作为临床标记的dmbt1及其用途的制作方法

专利名称：作为临床标记的dmbt1及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于鉴定及监测具有雌激素或孕激素作用化合物的方法、组合物和化合物。在目前的方法里，用抑癌候选基因DMBT1(恶性脑肿瘤1中删除的基因(deleted in malignant brain tumors 1))的调控和编码序列来确定化合物的雌激素和孕激素的活性。
背景技术：
激素替代疗法(hormone replacement therapy，HRT)代表了预防医学较重要的一个领域，对个人及公共健康有很大的影响。由于许多原因使用了激素替代疗法，包括对绝经、部分或全部子宫切除和闭经的治疗。绝经后，常给予雌激素作为激素替代疗法来治疗或预防临床适应症例如轻度到严重的血管疏缩性症状(vasomotorsymptoms)和外阴阴道萎缩症(vulvovaginal atrophy)、骨质疏松症，并且正试验于阿耳茨海默症(Alzheimer’s disease)和结肠癌。在一些无月经(amenorrhoeic)的情况下，可给予雌激素来恢复月经。
虽然使用雌激素的HRT已有许多对健康有益的证明，但也伴随一些副作用。这些作用包括增加患子宫癌和乳腺癌、乳房胀痛及子宫出血的风险。结合疗法(Co-adminstrative therapies)已被用来减少这种副作用。例如在HRT期间为了抵消增加的患子宫内膜癌的风险，黄体酮常与雌激素联合给药。遗憾的是，用这种联合治疗的方法可出现其他的并发症。例如，通常不认为黄体酮治疗适合无子宫的妇女，并且最近的研究表明在雌激素和黄体酮HRT用药情况下患癌症和中风的危险增加。
HRT领域较新的进展包括使用被称作选择性雌激素受体调节剂(Selective Estrogen Receptor Modulators，SERMs)的化合物作为HRT中雌激素的替代物。SERMs是可提供雌激素的有益作用而避免其他副作用的药物。例如，SERM可在骨组织提供所需的雌激素激动剂(agonist)活性而在子宫组织提供拮抗剂(antagonist)活性。目前临床上有效的有两种SERM。SERM他莫昔芬(tamoxifen)用于预防和治疗乳腺癌，SERM雷洛昔芬(raloxifene)用于预防和治疗骨质疏松。这些药物及其它的SERM特异结合并影响雌激素受体的活性。
另外一类可用于HRT方案的化合物包括孕酮受体调控剂(Progesterone Receptor Modulators，PRM)，例如其包括米非司酮(mifepristone)和奥那司酮(onapristone)。PRM已被考虑作为雌激素替代疗法的附加剂并且也用于单独治疗。PRM是特异结合孕酮受体并调控该受体活性的化合物，从而影响细胞的活性。PRM的一个重要性质是其抗增殖作用。例如，在月经周期的卵泡期给予PRM可抑制子宫内膜的增殖活性。PRM有许多潜在的用途，包括治疗子宫内膜异位、子宫平滑肌瘤、避孕和激素替代疗法。
尽管HRT研究有进展，仍很需要新的SERM和PRM。鉴定和使用新的SERM和PRM可提供更适合特定病症或预防治疗的疗法。这些化合物有可能提供雌激素替代疗法的益处而无伴随目前疗法的危险和副作用。例如，新的SERM也许能促进靶组织例如骨和神经组织中的活性同时非靶组织如子宫内膜组织和乳房组织不受影响。
此外，用来鉴定新的SERM和PRM迫切需要新的组合物和方法。这些组合物和方法也可能对临床检测已知或实验性SERM和PRM的活性有价值。更好的是，这些方法将易于快速和准确的测定那些SERM和PRM化合物。
很清楚，用来测定雌激素或孕激素(分别如SERM和PRM证明)活性的标记物会是一个对本技术领域颇有价值的贡献。这种标记物会对用于激素替代疗法的新化合物的开发有利。
发明概述如本文所述，本发明提供了用于鉴定或筛选具有雌激素活性化合物的化合物、组合物和方法。本发明的一个基础是发现了具有雌激素活性的化合物能上调DMBT1基因的表达。因此一方面本发明提供了一种用于鉴定具有雌激素活性的待测化合物的方法。该方法包括步骤(a)用待测化合物接触雌激素应答系统(estrogen-responsivesystem)；(b)从雌激素应答系统获得关于由DMBT1调控序列控制的基因表达信息；和(c)用来自步骤(b)的信息确定待测化合物是否具有雌激素活性。在一些情况下，基因的表达是与对照比较来测量的，并且基因表达量的增加与具有雌激素活性的待测化合物相关。
用来测量基因表达的雌激素应答系统可以是动物、部分动物体例如雌激素应答组织或细胞。由DMBT1调控序列控制的基因可以是DMBT1本身或是可操作性连接到DMBT1调控序列的异源基因。
另一方面，本发明提供了一种方法以确定待测化合物是否具有选择性雌激素活性。在这个方法中两种不同的雌激素应答系统接触相同待测化合物，由每个系统测量DMBT1调控序列控制的基因表达。如果一个雌激素应答系统表现出基因表达提高而另一应答系统表现为表达降低或无表达，则此待测化合物具有选择性雌激素活性。
再一方面，选择性雌激素活性的测定可通过接触两种不同的雌激素应答系统，并在一个系统中测量DMBT1调控序列控制的基因表达而在另一个系统中测量雌激素活性另一不同标记(例如组织生长)来实现。如果一个雌激素应答系统表现为如基因表达无增加而另一个表现为如阳性反应(例如组织生长)，那么待测化合物就具有选择性雌激素活性。
又一方面，本发明提供了测定化合物的孕激素或抗孕激素活性的方法。在这个方法中使雌激素及孕酮应答系统(estrogen-andprogesterone-responsive system)与雌激素化合物接触，也与待测化合物接触。从已经接触了雌激素和待测化合物的系统测量DMBT1调控序列控制下的基因表达。从基因表达测量得到的信息可与标样比较并用来确定待测化合物是否具有孕激素活性或抗孕激素活性。
在其他方面，本发明提供了一种监测受试者雌激素和孕激素活性的方法。该方法的步骤包括处理受试者、从处理后的受试者获得关于DMBT1表达的信息和用表达信息测定雌激素或孕激素活性。
