专利名称：腺病毒的聚合物包裹的制作方法
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相关申请的交叉参考本申请要求2003-6-30提交的美国序列号为60/484,060的申请的权利，该申请被纳入本文作为参考。
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由于重组腺病毒能够将基因输送到许多正在增殖或非增殖的细胞而被广泛用作基因治疗的载体。然而，全身输送腺病毒会遇到一些障碍，如血液半衰期短(Morrissey等，Toxicol Sci.65266-275(2002)；Alemany等，J Gen Virol.812605-2609(2000))、被网状内皮系统(RES)排除(Ziegler等，Hum Gene Ther.13935-945(2002)；Tao等，Mol Ther.328-35(2001))、引发先天性免疫反应(Zhang等，Mol Ther.3697-707(2001)；Schnell等，Mol Ther.3708-722(2001))、被已经存在的抗体中和(Rahman等，Mol Ther.3768-778(2001))以及腺病毒亚型向某些组织和细胞类型天然取向(Bergelson，Biochem Pharmacol.57975-979(1999))。此外，由于腺病毒可引发强烈的体液免疫反应，反复用药是困难的(Rahman等，Mol Ther.3768-778(2001))。
为克服这些问题，有些人曾经采用使亲水性共聚物如PEG(O′Riordan等，HumGene Ther.101349-1358(1999)；Croyle等，Hum Gene Ther.111713-1722(2000))或pHPMA(Fisher等，Gene Ther.8341-348(2001))与腺病毒衣壳共价结合，通过遗传重新构建纤维而改变病毒表面(Hidaka等，J Clin Invest.103579-587(1999))，或将rAd包裹入脂质体(Yotnda等，Mol Ther.5233-241(2002))。用亲水性聚合物(例如PEG)策略性修饰腺病毒表面是基于已经完善的发现，即用PEG共价修饰蛋白质和酶可增强它们的治疗功效，同时提高循环半衰期、降低免疫原性、提高溶解度和合适的体内生物活性(Harris等，Clin Pharmacokinet.40539-551(2001)；Wang等，AdvDrug Deliv Rev.54547-570(2002))。
腺病毒与包裹聚合物共价结合需要额外的纯化步骤，这将降低化学产率。此外，当腺病毒与PEG共价结合时其感染性通常会降低(O′Riordan等，Hum Gene Ther.101349-1358(1999)；Croyle等，Hum Gene Ther.111713-1722(2000))。本发明涉及该问题以及其它问题。
发明概述本发明提供了共聚物和腺病毒的非共价复合物。所述共聚物是阳离子聚合物(如PEI、聚赖氨酸、DEAE-葡聚糖及其衍生物)与非离子聚合物(如PEG及其衍生物)的组合，它可改善腺病毒在细胞内的输送和转基因表达。本发明的复合物提供了一种易于制造的物质，这种物质在治疗上比未包裹的腺病毒更有效。
在第一个方面，本发明提供了包含与共聚物非共价复合的腺病毒的复合物。所述共聚物包含式I所示结构 其中，m是1-1000的整数。符号i是2-m的整数并表示Xi的位置。符号X1、Xi和Xm+1是独立选择的单体，其中，(i)所述单体包含选自仲胺和叔胺的胺；和(ii)至少一个所述单体包含Q。Q为选自式IIa和式IIb的结构 其中，Z选自O和NH。符号h是0-1的整数。符号R1包含聚亚烷基二醇部分。本发明的共聚物还不含交叉聚合，且在生理pH下，所述共聚物中至少一个氮原子带有正电荷。
在第二个方面，式I的共聚物用于制造非共价复合的腺病毒共聚物复合物的方法。
在第三个方面，式I的共聚物用于将腺病毒引入细胞的方法。在该方法中，(a)使腺病毒非共价接触共聚物，和(b)使复合物接触细胞。
在第四个方面，本发明提供了一种生理制剂，其中包含(a)式I的共聚物；(b)腺病毒，形成腺病毒的非共价复合物；和(c)生理上可接受的赋形剂。
在第五个方面，本发明提供了含有式I的共聚物和腺病毒的试剂盒，其中，共聚物和腺病毒是非共价连接的。
通过下面的详细描述将显示本发明的其它方面和实施方案。
定义除非另有说明，本文所用的所有技术和科学术语一般具有与本发明所属技术领域的一般技术人员的常规理解相同的含义。通常，本文采用的命名法以及下文所述的细胞培养、分子遗传、有机合成、分析化学以及核酸化学和杂交的实验室过程是熟知的并经常用于该领域。所述技术和过程通常按照本领域的常规方法和各种常规参考资料(通常可参见Knipe等FIELDS VIROLOGY，第三版(2001)Lippincott，Williams，和Wilkins，Philadelphia，PA，它们被纳入本文作为参考)进行，这些参考资料在本文全文中提供。采用标准技术或其改进技术来进行化学合成和化学分子。
“核酸”是指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸以及它们的单链或双链形式的聚合物。该术语包括术语基因、cDNA、mRNA、寡核苷酸和多核苷酸。该术语还包括具有经过修饰的主链残基或键的合成的、天然产生的和非天然产生的核苷类似物。这些核苷类似物与所提及的核酸具有类似的结合特性，或者以与所提及的核苷类似的方式代谢。这种类似物的例子包括但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、膦酸甲酯、手性膦酸甲酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽核酸(PNA)。
除非另有说明，特定的核酸序列还隐含地包括其保守性修饰的变体(例如简并密码子取代)和互补序列，以及明确提到的序列。具体地说，简并密码子取代可通过产生下述序列而获得，该序列中一种或多个所选(或所有)密码子的第三个位置被混合的碱基和/或脱氧肌苷残基取代(Batzer等，核酸Res.195081(1991)；Ohtsuka等，J.Biol.Chem.2602605-2608(1985)；Rossolini等，Mol.Cell.Probes 891-98(1994))。
术语“接触细胞”是指使腺病毒或本发明的复合物进入细胞内部。该术语包括，例如，静脉内或口服施用病毒或复合物而使其进入细胞内部。
术语“腺病毒”通常包括含有全部或部分腺病毒基因组的多核苷酸。“腺病毒”是指乳腺腺病毒属，包括但不限于人、牛、绵羊、马、犬、猪、鼠和猿腺病毒亚属的动物腺病毒。具体地说，人腺病毒包括A-F亚属以及其各自的血清型，各自的血清型和A-F亚属包括但不限于1、2、3、4、4a、5、6、7、8、9、10、11(Ad11A和Ad11P)、12、13、14、15、16、17、18、19、19a、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、34a、35、35p、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48和91型人腺病毒。在本发明中有用的牛腺病毒包括但不限于1、2、3、4、7和10型牛腺病毒。犬腺病毒包括但不限于犬1型(CLL、Glaxo、RI261、Utrect、Toronto 26-61株)和2型。感兴趣的马腺病毒包括但不限于马1和2型，感兴趣的猪腺病毒包括，例如，猪3和4型。“腺病毒”也包括重组腺病毒，如通过核酸缺失、插入或突变制造的那些。重组腺病毒也可通过DNA连接从不同的血清型或亚属制造。
术语“非共价”是这里是指物质通过离子键、静电相互作用、氢键、亲水-亲水相互作用、疏水-疏水相互作用、范德华力以及它们的组合相互连接。
术语“聚合物”是这里是指通常为高分子量的由多达数百万重复连接单体构成的天然和合成的化合物。每个单体是相对较轻且简单的分子。
术语“均聚物”是这里是指衍生自一种类型单体的聚合物。
术语“共聚物”是这里是指通过两种或多种不同单体之间同时聚合制得的一种聚合物。
术语“交叉聚合”是这里是指两个或多个聚亚烷基亚胺部分与聚亚烷基二醇分子的相反末端共价连接。
文中，取代基以其常规化学式从左到右书写，但它们同样包括化学上相同的从右到左书写其结构的取代基，例如-CH2O-等价于-OCH2-。
除非另有说明，术语“烷基”本身或作为其它取代基的一部分表示直链或支链或环状烃基，或其组合，它们可以是完全饱和的、单不饱和或多不饱和的，并且可包括二价和多价基团，含有指定数目的碳原子(即，C1-C10表示1-10个碳)。饱和烃基的例子包括但不限于例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、环己基、(环己基)甲基、环丙基甲基等基团，例如正戊基、正己基、正庚基、正辛基等的同系物和同分异构体。不饱和的烷基是含有一个或多个双键或三键的烷基。不饱和烷基的例子包括但不限于乙烯基、2-丙烯基、丁烯基、2-异戊烯、2-(丁二烯基)、2，4-戊二烯基、3-(1，4-戊二烯基)、乙炔基、1-和3-丙炔基、3-丁炔基，以及高级同系物和同分异构体。除非另有说明，术语“烷基”还包括下面详细定义烷基的衍生物，如“杂烷基”。仅限于烃基的烷基被称为“同烷基(homoalkyl)”。
术语“亚烷基”本身或作为其它取代基的一部分是指衍生自烷烃的二价基团，例如但不限于-CH2CH2CH2CH2-，并且还包括那些下面被称为“杂亚烷基”的基团。通常，烷基(或亚烷基)将含有1-24个碳原子，含有10个或更少碳原子的那些基团是本发明优选的。“低级烷基”或“低级亚烷基”是较短链的烷基或亚烷基，通常含有8个或更少碳原子。
术语“烷氧基”、“烷基氨基”和“烷基硫代”(或硫代烷氧基)在这里以其常规含义使用，分别表示那些通过氧原子、氨基或硫原子连接到分子剩余部分的那些烷基。
除非另有说明，术语“杂烷基”自身或与其它术语结合表示稳定的直链或支链或环状烃基，或其组合，它由标示数量的碳原子和至少一个选自O、N、Si和S的杂原子构成，且其中的氮原子和硫原子可任选被氧化，同时氮杂原子可任选被季铵化。杂原子O、N和S以及Si可位于杂烷基的任何内部位置或位于烷基与分子剩余部分连接的位置。其例子包括但不限于-CH2-CH2-O-CH3、-CH2-CH2-NH-CH3、-CH2-CH2-N(CH3)-CH3、-CH2-S-CH2-CH3、-CH2-CH2，-S(O)-CH3、-CH2-CH2-S(O)2-CH3、-CH＝CH-O-CH3、-Si(CH3)3、-CH2-CH＝N-OCH3和-CH＝CH-N(CH3)-CH3。至多两个杂原子可以是连续的，例如-CH2-NH-OCH3和-CH2-O-Si(CH3)3。类似地，术语“杂亚烷基”本身或作为其它取代基的一部分表示衍生自杂烷基的二价基团，其例子有但不限于-CH2-CH2-S-CH2-CH2-和-CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-。就杂亚烷基而言，杂原子可占据一个或两个链末端(例如亚烷基氧基、亚烷基二氧基、亚烷基氨基、亚烷基二氨基等)。再者，对于亚烷基和杂亚烷基连接基团，对于连接基团的书写方向没有要求。例如，式-C(O)2R’-表示-C(O)2R’-和-R’C(O)2-。
