227Th络合物(例如螯合络合物)在227Th衰变后释放223Ra(参见下面的实施例6)。这可能是由核反冲、或不相容的螯合或各因素的结合而引起的。这与本领域所接受的α放射体所需的性质(例如参见Feinendegen等1998，同上)相反，即作为一个重要的安全特性α放射体化合物应在母体螯合物中保留任何放射性子体核素。
根据本领域目前可得的数据，镭-223的最大耐受剂量预期在39至113kBq/kg范围内(参见下面的实施例7)。本领域公认必需采用现实且保守的子体同位素毒副作用估计(例如参见Finendagen(1998)，同上)，由此认为可接受镭-223最大为39kBq/kg。当使用任何高于此的剂量，可预期镭将导致患者死亡，这当然一定不能接受。
223Ra在体内的生成将随着227Th的停留时间而改变。当100％保留时，1kBq的227Th将生成大量的223Ra原子，相当于注射1.6kBq剂量的完全保留的223Ra。由此，39kBq/kg镭-223的最大耐受剂量相当于给药24.4kBq/kg完全保留的227Th。这显著低于最低预期的36kBq/kg治疗剂量，其也是基于完全保留作出的估计(参见如上讨论)。如果钍的保留降低，所给药的每单位钍将生成较少的镭，但钍的有效性将相应降低，因此其剂量必需升高。由此，根据本领域现有证据预期足以提供治疗效果的227Th最低量将高于预期引起致死骨髓毒性的量。因此，无法看出给药227Th存在治疗窗带。
重要的是，本发明人现已确定，事实上在人类患者中可给药并耐受至少200kBq/kg的223Ra剂量。这些数据示于下面的实施例8中。因此，现在可以完全出乎预料地看出，给药哺乳动物患者治疗有效量的227Th(比如高于36kBq/kg)确实存在治疗窗带，而不存在所预期的该患者将遭受不可接受的严重甚至致死骨髓毒性的危险。
227Th生成223Ra的量将取决于放射性标记化合物的生物半衰期。理想的情况将是使用快速肿瘤吸收的络合物，包括进入肿瘤细胞，强烈的肿瘤保留且在正常组织中生物半衰期短。但是，生物半衰期低于理想值的络合物也是有效的，只要223Ra的剂量维持在可耐受的水平。在体内生成的223Ra的量将是钍给药量以及钍络合物保留时间的因素。本领域普通技术人员可轻易地计算在任何特定情况中生成的镭-223的量，下面的实施例1和2中给出了例示性的计算。227Th的最大给药量将由体内生成的镭的量决定，且必需低于将产生无法耐受水平的副作用尤其是骨髓毒性的量。该量通常将低于300kBq/kg，特别是低于200kBq/kg且最优选低于170kBq/kg(例如低于130kBq/kg)。
因此，在本发明的方法中，钍络合物合意地以钍-227剂量为18至400kBq/kg体重给药，优选36至200kBq/kg，(比如50至200kBq/kg)，更优选75至170kBq/kg，特别是100至130kBq/kg。钍的剂量、络合剂以及给药路线合意地将使得在体内生成的镭-223的剂量低于300kBq/kg，更优选低于200kBq/kg，更加优选低于150kBq/kg，特别是低于100kBq/kg。上述剂量水平优选是227Th的完全保留剂量，但考虑到一些227Th将在衰变前从体内清除，也可以是给药剂量。
当227Th络合物的生物半衰期短(例如低于7天，特别是低于3天)时，可能需要非常大的给药剂量以提供等效保留剂量。因此，根据上文所述的公式，例如，150kBq/kg完全保留剂量相当于以711kBq/kg的剂量给药的半衰期为5天的络合物。通过使用该公式，可由该络合物的生物清除率计算任何上述保留剂量的等效给药剂量。
由于一个227Th核衰变提供一个223Ra原子，227Th的保留和治疗活性将与患者所忍受的223Ra剂量直接相关。