还有一方面，本发明提供了一个雌激素应答系统，其包含的核酸具有可操作性连接到报告基因的DMBT1调控序列。雌激素应答系统可以是含有外源核酸一个细胞，例如含有质粒，其序列包含可操作性连接到报告基因的DMBT1调控序列。细胞典型表达的功能性雌激素受体可以进行内源性或外源性表达。在相关方面，本发明也提供了一个雌激素及孕酮应答系统，其包含的核酸具有可操作性连接到报告基因的DMBT1调控序列。该系统细胞同时典型表达功能性雌激素受体和功能性孕酮受体。
又一方面本发明提供分离的异源核酸序列，其包含部分可操作性连接到报告基因的DMBT1调控序列。具体的，有效的分离异源核酸具有可操作性连接到报告基因的DMBT1调控序列，该序列至少包含SEQ ID NO.1的核苷酸840-872。这些核酸可使得受体基因应答雌激素信号从而产生增量调节。其它有效的分离异源核酸包含的可操作性连接到报告基因的DMBT1调控序列由SEQ ID NO11-2259全部或部分核苷酸或其变异体组成。
附图简述

图1，雌酮、SERM和雌激素拮抗剂对大鼠子宫重量的影响(E雌酮；T他莫昔芬；R雷洛昔芬；和IICI182780)。
图2，雌酮、SERM和雌激素拮抗剂对大鼠子宫中DMBT1表达的影响。
图3，雌酮与SERM、雌激素拮抗剂同时给药对大鼠子宫中DMBT1表达的影响。
图3B，增加雌激素或黄体酮浓度(MPA)对大鼠子宫中DMBT1表达的影响。
图4，雌酮和SERM对大鼠子宫重量的影响(E雌酮；5RA-DCC5R-芳基-5，11-二氢-苯并吡喃并(4，3-c)苯并吡喃；和5SA-DCC5S-芳基-5，11-二氢-苯并吡喃并(4，3-c)苯并吡喃)。
图5，雌酮和SERM对大鼠子宫中DMBT1表达的影响。
图6，雌激素对DMBT1/荧光素酶报告构建体(luciferase reporterconstructs)的诱导作用。分析的报告构建体是pDMBT1-1/lucDMBT1-1347至+41的启动子区域(向上指的三角)；pDMBT1-2(向下指的三角)/lucDMBT1-2921至+41的启动子区域；oligo(实心菱形)(pDMBT1-3/luc)pDMBT1-2766至-2734的启动子区域；pGL3(空心方形)pGL3basic(对照)；pERE-luc(实心椭圆)鸡卵黄蛋白ERE序列(chicken vitellogenin ERE sequence)；和pTA(实心方形)；pTAbasic(对照)。
图7，DMBT1 mRNA在雌激素和不同PRM处理过的OVX猴子宫内膜中的表达。(E2雌酮；Mif米非司酮；17N11-DE17β-N-取代-11β-二甲氨基苯基-雌甾-4，9-二烯-3-酮；17β-N-取代-11β-哌啶苯基-雌甾-4，9-二烯-3-酮17N11-PE)结果以平均值+/-标准差提供。大多数实验组的猴为n＝3。*指n＝1的组，**指n＝2的组。
发明详述除非另外限定，这里所用的所有技术和科学术语与本发明所属领域普通技术人员通常理解的含义相同。与这里所述的那些基本相似或等同的任何方法、设备和材料都可用于实践或实验本发明。
这里公开的所有公布和专利仅供公开之用。本文所有内容不能解释为一种许可，即发明者无权提早任何公布和/或发明日期，包括这里引用的任何公布和/或发明。
在本发明中常用的确定术语具有以下列出的含义。这些术语还可在详述中做更详细的解释。
如这里用的术语“包含”、“含有”和“包括”是用其公开的、非限制含义。
“雌激素活性”是指对生物系统产生一种或更多的类似雌激素作用的能力。“雌激素”是指天然的雌激素(包括但不仅限于雌二醇、雌酮和雌三醇)，以及合成的雌激素(包括但不仅限于乙炔雌二醇(ethinyl estradiol)、己烯雌酚(diethylstilbesterol)和美雌醇(mestranol))。雌激素的这种作用是特有的，称为“雌激素激动剂活性”(estrogen agonist activity)。具有雌激素活性的化合物模拟至少一种雌激素的作用，并且通常是通过结合雌激素受体以起始产生这种作用。不言而喻在一个复杂生物体例如哺乳动物体内，雌激素对不同的类型组织均有活性，因此对一种组织的任一种特定雌激素活性都可被称为雌激素活性。被称为SERM的化合物具有典型的雌激素活性。
“雌激素作用”(estrogenic effect)是指当雌激素与其受体结合时细胞、组织或生物体中出现的应答反应。雌激素作用的例子包括雌激素受体独立转移至胞核；诱导雌激素应答基因包括DMBT1的表达；提高一氧化氮产量；细胞增殖，包括如乳腺上皮细胞和子宫内膜细胞的增殖；细胞分化和生长，包括如提高神经的生长和分化；组织生长和子宫内膜组织的生长；骨矿物质密度的增加；血液成分的改变包括高密度脂蛋白(HDL)胆固醇和甘油三脂的增加、低密度脂蛋白(LDL)胆固醇的降低以及凝固性增强；和炎症的增加。
“雌激素应答系统”用作广义是指在如对雌激素的应答时基因表达开始变化或者蛋白磷酸化作用改变的细胞群。这里所用的“雌激素应答系统”是指单细胞、细胞群并因而指组织、器官或甚至是复杂的多细胞有机体，例如可对雌激素产生应答并可在其中试验雌激素应答作用的动物。
“选择性雌激素应答”的证明是当化合物对两个不同的雌激素应答系统或一个雌激素应答系统的两个不同部分有不同的活性。促进选择性雌激素应答的化合物通常称为SERMs，这里提供了其一些例子。但是其它非通常称为SERMs但也可表现雌激素活性的化合物也可能促进选择性雌激素应答。
“抗雌激素活性”(Anti-estrogenic activity)是指能产生与雌激素引起的作用相反的作用和/或产生的作用能阻遏(减少)雌激素导致的作用。有“抗雌激素活性”的化合物包括如1)降低基因表达或减弱组织生长的化合物，而通常雌激素提高该基因的表达或提高该组织的生长；2)提高基因表达或增加组织生长，而通常雌激素降低该基因表达或减弱该组织生长；或3)当伴随雌激素给药时降低雌激素应答量的化合物。许多已知的称为“雌激素拮抗剂”的化合物具有“抗雌激素活性”。
