骨生成促进和/或骨吸收抑制剂的制作方法

专利名称：骨生成促进和/或骨吸收抑制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及以β2微球蛋白、组蛋白、补体成分3、单核细胞趋化性蛋白质1、溶菌酶、核糖核酸酶、凝血酶原、细胞色素P-450、纤溶酶原、运铁蛋白、凝血酶、纤溶酶、补体成分4、β防卫素及它们的酶解产物中的任意1种以上作为有效成分的骨生成促进和/或骨吸收抑制剂。本发明还涉及掺入了β2微球蛋白、组蛋白、补体成分3、单核细胞趋化性蛋白质1、溶菌酶、核糖核酸酶、凝血酶原、细胞色素P-450、纤溶酶原、运铁蛋白、凝血酶、纤溶酶、补体成分4、β防卫素及它们的酶解产物中的任意1种以上的骨生成促进和/或骨吸收抑制剂，以及骨生成促进和/或骨吸收抑制用饮食品、药物或饲料。
背景技术：
近年来，随着老龄人口的增加，骨质疏松症、骨折、腰痛等各种骨疾病有增加的趋势。骨组织中不断地进行着骨生成和骨吸收，年轻时骨生成和骨吸收保持平衡，随着年龄增长由于各种原因该平衡倾向于骨吸收(解偶联)。而且，如果该状态长期持续，则骨组织变脆，会产生骨质疏松症、骨折、腰痛等各种骨疾病。如果能够防止该解偶联，则可以预防骨质疏松症、骨折、腰痛等各种骨疾病。
一直以来，作为防止解偶联、预防或治疗各种骨疾病的方法，进行(1)通过食物的钙补充、(2)轻度运动、(3)日光浴、(4)药物治疗等。通过食物的钙补充使用碳酸钙、磷酸钙等钙盐或蛋壳、鱼骨粉等天然钙剂。但是，它们未必能说是适合口服摄取的素材。
轻度运动可以是慢跑或散步等，但身体虚弱的情况下轻度运动也是困难的，而卧床不起的老人几乎无法运动。日光浴从补充活性维生素D3的角度是好的，但是仅靠这一方式是不够的。服用药物时使用1α-羟基维生素D3或降钙素等，已知对骨质疏松症的治疗是有效的。但是，这些物质是药物，也不能作为食品素材使用。
破骨细胞是由造血干细胞产生、存在于海绵质骨表面、溶解骨的细胞。此外，成骨细胞是存在于骨组织表面、在胶原等骨基质蛋白质旺盛地合成的骨生成中起到中心作用的细胞。在该骨基质蛋白质上沉积磷酸钙、羟磷石灰的结晶(钙化)，则形成硬的骨组织。
通过破骨细胞溶解骨基质(骨吸收)，然后成骨细胞合成骨基质(骨生成)，从而产生骨的生成和成长(塑建)、代谢(重建)。
为了得到可作为食品素材的具有骨生成促进作用和骨吸收抑制作用的物质，本发明者持续探索了存在于乳清蛋白质中的骨生成促进因子和骨吸收抑制因子。结果发现，通过反渗透膜和电透析等的处理从乳清蛋白质的水溶性部分除去了乳清来源的盐的蛋白质和肽的混合物具有骨强化作用(日本专利特开平4-183371号公报)。而且，发现对该蛋白质和肽的混合物的水溶液进行乙醇处理、加热处理、加盐处理、超滤膜处理而得到的部分具有成骨细胞增殖促进作用和骨强化作用(例如日本专利特开平5-176715号公报和日本专利特开平5-320066号公报)。此外，还发现在奶中仅微量存在的碱性蛋白质具有成骨细胞增殖促进作用、骨强化作用和骨吸收抑制作用(日本专利特开平8-151331号公报)。
本发明者进一步进行探索，尝试分离纯化具有骨生成促进作用和骨吸收抑制作用的活性本体，鉴定该物质后发现，通过已知物质β2微球蛋白、组蛋白、补体成分3、单核细胞趋化性蛋白质1、溶菌酶、核糖核酸酶、凝血酶原、细胞色素P-450、纤溶酶原、运铁蛋白、凝血酶、纤溶酶及它们的酶解产物，破骨细胞引起的骨吸收显著地受到抑制。
此外，还发现通过凝血酶原、细胞色素P-450、纤溶酶原、运铁蛋白、凝血酶、纤溶酶及它们的酶解产物，破骨细胞引起的骨吸收在显著地受到抑制的同时促进成骨细胞的增殖，因而骨生成得到促进。
另外，还发现通过由补体成分4、β防卫素及它们的酶解产物促进成骨细胞的分化，骨生成得到促进，从而完成了本发明。
β2微球蛋白(β2-Microglobulin)是分子量约11.6kDa的蛋白质，是主要组织相容性复合体(MHC)的构成成分。已知广泛分布在血液为首的全身组织中，也被报道存在于人类和牛的奶中。关于β2微球蛋白对骨的作用，有作为骨代谢转换的标记，高转换型骨质疏松症的血中β2微球蛋白浓度升高的报道(J.M.Quesada及其他6人，“作为高龄女性的高骨重建的标记的血清β2微球蛋白”，Mechanism of Aging and Development，(美国)1998年，102号，293-298页)。此外，还有由于促进培养成骨细胞MC3T3的增殖、因而β2微球蛋白促进骨生成的报道(E.Balint和其他2人，“在β2微球蛋白诱导的矿物质从骨的溶出中的白细胞介素6的作用”，Kidney International，(美国)2000年，57号，1599-1607页)。另一方面，关于骨吸收作用，有β2微球蛋白促进钙从骨溶出的报道(J.Petersen和另1人，“β2微球蛋白的骨吸收中的活体效果”，AmericanJournal of Kidney Diseases，(美国)1994年，23号，726-730页)。但是，促进钙溶出的作用和抑制骨吸收的作用不同，没有见到记载了关于如本发明者发现的β2微球蛋白抑制骨吸收的作用的文献。