除非另有说明，术语“环烷基”和“杂环烷基”自身或与其它术语组合分别表示“烷基”和“杂烷基”的环状形式。因此，环烷基或杂环烷基包括饱和与不饱和的环连接。此外，对于杂环烷基，杂原子可占据杂环与分子剩余部分连接的位置。环烷基的例子包括但不限于环戊基、环己基、1-环己烯基、3-环己烯基、环庚基等。杂环烷基的例子包括但不限于1-(1，2，5，6-四氢吡啶基)、1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-吗啉基、3-吗啉基、四氢呋喃-2-基、四氢呋喃-3-基、四氢噻吩-2-基、四氢噻吩-3-基、1-哌嗪基、2-哌嗪基等。
术语“聚亚烷基二醇”在这里是指聚乙二醇、聚丙二醇、聚丁二醇及其衍生物。合适的聚亚烷基二醇衍生物的例子是己二酸二酰肼-甲氧基-聚乙二醇。其它例子列于Shearwater公司的目录《用于生物医学的聚乙二醇和衍生物》(Polyethylene Glycol andDerivatives for Biomedical Applications)(2001)。
除非另有说明，术语“芳基”是指多不饱和的芳烃取代基，它可以是单环或多环(优选含有1-3个环)，多个环稠合在一起或共价连接。术语“杂芳基”是指含有1-4个选自N、O和S的杂原子的芳基(或环)，其中，氮和硫原子可任选被氧化，且氮原子可任选被季铵化。杂芳基可通过杂原子连接到分子的剩余部分。芳基和杂芳基的非限制性例子包括苯基、1-萘基、2-萘基、4-联苯基、1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2-噁唑基、4-噁唑基、2-苯基-4-噁唑基、5-噁唑基、3-异噁唑基、4-异噁唑基、5-异噁唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并咪唑基、5-吲哚基、1-异喹啉基、5-异喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹啉基和6-喹啉基。上述每个芳基和杂芳基的取代基可选自下述可接受的基团。
简言之，术语“芳基”当与其它术语连用(例如芳氧基、芳硫氧基、芳基烷基)时包括上文定义的芳环或杂芳环。因此，术语“芳基烷基”包括那些其中芳基结合到烷基上的基团(例如苄基、苯乙基、吡啶基甲基等)，其中的烷基包括那些碳原子(例如亚甲基)被例如氧原子取代的烷基(例如苯氧基甲基、2-吡啶氧基甲基、3-(1-萘氧基)丙基等)。
术语“氧代”在这里表示与碳原子双键连接的氧。
上述每个术语(例如“烷基”、“杂烷基”、“芳基”和“杂芳基”)是指包括所述基团取代和未取代的形式。每种类型基团取代基的例子在下文提供。
烷基和杂烷基的取代基(包括那些通常被称为亚烷基、链烯基、杂亚烷基、杂链烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、环链烯基和杂环链烯基)可以是选自下组中的一个或多个，但不限于-OR’、＝O、＝NR’、＝N-OR’、-NR’R”、-SR’、-卤素、-SiR’R”R、-OC(O)R’、-C(O)R’、-CO2R’、-CONR’R”、-OC(O)NR’R”、-NR”C(O)R’、-NR’-C(O)NR”R、-NR”C(O)2R’、-NR-C(NR’R”R)＝NR””、-NR-C(NR’R”)＝NR、-S(O)R’、-S(O)2R’、-S(O)2NR’R”、-NRSO2R’、-CN和-NO2，其数量可为0至(2m’+1)，其中m’是该基团中碳原子的总数。R’、R”、R和R””分别独立表示氢、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基(例如被1-3个卤素取代的芳基)、取代或未取代的烷基、烷氧基或硫代烷氧基，或芳基烷基。例如，当本发明的化合物含有多个R基团时，每个R基团是独立选择的，如同当存在一个以上R’、R”、R和R””基团时每个R’、R”、R和R””基团是独立选择的一样。当R’和R”结合到同一氮原子时，它们可与氮原子结合形成5-、6-或7-元环。例如，-NR’R”表示包括但不限于1-吡咯烷基和4-吗啉基。通过上面对取代基的讨论，精通本领域是技术人员将理解，术语“烷基”包括其中碳原子连接到氢基团之外的基团的基团，如卤代烷基(例如-CF3和-CH2CF3)和酰基(例如-C(O)CH3、-C(O)CF3、-C(O)CH2OCH3等)。
与烷基取代基类似，芳基和杂芳基的取代基是可变的并且可选自，例如卤素、-OR’、＝O、＝NR’、＝N-OR’、-NR’R”、-SR’、-卤素、-SiR’R”R、-OC(O)R’、-C(O)R’、-CO2R’、-CONR’R”、-OC(O)NR’R”、-NR”C(O)R’、-NR’-C(O)NR”R、-NR”C(O)2R’、-NR-C(NR’R”R)＝NR””、-NR-C(NR’R”)＝NR、-S(O)R’、-S(O)2R’、-S(O)2NR’R”、-NRSO2R’、-CN和-NO2、-R’、-N3、-CH(Ph)2、氟代(C1-C4)烷氧基和氟代(C1-C4)烷基，其个数可从0到芳环系统上开价(open valence)的总数；且其中R’、R”、R和R””独立选自氢、烷基、杂烷基、芳基和杂芳基。例如，当本发明的化合物含有多个R基团时，每个R基团是独立选择的，如同当存在一个以上R，、R”、R和R””基团时每个R’、R”、R和R””基团是独立选择的一样。
芳环或杂芳环相连原子上的两个取代基可任选被具有下式的取代基替代-T-C(O)-(CRR’)q-U-，其中T和U独立为-NR-、-O-、-CRR’-或单键，q是0-3的整数。或者，芳环或杂芳环相连原子上的两个取代基可任选被具有下式的取代基替代-A-(CH2)r-B-，其中A和B独立为-CRR’-、-O-、-NR-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2NR’-或单键，r是1-4的整数。如此形成的新环的一个单键可任选被双键替代。或者，芳环或杂芳环相连原子上的两个取代基可任选被具有下式的取代基替代-(CRR’)s-X-(CR”R)d-，其中s和d分别为0-3的整数，X是-O-、-NR’-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-或-S(O)2NR’-。取代基R、R’、R”和R优选独立选自氢或取代或未取代的(C1-C6)烷基。
术语“杂原子”在这里包括氧(O)、氮(N)、硫(S)和硅(Si)。
化合物的中性形式优选通过使盐与碱或酸接触并以常规方式分离母体化合物来再生。化合物的母体形式在某些物理特性(如在极性溶剂中的溶解度)上不同于各种盐形式。
除了盐形式，本发明提供了前药形式的化合物。这里所述的化合物的前药是指易于在生理条件下发生化学变化从而提供本发明化合物的那些化合物。此外，可在体外环境下通过化学或生化方法使前药转变为本发明的化合物。
术语“环”在这里是指原子的环状排列，在这种排列中可任选含有杂原子。环包括芳族和非芳族部分，如取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基和取代或未取代的杂芳基。环的原子数通常被定义为环成员的数目。例如，“5-至7-元环”表示环排列中有5-7个原子。每个成员可任选为杂原子。因此，术语“5-至7-元环”包括例如吡啶基、哌啶基和噻唑基环。环通常表示成括号内单个明确的取代基，括号外有下标字母。下标字母通常表示一组整数，如1-10。这个整数表示环取代基的数目，其中每个取代基可以是不同的。例如，就取代基(R1)s而言，其中s是2，该环可被取代或未取代的烷基以及取代或未取代的杂烷基取代。
术语“多”在这里表示至少是2。例如，多价金属离子是化合价至少为2的金属离子。
“部分”是指结合到其它结构的分子的残基。
符号 无论是作为键使用或与键垂直出现，都指示所示部分与分子剩余部分的连接点。
本发明的某些化合物包含不对称碳原子(光学中心)或双键；外消旋物、非对映体、几何异构体以及各个异构体都包括在本发明范围之内。
附图简述
图1合成PEI-mPEG共聚物的示意图。分子量为25kDa的分支聚乙烯亚胺(平均x＝2，y＝1)与mPEG-SPA(5kDa)在133mM硼酸盐、100mM氯化钠、0.7mM EDTA(pH8.4)中反应。
图2重组腺病毒(图A)和被PEI-mPEG包裹的腺病毒(图B，包裹率为C)的Resource-Q阴离子交换层析谱。该图显示作为时间函数的260nm的吸光度。插图显示了腺病毒峰(图A，RT＝10.37分钟)和流通液中包裹的腺病毒峰(图B，RT＝0.64分钟)的吸收谱。层析条件如下流速1mL/分钟，缓冲液A50mM Hepes，pH 7.5；缓冲液B缓冲液A+1.5M NaCl，梯度20％B至40％B，10分钟。
图3重组腺病毒和被PEI-mPEG包裹的腺病毒的体外感染性和β-半乳糖苷酶表达。采用的细胞系是T24膀胱癌(白色柱)和A549肺癌(黑色柱)。表达GFP(图A)或β-半乳糖苷酶(图B)的重组腺病毒以表1所述的三种不同的聚合物病毒颗粒比例(rAd(enc)A、rAd(enc)B和rAd(enc)C)用PEI-mPEG包裹。还显示了未处理的细胞(UT)和用非包裹的腺病毒感染的细胞(rAd)。
图4静脉内给予不同剂量腺病毒或包裹的腺病毒的BALB/c小鼠的肝(黑色柱)、脾(对角线阴影柱)、肾(水平阴影柱)和肺(白色柱)中重组腺病毒DNA的量化PCR结果。病毒以最高PEI-mPEG∶病毒颗粒比例(表1中的C)包裹。各组以每只动物3×1010、1×1010和3×109病毒颗粒进行注射。每组对三只动物给药。
图5静脉内给予不同剂量腺病毒或包裹的腺病毒的BALB/c小鼠的肝(黑色柱)、脾(对角线阴影柱)、肾(水平阴影柱)和肺(白色柱)中β-半乳糖苷酶的活性。病毒以最高PEI-mPEG∶病毒颗粒比例(表1中的C)包裹。各组以每只动物3×1010、1×1010和3×109病毒颗粒进行注射。每组对三只动物给药。由于测定中不同的背景水平，肝脏提取物的检测限为每克组织7.7ng，而所有其它组织为0.1ng/g。
发明详述I.介绍本发明涉及非共价包裹病毒颗粒形成复合物的共聚物。复合物是易于制造的(例如通过将病毒与聚合物混合物)并可用于在细胞内表达核酸。与共价连接的共聚物不同，不需要对复合生物材料如腺病毒进行化学修饰，因此可避免广泛定性可能的反应产物。对于例如治疗或诊断目的(例如使用报告基因)，将核酸引入细胞是有用的。例如，一些试验性癌症治疗利用各种腺病毒或腺病毒载体。参见例如美国专利5,846,945；5,801,029；PCT/US99/08592；美国专利5,747,469；PCT/US98/03514和PCT/US97/22036。本发明的病毒/聚合物复合物可用来在体外、体内或离体条件下将感兴趣的核酸转移到不同细胞类型。
II.组合物A.共聚物在第一个方面，本发明提供了一种含有与共聚物非共价复合的腺病毒的复合物。所述共聚物包含式I所示结构 其中，m是1-1000的整数。符号i是2-m的整数并表示Xi的位置。符号X1、Xi和Xm+1是独立选择的单体，其中，(i)所述单体包含选自仲胺和叔胺的胺；和(ii)至少一个所述单体包含Q。Q为选自式IIa和式IIb的结构