在简化的算法中，假定在靶组织内没有明显的保留，体内生成的223Ra可与227Th的给药量相关。那么227Th的最大耐受剂量可表达为1.65×DaddTTh((TBio)-1+(TTh)-1)<MaxRa]]>其中TBio是227Th络合物的生物半衰期；TTh是227Th的物理半衰期(18.7天)；Dadd是所给药的227Th络合物活性(kBq/kg)；且Max Ra是如本文所述的可接受的非-骨髓毒性量的223Ra(kBg/kg)；在一个优选实施方案中，本发明因此提供了治疗哺乳动物患者软组织疾病的方法，所述方法包括给药所述患者治疗有效量的钍-227和络合剂的靶向软组织络合物，其中所述量是由下式I计算的Dadd，以至在体内通过所给药的钍-227核衰变生成可接受的非-骨髓毒性量DRa的镭-223；Dadd=DRa×TTh((TBio)-1+(TTh)-1)1.65---(I)]]>其中TBio是所述钍-227和络合剂的靶向软组织络合物的生物半衰期；TTh是227Th的物理半衰期(18.7天)；Dadd是所给药的227Th络合物活性(kBq/kg)；且DRa是223Ra可接受的非-骨髓毒性量，例如75至200kBg/kg。
通过已知技术使用非放射活性钍或例如通过使用非常低水平的钍-227联合非-放射活性钍测量特征性γ放射可测量任一特殊钍-227和络合剂的软组织靶向络合物的生物半衰期。根据该公式，例如可看出，从生物半衰期为10天的钍-227和络合剂的软组织靶向络合物通过[100×18.7×(10-1+18.7-1)]/1.65＝173kBq/kg的给药剂量生成了100kBg/kg的非骨髓毒性剂量的223Ra。
除非可有利地应用其性质，显然需要使患者接触最小量的223Ra子体同位素。但是，为了允许给药足够的227Th，必需生成一定量的镭。该量将足以允许给药治疗有效量的227Th，并一般将高于考虑到预期的223Ra骨髓毒性先前所认为的最大可接受量(参见下面实施例7和8以及前面的讨论)。特别地，在体内生成的镭-223的量通常将高于40kBq/kg，例如高于60kBq/Kg。有时，体内生成的223Ra必需高于80kBq/kg，例如高于100或115kBq/kg。
在适当载体溶液中的钍-227标记的络合物可静脉内、腔内(例如腹腔内)、皮下、经口或局部给药，可一次施用或用于分次施用方案(fractionatedapplication regimen)中。
该络合物将优选以溶液通过胃肠外途径给药，特别是静脉内或腔内途径给药。优选地，本发明的组合物将配制成胃肠外给药的无菌溶液。
本发明方法和产物中的钍-227可单独使用或与其它治疗形式联合使用，所述治疗形式包括外科手术、外粒子束放射治疗、化疗、其它放射性核素、或者组织温度调节等等。这形成了本发明方法的进一步优选的实施方案。在一个特别优选的实施方案中，患者还接受了干细胞治疗从而减少镭-223诱导的骨髓毒性作用。
根据本发明，227Th可与靶向络合剂络合。典型地，其分子量为100g/mol至几百万g/mol，且优选对于疾病-相关受体和/或适宜的前-给药受体(例如生物素或抗生物素蛋白)具有亲和力，所述受体在给药227Th之前结合于靶向所述疾病的分子。适宜的靶向部分包括多肽和寡肽、蛋白、DNA和RNA片段、适体(aptamers)等，优选蛋白，例如抗生物素蛋白、strepatavidin、多克隆或单克隆抗体(包括IgG和IgM型抗体)或者蛋白或蛋白片段或构建物的混合物。特别优选抗体、抗体构建物(antibody constructs)、抗体片段(例如FAB片段)、片段构建物(例如单链抗体)或其混合物。
227Th与分子量通常低于10000g/mol的肽、氨基酸、甾类或非甾类激素、叶酸、雌激素、睾丸素、生物素或其它特异性结合化合物的治疗性缀合物也适用于本发明。
由此将理解为该软组织靶向络合剂是双功能剂一部分必需用于络合钍离子，优选形成螯合络合物，即该络合物中钍是多重络合；另一部分必需用作使该络合物靶向所治疗的软组织的媒介物。该络合部分可由一个或多个存在于靶向部分上的官能团或可通过化学处理引入靶向部分上的官能团组成。但通常该络合部分直接或间接(例如通过连接部分)缀合于靶向部分。靶向放射药物和靶向显像试剂领域公知这样的活性(例如治疗或诊断活性)金属-络合部分-任选的连接部分-靶向部分，其可以以类似的方式选择并构建钍。关于此点可参考例如″Handbook of Targeted Delivery of Imaging Agents″，Ed.Torchilin，CRC Press，1995。