“孕激素活性”(Progestogenic activity)是指对生物系统有一种或更多类似由孕酮引起的作用。这里所用的孕酮是指孕酮及其合成的类似物(黄体酮，progestins)。孕酮的这种作用是典型的“孕酮激动剂活性”(progesterone agonist activity)。具有孕酮活性的化合物模拟至少一种孕酮的作用，并且通常通过结合孕酮受体以起始产生这种作用。在一个复杂生物体内例如动物，优选哺乳动物体内，孕酮对不同类型的组织具有作用，因而任一种特定对一种组织孕酮作用都可被指为孕酮活性。
“抗孕激素活性”(Anti-progestogenic activity)指能产生与孕酮导致的作用相反的作用和/或产生的作用能阻遏(减少)孕酮导致的作用。通常具有抗孕酮活性的化合物可与孕酮受体结合并改变其活性。一些抗孕激素化合物或处理也能减少对一个系统的雌激素作用。例如，一些抗孕激素化合物可结合至孕酮受体并减弱由雌激素引起的基因表达或组织生长。许多已知的称为“孕酮拮抗剂”的化合物能阻碍具有孕酮活性的化合物的作用，并具有抗孕激素的活性。
被称为“孕酮受体调控剂”(progesterone receptor modulators，PRM)的化合物能结合孕酮受体并改变其活性。在一些情况下PRM可调整雌激素和孕激素化合物对生物系统的作用。一些PRM可具有抗孕激素活性，例如孕酮拮抗活性。
这里“孕酮应答系统”(Progesterone-responsive system)用其广义，指一个细胞群在如应答孕酮时起始改变基因表达或蛋白质磷酸化作用。这里“孕酮应答系统”指单个细胞、细胞群因此指组织、器官甚至复杂多细胞生物体，例如可应答雌激素并可在其中试验孕酮应答作用的动物体。
“雌激素和孕酮应答系统”用其广义，指一个细胞群在如应答雌激素和孕酮时起始改变基因表达或蛋白质磷酸化作用。这里“雌激素和孕酮应答系统”指单个细胞、细胞群因此指组织、器官甚至复杂多细胞生物体，例如可应答雌激素和孕酮并可在其中试验雌激素和孕酮应答作用的动物体。
“DMBT1基因”是指(1)编码的蛋白与人DMBT1蛋白有约高于60、65、70、75、80、85、90或95％的同一性(Mollenhauer et al.(1997)Nat.Genet.1732-39；GenBank protein accession NoNP_015568.1)；(2)编码的蛋白能与源自抗DMBT1蛋白的抗体如多克隆或单克隆抗体结合，如这里所述的人DMBT1蛋白；(3)能在严格杂交条件下与特定核酸特异性杂交，该核酸与人DMBT1cDNA(GenBank nucleotide accession NoNM_007329.1)有高于60、65、70、75、80、85、90或95％的同一性；或者(4)能通过特定引物进行扩增，该引物能在高严格条件下与DMBT1 cDNA如上述人DMBT1 cDNA进行特异性杂交。严格杂交条件为本领域熟知。(如参见Sambrook et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual，SecondEdition，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York，(1989))“DMBT1”基因包括已鉴定的人(GenBank检索号NM_017579和AJ243212)、大鼠(GenBank检索号U32681，86％核苷酸与人的同一)、小鼠(GenBank号U37438，89％核苷酸与人的同一)、母牛(BF600097，87％同一性)和其它动物的DMBT1直系同源基因(ortholog)。该基因也被称为糖蛋白(glycoprotein(GP))340、CRP-ductin、hensin和ebnerin。
“DMBT1调控序列”指在应答雌激素信号时DMBT1基因中能调控DMBT1(或者DMBT1直系同源基因)的开放阅读框的核酸序列。在DMBT1调控序列方面，人DMBT1基因5′区域的一个3715bp序列可见SEQ ID NO1(EMBL检索号No.AJ271916)，并列于表2。这里提到的DMBT1 5′调控区域的核苷位置是相对于DMBT1起始密码子(+1)并根据表2中SEQ ID NO1的核苷标号方式表示的。DMBT1调控序列的例子将在下文讨论。
如本文所用，本发明的“变异体”核酸分子是一个与相应野生型核酸分子至少有80％，优选至少约90％更优选至少约95％，但低于100％同源性或同一性的连续核酸分子。变异核酸包含相应野生型核酸分子中没有的核苷酸碱基，例如相对于相应野生型多核苷酸分子发生的5′、3′或内部的删除或添加。本发明的变异多核苷酸是在应答雌激素信号时能启动DMBT1表达的DMBT1调控序列。
“外源”指多核苷酸或多肽不是在宿主细胞中天然存在或不是由宿主细胞产生。
当然本文所用的术语并不是为了限制本发明的范围。需要指出的是在这里和附加的权利要求书中，如果没有在上下文中另外明确表示，单数形式(“一”和“该”)均包括其相应物的复数形式。因此如″一个细胞″的提法可指一个或多个细胞，或本领域技术人员已知的它们的等价物等。
总体上，本发明提供了可有效鉴别和/或监测具有或能启动雌激素活性的化合物或处理方案的方法、组合物和化合物。本发明至少部分基于以下发现，即具有雌激素活性的化合物能增量调控在DMBT1调控序列控制下的基因表达，例如它控制的DMBT1基因或报告基因。在一个相关实施方案中，本发明可用于分别鉴别如下化合物，即不能增量或减量调控在DMBT1调控序列控制下的基因表达，因而不具有雌激素活性，或者具有抗雌激素活性。