其中，Z选自O和NH。符号h是0-1的整数。符号R1包含聚亚烷基二醇部分。本发明的共聚物还不含交叉聚合，且在生理pH，所述共聚物中至少一个氮原子带有正电荷。
在一示例性实施方案中，至少一个所述单体还包含选自-NH2和-OH的化学部分。如果Q选自式IIa，则至少一个Q通过一个选自氮和氧的原子与所述单体共价连接。如果Q选自式IIb，则至少一个Q通过碳原子与所述单体共价连接。
在一示例性实施方案中，Q具有式IIa，h是0，Z是O，且所述单体包含式III所示结构 其中，a是1-10的整数，b是1-10的整数。在另一示例性实施方案中，Q具有式IIa，h是0，Z是O，且所述单体包含式IV所示结构 其中，c是1-10的整数。再在另一个示例性的实施方案中，Q具有式IIa，h是0，Z是O，且所述共聚物具有a)至少一个具有式III所示结构的单体，其中a是1-10的整数，b是1-10的整数；和b)至少一个具有式IV所示结构的单体；其中c是1-10的整数。在再一示例性实施方案中，a是2。在另一示例性实施方案中，b是2。在一示例性实施方案中，c是2。在再一示例性实施方案中，a是3。在另一示例性实施方案中，b是3。在一示例性实施方案中，c是3。在另一示例性实施方案中，所述单体是吖丙啶。
在一示例性实施方案中，Q具有式IIa，h是0，Z是O，且所述单体包含式V所示结构 在另一示例性实施方案中，所述单体是赖氨酸。
在一示例性实施方案中，Q具有式IIa，h是1，Z是NH，且所述单体包含式VI所示结构 其中，R3选自H、-(CH2CH2)NH(CH2CH3)2和-(CH2CH2)N(CH2CH3)2CH2CH2NH(CH2CH3)2。在另一示例性实施方案中，每三个所述单体中约有两个R3是H，且每三个所述单体中约有一个R3选自-(CH2CH2)NH(CH2CH3)2和-(CH2CH2)N(CH2CH3)2CH2CH2NH(CH2CH3)2。在另一示例性实施方案中，所述单体是DEAE-葡聚糖。
在一示例性实施方案中，Q具有式IIb，且所述共聚物包含a)至少一个包含式VI所示结构的单体，其中，R3选自H、-(CH2CH2)NH(CH2CH3)2和-(CH2CH2)N(CH2CH3)2CH2CH2NH(CH2CH3)2；和b)至少一个包含式VII所示结构的单体 在另一示例性实施方案中，每三个所述单体中约有两个的R3是H，且每三个所述单体中约有一个的R3选自-(CH2CH2)NH(CH2CH3)2和-(CH2CH2)N(CH2CH3)2CH2CH2NH(CH2CH3)2。在另一示例性实施方案中，所述包含式VII所示结构的单体的比例在5和25之间。在再一示例性实施方案中，每三个所述单体中约有两个的R3是H，且每三个所述单体中约有一个的R3选自-(CH2CH2)NH(CH2CH3)2和-(CH2CH2)N(CH2CH3)2CH2CH2NH(CH2CH3)2，且所述包含式VII所示结构的单体的比例在5和25之间。
在某些实施方案中，所述非离子聚合物包括聚亚烷基二醇部分，该部分共价连接到一些单体。在某些实施方案中，这种共价连接形成仲胺或叔胺、酰胺、二酰肼、酯、脲、异脲、氨基甲酸酯或氨基甲酸乙酯。聚亚烷基二醇的例子包括聚乙二醇(PEG)及其衍生物。
一实施方案中，在阳离子聚合物(如PEI、聚赖氨酸、DEAE-葡聚糖及其变体)上加入非离子聚合物(如聚乙二醇(PEG))可防止由共聚物和病毒形成的复合物沉淀和聚集，因此可增加复合物的溶解度。在其它实施方案中，PEG可提高转染率。
在另一示例性实施方案中，R1包含式VII所示结构I 符号n是2-2000的整数。符号p是1-8的整数。R2选自取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的3-至7-元环烷基、取代或未取代的5-至7-元杂环烷基、取代或未取代的芳基和取代或未取代的杂芳基。再在另一个示例性的本发明的共聚物在阳离子聚合物单体上有不同取代水平的非离子聚合物。例如，阳离子聚合物PEI中15％的吖丙啶单体被非离子聚合物PEG取代。一些情况下，非离子聚合物的取代水平在10％和20％之间。其它情况下，非离子聚合物的取代水平在10％和30％之间。在其它情况下，非离子聚合物的取代水平在15％和25％之间。在其它情况下，非离子聚合物的取代水平约为20％。在其它情况下，非离子聚合物的取代水平在10％和40％之间。
在一示例性实施方案中，被Q取代的单体的比例至少为10％，且Q具有式IX所示结构 符号n是2-2000的整数。符号p是1-8的整数。R2选自取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的3-至7-元环烷基、取代或未取代的5-至7-元杂环烷基、取代或未取代的芳基和取代或未取代的杂芳基。再在另一个示例性的实施方案中，p是2。在另一示例性实施方案中，被Q取代的单体的比例为15-30。在再一示例性实施方案中，被Q取代的单体的比例为17-22。
在一示例性实施方案中，被Q取代的单体的比例至少为10，且Q具有式X所示结构
符号n是2-2000的整数。符号p是1-8的整数。符号f是0-1的整数。当f是1时，符号R4具有式XI所示结构 在图XI中，N′共价结合到N*，且g是1-9的整数。符号R2选自取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的3-至7-元环烷基、取代或未取代的5-至7-元杂环烷基、取代或未取代的芳基和取代或未取代的杂芳基。在另一示例性实施方案中，f是0。再在另一个示例性的实施方案中，f是1。在再一示例性实施方案中，g是4。在另一示例性实施方案中，被Q取代的单体的比例为15-30。在另一示例性实施方案中，被Q取代的单体的比例为17-22。
在一示例性实施方案中，被Q取代的单体的比例至少为10，且Q具有式XII所示结构 符号n是2-2000的整数。符号p是1-8的整数。R2选自取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的3-至7-元环烷基、取代或未取代的5-至7-元杂环烷基、取代或未取代的芳基和取代或未取代的杂芳基。在另一示例性实施方案中，被Q取代的单体的比例为15-30。在另一示例性实施方案中，被Q取代的单体的比例为17-22。
在一示例性实施方案中，复合物的直径在约20nm和约300nm之间。在另一示例性实施方案中，复合物的直径在约80nm和约150nm之间。
在一示例性实施方案中，R2选自取代和未取代的烷基、取代和未取代的芳基、叶酸根、运铁蛋白、半乳糖、葡萄糖、抗体、抗体片段和肽。在另一示例性实施方案中，R2是甲基。在另一示例性实施方案中，p是2。在另一示例性实施方案中，p是2，a是2，b是2，c是2。
在一示例性实施方案中，共聚物与腺病毒的比例在3,500∶1和30,000∶1之间。在另一示例性实施方案中，共聚物与腺病毒的比例在3,600∶1和20,000∶1之间。在再一示例性实施方案中，共聚物与腺病毒的比例在10,000∶1和30,000∶1之间。
本发明的共聚物可具有一定范围的外形尺寸。例如，一些本发明的共聚物的平均分子量在约100和约300千道尔顿(kDa)之间。一些实施方案中，平均分子量在125和250kDa之间。在其它实施方案中，平均分子量在约150和约170kDa之间。共聚物的长度不是关键的，只要由它与腺病毒形成的复合物基本上是电中性的即可。在一示例性实施方案中，符号m是10-900的整数。在另一示例性实施方案中，符号m是50-600的整数。在再一示例性实施方案中，符号m是75-300的整数。
共聚物的制造以下示例性流程1-5例举了制备本发明化合物的方法。这些方法不限于制造例举的化合物，而且可用来制造其它化合物。本发明化合物也可用所述流程中未明确例举的方法来制造。所述化合物可用容易获得的原料或已知中间体来制造。
最参见形式的共聚物可通过阳离子聚合物与非离子聚合物(但其一端用非反应性基团封端)反应制得。例如，PEI-mPEG共聚物是由阳离子聚合物PEI与一端用甲氧基封端而另一端用琥珀酰亚胺基丙酸酯基团处理的非离子聚合物PEG反应制得的。
非离子聚合物在本发明中，非离子亲水聚合物如聚亚烷基二醇与阳离子聚合物共价连接。合适的聚亚烷基二醇可从许多来源购买，其中包括Aldrich Chemical Company的聚丙二醇和聚(1，2丁二醇)，以及Nektar Therapeutics的聚乙二醇及其衍生物。一些情况下，聚亚烷基二醇亚单位通过仲胺或叔胺、酰胺、二酰肼、酯、脲、异脲、氨基甲酸酯、氨基甲酸乙酯等基团或它们的组合共价连接到阳离子聚合物。聚亚烷基二醇亚单位的数目(n)可以是，例如，2-2,000。在一些本发明的化合物中，亚单位的数目在45-1,200之间。在其它本发明的化合物，亚单位的数目在250-1,000之间。
为减少不需要的副反应，聚二醇可被封端，例如用形成醚键的基团，如烷氧基。在一些本发明的化合物中，单甲氧基聚乙二醇(mPEG)被用作封端基团。封端基团的其它例子有取代和未取代的烷基、取代和未取代的芳基、叶酸盐、运铁蛋白、半乳糖、葡萄糖、抗体、抗体片段和肽。PEG封端基团的例子可在Nektar Therapeutics(以前叫做Shearwater Polymers)(Birmingham，AL)2001年的目录(可在互联网(万维网)上于nektar.com获得)中找到，其被纳入本文作为参考。
一些实施方案中，与阳离子聚合物偶联之前，非离子聚合物被化学活化。例如，活化的PEG(在该实施例中为mPEG)的可能的有用形式包括mPEG氰尿酰氯、mPEG琥珀酰亚胺基琥珀酸酯、tresyl-mPEG和mPEG琥珀酰亚胺基丙酸酯(mPEG-SPA)。活化的PEG基团的再其它的例子可在上述Nektar Therapeutics的目录中找到。
阳离子聚合物本发明的阳离子聚合物包括表示带有正电荷的单体的符号X1、Xi和Xm+1。这些带有正电荷的单体形成阳离子聚合物。这些带有正电荷的单体含有仲胺或叔胺，并且也可含有伯胺或醇官能度。本发明的阳离子聚合物的平均分子量可在约800和约800,000道尔顿之间。一些实施方案中，平均分子量在2,000和100,000道尔顿之间。在其它实施方案中，平均分子量在约15,000和约50,000道尔顿之间。此外，阳离子聚合物的长度可用m表示，m可在1和1000之间变化。一些实施方案中，m是10和900之间的整数。在其它实施方案中，m是50和600之间的整数。再在其它实施方案中，m是75和300之间的整数。
在一示例性实施方案中，所述阳离子聚合物是聚亚烷基亚胺、聚赖氨酸、DEAE-葡聚糖和DEAE-葡聚糖变体。
阳离子聚合物聚亚烷基亚胺在一示例性实施方案中，所述阳离子聚合物是聚亚烷基亚胺。一些情况下，所述聚亚烷基亚胺包含以下单体 其中，a和b是1-10之间的整数。一些情况下，a是2，b是2。其它情况下，a是3，b是3。其它情况下，所述聚亚烷基亚胺包含以下单体 其中，c是1-10之间的整数。一些情况下，c是2。其它情况下，c是3。再在其它情况下，所述聚亚烷基亚胺是上述单体的混合物。再在其它情况下，所述聚亚烷基亚胺的聚吖丙啶(PEI)。
示例性的聚吖丙啶-PEG共聚物是用流程1的方法制造的。
流程1 在该流程中，PEI与甲基封端的、琥珀酰亚胺活化的PEG在含有硼酸盐缓冲液的水溶液中反应以制造PEI-mPEG共聚物。在某些实施方案中，聚亚烷基亚胺含有如流程I所示结构的单体，其中，x和y的比例在1∶1和5∶1之间。该比例可以是例如2∶1或甚至3∶1。合适的聚亚烷基亚胺化合物可从许多来源购买，包括Aldrich ChemicalCompany的聚乙烯亚胺，Polysciences的聚乙烯亚胺，和BASF Corporation的POLYMIN聚(乙烯亚胺)和LUPASOLTM聚(乙烯亚胺)。