本发明中的钍-227将优选通过使用双功能螯合剂与靶向分子缀合。螯合剂可以是环状、直链或支链的。可特别参考聚氨聚酸螯合剂，其包含直链、环状或支链的聚氮杂烷基(polyazaalkane)骨架，含有连接于骨架氮的酸性(例如羧烷基)基团。适宜的螯合剂例子包括DOTA衍生物比如对-异硫氰酸基苄基-1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸(p-SCN-Bz-DOTA)以及DTPA衍生物比如对-异硫氰酸基苄基-二亚乙基三胺五乙酸(pSCN-Bz-DTPA)，第一个是环状螯合剂，后一个是线状螯合剂。
对于本发明的钍而言，1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸衍生物是特别优选的螯合剂，但不知它们配位于四价金属比如钍的能力。本发明人意想不到地发现尽管无法轻易地使用标准方法螯合钍与DOTA衍生物，DOTA衍生物与金属一起加热提供了有效地螯合，如下面实施例所显示的。在另一方面，本发明因此提供了形成本发明或适用于本发明方法的络合物的方法，包括一起加热钍-227和1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸衍生物形成螯合的钍-227，随后将该螯合的钍-227连接于靶向部分。可使用任何适宜的靶向部分，比如本文所述部分(如下)。
可在络合部分缀合于靶向部分之前或之后进行络合部分的金属化。使用上述加热方法，但是，优选在连接靶向部分之前配位金属。
螯合剂优选为非膦酸酯分子，在本发明中227Th优选不与任何膦酸酯或其它骨-靶向基团相连。
通过螯合剂可连接于钍-227的靶向化合物的类型包括单克隆或多克隆抗体、生长因子、肽、激素以及激素类似物、叶酸和叶酸衍生物、生物素(botin)、抗生物素蛋白和抗生蛋白链菌素或其类似物。其它可能的载体是RNA、DNA或其片段、寡核苷酸、碳水化合物、脂质或通过将这样基团与蛋白或不与蛋白结合的化合物等。
钍-227缀合于具有生物亲和性的靶向部分，优选排除亲骨剂、脂质体和叶酸缀合的抗体或抗体片段，从而为了治疗目的照射软组织。
本发明的钍-227标记分子可用于通过靶向疾病-相关受体而治疗癌性或非癌性疾病。典型地，227Th的这样的医疗应用将通过放射免疫疗法用于治疗癌性或非癌性疾病，基于通过螯合剂将227Th连接于抗体、抗体片断或者抗体或抗体片断构建物。227Th在根据本发明的方法和药物中的应用特别适于治疗任何形式的癌症以及风湿病(rheumatological disease)，尤其是皮肤癌、前列腺癌、宫颈癌或乳腺癌或炎性疾病比如关节炎或纤维组织炎。
本文所示的在体外使用钍标记单克隆抗体的试验证明了钍-227可通过双功能螯合剂连接于载体分子。其也证明了这样的227Th免疫缀合物对于CD20抗原表达的人淋巴细胞系DAUDI显示了特异的结合性质并证明了每个细胞可结合适当数目的227Th原子。因此，第一次说明使用227Th标记分子靶向受体是可行的。
应用钍-227的一个有意义的特征是由于子体核素向内生长(ingrowth)辐射强度将随着时间而增加，即，在吸收期和清除期释放于正常器官的剂量可保持低水平。这由附图的图1举例说明。如果在肿瘤中的保留时间高，剂量率将随时间增加，由于子体核素向内生长，取决于子体核素的肿瘤保留时间。由于反冲能的困难，子体若要在靶点处有效保留，通常需要非常特殊的释放方法，比如在脂质体中或使得放射性核素渗入矿化骨骼中。
如果负载227Th的分子在体内生物保留半衰期短，那么释放的223Ra量可减少，因为在高比例的227Th衰变成223Ra之前该放射性核素的大部分将被排除。但是根据本发明，需要增加227Th的量从而保持治疗效果。在体内优选的生物半衰期低于7天，优选低于4天且特别优选低于2天。如果选择络合剂以致将227Th释放入靶向细胞内，这将进一步增加特异的细胞毒性并降低放射活性子体的全身毒性，因为子体同位素至少部分保留于肿瘤位点。所有这些特征拓宽了227Th的治疗窗带并由此构成了本发明的优选实施方案。