另一方面，本发明提供了可有效鉴别和/或监测具有或能启动孕激素活性或抗孕激素活性的化合物或处理方案的方法、组合物和化合物。本发明证明当将具有孕激素或抗孕激素活性的化合物与雌激素化合物伴随给药时，能够在某种雌激素和孕酮应答系统中减弱雌激素介导的在DMBT1调控序列控制下的基因表达的增量调控作用。例如一种具有孕激素活性的化合物能在大鼠子宫内减弱雌激素介导的在DMBT1调控序列控制下的基因表达的增量调控作用；而一种具有抗孕激素活性的化合物能在猴子宫内减弱雌激素介导的在DMBT1调控序列控制下的基因表达的增量调控作用。
本发明进一步提供了雌激素应答系统，它包含的DMBT1调控序列可有效鉴别或监测被怀疑具有雌激素或抗雌激素活性的化合物。本发明提供了雌激素和孕酮应答系统，它包含的DMBT1调控序列，可有效鉴别或监测被怀疑具有孕激素或抗孕激素活性的化合物。
也提供了分离的核酸，含有可操作性连接到一个报告基因的DMT1调控序列。该DMT1调控序列在应答雌激素信号时能增量调控该报告基因的表达。
DMT1是一个结构复杂的蛋白，其功能也显得同样复杂。已有的工作表明它涉及到粘膜保护和上皮分化。这些功能已经在不同种生物和不同组织中被详细说明。例如在肺中DMBT1的表达伴随着免疫应答(Holmskov et al.，Proc Natl Acad Sci USA 1999，9610794-10799；Madsen et al，2003，Eur J Immunol.332327-2336；Bikker et al，2002，J Biol Chem 27732109-32115；Prakobphol et al，2000，J BiolChem.27539860-39866)；而在肝脏、肾脏和肠中其表达伴随着细胞分化(Bisgaard et al，2002 Am J Pathol.1611187-1198；Vijayakumaret al.，1999，J Cell Biol.1441057-1067；Cheng et al，1996，AnatRecord 244327-343)。尚不清楚这两种功能是否在同一组织中共存。本发明证明在子宫上皮中DMBT1的表达受到雌激素的控制，这个位置有进行中的细胞增殖和分化循环，并且具有粘膜分泌中刺激免疫活性过程中的重要角色。
本发明证明DMBT1的表达在猴子宫内膜细胞和大鼠子宫上皮细胞中受到雌激素的强增量调控(图7和图2)。在对大鼠进行雌激素处理一天后，体内DMBT1基因表达的诱导快速发生(图3B)。在猴子宫内雌激素对DMBT1表达的诱导作用被米非司酮，一种黄体酮拮抗剂所抑制(图7)。米非司酮在由雌激素支配的猴或大鼠子宫内抑制细胞增殖的活力与前述性质有关(Wolf et al.，1989，FertilSteril.521055 1060；Slayden et al，1993，Endocrinology 1321845 1856；Chwalisz et al，2000，Steroids 65741-751)。此外在大鼠子宫内雌激素对DMBT1表达的诱导作用被一种黄体酮剂量依赖性抑制。进一步，黄体酮的抗雌激素作用被与黄体酮拮抗剂共处理大鼠所逆转(图3B)。这些特性被通过其它雌激素依赖的标记基因而观察到，例如那些用于补体成分3的基因(Lundeen et al.，2001，J Steroid BiochemMol Biol.78137-143)。在大鼠子宫内雌激素对DMBT1表达的诱导作用也被与ICI 182，780，一种雌激素拮抗剂共处理大鼠所抑制(图3A)。
此外他莫昔芬(tamoxifen)，一种在子宫中增加上皮厚度的SERM(Nephew et al，2000，Proc Soc Exp Biol Med.223288-294)，也被视为在该组织中的雌激素拮抗剂，能在大鼠子宫内强烈激发DMBT1表达(图2)，尤其是在子宫上皮细胞中(数据未显示)。雷洛昔芬是一种大鼠子宫雌激素拮抗剂，但与他莫昔芬相反，它本身没有对子宫上皮的强激发作用(Buelke-Sam et al.，1998，ReprodToxicol.12217-221；Fig.1)。
使用免疫组织化学方法，本发明证明DMBT1的表达仅限于大鼠子宫上皮细胞(数据未显示)。这个发现与其它发现有关，即DMBT1被限制在不同组织的上皮细胞内(Holmskov et al，supra；Mollenhauer，2000，Cancer Res.601704-1710；Bisgaard et al，supra；Vijayakumar etal.，supra；Cheng et al supra；Mollenhauer et al.，2002，Cancer DetPrev.26266-274)。
本发明证明了DMBT1对鉴别具有雌激素活性、抗雌激素活性、孕酮活性或抗孕酮活性的化合物的有效性。
Ace和Okulicz(Ace et al.，1998，J Clin Endocrinol Metab.833569-3573)报道在未受损猴月经循环的孕酮支配期内，DMBT1表达受增量调控，而在雌激素支配期内在子宫内膜中只有很少或没有可检测的表达。他们通过原位杂交分析进一步表明DMBT1基因表达被限制在子宫内膜基质内。近来这个工作小组又发表了一篇新论文，表明猴DMBT1表达在孕酮支配期内降低(Ace and Okulicz，2004，Reprod Biol Endocrinol.254 http://www.rbej.com/content/2/1/54)。
在一个实施方案中，本发明提供了一种鉴别和/或筛选至少具有一种雌激素活性的化合物的方法。该方法步骤包括(a)使一种待测化合物与一种雌激素应答系统接触；(b)在该雌激素应答系统中通过操作性连接在DMBT1调控序列上的基因，来检测基因表达情况并以此作为雌激素活性的量度。
在某个实施方案中，步骤(b)可包括测量相对于对照的该基因表达，并进一步相对未用待测化合物的方法来鉴别待测化合物改变基因表达水平的结果。