组蛋白(Histone)是存在于高等动物的细胞核中的碱性蛋白质。高等动物中，据说掌握基因信息的DNA(脱氧核糖核酸)以直线距离计长约2m，为了将该DNA高效地收纳在细胞核中，组蛋白是必须的蛋白质。即，DNA以缠绕附着在组蛋白上的状态功能性地折叠。通常由H1、H2A、H2B、H3、H4这5种分子种类构成，以H2A、H2B、H3、H4各2分子共计8分子形成一个集合体。DNA缠绕附着在该集合体上，形成被称作染色质的单位。H1起到使染色质相互连接的作用。组蛋白和DNA通常是这样成组的，以重量比表示大致1∶1的比例存在于核内。至今，对于DNA作为核酸及其构成成分，进行了大量关于营养效果的报道，核酸也被认为可能是第6必须营养素。但是，对于与其成对存在的组蛋白，没有报道过营养效果。动物性食物基本上是细胞的集合体。因此，组蛋白是只要摄取了食物、不论动物的种类都必然会摄入的蛋白质。但是，人类在绝大多数情况下摄取使用了像精白米和小麦粉、砂糖等这样精制的、不含细胞核的食物素材的无细胞食品。如果只需要组蛋白的骨吸收抑制作用，在进食时大量摄入作为细胞块的肝脏和鱼白等食物素材即可，但是味觉上和食品加工上的问题大，制约极大。
补体(Complement component)是存在于血清中、与抗原抗体复合物反应而被活化、引发复杂的反应并发挥生理活性的酶样物质。现在，已知C1～C9九个成分。Complement component 3、即C3被称作补体成分3，是补体成分中含量最多的。其结构为分子量10.5万的α链和分子量7.5万的β链通过两处S-S键交联的糖蛋白。该分子量18万的C3通过C3转化酶被分成α链的一部分分解而成的分子量9000的C3a和含有两处S-S键的余下的分子量17万的C3b。C3a刺激肥大细胞促进组胺的释放等，已知是引起炎症反应的代表性的过敏毒素之一。C3b被C3转化酶进一步分解，其一部分与抗原抗体复合物共价结合。由于血液中的巨噬细胞等吞噬细胞在细胞表面具有C3b受体，结果该反应使吞噬细胞对异物的吞噬亢进。由此，补体成分3(C3)是与免疫反应密切相关的物质。另外，还公开了含有补体成分3作为有效成分的胚胎·胎儿及其组织培养用营养因子组合物和不孕症治疗用组合物(日本专利特开平10-033164号公报)。由本发明知道，补体成分3对于具有分解作为自体组织的骨组织的功能的破骨细胞相反地起到抑制其活性的作用。
单核细胞趋化性蛋白质-1(Monocyte chemotactic protein-1或Monocytechemoattractant protein-1、MCP-1)是单核细胞和血管内皮、神经胶质瘤细胞质等产生的单核细胞趋化性因子。它与RANTES(regulated on activation，normal T cell expressed and secreted，调节活化正常T细胞表达和分泌因子)都是代表性的C-C趋化因子家族成员之一，分子量为8000～18000，由76个氨基酸构成。主要对单核细胞表现出趋化性，对中性白细胞和淋巴细胞没有作用。
溶菌酶(Lysozyme)是水解存在于细菌细胞壁的黏肽等中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡萄糖胺之间的β-1→4键的酶，广泛分布于动植物界。根据基质特异性和分子量分为4类。
核糖核酸酶(Ribonucl ease)是作用于作为核酸的一种的核糖核酸(RNA)、产生单核苷酸或寡核苷酸的酶的总称。
凝血酶原(Prothrombin)是分子量约7.2kDa的蛋白质，也被称作凝血因子II。它是维生素K依赖性凝血因子之一，在维生素K的存在下通过因子X分解成凝血酶。产生的凝血酶将纤维蛋白原分解成纤维蛋白，通过纤维蛋白的交联血液凝固。已知凝血酶原广泛分布在血液为代表的全身组织中，也被报道存在于人类和牛的奶中。
凝血酶(Thrombin)如上所述是由因子X等酶分解凝血酶原而得到的。
细胞色素P-450(Cytochrome P-450)是以还原态结合一氧化碳在450nm附近表现出索雷吸收带的一族血红素蛋白的总称。功能上涉及各种甾类激素、胆汁酸、前列腺素类激素的合成·分解反应，脂肪酸的ω氧化，维生素D的活化反应，无数的外源药物和进入体内的环境污染物质等的氧化解毒反应。
纤溶酶原(Plasminogen)是纤溶酶的前体，存在于动物血浆中，通过纤溶酶原激活物切断分子内的Arg-Val键而成为活性的纤溶酶。它是分子量约91000的单链糖蛋白，通过纤溶酶等蛋白酶N末端侧的肽链被切断，形成分子量约82000的修饰了的纤溶酶原。
纤溶酶(Plasmin)是如上所述通过纤溶酶原激活物等酶分解纤溶酶原得到的。
运铁蛋白(Transferrin)是与血中的运送铁结合的分子量约75000的蛋白质，也被称作铁结合蛋白。未熟红细胞具有对于与运铁蛋白结合的铁的受体，为了将血清铁用于血红蛋白的合成必须与运铁蛋白结合。对于运铁蛋白揭示了膜结合型运铁蛋白样蛋白质促进软骨细胞的生成，但这是促进软骨细胞的生成，与促进骨生成机理完全不同(日本专利特开2002-20331号公报和再公开专利WO 01/013951号公报)。
