专利名称：人组织蛋白酶g的dna适体的制作方法
背景技术：
组织蛋白酶G是通常发现于嗜中性粒细胞和单核细胞嗜天青颗粒的丝氨酸蛋白酶。与弹性蛋白酶和蛋白酶3一起属于胰凝乳蛋白酶家族，并且水解细胞外基质蛋白质如弹性蛋白、胶原、纤连蛋白和层粘连蛋白，导致动物广泛的肺组织损伤。
组织蛋白酶G还在血液凝固中起作用，事实上它参与了白血球启动的血凝固的另一个途径，并且通过激活凝血因子X和V而水解并潜在调节凝血酶受体以及体外(in vitro)激活血小板。它还能够将血管紧张素I转变成血管紧张素II，其中在分子其它处只发生较少水解。
已经表明组织蛋白酶G能够杀死细菌和真菌，但是该特性与其活性无关，事实上其水解后产生的肽具有直接抗菌特性。它还能使坏死组织恶化并且因此与几种炎性疾病如肺气肿、支气管炎、囊性纤维化和银屑病相关。
组织蛋白酶G的酶活性通过两类蛋白质蛋白酶抑制剂调节所谓的“典型”抑制剂和丝氨酸蛋白酶抑制剂。前者是相对较小的蛋白质(29-190个氨基酸)并且是紧密结合的可逆抑制剂；其中有Mucus蛋白酶抑制剂(MPI)、水蛭蛋白酶抑制剂c和抑蛋白酶肽。丝氨酸蛋白酶抑制剂是较大的蛋白质(400-450个残基)，由于在组织蛋白酶G的催化部位和丝氨酸蛋白酶抑制剂的反应位点环域之间形成不可水解的酰基键，所以丝氨酸蛋白酶抑制剂与它们的关联蛋白质形成不可逆的复合物。在丝氨酸蛋白酶抑制剂中，1-抗胰凝乳蛋白酶是最重要的因为它们能够结合和抑制其它胰凝乳蛋白酶所以该家族抑制剂不是选择性的。而且，它们的体内(in vivo)稳定性和分布受其肽的性质的影响。
从包含1，2，5-噻二唑烷-3-酮1，1-二氧化物(1，2，5-thiadiazolidin-3-one1，1dioxide)或者1，3-二氮杂环丁烷-2，4二酮的肽模拟物支架发现了几种合成抑制剂，并且它们中的一些(特别是具有芳族侧链的那些)表现出对组织蛋白酶G的相当特异的活性。然而，它们与酶形成了不可逆的酰基化合物。
最近，发现全长的和水解的染色体DNA都能体外和体内结合和抑制组织蛋白酶G。一个30bp的DNA片段在生理条件下与组织蛋白酶G紧密结合，并且对人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶的亲和性与对蛋白酶3的亲和性相比降低一个等级，这与弹性蛋白酶的阳离子特性降低相一致。
具体而言，EP-775745公开了具有大约40个核苷酸(并且在任何情况下均低于55个核苷酸)的链长度并且包含G对重复单位的抑制组织蛋白酶G的寡核苷酸适体，它对于治疗和预防炎症发生和前凝血剂不良状况是有用的。
发明描述本研究主要致力于组织蛋白酶G的非肽抑制剂的鉴定，其中所述的抑制剂具有高水平的选择性并且因此能够更有效地用于治疗和预防上述疾病并且也可用于治疗和预防遗传病、退化性疾病、DNA损伤、瘤形成和/或皮肤病。
像抗体一样，DNA分子也能依靠它们的序列呈现出多种三维结构。它们中的一些与靶标的结合有关。在本研究中，我们采用叫作SELEX(指数富集配体系统进化)的方法选择和鉴定了称作适体并表现出对组织蛋白酶G高亲和性的ssDNA或RNA分子。
适体技术结合了在寡核苷酸随机库中产生巨大结构多样性的能力和扩增所选择序列的聚合酶链式反应(PCR)的能力。该技术涉及筛选寡核苷酸的大的随机序列库，并且基于它们能够呈现出大量的四级结构的事实，在这些大量的四级结构当中一些四级结构会拥有针对靶分子的目的结合或催化活性。
虽然抑制作用不是选择过程所需要的，但是在许多情况下这些配体直接抑制靶蛋白质的生物学功能。在这些情况下，配体的抑制性功能推测可能是由于它们的结合部位与蛋白质的功能区重叠所致。
我们研究的结果导致阐明了一个具有相当高水平选择性的抑制组织蛋白酶G的新类适体。
本发明的新的抑制组织蛋白酶G的适体是单链或双链线形DNA或多核苷酸序列，其特征为具有至少60个(优选70个)核苷酸的链长度并且基本上没有分子间和/或分子内碱基配对。