阳离子聚合物聚赖氨酸另一种示例性的用于本发明的阳离子聚合物是聚赖氨酸。聚赖氨酸可从许多来源购买，包括Sigma Chemical Company。聚赖氨酸由具有以下结构的单体构成 聚赖氨酸-PEG共聚物在用流程2的方法制造。
流程2 在该流程中，聚赖氨酸与甲基封端的、琥珀酰亚胺活化的PEG在含有硼酸盐缓冲液的水溶液中反应以制造聚赖氨酸-mPEG共聚物。
阳离子聚合物DEAE-葡聚糖另一种示例性的用于本发明的阳离子聚合物是DEAE-葡聚糖。DEAE-葡聚糖盐酸可从许多来源购买，包括Sigma Chemical Company。DEAE-葡聚糖可含有例如下面列出的单体的混合物
DEAE-葡聚糖-PEG共聚物用流程3的方法制造。
流程3 在该流程中，糖与溴化氰在60％丙酮∶30％水∶10％三乙胺溶剂中在-15℃下反应以制造活化的糖腈(saccharide nitrile)。随后与胺取代的mPEG在乙酸盐缓冲水溶液中于4℃混合物24小时，从而形成DEAE-葡聚糖-mPEG异脲。在那些实施方案中，DEAE-葡聚糖是阳离子聚合物，未取代的葡萄糖亚单位与DEAE取代的葡萄糖(包括单和多DEAE-取代)亚单位的比例在1∶1和5∶1之间。该比例可以是，例如2∶1或者甚至3∶1。
在另一示例性实施方案中，带有己二酸二酰肼键合的DEAE-葡聚糖-PEG共聚物是用流程4的方法制造的。
流程4 在该流程中，糖与溴化氰在60％丙酮∶30％水∶10％三乙胺溶剂中在-15℃下反应以制造活化的糖腈。活化的聚合物先与脂肪酸二酰肼反应，随后与醛官能化的mPEG在氰基硼氢化钠存在下反应以使DEAE-葡聚糖-PEG共聚物具有己二酸二酰肼键合基。在那些实施方案中，DEAE-葡聚糖是阳离子聚合物，未取代的葡萄糖亚单位与DEAE取代的葡萄糖(包括单和多DEAE-取代)亚单位的比例在1∶1和5∶1之间。该比例可以是，例如2∶1或者甚至3∶1。
阳离子聚合物DEAE-葡聚糖变体在另一示例性实施方案中，制造了某些DEAE-葡聚糖-PEG共聚物变体。DEAE-葡聚糖变体可含有上述单体。DEAE-葡聚糖-PEG共聚物变体是用流程5的方法制造的。
流程5 在该流程中，糖与高碘酸反应以将邻位(viccinal)羟基氧化成二醛。随后与胺取代的mPEG混合，形成DEAE-葡聚糖-mPEG亚胺共聚物变体。随后与氰基硼氢化钠反应制得DEAE-葡聚糖-mPEG胺共聚物变体。
B.病毒由于病毒不会被受感染宿主的免疫系统发现，因此在将核酸输送到特定细胞类型时非常有效。这些特性使得某些病毒成为有吸引力的基因治疗的候选基因输送载体。逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒(AAV)和单纯疱疹病毒是基因治疗通常使用的病毒的例子。上述每种病毒都尤其优点和局限，因此可按照它们在某种基因治疗中的适用性来进行选择。
作为外源DNA输送载体的腺病毒被广泛用作现代分子生物学的工具。不同于大多数逆转录病毒载体，腺病毒复制不要求受体宿主细胞被分裂。腺病毒可被设计进入哺乳动物细胞并表达蛋白质，但也在制造感染性后代病毒上有缺陷。
可制造可复制的或在生产性感染所需的各种基因上条件缺陷的腺病毒载体。例如，从用腺病毒-SV40重组体进行的实验得知，完整的腺病毒E3区域可被删除而不会使组织培养细胞中的病毒生长发生巨大改变。该区域可被外源DNA取代。所得腺病毒可在任何可被野生型腺病毒感染的细胞系中生长。E3取代的腺病毒最初用于插入基因以制造免疫蛋白质。
不同于构建成载体以进行免疫的腺病毒(其中需要病毒复制以增加免疫表位的量)，设计作为基因治疗工具的病毒通常被设计成复制缺陷型。对后一种载体而言，许多外源DNA取代了删除的E1A和E1B区域。可用各种方法制造这种构建物，其中包括在腺病毒序列侧翼插入外源DNA的质粒。
也有其它使用腺病毒以便于外源DNA插入细胞的方法。可利用病毒附着、通过内含体进行加工以及最终将DNA输送到细胞核的机制来共内在化腺病毒颗粒之外的外源DNA。例如，与聚赖氨酸复合的DNA可与腺病毒颗粒结合并共内在化。参见例如Cottam，J Virol 673777-3785(1993)，Wagner，PNAS 884255-5259(1991)。推测该复合物通过将尾丝附着到其假想受体而进入细胞，但这些技术有许多改进，包括配体(如运铁蛋白)，以便于进入带有运铁蛋白受体的细胞。参见例如Wagner，PNAS 896099-6103(1992)。不必将病毒与外部DNA连接以使DNA进入培养物内的细胞。参见例如Yoshimura，J Biol Chem 2682300-2303(1993)。
C.复合物在另一方面，本发明提供了一种含有腺病毒和共聚物的复合物。这些共聚物可以是上文A部分所述的类型。在这些复合物中，腺病毒和共聚物是相互非共价复合的。
本发明的复合物可具有一定的外形尺寸。例如，复合物中共聚物与腺病毒的比例的可变的。一些实施方案中，共聚物与腺病毒的比例在3,500∶1和30,000∶1之间。在其它实施方案中，共聚物与腺病毒的比例在3,600∶1和20,000∶1之间。再在其它实施方案中，共聚物与腺病毒的比例在10,000∶1和30,000∶1之间。
此外，复合物的大小是可变的。一些实施方案中，复合物在约20nm和约300nm之间。在其它实施方案中，复合物在约80nm和约150nm之间。
复合物的制备在最简单的形式中，本发明的共聚物仅仅是与腺病毒接触或混合物(见实施例2)。几乎立即形成复合物，且不需要进一步的纯化。然后可用本发明的复合物接触细胞。本发明的复合物与细胞接触导致将病毒或病毒核酸引入细胞。
用阳离子PEI-PEG共聚物非共价包裹腺病毒导致病毒表面电荷被完全掩蔽，同时在体外和体内增加病毒感染和转基因表达。表面修饰可通过简单的混合处理实现，而不需进一步的纯化步骤。在将PEI-PEG作为一种成分加入任何纯化的病毒制品，因此它可与任何已有病毒载体一起使用。
一些实施方案中，细胞在体外接触复合物。一些实施方案中，细胞在体内接触复合物。
在另一方面，本发明提供了一种制造非共价复合的腺病毒共聚物复合物的方法。在该方法中，这部分所述的共聚物与腺病毒接触。
在另一方面，本发明提供了一种将腺病毒引入细胞的方法。在该方法中，使共聚物非共价接触腺病毒从而形成复合物。然后使该复合物接触细胞。
IV.药物应用在第四个方面，本发明提供了一种生理制剂，其中含有(a)共聚物；(b)腺病毒，它将与腺病毒形成一种非共价复合物；和(c)生理上可接受的赋形剂。这种生理制剂中的共聚物包含式I所示结构，其中，m是1-1000的整数。符号i是2-m的整数并表示Xi的位置。符号X1、Xi和Xm+1是独立选择的单体，其中，(i)包含选自仲胺和叔胺的胺；和(ii)至少一个单体包含Q。Q为选自式IIa和式IIb的结构，其中，Z选自O和NH。符号h是0-1的整数。符号R1包含聚亚烷基二醇部分。本发明的共聚物还不含交叉聚合，且在生理pH，所述共聚物中至少一个氮原子带有正电荷。
生理上可接受的赋形剂包括，例如运载体、水、pH-调节剂或缓冲剂、防腐剂、稳定剂或其它成分等物质。生理上可接受的运载体可含有生理上可接受的化合物，这种化合物可用来例如稳定重组腺病毒载体输送系统。生理上可接受的化合物可包含，例如，碳水化合物(如葡萄糖、蔗糖或葡聚糖)、羟丙基-β-环糊精、抗氧化剂(如山梨酸或谷胱甘肽)、螯合剂、水、低分子量蛋白质或其它稳定剂或赋形剂。
其它生理上可接受的化合物包括，例如，润湿剂、乳化剂、分散剂或防腐剂，它们可用来防止微生物生长或作用。各种防腐剂是熟知的，包括例如苯酚和抗坏血酸。精通本领域的技术人员将了解根据给药途径和重组腺病毒载体输送系统的特定生理化学特性来选择生理上可接受的运载体。运载体、稳定剂或佐剂的例子可在Gennaro的《雷明顿药物科学与实践》(REMINGTON′STHE SCIENCE AND PRACTICE OFPHARMACY)(第19版，(1995)，Mack Publishing Co.，Easton，PA)中找到，该书被纳入本文作为参考。
本发明化合物可以口服、肠胃外和局部剂型的各种方式给予。因此，本发明化合物可通过注射给予，即静脉内、肌肉内、真皮内、皮下、十二指肠内或腹膜内注射。同时，这里所述的化合物可通过吸入给予，例如鼻内给药。此外，本发明化合物可透皮给予。因此，本发明提供了一种生理组合物，其中含有生理上可接受的赋形剂和由来自上文“共聚物”章节的共聚物以及来自上文“病毒”章节的病毒构成的复合物。
有效量的复合物被作为含在药学上可接受的赋形剂中的组合物给予患者，所述赋形剂包括但不限于盐水溶液、合适的缓冲液、防腐剂、稳定剂，并且可与合适的药剂如镇吐药一起给予。有效量是足以产生有益结果或所需结果，包括临床结果的量。有效量可一次或多次给予。出于本发明的目的，有效量的复合物是足以减轻、改善、稳定、逆转、减缓或延迟疾病状态发展或足以诊断特定组织或疾病状态的量。一些个体用这些处理难以治疗，应该理解为该方法包括对这些个体给药。给药量将由个体状况、疾病程度、给药途径、用药剂量以及所需目的决定。
复合物的输送通常通过定位注射或静脉注射实现。载体的定位注射可包括，例如，腹膜内、胸膜内、鞘内、动脉内、眼内、肿瘤内注射或局部应用。在用复合物和其它药剂的组合进行治疗时这些方法可根据需要方便调节。
可用各种方法将复合物输送到靶细胞，包括但不限于脂质体、本领域熟知的常规转染方法(如磷酸钙沉淀或电穿孔)、直接注射和静脉内灌输。输送方法将主要取决于特定复合物(包括其形式)以及靶细胞的类型和位置(即细胞在体外或体内)。取决于给药途径，用于人类的病毒剂量范围为1×106-1×1014。
液体形式的制品包括溶液、悬液和乳剂，例如，水或水/丙二醇溶液。为进行肠胃外注射，可用聚乙二醇水溶液的溶液来配制液体制品。
V.试剂盒在第五个方面，本发明提供了含有共聚物和腺病毒的试剂盒，其中，所述共聚物和腺病毒是非共价连接的。试剂盒中的共聚物包含式I所示结构，其中，m是1-1000的整数。符号i是2-m的整数并表示Xi的位置。符号X1、Xi和Xm+1是独立选择的单体，其中，(i)所述单体包含选自仲胺和叔胺的胺；和(ii)至少一个所述单体包含Q。Q为选自式IIa和式IIb的结构，其中，Z选自O和NH。符号h是0-1的整数。符号R1包含聚二醇部分。本发明的共聚物还不含交叉聚合，且在生理pH，所述共聚物中至少一个氮原子带有正电荷。
本发明还提供了试剂盒以准备用于细胞注射的病毒制品，例如用于基因治疗。所述试剂盒含有，例如，本发明的共聚物。所述试剂盒可任选在独立容器中含有病毒，如腺病毒。所述试剂盒可任选含有描述如何进行本发明的书面说明。该试剂盒中可包含用来进行测定的其它材料，包括试管、移液管等。本发明的试剂盒可含有足够进行一次测定的材料，或者可含有足够进行多次测定的材料。
以下实施例仅是为了举例而不是要进行限制。
实施例应该理解，这里所述的实施例和实施方案仅是出于举例的目的，精通此领域的技术人员可根据其提出各种修改和变化，且这些修改和变化包含在本申请的精神和范围以及附加权利要求的范围之内。出于所有目的，这里引用的所有出版物、专利和专利申请被全文纳入本文作为参考。