补体成分4(Complement component C4)是存在于血清中、与抗原抗体复合物反应而被活化、引发复杂的反应并发挥生理活性的酶样物质。补体成分4本身不具有对抗原的特异性，但通过抗原抗体复合物被活化，引起吞噬作用的亢进，或者破坏结合了特异抗体的细胞或细菌。补体成分4是由称作α链、β链、γ链的3种多肽链构成的分子量210kDa的蛋白质。过去关于补体成分4促进成骨细胞的分化并不为人所知。
防卫素(Defensin)作为分子内具有3个S-S键的强碱性抗菌肽已知，是存在4～10个精氨酸残基、6个半胱氨酸残基的由29～34个氨基酸构成的碱性蛋白质。根据半胱氨酸残基存在位置的不同，大致分为α型和β型。不仅具有对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的抗菌活性，而且对霉菌和病毒也具有抗菌活性。已知β防卫素在呼吸系统上皮细胞和粘膜上皮细胞中有表达，在人类中有6种类型。已知防卫素除了抗菌作用之外，还广泛涉及对正常细胞和癌细胞的细胞毒效应、自肥大细胞的组胺释放作用、单核细胞趋化作用等生物防御。揭示有通过投与酵母和乳酸菌的特定的培养液滤液使防卫素等分泌的反转录病毒感染症治疗药(日本专利特开2004-115497号公报)和由刺激皮肤中的防卫素的表达的蒿属植物的根得到的化妆用组合物等(日本专利特开2004-067660号公报)，过去关于其促进成骨细胞的分化并不为人所知。
这些具有骨生成促进作用和骨吸收抑制作用的物质中，关于β2微球蛋白如前所述有促进钙从骨溶出等报道。但是，也如前所述，促进钙溶出的作用与抑制骨吸收的作用不同，没有发现记载了关于如本发明者所发现的β2微球蛋白抑制骨吸收的作用的文献。对于除β2微球蛋白之外的组蛋白、补体成分3、单核细胞趋化性蛋白质1、溶菌酶、核糖核酸酶、凝血酶原、细胞色素P-450、纤溶酶原、运铁蛋白、凝血酶、纤溶酶、补体成分4、β防卫素及它们的酶解产物中的任一种，也没有发现记载关于其骨生成促进和抑制骨吸收的作用的文献。
发明的揭示发明要解决的课题本发明的课题是提供从骨质疏松症、骨折、腰痛等各种骨疾病的性质看可以在日常的饮食偏好上不产生问题，长期地直接口服摄取，并直接对骨给予骨生成促进和骨吸收抑制作用，能够期待骨质疏松症、骨折、腰痛等各种骨疾病的预防或改善治疗效果的新的骨生成促进和骨吸收抑制剂，以及骨生成促进和骨吸收抑制用饮食品、药物或饲料。
解决课题的方法本发明者鉴于这些问题，广泛地对食品素材所含有的表现出骨强化作用的物质进行了认真研究，对于具备骨生成促进作用和骨吸收抑制作用的蛋白质，尝试分离纯化具有骨生成促进和骨吸收抑制作用的成分，鉴定该物质后发现，已知物质β2微球蛋白、组蛋白、补体成分3、单核细胞趋化性蛋白质1、溶菌酶、核糖核酸酶、凝血酶原、细胞色素P-450、纤溶酶原、运铁蛋白、凝血酶、纤溶酶及它们的酶解产物显著地抑制破骨细胞引起的骨吸收，此外，凝血酶原、细胞色素P-450、纤溶酶原、运铁蛋白、凝血酶、纤溶酶及它们的酶解产物在显著地抑制破骨细胞引起的骨吸收的同时通过促进成骨细胞的增殖促进骨生成，另外，通过补体成分4、β防卫素及它们的酶解产物促进成骨细胞的分化，骨生成得到促进。
而且，发现可以将这些物质用作骨生成促进和/或骨吸收抑制剂，从而完成了本发明。
即，本发明涉及以β2微球蛋白、组蛋白、补体成分3、单核细胞趋化性蛋白质1、溶菌酶、核糖核酸酶、凝血酶原、细胞色素P-450、纤溶酶原、运铁蛋白、凝血酶、纤溶酶、补体成分4、β防卫素及它们的酶解产物中的任意1种以上作为有效成分的骨生成促进和/或骨吸收抑制剂。
此外，本发明还涉及掺入了β2微球蛋白、组蛋白、补体成分3、单核细胞趋化性蛋白质1、溶菌酶、核糖核酸酶、凝血酶原、细胞色素P-450、纤溶酶原、运铁蛋白、凝血酶、纤溶酶、补体成分4、β防卫素及它们的酶解产物中的任意1种以上的骨生成促进和/或骨吸收抑制剂，以及骨生成促进和/或骨吸收抑制用饮食品、药物或饲料。
发明的效果本发明的以β2微球蛋白、组蛋白、补体成分3、单核细胞趋化性蛋白质1、溶菌酶、核糖核酸酶、凝血酶原、细胞色素P-450、纤溶酶原、运铁蛋白、凝血酶、纤溶酶、补体成分4、β防卫素及它们的酶解产物中的任意1种以上作为有效成分的骨生成促进和/或骨吸收抑制剂可以通过口服给药用于骨质疏松症等各种骨疾病的预防和改善。此外，若将这些有效成分掺入饮食品、药物或饲料，则起到促进骨生成或抑制骨吸收或预防、改善骨质疏松症等各种骨疾病的效果。
实施发明的最佳方式本发明是通过掺入β2微球蛋白、组蛋白、补体成分3、单核细胞趋化性蛋白质1、溶菌酶、核糖核酸酶、凝血酶原、细胞色素P-450、纤溶酶原、运铁蛋白、凝血酶、纤溶酶及它们的酶解产物中的任意1种以上，抑制破骨细胞引起的骨吸收的骨吸收抑制剂。
此外，本发明还是通过掺入凝血酶原、细胞色素P-450、纤溶酶原、运铁蛋白、凝血酶、纤溶酶及它们的酶解产物中的任意1种以上，显著地抑制破骨细胞引起的骨吸收、同时促进成骨细胞的增殖的骨生成促进和骨吸收抑制剂。
另外，本发明还是通过掺入补体成分4、β防卫素及它们的酶解产物中的任意1种以上，促进成骨细胞的分化的骨生成促进剂。
通过利用β2微球蛋白、组蛋白、补体成分3、单核细胞趋化性蛋白质1、溶菌酶、核糖核酸酶、凝血酶原、细胞色素P-450、纤溶酶原、运铁蛋白、凝血酶、纤溶酶、补体成分4、β防卫素及它们的酶解产物中所发现的骨生成促进和/或骨吸收抑制作用，可以期待使骨代谢偏向于骨生成优先的平衡。因此，本发明可以提供具有骨生成促进和骨吸收抑制作用的骨生成促进和/或骨吸收抑制剂、骨生成促进和/或骨吸收抑制用饮食品、药物或饲料。