根据本发明的最佳实施方案，DNA序列具有70-120个核苷酸、优选70-110个核苷酸、甚至更加优选80-100个核苷酸的链长度。虽然本发明的序列可以是单链或者双链的，但单链序列是优选的。本发明的序列还可以优选地表征为具有大约25-50％、优选35-45％的鸟嘌呤摩尔含量和/或具有大约1.0-2.0、优选1.2-1.8的AG/TC摩尔比(为了本发明的目的，AG意思是指序列中A和G核苷酸的总数，而TC意思是指序列中T和C核苷酸的总数)。
本发明的优选实施方案是●(GT)n或(AC)n寡聚物(oligopolymer)，其中n为35-60，优选40-50；●(T)n或(G)n或(A)n或(C)n或(肌苷)n单一多聚物(omopolymer)，其中n为70-120，优选80-100。
在本发明的条件内，措辞“基本上没有分子间和/或分子内碱基配对”意思是指在严格和非严格条件下DNA或多核苷酸序列的分子间和/或分子内碱基配对没有达到高于20％、优选高于10％、甚至更加优选高于5％的程度。此种结果是它们的结构的直接结果，因为如下事实实际上阻止了任何种类的杂交●具有1.0-2.0的AG/TC摩尔比；或●为(GT)n或(AC)n寡聚物，其中n大于30；或●为(T)n或(G)n或(A)n或(C)n或(肌苷)n单一多聚物，其中n大于60。
根据下面的讨论很明显本发明的适体确实选择性地并有效地抑制组织蛋白酶G，并且因此它们可以用于制造治疗和预防炎症发生、前凝血剂不良状况、遗传病、退化性疾病、DNA损伤、瘤形成和/或皮肤病的药物，因此这代表了是本发明的目标。本发明的进一步目标是包含本发明抑制组织蛋白酶G的适体和通常的赋形剂和/或佐剂的药物组合物。本发明的其它目标是选自序列表中所报道(即选自SEQ ID NO1至SEQ ID NO18)的抑制组织蛋白酶G的适体。
实施例实验部分材料组织蛋白酶G购自Europa Bioproducts或Calbiochem。所有的寡核苷酸从Eurogentec Bel SA(比利时)得到并在使用前用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)纯化。一些已经通过PAGE纯化的寡核苷酸从Gibco BRLCustom Primers得到。Taq聚合酶购自Pharmacia Amersham Biotech，而dNTP钠盐购自Boehringer Mannheim。T4多核苷酸激酶、连接酶和限制酶购自Gibco Life Technologies。使用Qiagen试剂盒进行质粒小量制备纯化并且使用T7序列(Pharmacia Amersham Biotech)和[γ-33P]dATP(NenLife Sciences)进行测序。
ssDNA文库合成的随机库是96个碱基长度的，并且分子的中间部分是随机区，随机区的两侧是用于扩增、克隆和测序的两个恒定区；其序列为5’CGTACGGAATTCGCTAGC(N)60GGATCCGAGCTCCACGTG-3’。下划线的序列分别指EcoRI和BamHI的限制位点。
通过使用引物II-up(其序列为5’-CGTACGGAATTCGCTAGC-3’)和引物III-Down(5’Biot-CACGTCGAGCTCGGATCC-3’，其中在5’端进行生物素化以便能够被链霉亲和素柱结合以得到ssDNA)的PCR对库进行扩增。
选择方法将开始的随机库用32p进行放射性标记、在高温下变性并在接近生理条件的孵育缓冲液(IB缓冲液30mM Tris HCl pH7.5，150mM NaCl，5mM KCl和5mM MgCl2)中与组织蛋白酶G孵育。
孵育在冰上进行90分钟，然后将样品装载到填有用IB缓冲液溶胀和平衡的琼脂糖SP(Amersham Pharmacia Biotech)的亲和层析微型柱上。将ssDNA/蛋白质溶液与树脂在4℃孵育30分钟。用缓冲液IB洗掉未结合的寡核苷酸分子，将保留下的更具有选择性的寡核苷酸分子用高离子强度洗脱缓冲液(EB缓冲液0.8M NaCl，50mM Tris pH7.8)从柱上洗脱下来。