概述在下面是实施例中，除非另有说明，温度的单位为摄氏度(℃)；操作在室温或环境温度下进行，“rt”或“RT”(通常约为18-25℃)；溶剂蒸发采用旋转式蒸发器在减压(通常为4.5-30mmHg)下进行，且浴温高达60℃；反应过程通常通过TLC监测，而反应时间仅为举例而提供；产率仅为举例而提供；并使用以下常用缩写L(升)、mL(毫升)、mmol(微摩尔)、g(克)、mg(毫克)、min(分钟)和h(小时)。
除非另有说明，合成中所有的所有化学物质购自Sigma(St.Louis，MO)。1H-NMR分析由Numega Resonance Labs，San Diego，CA进行。NMR分析之前，共聚物以去离子水用10,000 MWCO膜(Slide-a-Lizer，Pierce，R℃kford，IL)渗析并冻干。重组腺病毒在CMV立即早期启动子(BGCG)控制下表达LacZ融合蛋白(β-Gal)基因已经被描述(Wills，K.N.，等Hum Gene Ther.51079-1088(1994))。重组腺病毒在CMV立即早期启动子(GFCB)控制下编码绿色荧光蛋白(GFP)基因已经被描述(Rahman，A.，等，Mol Ther.3768-778(2001))。BGCG和GFCB按照下述方法制造并纯化(Huyghe，B.G.，等，Hum Gene Ther.61403-1416(1995))。
尺寸排阻(size exclusion)色谱在Akta FPLC系统上进行，采用用Sephacryl S-200树脂(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)填装的HiPrep柱(1.6×60cm)。反相层析在Jupiter 5u C4柱(150×2mm，Phenomenex Torrance，CA)上进行，采用WatersHPLC系统(Waters，Milford，MA)和Sedex 75蒸发光散射检测器(SEDERE，Alfortville，France)。复合物颗粒的大小通过动态光散射在N4 Plus粒度分级器(Coulter，Miami，FL)上确定。表面电荷(ζ电势)在DELSA 440SX(Coulter，Miami，FL)上测量。包裹的病毒颗粒通过阳离子交换层析在Resource Q柱(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)上分析(Shabram，P.W.，等Hum Gene Ther.8453-465(1997))。流式细胞术在FACS Calibur流式细胞器(Becton Dickinson，SanJose，CA)上进行；收集总共50,000细胞的前向散射(FSC)、侧向散射(SSC)和FL-1参数。细胞和组织裂解液的总蛋白质浓度用BCA法(Pierce，R℃kford，IL)相对牛血清白蛋白(BSA)标准来确定。
实施例1PEI-mPEG聚合物的制备PEI(25kDa)购自Aldrich(Milwaukee，WI)，甲氧基-PEG-SPA(5kDa)获自Shearwater(Huntsville，AL)。通过反相HPLC(线性梯度从100％的水(含0.1％TFA)到100％的乙腈(含0.1％TFA)，20分钟，流速0.4mL/分钟)分析原料显示在10分钟有PEI单峰，在15分钟有mPEG单峰。
PEG接枝的聚合物通过流程1所示PEI与mPEG-SPA的反应来分析。在流程1中，1M PEI溶液的制备过程如下将2.155克PEI(25kDa)溶于10mL水，用1N HCl调节pH至7.0，并用水调节体积至50mL。在153.9毫克mPEG-SPA(3.0×10-5mol)中加入400μL稀释在800μL硼酸盐缓冲液(200mM硼酸盐，150mM NaCl，1mMEDTA，pH 8.4)中的PEI原液(1.27×10-4mol伯胺)。使反应在室温下振荡进行1小时。
PEI-mPEG聚合物的纯化反应混合物通过尺寸排阻色谱纯化。收集组分；收集那些含有PEI-mPEG共聚物的组分并通过反相层析分析。
PEI-mPEG聚合物的定性通过反相层析分析纯化的反应产物(PEI-mPEG共聚物)显示单个宽峰。无特征性PEI和PEG峰证明原料被除去。此外，宽PEI-mPEG洗脱峰说明共聚物中PEG与PEI的比例是不均匀分布的。
表B.缩写，说明和材料来源
原料制备10-甲基丙烯酰氧基癸基磷酸酯(从POCl3得到的MDP-A)甲基丙烯酸10-羟基癸基酯的合成在抽气式压力下，4小时内将1，10-癸二醇(206.62g，1.19mol)，甲基丙烯酸(92.40g，1.06mol)，p-甲苯磺酸水合物(10.00g，53mmol)和2，6-二-叔丁基-4-甲基酚(0.50g)的混合物加热至85℃。通过蒸馏头除去反应过程中释放的水。冷却至室温后，加入己烷(500mL)，过滤混合物。然后滤液用1M NaOH水溶<p>为确定包裹在腺病毒在血清存在时是否稳定，将PEI-mPEG处理的腺病毒在用PBS配的50％v/v胎牛血清(FBS)中在室温下培育1小时。样品随后通过Resource QHPLC分析检测。在“典型”腺病毒保留时间未观察到腺病毒峰，这说明聚合物未被FBS从rAd中置换。未处理的对照腺病毒的保留时间在50％v/v FBS中无变化。
对一等分PEI-mPEG处理的病毒进行等密度CsCl密度梯度离心。柱纯化的PEI-mPEG中的BGCG和BGCG被分别加样到CsCl分布-梯度，按照先前的描述(Prage，L.等，Virology.49745-757(1972))仅做较小改进。将每种制品约5×1011病毒颗粒覆盖在10mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)中的1.25gm/ml和1.40gm/ml CsCl分布-梯度上。病毒样品在Beckman SW41 Ti旋转器中在8℃以约154,000xg离心1小时。收集每个试管的病毒带并与用10mM Tris-HCl(pH 8.0)配的1.30gm/ml CsCl混合。继续在VTi 65.3旋转器中在8℃以约199,000xg离心过夜。收集各个病毒带，使用MWCO 50,000的Spectra/Por膜(Spectrum Medical Industries，Inc.，修斯顿，得克萨斯州)在用2mM MgCl和1x PBS(pH 7.4)配的3％蔗糖中渗析。渗析的病毒在-80℃冷冻保存。
仅观察到一条与对照腺病毒有相同浮力密度的带。分离的腺病毒带用vPBS(1xPBS，3％蔗糖，2mM氯化镁，pH 7.5)渗析并通过Resource-Q HPLC分析。采用标准层析条件，病毒在典型保留时间洗脱，说明PEI-mPEG聚合物通电荷相互作用与病毒结合并被CsCl溶液的高离子强度置换。此外，PEI-mPEG包裹的病毒的电镜观察显示出典型的二十面体的腺病毒形态。该数据显示，PEI-mPEG聚合物与腺病毒的相互作用是可逆的，且不会影响病毒颗粒的完整性。
实施例3体外感染性测定在两种不同的细胞A549和T24上评价了被PEI-mPEG聚合物包裹的腺病毒在感染性和转基因表达上的效应。A549细胞(人上皮肺癌细胞)表达柯萨奇腺病毒受体(CAR)，因此容易被腺病毒感染。A549细胞保持在7％CO2、37℃培养箱中补充有10％FBS的DMEM中。相反，T24细胞是CAR阴性的，因此相比A549细胞不易被感染。T24(人上皮膀胱癌细胞)保持在相同培养箱中补充有10％FBS的Ham’sF12/DME高葡萄糖的1∶1混合物中并在繁殖。培养物在T-225cm2组织培养烧瓶中生长至约80％铺满(confluent)，用0.25％胰岛素分离并以每孔5×105细胞接种到6孔平板。细胞被维持一夜(37℃，7％CO2)，然后用腺病毒或PEI-mPEG包裹的腺病毒感染。用表达绿色荧光蛋白(GFP)的重组腺病毒确定感染性。转导效率，即GFP阳性(被感染)细胞的百分比，通过流式细胞术确定。转导效率(GFP阳性细胞百分比)是将FITC(FL-1)阳性细胞数除以被分析的细胞总数来确定的。
对于这两个细胞系，转导效率的增加与PEI-mPEG浓度的增加成正比(图3A)。对于T24细胞，rAd-PEI-mPEG A、B和C相对非包裹的腺病毒的增加分别为1％、89％和107％。对于A549细胞，在包裹水平A观察到降低-3％，而在包裹水平B和C分别观察到10％和31％的增加。
无论所用细胞系的CAR表达状态，包裹的腺病毒的体外感染性都增加。虽然CAR阴性细胞(T24)略高于基线水平(用非包裹的腺病毒建立)，但用CAR阳性细胞(A549)获得了最高转染水平。这显示病毒包裹不仅能消除受体介导的感染，而且可以受体独立方式增强感染性。这一观察结果与用共价PEG化腺病毒获得的结果(O′Riordan，等Hum Gene Ther.101349-1358(1999)；Croyle等，Hum.Gene Ther.111713-1722(2000))形成对比，其中根据所用PEG化(pegylation)化学制剂，观察到体外感染性中等程度至严重程度的降低。
据报道，用PEI(无PEG)和其它聚阳离子包裹的腺病毒体外感染性增加(McKay等，Gene Ther.7644-652(2000))。大于200nm的颗粒显示在脾脏中聚集因此可通过循环有效除去(Litzinger等，Bi℃him.Biophys.Acta.119099-107(1994))。此外，粒度小于300nm的颗粒可以渗入某些靶组织如实体瘤(Hobbs等，Pr℃.Natl.Acad.Sci.USA.954607-4612(1998))。另一方面，含有PEI-PEG共聚物的制剂不会造成腺病毒聚集。
体外转基因表达用表达β-半乳糖苷酶的重组腺病毒在相同的两个细胞系内评价体外转基因表达(图3B)。细胞用感染性测定所述同样的方式用PEI-mPEG包裹的BGCG或BGCG感染。将细胞裂解并用化学发光β-半乳糖苷酶报告基因测定试剂盒(Roche，曼海姆，德国)分析转基因表达。简言之，感染24小时后细胞用PBS洗涤并在室温下用温和去污剂裂解30分钟。通过离心除去细胞碎片之后将50μl稀释的细胞提取物转移到96孔化学发光测定平板。在其中加入10μl化学发光第五(Galacton Plus)，然后在室温培育1小时。该测定平板然后在TR717微板光度计(Tropix，Bedford，MA)上分析。确定相对β-半乳糖苷酶标准物(随试剂盒提供)的β-半乳糖苷酶浓度，并以裂解物的总蛋白质浓度校正。对于这两个细胞系都观察到PEI-mPEG包裹的腺病毒相比非包裹的腺病毒转基因表达增加。对于T24细胞，增加为27％(A)、157％(B)和130％(C)，而对于A549细胞为40％(A)、67％(B)和144％(C)。
实施例4体内生物分布和体内转基因表达静脉注射重组腺病毒或包裹的腺病毒到BALB/c小鼠的尾静脉之后评价体内分布和转基因表达。注射后三天收获器官/组织，通过定量PCR分析腺病毒DNA的存在，并用化学发光β-gal报告基因测定试剂盒分析β-半乳糖苷酶酶活性。
体内生物分布和体内转基因表达将PEI-mPEG包裹的BGCG或BGCG缓慢(300μl/20秒)注射入雌性BALB/c小鼠的尾静脉。注射三天后杀死动物并切除肝脏和组织。将组织立即置于OCT并在-70℃冷冻。切下6μm的切片然后用X-gal染色。各个组织的切片在液氮中冷冻。每个剂量组有3只动物。