本发明中，作为骨生成促进和/或骨吸收抑制的有效成分使用的β2微球蛋白、组蛋白、补体成分3、单核细胞趋化性蛋白质1、溶菌酶、核糖核酸酶、凝血酶原、细胞色素P-450、纤溶酶原、运铁蛋白、凝血酶、纤溶酶、补体成分4和β防卫素都微量地存在于牛、水牛、人类、猪、绵羊、山羊、马等的奶中，可以从奶中分离提取。奶成分可以使用鲜奶、脱脂乳、或从乳清分离的蛋白质部分、或者从鲜奶中分离的奶中的细胞部分。β2微球蛋白、补体成分3、单核细胞趋化性蛋白质1、凝血酶原、细胞色素P-450、纤溶酶原、运铁蛋白、凝血酶、纤溶酶、补体成分4和β防卫素也可以由健康的家畜的血液来制备。提取组蛋白的素材除了奶成分之外还可以使用谷物胚芽、鱼白等。谷物胚芽可以使用小麦胚芽、大米胚芽等。鱼白使用采集自鲑鱼、鳟鱼、鳕鱼、鲱鱼、乌贼、扇贝等鱼类和贝类的鱼白即可，特别是从资源的有效利用的角度来看，较好是使用鲑鱼、鳟鱼、鳕鱼等捕获量大的鱼类的鱼白。
β2微球蛋白、组蛋白、补体成分3、单核细胞趋化性蛋白质1、溶菌酶、核糖核酸酶、凝血酶原、细胞色素P-450、纤溶酶原、运铁蛋白、凝血酶、纤溶酶、补体成分4、β防卫素都在市场上有售，可以使用该市场上销售的产品。此外，也可以使用通过基因工程制作的重组体。
另外，还可以使用将β2微球蛋白、组蛋白、补体成分3、单核细胞趋化性蛋白质1、溶菌酶、核糖核酸酶、凝血酶原、细胞色素P-450、纤溶酶原、运铁蛋白、凝血酶、纤溶酶、补体成分4、β防卫素通过胰蛋白酶、胰酶制剂、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、激肽释放酶、组织蛋白酶、嗜热菌蛋白酶和V8蛋白酶等蛋白质分解酶分解得到的产物。例如，凝血酶原分解产物为将上述的凝血酶原用蛋白质分解酶部分分解得到的肽混合物。可以使用将凝血酶原用因子X等酶分解得到的凝血酶。此外，可以使用将纤溶酶原用纤溶酶原激活物等酶分解得到的纤溶酶。凝血酶、纤溶酶也和凝血酶原、纤溶酶原一样在市场上有售，可以使用该市场上销售的产品。
从奶的制备可以如下进行例如，使新鲜的牛奶与离子交换树脂接触，吸附含有β2微球蛋白、组蛋白、补体成分3、单核细胞趋化性蛋白质1、溶菌酶、核糖核酸酶、凝血酶原、细胞色素P-450、纤溶酶原、运铁蛋白、凝血酶、纤溶酶、补体成分4、β防卫素的部分，慢慢提高氯化钠的浓度而溶出后，通过凝胶过滤层析法分别得到。
从血液的制备可以如下进行使柠檬酸血浆与柠檬酸钡反应，分别回收吸附在不溶性钡上的β2微球蛋白、组蛋白、补体成分3、单核细胞趋化性蛋白质1、溶菌酶、核糖核酸酶、凝血酶原、细胞色素P-450、纤溶酶原、运铁蛋白、凝血酶、纤溶酶、补体成分4、β防卫素的沉淀。另外，可以通过离子交换层析法提高纯度。
本发明的骨生成促进和/或骨吸收抑制剂以β2微球蛋白、组蛋白、补体成分3、单核细胞趋化性蛋白质1、溶菌酶、核糖核酸酶、凝血酶原、细胞色素P-450、纤溶酶原、运铁蛋白、凝血酶、纤溶酶、补体成分4、β防卫素及它们的酶解产物中的任意1种以上作为有效成分。此外，可以将该β2微球蛋白、组蛋白、补体成分3、单核细胞趋化性蛋白质1、溶菌酶、核糖核酸酶、凝血酶原、细胞色素P-450、纤溶酶原、运铁蛋白、凝血酶、纤溶酶、补体成分4、β防卫素及它们的酶解产物中的任意1种以上掺入牛奶、奶饮料、咖啡饮料、果汁、果冻、饼干、面包、面条、香肠等饮食品中，也可以制成片剂或粉末等药物。另外，通过同时使用氯化钙、碳酸钙、乳酸钙、蛋壳、牛奶来源的钙等吸收性良好的钙剂，使骨代谢偏向于骨生成优先的平衡，也可以进一步提高骨强化作用。
本发明的骨生成促进和/或骨吸收抑制剂的给药量根据有效成分、年龄、治疗效果和病情经过不同而不同，成人的情况下，每天分数次口服摄取1ng～1g即可。通过这样摄取本发明的骨生成促进和/或骨吸收抑制剂，可以预防骨质疏松症等各种骨疾病。β2微球蛋白、组蛋白、补体成分3、单核细胞趋化性蛋白质1、溶菌酶、核糖核酸酶、凝血酶原、细胞色素P-450、纤溶酶原、运铁蛋白、凝血酶、纤溶酶、补体成分4、β防卫素原来是血浆或奶来源的成分，在大鼠中没有发现急性毒性。此外，使饲料中含有这些有效成分，也可以促进家畜或家禽等的骨生成或抑制骨吸收。
接着，例举实施例和试验例，对本发明进行详细说明，但它们只是单纯地示例本发明的实施方式，本发明并不局限于这些实施例。
(骨吸收抑制作用)考察β2微球蛋白、组蛋白、补体成分3、单核细胞趋化性蛋白质1、溶菌酶、核糖核酸酶、凝血酶原、细胞色素P-450、纤溶酶原、运铁蛋白、凝血酶和纤溶酶的骨吸收抑制作用。供于试验的各有效成分都是市场上销售的产品。供于试验的各有效成分的来源和各有效成分的最终浓度如表1所示。
摘出出生后10～20天的ICR类小鼠的长管骨，去除软组织后，利用机械方法在含有5％牛胎血清的α-MEM(Flow Laboratories公司制)溶液中将骨切细，得到含有破骨细胞的总骨髓细胞。将该含有破骨细胞的总骨髓细胞分散在象牙片上，使其达到约2×106个细胞，用含有5％牛胎血清的α-MEM溶液点样。2小时后，加入含有5％牛胎血清的α-MEM溶液，使β2微球蛋白、组蛋白、补体成分3、单核细胞趋化性蛋白质1、溶菌酶、核糖核酸酶、凝血酶原、细胞色素P-450、纤溶酶原、运铁蛋白、凝血酶和纤溶酶分别达到表1所示的最终浓度，在37℃下培养5天，考察存在的破骨细胞的骨吸收抑制活性。