在本发明另一个实施方案中，同时患软组织和骨骼疾病的患者可通过给药钍而经受227Th和在体内生成的223Ra的治疗。在这一特别有利的方面，额外的治疗性组分来源于靶向骨骼疾病的可接受非骨髓毒性量的223Ra。在该治疗方法中，227Th通常通过其适当的靶向用于治疗原发和/或转移的软组织癌症，由227Th衰变所生成的223Ra用于治疗同一患者的骨骼疾病。该骨骼疾病可能是由原发的软组织癌症向骨骼的转移，或可能是原发疾病而对软组织的治疗则是对抗转移的癌症。
有时，软组织和骨骼疾病可能不相关(例如，附加治疗风湿性软组织疾病患者的骨骼疾病)本文提到的文献作为参考引用。
现将通过下面非限制性实施例举例说明本发明。
实施例背景假定一般地，患者的肿瘤组织重量与体重相比是低的，即使在肿瘤内的钍络合物具有有效的浓度和保留时间，通常1％或更低的钍将到达人体内的肿瘤组织。因此可基于钍络合物的全身清除率估计软组织接触。因此在实施例1和2中忽略了肿瘤靶向效果，其显示了相对于所给药的227Th量生物半衰期对体内生成的223Ra量的影响。
材料乙酸铵(AmAc)，L-抗坏血酸(AscA)，二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)，乙二胺四乙酸(EDTA)，碳酸钠(Na2CO3)，碳酸氢钠(NaHCO3)，乙酸四甲基铵(TMAA，90％纯度)得自Aldrich(Milwaukee，WI，USA)，除非另有说明，纯度超过99％。2-(对-异硫氰酸基苄基)-1，4，7，10-四氮杂环十二烷(NCS-DOTA)得自Macrocyclics，Dallas，TX，USA。牛血清白蛋白(BSA)和albumine牛组分V得自Sigma，St.Louis，MO，USA。磷酸盐缓冲盐水(PBS)，胎牛血清(FBS)和含有glutamax的RPMI 1640培养基得自Gibco，Paisley，Scotland，UK。所提供的RPMI 1640培养基中含有15％FBS，青霉素和链霉素。阴离子交换材料得自Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA，USA。Mabthera(rituximab)得自F.Hoffmann-La Roche AG，Basel，Switzerland。所用细胞系是购自EuropeanCollection of Cell Cultures(ECACC)，Salisbury，UK的CD20阳性淋巴癌DAUDI。
实施例1.给药全身保留半衰期为12小时的钍标记化合物后计算体内生成的223Ra。
227Th的有效半衰期(假定保留在肿瘤中的227Th部分可以忽略)为1/T1/2有效＝1/T1/2物理+1/T1/2生物→T1/2有效＝0.487天。在体内衰变的227Th部分等于T1/2有效/T1/2物理＝0.0262，其相应于每注射100kBq的227Th生成6.1×109个223Ra原子。每100kBq(起始的)227Th的子体核素的毒性成分大概相当于4.3kBq的223Ra的钍-223剂量。0.0262的所给药的钍衰变相当于每给药100kBq的227Th完全保留的2.6kBq。
实施例2.给药全身保留半衰期为4天的钍标记化合物后估算体内生成的223Ra。
如实施例1中计算，T1/2有效＝3.3天机体清除。这相当于0.176的Th原子部分在体内衰变。这相应于每100kBq的227Th生成4.1×1010个223Ra原子。每注射100kBq227Th的子体核素的毒性成分应大概相当于29kBq的223Ra注射剂量。具有这一生物半衰期时，给药100kBq的227Th相当于完全保留了17.6kBq。