为了增加严格性可以在选择过程中改变洗涤体积和DNA浓度，其中在第一个循环中DNA浓度是蛋白质的两倍，但浓度逐渐减低。
测定各个级分并将Selex循环的产量表示为总放射性的百分数。收集洗涤流过液和EB洗脱的前2个级分并扩增。
聚合酶链式反应使用0.3-0.5u/50μl浓度的Taq聚合酶进行聚合酶链式反应，缓冲液为生产者所指定的。在每次不同的选择后调整循环数。
在插入用于克隆的质粒载体之前，将DNA进行反应以得到平端在推荐的缓冲液中将一份正常PCR反应与2.5u/μl Pfu Turbo聚合酶(Stratagene)在72℃孵育30分钟。
ssDNA的产生为了从dsDNA得到ssDNA我们使用了碱变性方法。使用生物素化的Down-II引物扩增DNA并结合到填有链霉亲和素琼脂糖(Pierce)的色谱柱上。在孵育30分钟后，使用NaCl 50mM，Tris/HCl 100mM，EDTA 10mM的缓冲液(SBB-链霉亲和素结合缓冲液)将未结合的dsDNA洗掉，而保留部分是变性的并且用0.15N NaOH洗下来。然后沉淀并收集用于选择循环。
克隆和测序使用2.5单位的EcoRI处理扩增的dsDNA和载体pUC19(Amersham-Pharmacia Biotech)并且使用产生平端的SmaI处理载体。
沉淀后，将3pmol dsDNA和0.6pmol pUC19在推荐的缓冲液中使用T4连接酶进行反应。
然后通过使用E.coli pulser(Biorad)的电穿孔方法将质粒导入大肠杆菌(E.coli)感受态细胞(SURE株，Stratagene)并铺于含有氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的固体培养基(用于蓝白斑筛选)上。分别挑取50个不同的白色克隆，并在液体LB培养基中生长并收获。通过碱裂解纯化质粒并通过琼脂糖凝胶电泳测定每次纯化的质粒的质量。
使用Sanger方法测定了适体的序列，其中用[γ-33P]dATP进行标记并使用2个不同引物EleA4575’-ACG-CCA-AGC-TTG-CAT-3’(正义)和EleS5’-GGG-TTT-TCC-CAG-TCA-CGA-3’(反义)。
Kd和Ki的测定如在选择方法中所实施，通过亲和层析测定了寡核苷酸的亲和性。将每一寡核苷酸的不同等分试样与15μg的组织蛋白酶G在冰上预先孵育。然后将溶液装载于用于选择的微型层析柱上并使用15倍体积的IB缓冲液洗涤。在孵育1小时后，用6倍体积的EB缓冲液洗涤。收集相等体积的级分并测定。
表面等离振子共振(SPR)实验将来自人嗜中性粒细胞的组织蛋白酶G溶解于HBS EP缓冲液，pH7.40(Biacore)，并按照Biacore推荐的方法使用Biacore胺偶联试剂盒将其固定于CM 5研究级传感器芯片流动室表面。空白对照流动室是通过使用不含组织蛋白酶G而含有所有上述试剂的试剂制备的。固定于流动室表面的组织蛋白酶G的量是5178.91±129.63RU。
将适体[Poly GT(链长度20、30、40、60、80和100)和Poly AC(链长度20、40和80]溶解于30mM Tris-HCl缓冲液，pH7.50，150mM NaCl，5mM KCl和5mM MgCl2中，并且注射到组织蛋白酶G表面或空白对照表面。进行3组实验。第一组，所有的适体浓度为500nM；第二组，所有的适体浓度为6595μg/L；第三组，根据待测试的适体浓度范围为15.6-8000nM。所有上述实验均使用运行缓冲液Biacore HBS EP Buffer，pH7.40并于25℃下进行。通过两次注射2M NaCl使组织蛋白酶G表面再生。将每一样品的传感图减去对照的传感图并且评价了结合反应。将在第三个实验中得到的结合反应以浓度(nM)的对数作图得到浓度-效应曲线，以便找出能够结合来自人嗜中性粒细胞的组织蛋白酶G的相对有效的适体。