骨吸收抑制作用的评价如下进行培养后，剥离象牙片上的细胞，进行苏木精染色，通过PIASLA-555进行图像分析，测定骨吸收窝(凹陷)的数量(濑野悍二等，研究主题分类的动物培养细胞手册(研究テ一マ别動物培餋細胞マニユアル)，第199-200页，1993)。即，凹陷数少意味着破骨细胞的活性下降，骨吸收受到抑制。此外，凹陷试验中表现出骨吸收抑制效果的物质在动物实验中也表现出骨吸收的抑制效果(Toba等，Bone，第27卷，第403-408页，2000)，一般凹陷试验是在考察骨吸收抑制效果方面合适的实验体系。作为对照，使用未添加有效成分的组，分别用以未添加有效成分的组的骨吸收活性作为100％时的骨吸收活性(％)表示。
其结果如表1所示。
以下中间体由4-氧代-哌啶-1-羧酸叔丁酯、乙胺、环丙胺或者正丙胺和市售芳基磺酰氯或者芳基乙酰氯利用实施例A4中所述方法进行制备。

A12.4-苯基-哌啶-4-羧酸苄基-甲基-酰胺.

A12.1.4-苯基-哌啶-1，4-二羧酸单苄酯.
将市售4-苯基-4-羧基哌啶甲苯磺酸酯(7.55g，20mmol)、N-(苄氧基羰基氧基)琥珀酰亚胺(5.0g，20mmol)和TEA(5mL，36mmol)的CHCl3(100mL)悬浮液在室温下搅拌48小时。将混合物用CH2Cl2(100mL)进行稀释并用1M NaOH水溶液(3×50mL)进行萃取。对水相用Et2O(2×50mL)进行萃取、用6N HCl水溶液进行酸化(pH 2)并用CH2Cl2(4×50mL)进行萃取。对合并的CH2Cl2萃取液进行干燥(Na2SO4)、过滤和蒸发，产生标题化合物。
(成骨细胞增殖作用)考察凝血酶原、细胞色素P-450、纤溶酶原、运铁蛋白、凝血酶和纤溶酶的成骨细胞增殖作用。供于试验的各有效成分都是市场上销售的产品。供于试验的各有效成分的来源和各有效成分的最终浓度如表2所示。
将小鼠成骨细胞MC3T3-E1细胞用含有10％牛胎血清的α-MEM(FlowLaboratories公司制)溶液，以2×104个/ml的细胞数接种到96孔板中，在5％CO2存在下，于37℃培养24小时，制成试验用培养细胞。接着，将培养基换成不含有牛胎血清的α-MEM培养基，在培养基中添加凝血酶原、细胞色素P-450、纤溶酶原、运铁蛋白、纤溶酶和凝血酶，分别使其达到表2所示的最终浓度，在37℃下培养18小时。对其通过使用5-溴脱氧尿苷(BrdU)的细胞增殖试剂盒(Amersham Bioscience公司制)考察细胞增殖活性。作为对照，使用未添加有效成分的组，分别用以未添加有效成分的组的细胞增殖活性作为100％时的细胞增殖活性(％)表示。其结果如表2所示。
表2

添加作为本发明的有效成分的凝血酶原、细胞色素P-450、纤溶酶原、运铁蛋白、纤溶酶和凝血酶的组与未添加有效成分的组相比，小鼠成骨细胞MC3T3-E1细胞增殖活性依赖于浓度都显著地增加，具有成骨细胞增殖作用。
(成骨细胞分化促进作用)对补体成分4和β防卫素的成骨细胞分化促进作用进行考察。即，将人类来源的前成骨细胞MG63细胞用含有10％牛胎血清的DMEM(Flow Laboratories公司制)溶液，以2×104个/ml的细胞数接种到96孔板中，在5％CO2存在下，于37℃培养4天，制成试验用培养细胞。接着，将培养基换成含有1％牛胎血清的培养基，在培养基中添加补体成分4(Complement component C4，C8195，Sigma公司制)，使最终浓度达到0.1、1和10μg/ml，或在培养基中添加β防卫素(β防卫素1和2，Peptide研究所株式会社制)，使最终浓度达到0.1、1和10μg/ml，在37℃下培养5天。回收培养上清，通过用I型原胶原C-肽EIA试剂盒(Procollagen Type I C-peptide EIA Kit)(Takara MK101，宝酒造公司制)测定培养上清中的I型原胶原量，考察成骨细胞分化促进活性。作为对照，使用未添加补体成分4和β防卫素的组。原胶原产生量分别以样本的I型原胶原测定量相对于对照的I型原胶原测定量的比例(％)表示。其结果如表3所示。
表3

添加补体成分4和β防卫素的组与对照(未添加补体成分4和β防卫素)组相比，I型原胶原量增加，具有成骨细胞分化促进作用。
如上所述，由[试验例1]的试验结果可知，β2微球蛋白、组蛋白、补体成分3、单核细胞趋化性蛋白质1、溶菌酶、核糖核酸酶、凝血酶原、细胞色素P-450、纤溶酶原、运铁蛋白、凝血酶、纤溶酶及它们的酶解产物显著地抑制破骨细胞引起的骨吸收；此外，由[试验例2]的试验结果可知，凝血酶原、细胞色素P-450、纤溶酶原、运铁蛋白、凝血酶、纤溶酶及它们的酶解产物通过抑制破骨细胞引起的骨吸收的同时促进成骨细胞的增殖，促进骨生成；另外，由[试验例3]的试验结果可知，补体成分4、β防卫素及它们的酶解产物通过促进成骨细胞的分化，促进骨生成。