实施例3227Th的制备从子体生长两周的227Ac混合物中选择性分离钍-227，向该Ac混合物(其已被蒸发至干)中加入0.25ml 7M的HNO3，并通过阴离子交换柱稀释溶液。该柱内径为2mm长度30mm，包含大约70mg AG-1X 8阴离子交换树脂(Biorad Laboratories，Hercules，CA，USA)(硝酸盐形式)。该柱经2-4ml 7M的HNO3洗涤以除去227Ac、223Ra和Ra子体而保留227Th。随后使用几毫升12MHCl从柱中反萃取(strip)227Th。最后，蒸发HCl至干并将227Th重新溶解于0.2M HCl中。
实施例4.钍-227标记的双功能螯合剂NCS-DOTA除非另有说明，所用化学品来自Aldrich(Milwaukee，WI，USA)且纯度为99％或更高。在半克小瓶中，向100μl227Th的0.2M HCl溶液中加入含有25μlp-SCN-苄基-DOTA(10mg/ml)(Macrocyclics Inc，Dallas，TX，USA)、20μl L-抗坏血酸(150mg/ml)和50μl乙酸四甲基铵(300mg/ml)(90％纯度)，pH约为5.5。该反应混合物在振荡器/恒温箱(Thermomixer Comfort，Eppendorf AG，Hamburg，Germany)中于55℃反应1小时。(这通常将导致定量洗脱227Th，通过0.5ml Sephadex C-25柱，用2.5ml 0.9％NaCI溶液，同时223Ra(未络合)几乎定量保留在柱上。还在含有227Th的对照试验中证明了，在不含螯合剂的“反应”溶液中，227Th和223Ra均有＞90％保留在柱上。)。未纯化的227Th-p-SCN-苄基-DOTA反应产物用于标记rituximab。
实施例5227Th放射免疫缀合物(RIC)的制备经过两步方法进行标记，第一步为227Th和螯合剂结合(如实施例4所述)。第二步为将放射活性螯合剂偶联于抗体。将该反应溶液(实施例4)加入到200μl rituximab(10mg/ml，MabtheraF.Hoffmann-La Roche AG，Basel，Switzerland)中，并通过加入约100μl 1M的Na2CO3/NaHCO3将该反应溶液调整到pH～9。反应溶液在振荡器(Thermomixer Comfort，Eppendorf AG，Hamburg，Germany)上于35℃轻微混合1h。此后，加入饱和硼酸盐(十水四硼酸钠，来自Fluka)溶液中的50μl 10mM的二亚乙基三胺五乙酸(DTPA，Fluka Chemie AG Buchs，Neu-Ulm，Germany)和200μl 0.2M氨基乙酸并继续温育5分钟。此后，将该反应混合物转移至Sephadex G-25PD 10柱中并使用含1％BSA(Gibco，Paisley，Scotland，UK)的PBS(Albumin，Bovine Fraction V，Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO，USA)溶液洗脱。以每份～0.6ml收集洗脱液，于剂量定标器(dose calibrator)(CRC-127R，Capintec，Ramsey，NJ，USA)上计数，并在进一步使用各级分之前，使用γ波谱(GEM15-P detector andGammavision 5.20soft-ware，both from EG & G Ortec，Oak Ridge，TN USA)分析相当于蛋白洗脱液级分以确定227Thγ波谱与223Raγ波谱。可分别使用如下的γ峰227Th236.0keV(11.6％丰度)，256.3keV(7.4％)，329.9keV(2.8％)。223Ra154.2keV(6.0％)，269.4keV(13.6％)，323.9keV(3.7％)。使用相当于约50％的蛋白洗脱液(经PD-10柱洗脱125I-标记的rituximab而证实)的级分6和7，因为它们基本上不含223Ra。级分8和9包含较大量的223Ra，表明在这些级分中蛋白和较小分子之间有显著重叠(当在PD-10柱上重新纯化，这两个级分从新的洗脱液中得到的227Th约为6和7级分的50％，证明存在227Th-rituximab)。基于在Ge-检测器上测量PD-10洗脱级分，计算总标记收率约为12％。还显示了于8℃存储了5天的旧制剂，可在PD-10柱上容易地纯化227Th-抗体缀合物从而除去227Th衰变所形成的223Ra。由此表明227Th可通过双功能螯合剂连接于靶向分子并纯化分离掉子体产物。存储时，所生成的子体产物223Ra从螯合剂释放并通过使用凝胶过滤/大小排阻纯化，可再生纯227Th-抗体缀合物。