结果部分适体的选择和鉴定我们从DNA库开始选择了组织蛋白酶G的适体，其中DNA库具有60个核苷酸的随机区和两侧的具有用于PCR反应的保守序列和用于随后克隆步骤的限制位点的区域(见上)。
我们选择亲和层析作为选择方法，将蛋白质结合到树脂上。因为在生理条件下带有正电荷的组织蛋白酶G(理论等电点为11)能够紧密地结合到离子交换树脂上，而DNA分子与树脂的非特异结合大大降低了，所以该方法是最容易的方法。实际上，只有识别蛋白质的DNA分子保留在柱子上，而未结合的物质将被洗掉。我们试着通过在结合溶液中包含5mM的氯化钾和氯化镁以提高缓冲液的离子强度并稳定寡核苷酸的折叠来获得标记ssDNA和蛋白质间更有选择性地结合过程。
然后使用高离子强度缓冲液(缓冲液EB)将选择的分子连同结合的蛋白质一起从柱子上有效去除并测定放射性。收集前两个级分和洗涤流过液，PCR扩增并还原成单链分子便于在下一循环中使用(细节见方法部分)。
我们进行了9个循环的选择在第四个循环后观察到产量明显增加，但是在三轮后没有观察到库亲和性的进一步增加时于是终止SELEX，实现了42％的终产量(表1)。通过改变洗涤次数和体积增加了选择的严格性。在第5和7个循环后进行保护柱的操作以避免适体非特异结合树脂将来自先前循环的库装载到没有蛋白质的柱子上，从柱中洗脱的第一个级分用于扩增并用于下一个循环。
图1SELEX循环方案图
序列分析如在实验部分所描述将选择的分子克隆入大肠杆菌细胞并测序。在50个克隆中发现了19个不同的序列。使用了两个序列比对程序即Clustal W和FastA-align查找重复的共有序列，但是由于分子的多样性相当高以致于甚至在所测序分子的子集中也没有得到好的比对。进一步的分析表明GT基序明显地在14个序列中出现重复。仔细观察后发现它们不易于形成适当程度的分子间和分子内碱基配对也不能形成像G四方结构(G quartet)一样的更加复杂的三维结构。看起来，选择方法产生了能够紧密结合带正电荷蛋白质的松散的、线性的和灵活的分子，它们的结合是由于电荷-电荷之间的相互作用。为了证实该假设，我们将所选择适体之一即60mer CG51与不具有配对序列的其他寡核苷酸如oligo GT或AC结构进行了比较。在最后一个循环的选择中得到的寡核苷酸序列报道如下；它们每一个记做不同的编号(其中CG51和CG43是相同的)。
上面的序列对应如下的序列表CG1＝SEQ ID NO1，CG3＝SEQ IDNO2，CG11＝SEQ ID NO3，CG16＝SEQ ID NO4，CG20＝SEQ ID NO5，CG25＝SEQ ID NO6，CG28＝SEQ ID NO7，CG32＝SEQ ID NO8，CG39＝SEQ ID NO9，CG43(和CG51)＝SEQ ID NO10，CG48＝SEQ IDNO11，CG49＝SEQ ID NO12，CG2＝SEQ ID NO13，CG31＝SEQ IDNO14，CG23＝SEQ ID NO15，CG34＝SEQ ID NO16，CG45＝SEQ IDNO17，CG40＝SEQ ID NO18。
所选择分子和相关序列对组织蛋白酶G的亲和性CG1GGGTGGCCCCCTAGTCGCGCACTGGAAGCGGTAGTGTCGTGAGATTCGTATCTGGGGTATCG3CAACGAGTCAGGGCGTGATTGGTGAAGATGTGTGGTTTGGCCAGAAAGGGCGATGGTGGACG11AGAGCTGAGACGGACATGCTGCCCATGGAGACTGTTCGAGAGGGTGAGCGGGAGTGGGCG16ACCCCTAGGTCAGCACGTAGTGTAGGGCGATGTGTTCATGGCGGGAATGTGAGTTGTGGGCG20GGGCGGCTCGCGTTGTGGAACATTCGTGGTGCCAATGCGTACCAGGGATTGCCTCCTGTCG25GGGCGATTGGCGAATGCAAGGGTAAGGTTGGGCGATTGATGTGCACGTAGC GCAGAGCATCG28GGAACGTGGTAGGTGTGTCTGCTGTGTGTGGCTCGGGCAGGTTGTCAGGGTGTTT