(含β2微球蛋白的骨吸收抑制剂)按照已知方法(Hoshi F.，D.Nagai，S.Higuchi，T.Noso，A.Takahashi，S.Kawamura，Veterinary Immunology and Immunopathology，53，29-38，1996.自初乳的牛β2微球蛋白的纯化和它完整的氨基酸序列(Purification ofbovine beta2-microglobul in from colostrums and its complete amino acidsequence))由牛初乳制备β2微球蛋白。
即，由10L牛初乳通过离心分离法得到脱脂乳，用1N盐酸将pH调整至4，用离心分离使凝集的酪蛋白沉淀。将20g酪蛋白溶解于1L 5mM磷酸钠缓冲液(PBSpH 8.3)中，使其吸附于用同样的缓冲液平衡化了的二乙氨乙基(DEAE)纤维素(DE-52Whatman公司制)柱。用平衡化缓冲液洗脱，将得到的部分用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行分析，将含有12kDa的蛋白质的部分通过超滤浓缩，对5mM PBS(pH 8.3)在4℃下透析一晚。将浓缩液通过用5mM PBS(pH8.3)平衡化了的由葡聚糖凝胶G-75柱构成的凝胶过滤层析。将含有12kDa的蛋白质的部分通过超滤浓缩，对10mM乙酸铵溶液进行透析。将其冷冻干燥，得到12mg作为本发明的有效成分的β2微球蛋白。将这12mg β2微球蛋白与120mg乳糖混合，成形为颗粒状，得到本发明的骨吸收抑制剂。
组蛋白、补体成分3、单核细胞趋化性蛋白质1、溶菌酶、核糖核酸酶、凝血酶原、细胞色素P-450、纤溶酶原、运铁蛋白、凝血酶、纤溶酶、补体成分4和β防卫素可以通过与上述β2微球蛋白同样的方法从牛初乳制备。
(含组蛋白的骨吸收抑制剂)将1kg除去了外皮的鲑鱼鱼白(含6％核酸)用水洗净后进行脱水，再加入3L水，用匀浆器制得匀浆。向该匀浆加入0.05N氢氧化钠溶液，将pH调整至6，加入20g木瓜蛋白酶，在35℃下搅拌2小时分解蛋白质后，在80℃下保持30分钟，使酶失活，终止分解。分解终止后，通过离心分离除去沉淀，向得到的上清加入2.5倍量的95％乙醇，使DNA沉淀。接着，将含水乙醇过滤除去后，冷冻干燥，得到65g由DNA粉末构成的本发明的骨吸收抑制剂。1g该骨吸收抑制剂中含有425mg组蛋白。
(含凝血酶原的骨生成促进和骨吸收抑制剂)按照已知方法(Hashimoto，N.，T.Morita和S.Iwanaga，J.Biochem.(东京)，第97卷，第1347-1355页，1985)制备牛血浆凝血酶原。即，加入柠檬酸钠，令浓度达到0.01M，通过离心分离得到牛血浆。在10L牛血浆中慢慢加入柠檬酸钡，使浓度达到0.1M，缓缓搅拌1小时后，以4000rpm离心分离10分钟。将得到的沉淀用含有0.01M氯化钡、1mM盐酸苄脒、0.02％叠氮化钠的0.1M氯化钠溶液洗涤，进行离心分离。该洗涤操作重复两次。将钡沉淀用1L 40％饱和硫酸铵悬浊，加入二异丙基氟磷酸酯(DFP)，使浓度达到1mM，搅拌一晚。以5000rpm进行离心分离30分钟，得到上清。向该上清加入饱和硫酸铵，使饱和度达到67％，通过5000rpm、30分钟的离心分离回收沉淀。将该沉淀溶解于100～150mL含有0.2M氯化钠、1mM DFP、1mM盐酸苄脒的0.05M磷酸钠缓冲液(pH 6.0)，对20L同样的缓冲液进行透析一晚。用离心分离除去不溶成分后，供于DEAE-葡聚糖凝胶A50层析。供于用含有0.2M氯化钠、1mM盐酸苄脒的0.05M磷酸钠缓冲液(pH 6.0)平衡化了的DEAE-葡聚糖凝胶A50柱(200×100mm)，将氯化钠浓度逐渐提高到600mM，将吸附的蛋白质洗脱。凝血酶原在氯化钠浓度达到约300mM时洗脱。将其通过透析脱盐，接着供于用50mM含有0.1M氯化钠、1mM盐酸苄脒的tris-盐酸缓冲液(pH 6.3)平衡化了的蓝色葡聚糖凝胶CL-6B柱(80×200mm)，用平衡化缓冲液洗涤后，用将氯化钠浓度调整为4M的缓冲液洗脱吸附的蛋白质。将其通过透析脱盐，冷冻干燥，得到1.0g作为本发明的有效成分的凝血酶原。将这1.0g凝血酶原与9.0g乳糖混合，成形为颗粒状，得到本发明的骨生成促进和骨吸收抑制剂。
β2微球蛋白、组蛋白、补体成分3、单核细胞趋化性蛋白质1、溶菌酶、核糖核酸酶、细胞色素P-450、纤溶酶原、运铁蛋白、凝血酶、纤溶酶、补体成分4和β防卫素可以通过与上述凝血酶原同样的方法从牛血浆制备。
(含凝血酶原的骨生成促进和骨吸收抑制剂)
由牛奶制得含凝血酶原的部分。用去离子水将填充了400g阳离子交换树脂的SP葡聚糖凝胶HP(Amersham Bioscience公司制)的柱(直径5cm×高30cm)充分洗涤后，在该柱中以25ml/min的流速通过40L(pH 6.7)未杀菌脱脂乳。通液后，用去离子水将该柱充分洗涤，用含有1.5M氯化钠的0.02M碳酸缓冲液(pH 7.0)将吸附在树脂上的蛋白质部分洗脱。接着，通过反渗透(RO)膜将该洗脱液脱盐，浓缩后冷冻干燥，得到21g蛋白质部分粉末，制成本发明的骨生成促进和骨吸收抑制剂。在该蛋白质部分粉末中含有0.01重量％凝血酶原。