实施例6227Th标记抗体与DAUDI人淋巴瘤细胞结合DAUDI细胞购自European Collecion of Cell Cultures(ECACC)，Salisbury，UK，根据供应商的说明使用培养基和Gibco的添加剂(Paisley，Scotland，UK)并使用500ml培养瓶(Cell Star，Greiner Bio-One GmbH，Firickenhausen，Germany)使其生长。DAUDI细胞(每0.7ml PBS中2×107个细胞)用于在体外研究227Th标记的rituximab。作为非特异性结合的对照，使用经40μg未标记的rituximab预饱和(封闭)15分钟的DAUDI细胞。向测定管(聚苯乙烯培养测试管，12×75mm，Elkay，Shrewsbury，MA，USA)中分别加入相当于1.3，5.3或26μg/ml的227Th标记的rituximab。使用未封闭和封闭的细胞在各浓度水平重复进行试验。于8℃温育2小时。温育后，计算细胞悬浮液的放射活性(Crystal II Multidetector，Packard Instrument Company Inc.Downers Grove，IL，USA)，并使用2ml 1％BSA(Albumin，Bovine Fraction V，Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO，USA)的PBS(Gibco，Paisley，Scotland，UK)溶液洗涤细胞并于200rpm离心(Centrifuge 5810R，Eppendorf AG，Hamburg，Germany)5分钟。重复洗涤/离心两次。此后，计数细胞沉淀的放射活性。结果(重复试验的各均值)示于下表3中。
表3
结果显示227Th标记的rituximab特异性结合于DAUDI细胞。平均地，RIC对于未封闭细胞的结合是封闭细胞的约12倍。此外，每个细胞结合若干治疗相关的227Th原子。
由此，使用适用于连接抗体、肽和维生素等的双功能螯合剂，可制备227Th标记的RIC，其具有特异性结合若干治疗相关的227Th原子于肿瘤细胞的能力。
实施例7根据现有文献计算223Ra毒性由于缺乏镭-223和镭-224的人体毒性数据，使用镭-224在狗体内的公开数据，如下得到223Ra的计算放射毒性。224Ra和223Ra的衰变系(包括子体核素的衰变)均导致每个镭原子放射四个α粒子。与子体相平衡的223Ra和224Ra每次转化的总α粒子剂量分别约为26.3和27.1MeV，因此，是很相当的。224Ra的半衰期为3.62天，223Ra为11.43天。这意味着，考虑到α粒子能量和半衰期的差异，并假定放射性核素长期生物保留(即，由放射性核素的物理半衰期控制清除)，每注射一个活性单位，223Ra的骨剂量约为224Ra的3.1倍。这是有效的假定，因为Ra是Ca类似物且易于渗入骨骼。
使用224Ra或223Ra治疗后受到强烈影响的血细胞类型可认为是嗜中性白细胞。公开的在成年狗中进行的224Ra生物效果研究数据(参见Muggenburg，Radiat Res146171-186，(1996))显示单次静脉内注射给药350kBq/每千克体重(kBq/kg)，嗜中性白细胞数目大幅降低至120甚至更低，如下表4所示。
表4