CG32GGGCATAGGGCGTCGTAGCCTGAAGGTGTGATTCGTGCGTTAGATGGGGGGCAGTCTGCCG39CGGTGGAGAGGTCGCAATGACACGGTTGACGATAGGCCCCTTGCTAACATCGGTTGGTGCG43CAACGTGTGATATGTGGGTATACGCTTGGGTGTTACGCTGAGCACAGAGGGTATTCGTGTCG48AGSGGGCAGCAGCACACCACACATGTACGTGGGGGATTGCATTGTGTACTTAGACGGTATCG49GGCCTGGGTGATGTACTATGTATGCGTCGTGGTGGCTGGTAAAGGGGGTCTGCTATGGGTCG51CAACGTGTGATATGTGGGTATACGCTTGGGTGTTACGCTGAGCACAGAGGGTATTCGTGTCG2CCACGGACGCTGTGAGCGGCCAACGGATGGGAATCACGATCTGGCCCGAACCACATACCGCG31TCACACTAGGGCACTTGCTAAGTAGCTATGTAACTCGATCATACTTATTAGGCTTGCG23AATCGATGGACACTTCAACGCAACTTGACATGGCGGTACGTGGACTCTTGTGGCGACAGTTCG34AACCCGTGTGATAAGGATATGGTGACTTCGTGGCACAGCGTCGACGGACTGCCCATTCCACG45GGCGGGCGGTATGGGCTGCAGGATATGCAGGGGCGCAGAGGACAGTCTGGCCATGTACTACG40GGCAGGGACGTTCCCAGGAATGCGGCACAGGCAGACAGCTCCCGACGAGTACCAGGGTG通过与选择方法类似的亲和层析法评价了寡核苷酸与组织蛋白酶G的结合。首先，将适体CG51与同样长度的AC和GT寡核苷酸比较，如所提到，这些AC和GT寡核苷酸不能明显折叠成通过沃森-克里克碱基配对或G四方结构形成所表征的任何结构。将CG51的互补序列(叫作cmpCG51)作为对照。此外，为了证明寡核苷酸长度是否是结合蛋白质的重要因素，测定了长于或短于60个核苷酸的AC和GT寡核苷酸的亲和性。
如通过SELEX的高产量所预测，CG51表现出对组织蛋白酶G高的亲和性(Kd为0.9nM)。除此之外，其Kd与相同长度的AC和GT寡核苷酸(Kd分别为0.8nM和1nM)和cmpCG51(Kd为0.6nM)的Kd是可比的(图1)。这些资料表明，关于通过松散和灵活分子紧密结合的假设是正确的。
比60mer长的分子如(AC)60和(GT)40(它们分别为120mer和80mer)表现出Kd为1.2nM的亲和性。另一方面，较短的分子(GT)20和(GT)10的Kd分别为1.5nM和2nM，这表明所选择寡核苷酸的长度对于有效结合是重要的。
为了证明寡核苷酸的结构对于组织蛋白酶的结合是否是重要的，将所选择的针对凝血酶的适体THR作为对照。已知该适体形成稳定的G四方结构。在这种情况下，Kd值低(4nM)，表明该类型的结构不可能表现出有效的识别基序。
有趣地是，双链CG51表现出比单链更低的亲和性，即使单链具有大量带电荷的基团也是如此。的确，双链寡核苷酸体积更大且更不灵活，因此不能最佳结合蛋白质。