在另一具体实施方案中，可获得DMBT1调控序列控制的基因表达信息以确定待测化合物是不表现雌激素活性还是表现抗雌激素活性。为了这个目的，步骤(b)可进一步包括，将应答待测化合物时无可检测的基因表达提高或基因表达的降低现象分别与无可检测雌激素活性或具有抗雌激素活性联系起来。这个方法对鉴别具有选择性雌激素活性的化合物(SERMs)尤其有效。例如，前文论述过的表现雌激素活性(如激发骨状组织)的化合物可在另一不同雌激素应答系统中(例如子宫内膜组织或乳腺组织，或源自这些组织的组织)被检验以确定DMBT1调控序列控制下的基因表达是没有变化还是在应答该待测化合物时受到减量调控。使用这些方法可能会鉴别出对特定组织具有雌激素活性的SERMs。下文将提供鉴别具有选择性雌激素活性的化合物的其它方法。
如上文所示，本方法所用的雌激素应答系统可以是一个细胞、细胞群包括组织，和能应答雌激素的复杂生物体。如此处定义，典型的雌激素应答系统包含的细胞含有雌激素受体，以使细胞能够应答雌激素。当一个雌激素受体的配体(如一个雌激素化合物)结合到该雌激素受体时，可起始一个细胞信号。这个信号可影响DMBT1调控序列从而导致连接于其上的基因受到增量调控。因此雌激素应答系统包含的细胞含有操作性连接到DMBT1调控序列上的基因。检测该连接基因表达的方法是通过测量该特定基因的一种功能。当该基因是DMBT1时，可监测到雌激素作用。当该基因是报告基因时，细胞优选包含重组构建体，它含有操作性连接到DMBT1调控序列上的报告基因。另一选择是这些细胞在内源性DMBT1调控序列控制下内源性表达DMBT1。下文将讨论报告基因的例子和检测内源性DMBT1基因表达变化的方法。在雌激素应答系统中，结合到雌激素受体上的待测化合物可能对DMBT1调控序列控制的基因表达产生增量或减量调控，或者无作用。
这里定义的“雌激素受体”指任何可结合到雌激素并且这种结合可提高或降低雌激素信号途径的活力的蛋白。优选的，一个雌激素受体是能结合雌激素的核受体基因家族中一个成员的产物，并且(1)它含有一个氨基酸序列，该序列与人雌激素受体1(α)(Greene et al.(1986)Science 2311150-4；GenBank蛋白检索号NoNP_000116)或者人雌激素受体2(β)(Mosselman et al.(1996)FEBS Lett 39249-53；GenBank蛋白检索号NoNP_001428)有高于约60％、65、70、75、80、85、90或95％的氨基酸序列同一性；或者(2)它能与源自抗雌激素受体的抗体如多克隆或单克隆抗体结合，例如这里所述的人雌激素受体1或2。
这里所用的雌激素受体包括人源受体和下文所述的来自非人哺乳动物的受体。这里提到的人源雌激素受体包括所述的α和β异构体，和其它任何另外的本领域技术人员认识的异构体。这里定义的“功能性雌激素受体”是一种能够在转录水平调控基因表达的雌激素受体。
在一个具体实施方案中雌激素应答系统是一种动物。动物包括天然动物和遗传修饰(转基因)的动物。动物可以是人类动物如人，或者一种兽医学动物。兽医学动物包括(但不限于)任何种类的非人动物，例如家庭动物如狗和猫；牲畜如母牛、绵羊和猪；实验室动物如小鼠、大鼠、猴、兔和豚鼠；和水生动物如鱼和海龟。
转基因动物也可用于本发明的方法。可使用以前构建的转基因动物，或选择构建可有助于本发明转基因动物。可通过转基因到一个动物体内构建有效的转基因动物。其方法在相关领域已被认识，并可在如Pinkert，C.A.(Ed.)Transgenic Animal TechnologyALaboratory Handbook，2nd edition，Academic Press(2003)中找到。有用的表型改变可通过提供转基因来产生，这包括改变雌激素或患提速受体的表达，或者由提供雌激素和/或孕酮受体变异体引起的变化。其它有效的转基因提供了操作性连接到一个目的核酸序列上的DMBT1调控序列。将调控区域“操作性连接”到一个核酸序列上，如果它能够控制该序列的转录。能够操作性连接到DMBT1调控区域上的基因包括如这里所需的可检测序列和报告基因。
在给予动物待测化合物之前，也可通过手术、药物或其它处理使得动物体产生所需状态。这种处理可用于减少或除去体内的一种或多种天然体内物质。例如可处理动物以降低或除去对生殖器官和腺体有作用的激素。对生殖器官和生殖腺有作用的激素包括促性腺激素如促卵泡素，和黄体生成素、泌乳刺激素、雌激素等。在其它情况下可通过处理以提高体内的天然物质含量并可有效于在动物体内检测待测化合物的作用。手术手段包括如摘除器官或腺体，它们产生激素或其它能在动物体内引起组织和细胞自分泌或旁分泌作用的物质。可产生这些效果手术方法包括如卵巢摘除术、肾上腺其除术和睾丸摘除术。在一些情况下某些药物可在待测化合物操作之前或之中给予动物，以减少或除去一种或多种体内天然物。
因此在本发明首选的实施方案中，雌激素应答系统是经过处理以降低体内雌激素水平的动物。具体的有效降低体内雌激素水平的处理方法包括卵巢切除术，并可任意包括给予动物一种化合物以降低对生殖器官和腺体有作用的激素(如那法瑞林)的合成。
这里所述方法典型的包括使雌激素应答系统如动物或分离的细胞群或组织与待测化合物接触这一步骤。这些方法的此种目的可在体内或体外实现。当接触步骤包括给予动物一种待测化合物时，待测化合物可通过任何适合的形式和方法给予。待测化合物可以多种形式准备，包括溶解、凝胶、冻干、散布或固化。可预见其首选形式将基于待测化合物的物理特性。待测化合物可通过口腔、静脉内、大脑内、肌肉内、腹膜腔内、皮内、皮下、鼻内或肺内给予动物。首选的给予方式基于动物和待测化合物类型，这对本领域技术人员来说将是明确的。待测化合物典型的给予剂量和时间须足以使该待测化合物完全发挥其对动物的作用。给予剂量和时间也基于动物和待测化合物类型。
待测化合物的作用可在动物体内使用多种方法进行测量。在一个复杂的生物体内例如哺乳动物体内，雌激素对多种组织均有活性，因此雌激素对一种组织的任何一种活性都可作为一种雌激素活性。响应雌激素的组织包括生殖组织(例如子宫组织，如子宫内膜和子宫肌层组织)、乳腺组织、类骨组织、神经组织、血管组织、肾脏组织、肝脏组织、肺脏组织、平滑肌和骨骼肌。具有雌激素活性的化合物可对这些组织中的一种、多种或全部产生作用。在首选的实施方案中，雌激素应答系统包括子宫组织或源自子宫部分的细胞。