350kBq/kg时，在一些患者中发生由骨髓破坏引起的血恶液质导致的死亡(8只狗中的三只)。由此假定在狗中224Ra最大耐受剂量在120至350kBq/kg之间。换成223Ra，如上所述，相应地为39-113kBq/kg的223Ra。假定狗和人具有相似的血液毒性，预期人体内达到最大耐受剂量为39至113kBq/kg范围内的223Ra。一般地，在两个不同物种间比较数据时必须谨慎。但是，狗和人在辐射引发的骨髓毒性方面非常相似(参见Hall，″Radiobiology for theradiologist，″Lippincott Williams & Wilkins，Philadelphia，PA，USA，2000)，由此将预期这一算法将有效地计算223Ra在人体内的最大耐受剂量。
实施例8223Ra在人体内的实验室研究在乳腺癌或前列腺癌患者的I期研究中，作为单一剂量给药37，74，130，170和200kBq/kg剂量水平的223Ra。监测嗜中性白细胞部分作为血液毒性的敏感指标。结果示于下表5中。
表5
由此令人惊奇地发现在人体内可耐受高剂量水平，并显示可释放较先前预计明显更高的放射剂量223Ra于骨表面而不引起不良的血液学毒性。
实施例9223Ra在人体内的进一步实验室研究经剂量测量校准至高精确度进行了实施例8的试验。于46，93，163，213和250kBq/kg的223Ra测量剂量水平作为单一剂量给药，还引入了多剂量方案。
患者和研究标准三十一位骨转移患者，其中10位由乳腺癌转移21位由前列腺癌转移，均编入IA期和IB期试验。前列腺癌患者为60至85岁，体重在50至120kg范围内。他们的疾病均发展成激素难治型(hormone refractory)。乳腺癌患者为40至70岁，体重为50至95kg。她们均发展为第二激素治疗和/或化疗。主要目标是评价223Ra的安全性和耐受性。
随访随访期8周。
剂量水平和治疗方案在单一注射试验中使用如下平均剂量水平46，93，163，213和250-kBqkg-1体重(b.w.)。每一剂量水平包括五位患者。包括15位前列腺癌患者和10位乳腺癌患者。
在重复注射方案中，包括6位前列腺癌患者。
三位患者预定接受5次给药，在三周间隔各给药50kBq kg-1b.w.，三位患者接受2次给药，在六周间隔各给药125kBq kg-1b.w.
血液清除在注射后不同时间点抽取大约1ml血液并用于放射活性测量以确定单次注射方案中包括的25位患者的血液清除曲线。测定各血液样品重量并计算每ml血液的计数率(假定1ml血液等于1g)。在NaI井型计数器中测量放射活性。假定血液中起始活性为100％且总血液重量为体重的7％，计算注射后即刻的活性水平。该数据代表生物数据，即，在注射时间和测量时间之间调整放射活性衰变。
放射性核素的生成由227Ac/227Th生成镭-223并使用Ac-树脂固定227Ac和227Th进行纯化，如W00040275中所述。在进一步使用前通过γ波谱测定产品浓缩物，即溶解的223RaCl2的放射性核素纯度。经无菌处理得到223Ra在NaCI和柠檬酸钠中的浓缩物。调节等渗性、pH和活性浓度，保持样品以进行病原和热原试验，并将终产物装入无菌小瓶中，随后使用可刺入注射器的密闭橡胶膜封口。将该小瓶置于铅容器中并运送至医院。
副作用在该研究剂量逐步升高部分中没有观察到剂量-限制性毒性。
发生可逆转的骨髓抑制，注射后2-3周出现最低点并在随访期间恢复。25位患者中有两位出现最大为3级的嗜中性白细胞减少。即使在两个最高的剂量水平，血小板仅显示了1级毒性。一般地，增加剂量水平具有较高的骨髓抑制趋势，但该作用不明显。很少观察到副作用，在最高剂量水平，五位患者中四位发生恶心，其是最常见的副作用。在所有剂量组中观察到可逆转的1级和2级腹泻，对药物反应良好，总共大约50％的患者出现腹泻。在最高剂量组中五位患者有四位出现呕吐。在其它剂量组中没有观察到呕吐。
重复注射方案50×5方案中的三位患者没有经受任何与重复治疗相关的其它毒性。由于分次给药，血液学曲线较剂量为五次给药之和的单次给药平滑。
与223Ra不相关的副作用在重复给药方案中，在125×2方案中只有一位患者实际上给药第二剂量。两位没有接受后续剂量的患者中，一位由于发展为肝转移而死亡，另一位因为先前的心脏病复发而被认为不适于进一步治疗。
骨髓毒性监测镭-223对嗜中性白细胞组分、血小板、白细胞计数和血红蛋白的作用从而对血液学毒性进行广泛测量。对于嗜中性白细胞和白细胞的作用最为明显，表明这些细胞是骨髓毒性的敏感标记物。结果表示为，在研究中表现出CTC毒性等级中特殊毒性水平的患者数目并列于下表6中。