腺病毒DNA的浓度在肝脏和脾脏中最高，而在肾脏中最低(图4)。被PEI-mPEG包裹的腺病毒也具有这种模式。对于非包裹的和包裹的腺病毒而言，腺病毒DNA浓度在所有器官中以剂量依赖型方式增加。比较给予相同颗粒数的非包裹的和包裹的腺病毒的动物的病毒DNA浓度，在接受包裹的腺病毒的组中观察到每毫克组织的腺病毒DNA拷贝数增加。平均增加值为肝脏1.8倍，脾脏2.9倍，肾脏1.5倍，肺2.7倍。
体内转基因表达组织样品中的β-半乳糖苷酶酶活性将组织样品称重加入裂解基质管(Q Biogene，Carlsbad，CA)，在每100mg组织中加入0.2mL含有蛋白质抑制剂混合物(随β-Gal试剂盒提供)的去污剂裂解缓冲液。组织样品在FastPrep组织匀浆器(Q Biogene，Carlsbad，CA)中裂解。3次冷冻-解冻循环之后将裂解液在50℃培养1小时以灭活内源β-半乳糖苷酶活性。裂解液在14,000xg离心10分钟以使其澄清。取出上清并用化学发光β-gal报告基因测定试剂盒(Roche，曼海姆，德国)分析稀释等分液的β-Gal酶活性。
评估病毒DNA水平采用Tri-Reagent(Molecular Research Center，Inc.)按照制造商的说明从约100mg组织中提取DNA。采用实时定量PCR，利用Taq聚合酶的5’核酸酶活性来检测PCR扩增子，以此量化病毒DNA(Wen，S.F.，等Cancer Gene Ther.71469-1480(2000))。除BGCG，将鼠GAPDH DNA相对量化以确保DNA的一致性和品质。
用于PCR的引物和探针序列如下BGCG正向引物，5′-AACGGTACTCCGCCACC-3′；BGCG反向引物，5′-ACTGGTTAGACGCCTTTCTCGA-3′；BGCG探针，FAM-TCCGCATCGACCGGATCGG-TAMRA；鼠GAPDH正向引物，5′GAAGGTGAAGGTCGAGTC-3′，GABDH反向引物5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′。
探针为FAM-CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC-TAMRA。PCR热曲线为50℃(2分钟)，95℃(10分钟)，以及95℃(15秒)和62℃(1分钟)，循环40轮。为量化病毒DNA，用分离自BGCG的稀释的病毒DNA作为病毒DNA标准。Q-PCR数据表达为病毒拷贝/mg组织。检出限约为10拷贝/mg组织。
通过测量从等分收获的组织制备的提取物中β-半乳糖苷酶酶活性来分析转基因表达(图5)。对于非包裹的腺病毒，除3×1010颗粒外，所有剂量的β-gal活性都在背景水平。一个例外是来自给予3×109颗粒的动物的肝脏样品，其显示出两倍的背景表达(14.6ng/g组织)。相反，给予PEI-mPEG包裹的腺病毒的动物在所有剂量范围显示出剂量依赖型表达。对于非包裹的腺病毒，表达在肝脏中最高，然后是脾脏，在肾脏和肺中最低。相比接受相同剂量的非包裹的腺病毒的组，在给予包裹的病毒的动物的所有组织中观察到表达增加。在动物的肝脏组织中观察到最大增加，即给予3×1010颗粒的动物为9.1倍，给予1×1010颗粒的动物为大于27.2倍(基于LOQ)，以及给予3×109颗粒的动物为2.6倍。
通过对组织冷冻切片进行组织学分析可观察肝脏内的转基因表达。这种分析被用作评估体内转导频率的一种方法。对一些小鼠注射不同剂量的BGCG而对其它小鼠注射不同剂量的PEI-mPEG-BGCG。尽管对于接受3×1010颗粒剂量的动物，转基因表达细胞的数目大致相等，但在用其它剂量水平的PEI-mPEG包裹的病毒处理的动物中观察到了增加的表达。在接受非包裹的腺病毒的动物肝脏中几乎未检测到阳性细胞，而当注射PEI-mPEG包裹的rAd时检测到显著数量的阳性细胞。
静脉注射重组腺病毒在各种免疫活性小鼠品系中导致高度非线性化剂量反应。这种反应在各种器官中都被发现，但报告最多出现在肝脏中，静脉注射后肝脏内有最高表达(Ziegler等，Hum Gene Ther.13935-945(2002)，Tao等，Mol Ther.328-35(2001))。这种效应是由于存在“生物滤器”，这可通过Kupffer细胞以及网状内皮组织系统的其它部分优先摄入腺病毒来说明(Tao等，Mol Ther.328-35(2001))。缺乏Kupffer细胞将导致干细胞内表达增加，这便支持了腺病毒在这些细胞内被隔离和降解(Ziegler等，Hum Gene Ther.13935-945(2002)，Tao等，Mol Ther.328-35(2001))。此外，共同施用无关腺病毒将导致转基因表达增加，这说明RES系统具有有限容量并可被高剂量病毒饱和(Ziegler等，Hum Gene Ther.13935-945(2002))。
用PEI-PEG共聚物包裹腺病毒是一种降低重组腺病毒与RES的相互作用以及提高载体系统治疗潜能的实际方法。给药后72小时，施用包裹的腺病毒的所有组织的病毒DNA水平都高于以相同剂量静脉注射的非包裹的病毒。这说明用PEI-PEG包裹可防止腺病毒被清除。同时，所有被分析的组织内的表达都增加，而在肝脏中有最大增加。这些发现与以下作用机制相一致，该机制中，PEI-PEG包裹降低了RES系统对重组腺病毒的摄取和降解，因此使靶组织更易接触rAd从而导致较高的病毒DNA和较高的表达水平。此外，PEI-PEG包裹增加了肝脏中转导事件的频率。这种效应在底至中等病毒剂量时更加显著，在这种剂量下RES系统未被腺病毒颗粒饱和。这是一个有价值的发现，因为剂量依赖毒性通常将阻止增加剂量以获得较高表达。总而言之，这些结果显示，用PEI-PEG聚合物包裹的腺病毒是一种提高腺病毒基因治疗载体治疗功效的有效方法。
上述实施例只是为了例证本发明而不是要限制其范围。本发明的其它变化对于本领域的一般技术人员的显见的并且包含在附加的权利要求范围之内。出于所有目的，这里引用的所有的出版物、专利和专利申请被纳入本文作为参考。
权利要求
1.一种复合物，其包含a)与b)非共价复合的腺病毒；b)包含式I所示结构的共聚物 其中m是1-1000的整数；i是2-m的整数，并表示Xi的位置；X1、Xi和Xm+1是独立选择的单体，其中(i)所述单体包含选自仲胺和叔胺的胺；和(ii)至少一个所述单体包含Q，Q为选自式IIa和式IIb的结构 其中，Z选自O和NH；h是0-1的整数；和R1包含聚亚烷基二醇部分；所述共聚物无交叉聚合；和在生理pH下，所述共聚物中至少一个氮原子带有正电荷。
2.如权利要求1所述的复合物，其中，Q具有式IIa，h是0，Z是O，且所述单体包含式III所示结构 其中，a是1-10的整数；和b是1-10的整数。
3.如权利要求1所述的复合物，其中，Q具有式IIa，h是0，Z是O，且所述单体包含式IV所示结构 其中，c是1-10的整数。
4.如权利要求1所述的复合物，其中，Q具有式IIa，h是0，Z是O，且所述共聚物包含a)至少一个所述单体包含式III所示结构其中，a是1-10的整数；和b是1-10的整数；和b)至少一个所述单体包含式IV所示结构其中c是1-10的整数。
5.如权利要求4所述的复合物，其中，a是2。
6.如权利要求5所述的复合物，其中，b是2。
7.如权利要求6所述的复合物，其中，c是2。
8.如权利要求4所述的复合物，其中，a是3。
9.如权利要求8所述的复合物，其中，b是3。
10.如权利要求9所述的复合物，其中，c是3。
11.如权利要求4所述的复合物，其中，所述单体是吖丙啶。
12.如权利要求1所述的复合物，其中，Q具有式IIa，h是0，Z是O，且所述单体包含式V所示结构
13.如权利要求1所述的复合物，其中，所述单体是赖氨酸。
14.如权利要求1所述的复合物，其中，Q具有式IIa，h是1，Z是NH，且所述单体包含式VI所示结构 其中，R3选自H、-(CH2CH2)NH(CH2CH3)2和-(CH2CH2)N(CH2CH3)2CH2CH2NH(CH2CH3)2。
15.如权利要求14所述的复合物，其中，每三个所述单体中约有两个的R3是H，每三个所述单体中约有一个的R3选自-(CH2CH2)NH(CH2CH3)2和-(CH2CH2)N(CH2CH3)2CH2CH2NH(CH2CH3)2。
16.如权利要求1所述的复合物，其中，所述单体是DEAE-葡聚糖。
17.如权利要求1所述的复合物，其中，Q具有式IIb，所述共聚物包含a)至少一个包含式VI所示结构的单体 其中，R3选自H、-(CH2CH2)NH(CH2CH3)2和-(CH2CH2)N(CH2CH3)2CH2CH2NH(CH2CH3)2；和b)至少一个包含式VII所示结构的单体
18.如权利要求17所述的复合物，其中，每三个所述单体中约有两个的R3是H，每三个所述单体中约有一个的R3选自-(CH2CH2)NH(CH2CH3)2和-(CH2CH2)N(CH2CH3)2CH2CH2NH(CH2CH3)2。
19.如权利要求17所述的复合物，其中，所述包含式VII所示结构的单体的百分数在5和25之间。
20.如权利要求18所述的复合物，其中，所述包含式VII所示结构的单体的百分数在5和25之间。
21.如权利要求1所述的复合物，其中，R1包含式VIII所示结构 其中n是2-2000的整数；p是1-8的整数；和R2选自取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的3-至7-元环烷基、取代或未取代的5-至7-元杂环烷基、取代或未取代的芳基以及取代或未取代的杂芳基。
22.如权利要求21所述的复合物，其中，p是2。
23.如权利要求4所述的复合物，其中，Q具有式IX所示结构 其中n是2-2000的整数；p是1-8的整数；和R2选自取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的3-至7-元环烷基、取代或未取代的5-至7-元杂环烷基、取代或未取代的芳基以及取代或未取代的杂芳基。
24.如权利要求1所述的复合物，其中，被Q取代的单体的百分数至少为10。
25.如权利要求1所述的复合物，其中，被Q取代的单体的百分数为15至30。
26.如权利要求12所述的复合物，其中，Q具有式IX所示结构，其中n是2-2000的整数；p是1-8的整数；和R2选自取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的3-至7-元环烷基、取代或未取代的5-至7-元杂环烷基、取代或未取代的芳基以及取代或未取代的杂芳基。
27.如权利要求14所述的复合物，其中，Q具有式X所示结构 其中n是2-2000的整数；p是1-8的整数；f是0-1的整数；当f是1时R4具有式XI所示结构 其中，N′共价结合到N*，其中g是1-9的整数；R2选自取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的3-至7-元环烷基、取代或未取代的5-至7-元杂环烷基、取代或未取代的芳基以及取代或未取代的杂芳基。
28.如权利要求27所述的复合物，其中，f是0。
29.如权利要求27所述的复合物，其中，f是1。
30.如权利要求29所述的复合物，其中，g是4。
31.如权利要求17所述的复合物，其中，Q具有式XII所示结构 其中n是2-2000的整数；p是1-8的整数；和R2选自取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的3-至7-元环烷基、取代或未取代的5-至7-元杂环烷基、取代或未取代的芳基以及取代或未取代的杂芳基。