可通过获得已经接触了待测化合物的雌激素应答系统的样品并测量该已接触样品的一种或多种特性来确定一种雌激素作用。也可通过获得包含产生自雌激素应答组织成分的样品来确定一种雌激素作用。例如可在给予一个哺乳动物待测化合物后，测量血液样品中的脂蛋白成分。来自生物体的这些种类的样品可称为“生物学样品”。
一个生物学样品可包括分离自试验对象或存在于试验对象中的组织、细胞和生物液。样品也可以是源自病人的“临床样品”(clinicalsample)。这种样品包括(但不仅限于)唾液、血液、血细胞(如白细胞)、羊膜液、血浆、精液、骨髓和组织或细针穿刺活检样品、尿、腹膜液、胸膜液或来自这些的细胞。生物学样品可包括组织切片如冷冻切片以用于组织学目的。生物学样品包括如取自子宫内膜的活组织切片。生物学样品也可称作“临床样品”。试验生物学样品是已经进行分析、监测或观测了的生物学样品。对照生物学样品可以是试验生物学样品的阳性或阴性对照。对照生物学样品通常包含与试验生物学样品相同类型的组织、细胞和生物液。
在本发明的另一实施方案中，在动物体内的从两种或多种不同雌激素应答组织或细胞测得处于DMBT1调控序列控制下的基因表达的信息。获得并分析这种信息可方便的确定一种待测化合物是否具有选择性雌激素活性(例如化合物是否是一种SERM)。例如如果在一个样品内待测化合物引起DMBT1调控序列控制下的基因表达的提高，而在另一样品内该待测化合物没有引起表达提高或引起表达减弱，则该化合物证明有选择性雌激素活性。
因此根据这个实施方案，本发明提供了一种鉴别或筛选具有选择性雌激素活性的化合物的方法，其步骤包括(a)使待测化合物与第一雌激素应答系统接触；(b)使待测化合物与第二雌激素应答系统接触；(c)从第一雌激素应答系统和第二雌激素应答系统获得表示DMBT1调控序列控制下的基因表达的信息；和(d)将(i)第一雌激素应答系统中DMBT1调控序列控制下的基因表达提高和在第二雌激素应答组织中表达降低或无表达，或(ii)在第一雌激素应答系统中表达降低或无表达和在第二雌激素应答系统中表达提高，与选择性雌激素活性联系起来。一方面这个实施方案的方法包括使待测化合物与动物接触，检测来自动物的第一雌激素应答组织中操作性连接到DMBT1调控序列上的基因表达，并检测来自动物的第二雌激素应答组织中操作性连接到DMBT1调控序列上的基因表达，或者检测第二动物中的相应表达，并将雌激素应答系统中的基因表达与选择性雌激素活性联系起来。
在本发明的另一实施方案中，可从一个应答待测化合物的细胞或组织测量DMBT1的表达或DMBT1调控序列控制的基因表达，再从一个不同细胞或组织(或在其中)测量产生的另一雌激素作用，如此可确定选择性雌激素活性。这中“另一雌激素作用”可以是由雌激素化合物产生的任何种类的作用，并且不是DMBT1表达或DMBT1调控序列控制的基因表达。该作用类型包括由雌激素受体活化引起的胞内作用，包括雌激素受体移动到胞核；雌激素应答基因表达的诱导；一氧化氮产生增强；细胞增殖，包括乳房内皮细胞和子宫内膜细胞；细胞分化和生长，包括神经突生长和分化的增强；组织生长，包括子宫内膜组织的生长；骨骼矿物密度提高；血液成分改变包括高密度脂蛋白(HDL)胆固醇和甘油三酯的增多，低密度脂蛋白(LDL)胆固醇的减少，血液凝固作用增强；和炎症的增多。
在这个实施方案中，从不同雌激素应答组织或细胞中(也就是从不同雌激素应答系统)测量DMBT1或DMBT1调控序列控制的基因表达和其它雌激素作用。根据这个实施方案，不同的雌激素应答系统可以是如，来自同一动物，来自不同动物，来自动物和来自修饰细胞，来自两种不同修饰细胞等。当待测化合物(a)提高一个雌激素应答系统的DMBT1表达或DMBT1调控序列控制的基因表达，并对另一雌激素应答组织有抗雌激素作用，或者(b)降低一个雌激素应答系统的DMBT1表达或DMBT1调控序列控制的基因表达，并对第二雌激素应答系统有雌激素作用的时候，即认为表现出选择性雌激素活性。
因此根据这个实施方案，本发明提供了另一鉴别或筛选具有选择性雌激素活性的方法，其步骤包括(a)使待测化合物与第一雌激素应答系统接触；(b)使待测化合物与第二雌激素应答系统接触；(c)测量第一雌激素应答系统中DMBT1调控序列控制下的基因表达；(d)测量第二雌激素应答系统中的其它雌激素作用；和(e)将(i)第一雌激素应答系统中表达的提高和在第二雌激素应答组织中无雌激素作用或抗雌激素作用，或(ii)在第一雌激素应答系统中表达的降低或无表达和在第二雌激素应答组织中存在雌激素作用，与选择性雌激素活性联系起来。
根据这个实施方案，接触步骤通常在测量同一雌激素应答系统步骤前面进行。除了这一限制，这些步骤可以按任何所需顺序进行。在一些情况下首先确定待测化合物对DMBT1调控序列控制下的基因表达产生的作用；在其它情况下，首先确定待测化合物对不同雌激素应答化合物产生的其它雌激素作用。步骤顺序可根据待鉴别化合物的种类或该方法其它相关因素来确定。
可使用任何适合的技术来从另一个雌激素应答系统测量雌激素作用。在一个具体实施方案中可直接从来自另一雌激素应答系统的样品测量雌激素作用。例如可测量一个组织样品在应答待测化合物时的尺度和重量增长，或者使用生化、免疫化学或显微技术来分析如组织中的细胞增殖情况。在另一具体实施方案中，可通过确定另一雌激素应答系统在应答待测化合物时产生的成分情况来测量雌激素作用。例如一个雌激素应答系统如类骨组织在应答待测化合物时可产生出现于动物血液或其它体液中的成分，例如分泌的骨翻转蛋白(secreted bone turnover)(例如骨钙蛋白、碱性磷酸酶和前胶原前肽)。可通过分析这些成分以确定待测化合物是否具有雌激素活性。由待测化合物的雌激素活性引起的变化可与合适的对照进行比较以量化该雌激素活性。