表权利要求
1.一种治疗哺乳动物患者软组织疾病的方法，所述方法包括给药所述患者治疗有效量的钍-227和络合剂的靶向软组织络合物，其中所述量使得在体内由所给药的钍-227核衰变生成可接受的非骨髓毒性量的镭-223。
2.权利要求1的方法，其中所述患者是人或犬。
3.权利要求1或2的方法，其中所述治疗有效量为至少18kBq钍-227/每千克体重。
4.权利要求1至3任一项的方法，其中所述治疗有效量为至少75kBq钍-227/每千克体重。
5.权利要求1至4任一项的方法，其中所述可接受的非骨髓毒性量低于300kBq镭-223/每千克体重。
6.权利要求5的方法，其中所述可接受的非骨髓毒性量低于150kBq镭-223/每千克体重。
7.权利要求1至6任一项的方法，其中所述络合物包含连接于配体的螯合钍-227，所述配体选自抗体、抗体构建物、抗体片段、抗体片段构建物及其混合物。
8.权利要求1至7任一项的方法，其中所述软组织疾病是恶性疾病。
9.权利要求8的方法，其中所述恶性疾病是选自癌、肉瘤、骨髓瘤、白血病、淋巴瘤和混合型癌的疾病。
10.权利要求1至9任一项的方法，其中所述患者还接受对抗其中所生成的镭-223的骨髓毒性的治疗。
11.权利要求10的方法，其中为所述患者提供干细胞治疗。
12.一种治疗哺乳动物患者软组织疾病的方法，所述方法包括给药所述患者治疗有效量的钍-227和络合剂的靶向软组织络合物，其中所述量是由下式I计算的Dadd，以致在体内由所给药的钍-227核衰变生成可接受的非骨髓毒性量DRa的镭-223；Dadd=DRa×TTh((TBio)-1+(TTh)-1)1.65---(I)]]>其中TBio是所述钍-227和络合剂的靶向软组织络合物的生物半衰期；TTh是227Th的物理半衰期(18.7天)；Dadd是给药的227Th络合物的活性(kBq/kg)；且DRa是223Ra可接受的非骨髓毒性量。
13.权利要求12的方法，其中DRa是200kBq/kg。
14.权利要求1至13任一项的方法与至少一种其它治疗方式联合，其它治疗方式选自外科手术、外粒子束放射治疗、化疗、用除227Th以外的放射性核素的内放射性核素治疗、和/或组织温度调节。
15.一种药物组合物，包括钍-227和络合剂的靶向软组织络合物，与至少一种药物载体或赋形剂。
16.一种钍-227和络合剂的靶向软组织络合物。
17.权利要求16的络合物，其中钍-227被1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸螯合。
18.一种制备权利要求17的络合物的方法，包括一起加热所述钍-227和所述1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸从而形成螯合的钍-227并随后将所述螯合的钍-227连接于靶向部分。
19.一种用于权利要求1至14任一项的方法中的试剂盒，所述试剂盒包括钍-227和络合剂的靶向软组织络合物的溶液以及将所述溶液用于所述方法的说明书。
20.一种用于权利要求1至14任一项的方法中的试剂盒，所述试剂盒包括可络合钍离子的络合剂；其中所述络合剂不是靶向软组织的络合剂，一种靶向软组织的化合物，任选一种连接化合物，可与所述络合剂缀合从而得到靶向软组织络合物；以及制备钍-227和络合剂的靶向软组织络合物，和任选所述络合物在所述方法中应用的说明书。
全文摘要
本发明提供了一种治疗哺乳动物患者(优选人或犬患者)软组织疾病的方法，所述方法包括给药所述患者治疗有效量的钍－227和络合剂的靶向软组织络合物，其中所述量使得在体内由所给药的钍－227核衰变生成可接受的非骨髓毒性量的镭－223。
文档编号A61P35/00GK1805760SQ200480016329
公开日2006年7月19日 申请日期2004年4月15日 优先权日2003年4月15日
发明者罗伊·拉森, 奥伊文德·布鲁兰德 申请人:艾尔格塔公司