表面等离振子共振(SPR)实验从第一组实验(每一适体为500nM)得到的资料提供了第一种证据，即以GT适体为例，超过60的链长度的增加导致结合的增加，但是这种增加比30-60范围内的增加较缓。在20-30的范围内时结合较差。以AC适体为例，它们的结合比GT适体的结合更不显著。SPR反应与分析物(在本例中为适体)的表面质量浓度相关，因此其取决于与表面(在本例中由组织蛋白酶G制成)结合部位数量有关的分析物的分子量。为了排除一下疑问，即适体的明显结合不是取决于适体的质量而恰恰是取决于适体结构特征，开展了第二组实验，其中质量浓度是相同的(每个适体浓度为6595μg/L)。结果同第一组实验所得到的结果(为了简短起见没有显示数据)。在图2中总结了GT和AC适体的浓度对数-效应的曲线。在该图中报道了每个适体在所提到的得到线性回归的浓度范围内的反应。GT 100是最有效的适体并被赋予效能为1(相对标准)。GT 80的相对效能大约为0.32，GT 60的相对效能大约为0.144，AC 80的相对效能大约为0.017，GT 40的相对效能大约为0.016，AC 40的相对效能大约为0.0047且GT 30的相对效能大约为0.0020。由于GT 20和AC 20结合较差，所以无法估计数值。可以粗略地将适体分成三个家族(图2)。第一家族GT 100，GT 80和GT 60；第二家族AC 80，GT 40，AC 40和GT30；第三家族AC 20和GT 20。
在图3中总结了PolyT适体的浓度对数-效应曲线。正如所认识到的，分别具有序列(T)100和(T)80的适体PolyT100和PolyT80比PolyT60更有效。讨论仅在四个循环的选择之后，可以看到结合到蛋白质的分子的百分数极大增加，并且在第9个循环得到了42％的产量，不可能进一步地对库进行富集。然而对所选择适体的序列分析没有发现它们具有共有基序的证据。仔细观察后发现这些分子大多数缺乏GT/C，因此不可能进行配对并折叠成G四方结构。可能带负电荷和灵活的单链DNA分子能够最好地结合这种带正电荷的蛋白质。甚至在SELEX缓冲液中存在相当数量的氯化钠和氯化镁的情况下，靶分子与蛋白质之间的相互作用仍然主要通过电荷相互作用控制着。
为了证实该奇特的“一致的”基因原理的假设，将所选择适体之一CG51的亲和性与几种AC和GT寡核苷酸的亲和性比较。我们确认CG51对组织蛋白酶G具有相当高的亲和性，其Kd在纳摩尔范围内，这表明选择过程有效选择出了有效的结合子(binder)库。(AC)30、(GT)30和与CG51具有相同长度(和总体结构特性的)的cmpCG51的解离常数是可比的，而较短的分子表现出较低的亲和性。双链CG51表现出对组织蛋白酶G较低的亲和性该意义十分巨大，因为它证明平均长度为30bp的染色体DNA不能够结合该蛋白质。
我们证明长度至少为60，优选70-80的线性和灵活的单链DNA与染色体对等物相比能够更有效结合组织蛋白酶G，并且也比较短的DNA链更有效。
序列表<110>真蒂奥姆有限公司<120>人组织蛋白酶G的DNA适体<130>04MG31E<150>EP 03425428.4<151>2003-06-30<160>18<170>PatentIn版本3.1<210>1<211>60<212>DNA<213>未鉴定<400>1gggtggcccc ctagtcgcgc actggaagcg gtagtgtcgt gagattcgta tctggggtat60<210>2<211>60<212>DNA<213>未鉴定<400>2caacgagtca gggcgtgatt ggtgaagatg tgtggtttgg ccagaaaggg cgatggtgga60<210>3<211>58<212>DNA<213>未鉴定<400>3agagctgaga cggacatgct gcccatggag actgttcgag agggtgagcg ggagtggg 58<210>4<211>60<212>DNA<213>未鉴定<400>4acccctaggt cagcacgtag tgtagggcga tgtgttcatg gcgggaatgt gagttgtggg60<210>5<211>59