如上文所述，一个非常有效的实施方案包括测量待测化合物的引起细胞增殖的能力。可以在如乳腺、类骨、神经或血管组织中测量细胞增殖情况。如所述的，可通过测量相对于对照的组织的重量或大小的增加情况来衡量细胞增殖的程度。也可以通过显微观测细胞分裂来确定增殖情况，或者通过生化或免疫学技术来确定增殖标记物的出现，例如细胞表面蛋白或者胞内分子，来确定增殖情况。有效的细胞增殖标记物包括但不仅限于，细胞循环蛋白如细胞周期蛋白和增生细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen(PCNA))，信号中间物(signaling intermediates)例如增殖相关基因产物(proliferation-associated gene product(PAG))，核酸结合蛋白和转录因子例如mRNA结合蛋白HuR，等等。
在本发明的一些实施方案中，测量了DMT1核酸或DMBT1蛋白的表达。生物学样品中的DMBT1 mRNA量可通过使该生物学样品与一种能够特异性检测DMBT1 mRNA的化合物或试剂相接触，来进行测量。有效技术包括使DMBT1 mRNA与能够与其特异性杂交的标记核酸探针相接触。特异于DMBT1 mRNA的核酸探针例如可以是一个本文所述的全长人DMBT cDNA或其部分序列，例如一个人DMBT1的至少长15、30、50、100、250或500核苷酸的寡核苷酸，它并且能购足以在严格条件下与DMBT1 mRNA杂交。特异于DMBT1 mRNA的核酸探针优选在严格条件下仅与特异于DMBT1mRNA发生杂交，而不与检验的生物学样品中存在其它核酸发生杂交。
关于核酸探针或抗体的“标记”这一术语用以指对探针或抗体的直接标记，即通过偶联(也就是物理法连接)上一个可检测的物质，也指对探针或抗体的间接标记，即通过化学反应连接上一个被直接标记的另一分子。间接标记的例子包括使用被荧光标记的二级抗体检测一个初级抗体，和用生物素末端标记DNA探针，这样就可用被荧光标记的链霉抗生物素来检测探针。
其它有效的在生物学样品中确定DMBT1 mRNA量的技术包括进行反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)。可从用待测化合物处理过的样品制备互补DNA(cDNA)，使用特异于DMBT1序列并能在严格PCR条件下与DMBT1 cDNA进行杂交的寡核苷酸引物扩增DMBT1cDNA。可使用商品试剂盒，它能方便的检测包含可检测标记物的PCR产物，例如SYBRTM Green PCR Core Reagents(Applied Biosystems，Foster City，CA)。
其它有效的在样品中确定DMBT1 mRNA量的技术DNA微阵列分析技术和Northern杂交，如在实施例1和实施例2中分别所述。
可通过使生物学样品与一个能特异性检测DMBT1蛋白的化合物或试剂相接触来测量生物学样品中的DMBT1蛋白。检测DMBT1蛋白的试剂优选为可与DMBT1蛋白某部分特异结合的抗体。在一种首选的方法中，一个DMBT1蛋白的特异抗体偶联一个可检测的标记物，并使用它来检测DMBT1。DMBT1蛋白的特异抗体可以是多克隆或是单克隆。可使用能够完整抗体分子或其片段(如Fab orF(ab’)2)。
检测多肽例如DMBT1的技术包括酶联免疫分析(ELISAs)、Western blots、免疫沉淀和免疫荧光技术。这些方法的细节可在如Sambrook et al(supra)中找到。
其它在体内检测mRNA或蛋白的技术包括下文将要描述的融合表达DMBT1调控序列和一个报告基因、原位杂交和免疫组织化学技术(以在特异亚细胞空间和/或结构中固定信使RNA和蛋白)。
此外，定量方法例如正电子散射X射线断层摄影(positronemission tomography(PET))成像术，使得以非侵入方式评估活人器官中DMBT1蛋白成为可能(Sedvall et al.，(1988)Psychopharmacol.Ser.，527-33)。例如通过静脉将痕量的偶联有放射性示踪剂的DMBT1蛋白注射入试验对象体内，就可得到放射性标记在试验对象的子宫、乳房、骨骼、血管系统或大脑中分布的图像。相关领域技术人员认识PET成像术和其它成像技术(参见review by Passchier et al.，(2002)Methods 27278)。
在其它实施方案中，一个报告基因被置于DMBT1调控区域的控制之下并测量其表达情况。这里使用的“报告基因”是一段不同于DMBT1调控区域的核酸序列，并且其在胞内表达时编码一个能提供可检测信号的蛋白。预期可使用很多种不同核酸序列作为报告基因。有效的核酸序列包括天然序列、重组序列和合成序列，当它们在胞内表达时可使用如核酸探针的方法来进行检测。报告基因能提供可检测的信号，例如来自荧光蛋白的散射光。其它报告基因编码的蛋白在某种物质存在时能催化一个特异反应，其反应产物提供一个可检测的信号。还有一些报告基因编码独特的蛋白，可使用亲和分析方法如免疫亲和分析来检测该该蛋白。
在首选的实施方案中，将一个报告基因置于DMBT1调控序列的控制之下，并且将这个异源序列导入到雌激素应答细胞内。可用在这个方法和本发明成分中的报告基因包括(但不仅限于)，绿色荧光蛋白(GFP)编码基因、β-半乳糖编码基因(lacZ)，荧光素酶编码基因(luc)、氯霉素乙酰转移酶编码基因(cat)、β-葡糖醛酸糖苷酶编码基因、新霉素转磷酸酶编码基因和鸟嘌呤黄嘌呤磷酸核糖转移酶编码基因。
在本发明另一实施方案中，雌激素应答系统是能表达功能性雌激素受体的细胞。这种细胞表达的功能性雌激素受体也至少包含DMBT1调控序列的部分序列，从而在该雌激素受体与雌激素化合物结合时，该序列能增量调控操作性连接于其上的基因表达。
因此根据本发明可通过以下步骤鉴别或筛选化合物雌激素活性(a)使细胞与待测化合物接触，该细胞具有(i)功能性雌激素受体和(ii)一个核酸，包含在DMBT1调控序列控制下的基因；(b)获取该基因的表达信息；和(c)使用步骤(b)的信息确定雌激素活性。
从而，使DMBT1调控序列控制下的基因表达提高的待测化合物具有雌激素活性；反之在雌激素存在时降低该基因表达的化合物可与抗雌激素活性联系起来。