32.如权利要求1所述的复合物，其中，所述复合物的直径为约20nm-300nm。
33.如权利要求1所述的复合物，其中，所述复合物的直径为约80nm-150nm。
34.如权利要求23所述的复合物，其中，R2选自取代和未取代的烷基、取代和未取代的芳基、叶酸根、运铁蛋白、半乳糖、葡萄糖、抗体、抗体片段和肽。
35.如权利要求34所述的复合物，其中，R2是甲基。
36.如权利要求35所述的复合物，其中，p是2，a是2，b是2，c是2。
37.如权利要求26所述的复合物，其中，R2选自取代和未取代的烷基、取代和未取代的芳基、叶酸根、运铁蛋白、半乳糖、葡萄糖、抗体、抗体片段和肽。
38.如权利要求37所述的复合物，其中，R2是甲基。
39.如权利要求38所述的复合物，其中，p是2。
40.如权利要求28所述的复合物，其中，R2选自取代和未取代的烷基、取代和未取代的芳基、叶酸根、运铁蛋白、半乳糖、葡萄糖、抗体、抗体片段和肽。
41.如权利要求40所述的复合物，其中，R2是甲基。
42.如权利要求41所述的复合物，其中，p是2。
43.如权利要求29所述的复合物，其中，R2选自取代和未取代的烷基、取代和未取代的芳基、叶酸根、运铁蛋白、半乳糖、葡萄糖、抗体、抗体片段和肽。
44.如权利要求44所述的复合物，其中，R2是甲基。
45.如权利要求45所述的复合物，其中，p是2。
46.如权利要求30所述的复合物，其中，R2选自取代和未取代的烷基、取代和未取代的芳基、叶酸根、运铁蛋白、半乳糖、葡萄糖、抗体、抗体片段和肽。
47.如权利要求46所述的复合物，其中，R2是甲基。
48.如权利要求47所述的复合物，其中，p是2。
49.如权利要求31所述的复合物，其中，R2选自取代和未取代的烷基、取代和未取代的芳基、叶酸根、运铁蛋白、半乳糖、葡萄糖、抗体、抗体片段和肽。
50.如权利要求49所述的复合物，其中，R2是甲基。
51.如权利要求50所述的复合物，其中，p是2。
52.如权利要求1所述的复合物，其中，共聚物与腺病毒的比例在3,500∶1和30,000∶1之间。
53.如权利要求52所述的复合物，其中，共聚物与腺病毒的比例在3,600∶1和20,000∶1之间。
54.如权利要求52所述的复合物，其中，共聚物与腺病毒的比例在10,000∶1和30,000∶1之间。
55.如权利要求1所述的复合物，其中，共聚物的分子量在150kDa和170kDa之间。
56.如权利要求1所述的复合物，其中，m是10-900的整数。
57.如权利要求56所述的复合物，其中，m是50-600的整数。
58.如权利要求57所述的复合物，其中，m是75-300的整数。
59.一种制备非共价复合的腺病毒共聚物复合物的方法，所述方法包括使共聚物接触腺病毒，所述共聚物包含式I所示结构，其中m是1-1000的整数；i是2-m的整数，并表示Xi的位置；X1、Xi和Xm+1是独立选择的单体，其中(i)所述单体包含选自仲胺和叔胺的胺；和(ii)至少一个所述单体包含Q，Q为选自式IIa和式IIb的结构 其中，Z选自O和NH；h是0-1的整数；和R1包含聚亚烷基二醇部分；所述共聚物无交叉聚合；和在生理pH下，所述共聚物中至少一个氮原子带有正电荷。
60.如权利要求59所述的方法，其中，Q具有式IIa，h是0，Z是O，且所述单体包含a)至少一个单体具有式III所示结构，其中，a是1-10的整数；和b是1-10的整数；和b)至少一个单体具有式IV所示结构，其中，c是1-10的整数；其中，至少10％的所述单体被式IX所示结构取代其中n是2-2000的整数；p是1-8的整数；和R2选自取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的3-至7-元环烷基、取代或未取代的5-至7-元杂环烷基、取代或未取代的芳基以及取代或未取代的杂芳基；所述共聚物无交叉聚合；和在生理pH下，所述共聚物中至少一个氮原子带有正电荷。
61.如权利要求60所述的方法，其中，p是2，a是2，b是2，c是2，且R2是甲氧基。
62.如权利要求59所述的方法，其中，Q具有式IIa，h是0，Z是O，且所述单体包含式V所示结构其中，至少10％的所述单体被式IX所示结构取代其中n是2-2000的整数；p是1-8的整数；和R2选自取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的3-至7-元环烷基、取代或未取代的5-至7-元杂环烷基、取代或未取代的芳基以及取代或未取代的杂芳基；所述共聚物无交叉聚合；和在生理pH下，所述共聚物中至少一个氮原子带有正电荷。
63.如权利要求62所述的方法，其中，p是2且R2是甲氧基。
64.如权利要求59所述的方法，其中，Q具有式IIa，h是1，Z是NH，且所述单体包含式VI所示结构；其中，每三个所述单体中约有两个的R3是H，且每三个所述单体中约有一个的R3选自-(CH2CH2)NH(CH2CH3)2和-(CH2CH2)N(CH2CH3)2CH2CH2NH(CH2CH3)2，其中，被Q取代的单体的百分数至少为10，且Q具有式X所示结构；其中n是2-2000的整数；p是1-8的整数；f是0；和R2选自取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的3-至7-元环烷基、取代或未取代的5-至7-元杂环烷基、取代或未取代的芳基以及取代或未取代的杂芳基；所述共聚物无交叉聚合；和在生理pH下，所述共聚物中至少一个氮原子带有正电荷。
65.如权利要求64所述的方法，其中，p是2且R2是甲氧基。
66.如权利要求59所述的方法，其中，Q具有式IIa，h是1，Z是NH，且所述单体包含式VI所示结构；其中，每三个所述单体中约有两个R3是H，且每三个所述单体中约有一个R3选自-(CH2CH2)NH(CH2CH3)2和-(CH2CH2)N(CH2CH3)2CH2CH2NH(CH2CH3)2，其中，被Q取代的单体的比百分数至少为10，且Q具有式X所示结构；其中n是2-2000的整数；p是1-8的整数；f是1；R4具有式XI所示结构；g是4；和R2选自取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的3-至7-元环烷基、取代或未取代的5-至7-元杂环烷基、取代或未取代的芳基以及取代或未取代的杂芳基；所述共聚物无交叉聚合；和在生理pH下，所述共聚物中至少一个氮原子带有正电荷。
67.如权利要求66所述的方法，其中，p是2且R2是甲氧基。
68.如权利要求59所述的方法，其中，Q具有式IIb，且所述共聚物包含a)至少一个包含式VI所示结构的单体；其中，R3选自H、-(CH2CH2)NH(CH2CH3)2和-(CH2CH2)N(CH2CH3)2CH2CH2NH(CH2CH3)2；和b)至少一个包含式VII所示结构的单体；其中，被Q取代的单体的百分数至少为10，且Q具有式XII所示结构；其中n是2-2000的整数；p是1-8的整数；和R2选自取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的3-至7-元环烷基、取代或未取代的5-至7-元杂环烷基、取代或未取代的芳基以及取代或未取代的杂芳基；所述共聚物无交叉聚合；和在生理pH下，所述共聚物中至少一个氮原子带有正电荷。
69.如权利要求68所述的方法，其中，p是2且R2是甲氧基。
70.一种将腺病毒引入细胞的方法，所述方法包括(a)使共聚物非共价接触腺病毒，所述共聚物包含式I所示结构，其中m是1-1000的整数；i是2-m的整数，并表示Xi的位置；X1、Xi和Xm+1是独立选择的单体，其中(i)所述单体包含选自仲胺和叔胺的胺；和(ii)至少一个所述单体包含Q，Q为选自式IIa和式IIb的结构 其中，Z选自O和NH；h是0-1的整数；和R1包含聚亚烷基二醇部分；所述共聚物无交叉聚合；和在生理pH下，所述共聚物中至少一个氮原子带有正电荷；和(b)使所述复合物接触细胞。
71.如权利要求70所述的方法，其中，所述腺病毒比无共聚物的腺病毒更具感染性。
72.如权利要求71所述的方法，其中，所述腺病毒的感染性高于无共聚物的腺病毒至少20％。
73.如权利要求71所述的方法，其中，所述腺病毒的感染性高于无共聚物的腺病毒至少100％。
74.如权利要求70所述的方法，其中，Q具有式IIa，h是0，Z是O，且所述单体包含a)至少一个单体具有式III所示结构，其中，a是1-10的整数；和b是1-10的整数；和b)至少一个单体具有式IV所示结构，其中，c是1-10的整数；其中，至少10％的所述单体被式IX所示结构取代其中n是2-2000的整数；p是1-8的整数；和R2选自取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的3-至7-元环烷基、取代或未取代的5-至7-元杂环烷基、取代或未取代的芳基以及取代或未取代的杂芳基；所述共聚物无交叉聚合；和在生理pH下，所述共聚物中至少一个氮原子带有正电荷。
75.如权利要求74所述的方法，其中，p是2，a是2，b是2，c是2，且R2是甲氧基。
76.如权利要求70所述的方法，其中，Q具有式IIa，h是0，Z是O，且所述单体包含式V所示结构其中，至少10％的所述单体被式IX所示结构取代其中n是2-2000的整数；p是1-8的整数；和R2选自取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的3-至7-元环烷基、取代或未取代的5-至7-元杂环烷基、取代或未取代的芳基和取代或未取代的杂芳基；所述共聚物无交叉聚合；和在生理pH下，所述共聚物中至少一个氮原子带有正电荷。
77.如权利要求76所述的方法，其中，p是2且R2是甲氧基。
78.如权利要求70所述的方法，其中，Q具有式IIa，h是1，Z是NH，且所述单体包含式VI所示结构；其中，每三个所述单体中约有两个的R3是H，且每三个所述单体中约有一个的R3选自-(CH2CH2)NH(CH2CH3)2和-(CH2CH2)N(CH2CH3)2CH2CH2NH(CH2CH3)2，其中，被Q取代的单体的百分数至少为10，且Q具有式X所示结构；其中n是2-2000的整数；p是1-8的整数；f是0；和R2选自取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的3-至7-元环烷基、取代或未取代的5-至7-元杂环烷基、取代或未取代的芳基和取代或未取代的杂芳基；所述共聚物无交叉聚合；和在生理pH下，所述共聚物中至少一个氮原子带有正电荷。
79.如权利要求78所述的方法，其中，p是2且R2是甲氧基。
80.如权利要求70所述的方法，其中，Q具有式IIa，h是1，Z是NH，且所述单体包含式VI所示结构；其中，每三个所述单体中约有两个的R3是H，且每三个所述单体中约有一个的R3选自-(CH2CH2)NH(CH2CH3)2和-(CH2CH2)N(CH2CH3)2CH2CH2NH(CH2CH3)2，其中，被Q取代的单体的百分数至少为10，且Q具有式X所示结构；其中n是2-2000的整数；p是1-8的整数；f是1；R4具有式XI所示结构；g是4；和R2选自取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的3-至7-元环烷基、取代或未取代的5-至7-元杂环烷基、取代或未取代的芳基和取代或未取代的杂芳基；所述共聚物无交叉聚合；和在生理pH下，所述共聚物中至少一个氮原子带有正电荷。