(含核糖核酸酶的骨吸收抑制剂)在50mg核糖核酸酶(Sigma公司制)中加入93.5g含水结晶葡萄糖、5g碳酸钙、1g糖酯、0.5g香料混合后，压片成片状，制成本发明的含核糖核酸酶的骨生成促进剂。
(含细胞色素P-450的骨生成促进和骨吸收抑制剂)在10mg细胞色素P-450(Sigma公司制)中加入93.5g含水结晶葡萄糖、5g碳酸钙、1g糖酯、0.5g香料混合后，压片成片状，制成本发明的含细胞色素P-450的骨生成促进和骨吸收抑制剂。
(含补体成分4和β防卫素的骨生成促进剂)将10L脱脂的牛奶通过S-葡聚糖凝胶柱(Pharmacia公司制)后，用20mM磷酸缓冲液(pH7.0)充分洗脱。使含1.5M食盐的磷酸缓冲液(pH8.5)的比例在1小时内上升至100％的同时梯度洗脱吸附的蛋白质，在洗脱时间15分钟的位置回收到0.5mg补体成分4，在20分钟的位置回收到0.3mgβ防卫素。
这样得到的补体成分4和β防卫素可以直接作为本发明的骨生成促进剂使用。
(含补体成分4的骨生成促进剂)在1mg补体成分4(Complement component C4，C8195，Sigma公司制)中加入93.4g含水结晶葡萄糖、5g碳酸钙、1g糖酯、0.5g香料混合后，压片成片状，制成本发明的含补体成分4的骨生成促进剂。

(含β防卫素的骨生成促进剂)在1mg β防卫素(β-Defensin-1，4337-s，Peptide研究所株式会社制)中加入93.4g含水结晶葡萄糖、5g碳酸钙、1g糖酯、0.5g香料混合后，压片成片状，制成本发明的含β防卫素的骨生成促进剂。
(含补体成分4和β防卫素的骨生成促进剂)在1mg补体成分4(Complement component C4，C8195，Sigma公司制)、1mgβ防卫素(β-Defensin-2，4338-s，Peptide研究所株式会社制)中加入93.4g含水结晶葡萄糖、5g碳酸钙、1g糖酯、0.5g香料混合后，压片成片状，制成本发明的含补体成分4和β防卫素的骨生成促进剂。
(含β2微球蛋白的骨吸收抑制用饮料)以表4所示的配比混合原料后，填充在容器中进行加热杀菌，制成本发明的含β2微球蛋白的骨吸收抑制用饮料。
表4
(含溶菌酶的骨吸收抑制用饼干)以表5所示的配比混合原料后，制成面团并成形后，进行焙烧，制成本发明的含溶菌酶的骨吸收抑制用饼干。
表5
(含补体成分3的骨吸收抑制用果冻)以表6所示的配比混合原料后，填充在容器中进行加热杀菌，制成本发明的含补体成分3的骨吸收抑制用果冻。
表6
(含组蛋白的骨吸收抑制用加工干酪)以表7所示的配比混合原料后，在85℃下乳化，制成本发明的含组蛋白的骨吸收抑制用加工干酪。
在大气压力下操作该带式煅烧设备。在煅烧区4与5之间，存在密封过渡区。这8个煅烧区分别装有风扇，以产生气体循环。向这8个煅烧区分别供应所需量的所期望的新鲜气体。为了获得所期望的大气压力，排出适量的气体。每个煅烧区中单位时间内循环的气体量大于单位时间内供入或排出的气体量。在每两个连续的煅烧区之间，在每种情况下存在隔离壁，其在催化剂前体料流区中开放，以减少气体的交换。每个煅烧区的长度为1.45m。设定输送带的速度从而获得以每个煅烧区计所期望的停留时间约2小时。所述各区如表1中所示的方式操作。
表1带式煅烧设备的操作参数

以此方式，连续生产约1.3公制吨的成品催化剂。该催化剂的代表性平均样品具有如下数据*钒的平均氧化态(Vox)4.15*平均BET表面积(m2/g)25*横向压缩强度(LCS)9.4N将150kg所述煅烧前体与3.8升去离子水混合。向该悬浮体中加入30.6g乙酰丙酮合钼。将该悬浮体在球磨机(6个直径为35mm的球，5个直径为30mm的球，2个直径为25mm的球，)中彻夜研磨。接着加入<p>[实施例17](含组蛋白的骨吸收抑制用狗饲料)以表10所示的配比混合原料后，制成本发明的含组蛋白的骨吸收抑制用狗饲料(狗食)。
表10
(含运铁蛋白和细胞色素P-450的骨生成促进和骨吸收抑制用果汁饮料)以表11所示的配比混合原料后，填充在容器中进行加热杀菌，制成本发明的含运铁蛋白和细胞色素P-450的骨生成促进和骨吸收抑制用果汁饮料。
表11
(含纤溶酶原的骨生成促进和骨吸收抑制用饼干)以表12所示的配比使用市场上销售的纤溶酶原混合原料后，制成面团并成形后，进行焙烧，制成本发明的含纤溶酶原的骨生成促进和骨吸收抑制用饼干。
表12
(含纤溶酶的骨生成促进和骨吸收抑制用饼干)以表13所示的配比使用市场上销售的纤溶酶混合原料后，制成本发明的含纤溶酶的骨生成促进和骨吸收抑制用饼干。
表13
(含运铁蛋白的骨生成促进和骨吸收抑制用果冻)以表14所示的配比混合原料后，填充在容器中进行加热杀菌，制成本发明的含运铁蛋白的骨生成促进和骨吸收抑制用果冻。
表14
(含凝血酶原的骨生成促进和骨吸收抑制用加工干酪)以表15所示的配比使用市场上销售的凝血酶原混合原料后，在85℃下乳化，制成本发明的含凝血酶原的骨生成促进和骨吸收抑制用加工干酪。
表15
(含凝血酶的骨生成促进和骨吸收抑制用加工干酪)以表16所示的配比使用市场上销售的凝血酶混合原料后，制成本发明的含凝血酶的骨生成促进和骨吸收抑制用加工干酪。
表16