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<400>17ggcgggcggt atgggctgca ggatatgcag gggcgcagag gacagtctgg ccatgtacta60<210>18<211>59<212>DNA<213>未鉴定<400>18ggcagggacg ttcccaggaa tgcggcacag gcagacagct cccgacgagt accagggtg 59
权利要求
1.抑制组织蛋白酶G的适体，其由具有至少60个核苷酸的链长度和经受低于20％的程度的分子间和/或分子内碱基配对的线性DNA或多核苷酸序列组成，其中所述序列表征为·具有1.0-2.0的AG/TC摩尔比；或·是(GT)n或(AC)n寡聚物，其中n大于30；或·是(T)n或(G)n或(A)n或(C)n或(肌苷)n单一多聚物，其中n大于60。
2.按照权利要求1所述的抑制组织蛋白酶G的适体，其特征在于具有60-120个核苷酸的链长度。
3.按照权利要求2所述的抑制组织蛋白酶G的适体，其特征在于具有70-110个核苷酸的链长度。
4.按照权利要求3所述的抑制组织蛋白酶G的适体，其特征在于具有80-100个核苷酸的链长度。
5.按照权利要求1-4中任意一项所述的抑制组织蛋白酶G的适体，其特征在于事实上其为单链序列。
6.按照权利要求1-5中任意一项所述的抑制组织蛋白酶G的适体，其特征在于具有1.2-1.8的AG/TC摩尔比。
7.按照权利要求1-6中任意一项所述的抑制组织蛋白酶G的适体，其特征在于具有25-50％的鸟嘌呤摩尔含量。
8.按照权利要求7所述的抑制组织蛋白酶G的适体，其特征在于具有35-45％的鸟嘌呤摩尔含量。
9.按照权利要求1-8中任意一项所述的抑制组织蛋白酶G的适体，其特征在于其为(GT)n或(AC)n寡聚物，其中n为30-60。
10.按照权利要求9所述的抑制组织蛋白酶G的适体，其特征在于其为(GT)n或(AC)n寡聚物，其中n为35-60、优选40-50。
11.按照权利要求1-8中任意一项所述的抑制组织蛋白酶G的适体，其特征在于其为(T)n或(G)n或(A)n或(C)n或(肌苷)n单一多聚物，其中n为60-120。
12.按照权利要求11所述的抑制组织蛋白酶G的适体，其特征在于其为(T)n或(G)n或(A)n或(C)n或(肌苷)n单一多聚物，其中n为70-120、优选80-100。
13.按照权利要求12所述的抑制组织蛋白酶G的适体，其特征在于经受低于10％的程度的分子间和/或分子内碱基配对。
14.按照权利要求13所述的抑制组织蛋白酶G的适体，其特征在于经受低于5％的程度的分子间和/或分子内碱基配对。
15.按照权利要求1-14任意一项所述的抑制组织蛋白酶G的适体的用途，其用于制造治疗和预防炎症发生、前凝血剂不良状况、遗传病、退化性疾病、DNA损伤、瘤形成和/或皮肤病的药物。
16.药物组合物，其中包含按照权利要求1-14任意一项所述的至少一种抑制组织蛋白酶G的适体和通常的赋形剂和/或佐剂。
全文摘要
本发明致力于组织蛋白酶G的非肽抑制剂的鉴定，其中所述的抑制剂具有高水平选择性并且能够有效地用于治疗和预防炎症发生和前凝血剂不良状况。本发明的抑制组织蛋白酶G的适体由具有至少60个核苷酸的链长度并且基本上没有有效的碱基配对的线性DNA或多核苷酸序列组成。
文档编号A61P29/00GK1816625SQ200480018755
公开日2006年8月9日 申请日期2004年6月18日 优先权日2003年6月30日
发明者M·帕伦博, B·加托, R·佩斯卡多尔, R·波尔塔, L·I·费罗 申请人:真蒂奥姆有限公司