81.如权利要求80所述的方法，其中，p是2且R2是甲氧基。
82.如权利要求70所述的方法，其中，Q具有式IIb，且所述共聚物包含a)至少一个包含式VI所示结构的单体；其中，R3选自H、-(CH2CH2)NH(CH2CH3)2和-(CH2CH2)N(CH2CH3)2CH2CH2NH(CH2CH3)2；和b)至少一个包含式VII所示结构的单体；其中，被Q取代的单体的百分数至少为10，且Q具有式XII所示结构；其中n是2-2000的整数；p是1-8的整数；和R2选自取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的3-至7-元环烷基、取代或未取代的5-至7-元杂环烷基、取代或未取代的芳基和取代或未取代的杂芳基；所述共聚物无交叉聚合；和在生理pH下，所述共聚物中至少一个氮原子带有正电荷。
83.如权利要求82所述的方法，其中，p是2且R2是甲氧基。
84.一种生理制剂，其包含(a)共聚物，其中包含式I所示结构，其中m是1-1000的整数；i是2-m的整数，并表示Xi的位置；X1、Xi和Xm+1是独立选择的单体，其中(i)所述单体包含选自仲胺和叔胺的胺；和(ii)至少一个所述单体包含Q，Q为选自式IIa和式IIb的结构 其中，Z选自O和NH；h是0-1的整数；和R1包含聚亚烷基二醇部分；所述共聚物无交叉聚合；和在生理pH下，所述共聚物中至少一个氮原子带有正电荷；(b)腺病毒，其中，所述共聚物与腺病毒形成非共价复合物；和(c)生理上可接受的赋形剂。
85.如权利要求84所述的生理制剂，其中，Q具有式IIa，h是0，Z是O，且所述单体包含a)至少一个单体具有式III所示结构，其中，a是1-10的整数；和b是1-10的整数；和b)至少一个单体具有式IV所示结构，其中，c是1-10的整数；其中，至少10％的所述单体被式IX所示结构取代其中n是2-2000的整数；p是1-8的整数；和R2选自取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的3-至7-元环烷基、取代或未取代的5-至7-元杂环烷基、取代或未取代的芳基和取代或未取代的杂芳基；所述共聚物无交叉聚合；和在生理pH下，所述共聚物中至少一个氮原子带有正电荷。
86.如权利要求85所述的生理制剂，其中，p是2，a是2，b是2，c是2，且R2是甲氧基。
87.如权利要求84所述的生理制剂，其中，Q具有式IIa，h是0，Z是O，且所述单体包含式V所示结构其中，至少10％的所述单体被式IX所示结构取代其中n是2-2000的整数；p是1-8的整数；和R2选自取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的3-至7-元环烷基、取代或未取代的5-至7-元杂环烷基、取代或未取代的芳基和取代或未取代的杂芳基；所述共聚物无交叉聚合；和在生理pH下，所述共聚物中至少一个氮原子带有正电荷。
88.如权利要求87所述的生理制剂，其中，p是2且R2是甲氧基。
89.如权利要求84所述的生理制剂，其中，Q具有式IIa，h是1，Z是NH，且所述单体包含式VI所示结构；其中，每三个所述单体中约有两个R3是H，且每三个所述单体中约有一个R3选自-(CH2CH2)NH(CH2CH3)2和-(CH2CH2)N(CH2CH3)2CH2CH2NH(CH2CH3)2，其中，被Q取代的单体的比例至少为10，且Q具有式X所示结构；其中n是2-2000的整数；p是1-8的整数；f是0；和R2选自取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的3-至7-元环烷基、取代或未取代的5-至7-元杂环烷基、取代或未取代的芳基和取代或未取代的杂芳基；所述共聚物无交叉聚合；和在生理pH下，所述共聚物中至少一个氮原子带有正电荷。
90.如权利要求89所述的生理制剂，其中，p是2且R2是甲氧基。
91.如权利要求84所述的生理制剂，其中，Q具有式IIa，h是1，Z是NH，且所述单体包含式VI所示结构；其中，每三个所述单体中约有两个的R3是H，且每三个所述单体中约有一个的R3选自-(CH2CH2)NH(CH2CH3)2和-(CH2CH2)N(CH2CH3)2CH2CH2NH(CH2CH3)2，其中，被Q取代的单体的百分数至少为10，且Q具有式X所示结构；其中n是2-2000的整数；p是1-8的整数；f是1；R4具有式XI所示结构；g是4；和R2选自取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的3-至7-元环烷基、取代或未取代的5-至7-元杂环烷基、取代或未取代的芳基和取代或未取代的杂芳基；所述共聚物无交叉聚合；和在生理pH下，所述共聚物中至少一个氮原子带有正电荷。
92.如权利要求91所述的生理制剂，其中，p是2且R2是甲氧基。
93.如权利要求84所述的生理制剂，其中，Q具有式IIb，且所述共聚物包含a)至少一个包含式VI所示结构的单体；其中，R3选自H、-(CH2CH2)NH(CH2CH3)2和-(CH2CH2)N(CH2CH3)2CH2CH2NH(CH2CH3)2；和b)至少一个包含式VII所示结构的单体；其中，被Q取代的单体的百分数至少为10，且Q具有式XII所示结构；其中n是2-2000的整数；p是1-8的整数；和R2选自取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的3-至7-元环烷基、取代或未取代的5-至7-元杂环烷基、取代或未取代的芳基和取代或未取代的杂芳基；所述共聚物无交叉聚合；和在生理pH下，所述共聚物中至少一个氮原子带有正电荷。
94.如权利要求93所述的生理制剂，其中，p是2且R2是甲氧基。
95.一种包含共聚物和腺病毒的试剂盒，其中，所述共聚物和腺病毒是非共价连接的，所述共聚物包含式I所示结构，其中m是1-1000的整数；i是2-m的整数，并表示Xi的位置；X1、Xi和Xm+1是独立选择的单体，其中(i)所述单体包含选自仲胺和叔胺的胺；和(ii)至少一个所述单体包含Q，Q为选自式IIa和式IIb的结构 其中，Z选自O和NH；h是0-1的整数；和R1包含聚亚烷基二醇部分；所述共聚物无交叉聚合；和在生理pH下，所述共聚物中至少一个氮原子带有正电荷。
96.如权利要求95所述的试剂盒，其中，Q具有式IIa，h是0，Z是O，且所述单体包含a)至少一个单体具有式III所示结构，其中，a是1-10的整数；和b是1-10的整数；和b)至少一个单体具有式IV所示结构，其中，c是1-10的整数；其中，至少10％的所述单体被式IX所示结构取代其中n是2-2000的整数；p是1-8的整数；和R2选自取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的3-至7-元环烷基、取代或未取代的5-至7-元杂环烷基、取代或未取代的芳基和取代或未取代的杂芳基；所述共聚物无交叉聚合；和在生理pH下，所述共聚物中至少一个氮原子带有正电荷。
97.如权利要求96所述的试剂盒，其中，p是2，a是2，b是2，c是2，且R2是甲氧基。
98.如权利要求95所述的试剂盒，其中，Q具有式IIa，h是0，Z是O，且所述单体包含式V所示结构其中，至少10％的所述单体被式IX所示结构取代；其中n是2-2000的整数；p是1-8的整数；和R2选自取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的3-至7-元环烷基、取代或未取代的5-至7-元杂环烷基、取代或未取代的芳基和取代或未取代的杂芳基；所述共聚物无交叉聚合；和在生理pH，所述共聚物中至少一个氮原子带有正电荷。
99.如权利要求98所述的试剂盒，其中，p是2且R2是甲氧基。
100.如权利要求95所述的试剂盒，其中，Q具有式IIa，h是1，Z是NH，且所述单体包含式VI所示结构；其中，每三个所述单体中约有两个的R3是H，且每三个所述单体中约有一个的R3选自-(CH2CH2)NH(CH2CH3)2和-(CH2CH2)N(CH2CH3)2CH2CH2NH(CH2CH3)2，其中，被Q取代的单体的百分数至少为10，且Q具有式X所示结构；其中n是2-2000的整数；p是1-8的整数；f是0；和R2选自取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的3-至7-元环烷基、取代或未取代的5-至7-元杂环烷基、取代或未取代的芳基和取代或未取代的杂芳基；所述共聚物无交叉聚合；和在生理pH下，所述共聚物中至少一个氮原子带有正电荷。
101.如权利要求100所述的试剂盒，其中，p是2且R2是甲氧基。
102.如权利要求95所述的试剂盒，其中，Q具有式IIa，h是1，Z是NH，且所述单体包含式VI所示结构；其中，每三个所述单体中约有两个的R3是H，且每三个所述单体中约有一个的R3选自-(CH2CH2)NH(CH2CH3)2和-(CH2CH2)N(CH2CH3)2CH2CH2NH(CH2CH3)2，其中，被Q取代的单体的百分数至少为10，且Q具有式X所示结构；其中n是2-2000的整数；p是1-8的整数；f是1；R4具有式XI所示结构；g是4；和R2选自取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的3-至7-元环烷基、取代或未取代的5-至7-元杂环烷基、取代或未取代的芳基和取代或未取代的杂芳基；所述共聚物无交叉聚合；和在生理pH，所述共聚物中至少一个氮原子带有正电荷。
103.如权利要求102所述的试剂盒，其中，p是2且R2是甲氧基。
104.如权利要求95所述的试剂盒，其中，Q具有式IIb，且所述共聚物包含a)至少一个包含式VI所示结构的单体；其中，R3选自H、-(CH2CH2)NH(CH2CH3)2和-(CH2CH2)N(CH2CH3)2CH2CH2NH(CH2CH3)2；和b)至少一个包含式VII所示结构的单体；其中，被Q取代的单体的百分数至少为10，且Q具有式XII所示结构；其中n是2-2000的整数；p是1-8的整数；和R2选自取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的3-至7-元环烷基、取代或未取代的5-至7-元杂环烷基、取代或未取代的芳基和取代或未取代的杂芳基；所述共聚物无交叉聚合；和在生理pH下，所述共聚物中至少一个氮原子带有正电荷。
105.如权利要求104所述的试剂盒，其中，p是2且R2是甲氧基。
全文摘要
本发明提供了非共价包裹腺病毒以促进其输送并导致从病毒基因组表达的共聚物。现已发现，阳离子聚合物(如PEI、聚赖氨酸、DEAE－葡聚糖及其衍生物)和非离子聚合物(如PEG及其衍生物)的共聚物可促进腺病毒在细胞内的输送以及转基因表达。本发明的复合物提供了一种易于制造的物质，这种物质在治疗上比未包裹的腺病毒更有效。
文档编号A61K39/235GK1859926SQ200480018432
公开日2006年11月8日 申请日期2004年6月16日 优先权日2003年6月30日
发明者T·施卢普 申请人:坎基股份有限公司