(含运铁蛋白的骨生成促进和骨吸收抑制用酸乳)将12重量％还原脱脂乳在90℃下加热杀菌20分钟后，分别接种嗜酸乳酸杆菌(Lactobacillus acidophilus)和嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)，得到两种起子培养物，将两者等量混合。接着，以表17所示的配比混合原料后，使其发酵，制成本发明的含运铁蛋白的骨生成促进和骨吸收抑制用酸乳。
表17
(含凝血酶原的骨生成促进和骨吸收抑制用婴儿配方奶粉)以表18所示的配比，使用实施例3中得到的凝血酶原混合原料后，制成本发明的骨生成促进和骨吸收抑制用婴儿配方奶粉。
表18
(含凝血酶的骨生成促进和骨吸收抑制用婴儿配方奶粉)以表19所示的配比，使用市场上销售的凝血酶混合原料后，制成本发明的骨生成促进和骨吸收抑制用婴儿配方奶粉。
表19
(含纤溶酶原的骨生成促进和骨吸收抑制用狗饲料)以表20所示的配比使用市场上销售的纤溶酶原混合原料后，制成本发明的骨生成促进和骨吸收抑制用狗饲料(狗食)。
表20
(含纤溶酶的骨生成促进和骨吸收抑制用狗饲料)以表21所示的配比使用市场上销售的纤溶酶混合原料后，制成本发明的骨生成促进和骨吸收抑制用狗饲料(狗食)。
实施例36

所得的产物具有类似于实施例53的油灰的特征。
以上的实施例例示本发明的特定实施方案。其它实施方案可以由本领域技术人员根据本发明的教导制备。
实施例37

*Pluronic 588310，Lot WPAW-502B，BASF，Corp.Mt.Olive，NJ07828-1234将成分合并并搅拌直至得到油灰样物质。所述材料容易分散在过量的水中。
此实施例中的Pluronic为粘性液体，形成极好的油灰。
由于此Pluronic是水溶性的，不需要加入吸收加速剂。
实施例38

*产品583095，Lot WP1W-515B，BASF Corp.，Mt.Olive，NJ07828-1234提供Pluronic作为“锭剂”，并研磨成粉，然后混合。所述混<p>[实施例32](含β防卫素的骨生成促进用婴儿配方奶粉)以脱脂乳75.61(重量％)、乳清蛋白质浓缩物2.36(重量％)、乳糖13.86(重量％)、矿物质混合物0.32(重量％)、水溶性维生素混合物0.32(重量％)、含脂溶性维生素的脂肪7.53(重量％)的比例混合原料并杀菌后，浓缩，喷雾干燥，制成配方奶粉原料粉。然后，以每1kg 10mg的量在无菌条件下添加β防卫素(β-Defensin-2，4338-s，Peptide研究所株式会社制)，混合，制成本发明的含β防卫素的骨生成促进用婴儿配方奶粉。
(含补体成分4的骨生成促进用狗食)以大豆饼12.0(重量％)、脱脂奶粉14.0(重量％)、大豆油4.0(重量％)、玉米油2.0(重量％)、棕榈油28.0(重量％)、玉米淀粉15.0(重量％)、小麦粉9.0(重量％)、麦糠2.0(重量％)、维生素混合物9.0(重量％)、矿物质混合物2.0(重量％)、纤维素3.0(重量％)的比例混合原料，杀菌并冷却后，以每1L 10mg的量在无菌条件下添加补体成分4(Complement component C4，C8195，Sigma公司制)并成形，制成本发明的含补体成分4的骨生成促进用狗饲料(狗食)。
权利要求
1.骨生成促进和/或骨吸收抑制剂，其特征在于，以β2微球蛋白、组蛋白、补体成分3、单核细胞趋化性蛋白质1、溶菌酶、核糖核酸酶、凝血酶原、细胞色素P-450、纤溶酶原、运铁蛋白、凝血酶、纤溶酶、补体成分4、β防卫素及它们的酶解产物中的任意1种以上作为有效成分。
2.骨吸收抑制剂，其特征在于，以β2微球蛋白、组蛋白、补体成分3、单核细胞趋化性蛋白质1、溶菌酶、核糖核酸酶、凝血酶原、细胞色素P-450、纤溶酶原、运铁蛋白、凝血酶、纤溶酶及它们的酶解产物中的任意1种以上作为有效成分。
3.骨生成促进和骨吸收抑制剂，其特征在于，以凝血酶原、细胞色素P-450、纤溶酶原、运铁蛋白、凝血酶、纤溶酶及它们的酶解产物中的任意1种以上作为有效成分。
4.骨生成促进剂，其特征在于，以补体成分4、β防卫素及它们的酶解产物中的任意1种以上作为有效成分。
5.骨吸收抑制用饮食品、药物或饲料，其特征在于，掺入了β2微球蛋白、组蛋白、补体成分3、单核细胞趋化性蛋白质1、溶菌酶、核糖核酸酶、凝血酶原、细胞色素P-450、纤溶酶原、运铁蛋白、凝血酶、纤溶酶及它们的酶解产物中的任意1种以上。
6.骨生成促进和/或骨吸收抑制用饮食品、药物或饲料，其特征在于，掺入了凝血酶原、细胞色素P-450、纤溶酶原、运铁蛋白、凝血酶、纤溶酶及它们的酶解产物中的任意1种以上。
7.骨生成促进用饮食品、药物或饲料，其特征在于，掺入了补体成分4、β防卫素及它们的酶解产物中的任意1种以上。
全文摘要
本发明提供可以在日常的饮食偏好上不产生问题，可长期地直接口服摄取，并直接对骨给予骨生成促进和骨吸收抑制作用，能够期待各种骨疾病的预防或改善治疗效果的新的骨生成促进和/或骨吸收抑制剂，以及骨生成促进和/或骨吸收抑制用饮食品、药物或饲料。以β
文档编号A61K38/36GK1856319SQ200480027778
公开日2006年11月1日 申请日期2004年9月30日 优先权日2003年9月30日
发明者森田如一, 芹澤篤, 松山博昭, 元賣睦美, 川上浩 申请人:雪印乳业株式会社