在这个方法中可使用天然细胞或修饰细胞。天然细胞包括分离自雌激素应答组织中分离的细胞，例如分离自子宫组织如子宫内膜和子宫肌层组织、乳腺组织、类骨组织、神经组织和血管组织。可使用活组织切片或其它相关领域认识的技术来分离这些细胞。
“修饰细胞”指已被通过人工操作改变了某种遗传或生化特性的细胞。修饰细胞包括如含有异源核酸的转染和转基因细胞。因此在另一实施方案中，本发明也提供了应答雌激素的修饰细胞，该细胞同时含有一个异源核酸，其中包含操作性连接到报告基因序列上的DMBT1调控序列。这种细胞对筛选化合物雌激素活性尤其有效。
根据本发明，可使用任何类型的细胞，只要它能表达功能性受体并产生能够驱动DMBT1调控序列控制下的基因表达的雌激素信号。可使用内源性表达雌激素受体的细胞，用异源核酸转染该细胞，该核酸包含操作性连接到如报告基因上的DMBT1调控序列。首选使用真核细胞。在一个首选的实施方案中，宿主细胞源自子宫，例如类似Ishikawa细胞的子宫内膜基质细胞。在另一首选实施方案中，宿主细胞源自乳房，例如MCF-7细胞。在另一首选实施方案中，宿主细胞源自骨骼，例如MG63细胞。在另一首选实施方案中，宿主细胞源自血管系统，例如HUVEC细胞。在另一首选实施方案中，宿主细胞是脑细胞，例如SK-N-MC细胞。此外预期可使用简单真核细胞例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)构建雌激素应答系统(Jungbauer，A.，and Beck，V.J.，(2002)Chromatogr B Analyt TechnolBiomed Life Sci，777167)。
如本文所述可使用能够表达雌激素受体的核酸转染细胞。可使用稳定转染或瞬时转染到胞内的载体表达雌激素受体。适合于表达雌激素受体载体在相关领域被认识并有商品供应，例如Promega公司产品(Madison，WI)。在一些情况下可能在胞内需要表达雌激素受体的变异体。某些雌激素受体变异体可能会表达出其活性相关的不同表型，例如组成性活力、敏感度提高和降低。雌激素受体变异体的一些例子参见Chambraud et al.(1990)J.Biol.Chem.26520686-91。
也可使用一个异源核酸转染细胞，此核酸含有处于DMBT1调控序列转录水平控制下的报告基因序列。处于DMBT1调控序列控制下核酸序列可以是任意种类的序列，只要它能被本文所述方法检测到。有效的核酸酸序列可编码本文所述的蛋白或酶，当基因表达时这些蛋白使得细胞可被检测。尤其有效的报告基因所编码的报告蛋白如荧光素酶(luc)也在本文中进行了描述。为了确定如特异性和背景，可使用第二融合基因作为提高检测特异性的对照，该融合基因含有相同的报告基因和不同的调控序列(例如，报告基因的调控序列不应答雌激素信号)。
在一个实施方案中，可制备一个核酸结构并将其导入到胞内。此核酸至少含有DMBT1调控序列(SEQ ID NO1，见表2)的部分序列，此部分序列足以在应答雌激素信号时驱动操作性连接基因的表达。
根据本发明，DMBT1调控序列(SEQ ID NO1的840-872部分)中从-2766到-2734位的部分序列能够在应答雌激素信号时驱动操作性连接于其上的基因的表达。因此在本发明的一个实施方案中，包含SEQ ID NO1840-872部分或其变异体的核酸可被操作性连接到一个基因上并被导入到雌激素应答细胞，并可在一种方法中用以鉴别具有雌激素活性的化合物。这段DMBT1调控序列的变异可包括核苷取代和/或删除，这些变异不足以降低它在应答雌激素信号时的驱动操作性连接的基因表达的能力。SEQ ID NO1840-872部分的变异体可使用合成或重组技术方便的制备。例如变异体序列相比SEQID NO1840-872部分具有约60％的核苷序列同一性，优选约为65、70、75、80、85、90、或者95％序列同一性。本发明的DMBT1调控序列优选可在高严格条件下与SEQ ID NO1杂交，或者与SEQ IDNO1内任何30mer连续序列相比至少有85％的序列同一性。
此外也发现DMBT1调控序列上游-1347处(SEQ ID NO12259核苷酸的上游)部分可提供改进的应答雌激素信号作用。因此在本发明的一个首选实施方案中，一个包含SEQ ID NO1 1-2259序列的核酸，包含SEQ ID NO1 1-2259序列中部分序列(包括SEQ ID NO1840-872序列)的核酸，或是包含这些序列变异体的核酸，可被操作性连接到一个基因上并导入雌激素应答细胞，并在一个方法中用以鉴别具有雌激素活性的化合物。更具体的，包含-2734位上游序列的DMBT1调控序列可提供改进的应答雌激素的作用。因此在本发明的另一首选实施方案中，一个包含SEQ ID NO1 1-872序列的核酸，包含SEQ ID NO1 1-872序列中部分序列(包括SEQ ID NO1 840-872序列)的核酸，或是包含这些序列变异体的核酸，可被操作性连接到一个基因上并导入雌激素应答细胞，并在一个方法中用以鉴别具有雌激素活性的化合物。
在另一实施方案中，本发明提供了分离的核酸序列，它包含操作性连接到一个报告基因上的DMBT1调控序列。DMBT1调控序列在应答雌激素化合物时能增量调控DMBT1的表达。在一个实施方案中，DMBT1调控序列包含SEQ ID NO1 840-872序列，或者包含这段序列的变异体(如本文所述)，这个调控序列本操作性连接到一个报告基因上。
在一个更首选的实施方案中，一个包含SEQ ID NO1 1-2259序列的核酸，包含SEQ ID NO1 1-2259序列中部分序列(包括SEQ IDNO1 840-872序列)的核酸，或是包含这些序列变异体的核酸，被操作性连接到一个报告基因上。在另一优选实施方案中，一个包含SEQ ID NO1 1-2259序列的核酸，包含SEQ ID NO1 1-872序列中部分序列(包括SEQ ID NO1 840-872序列)的核酸，或是包含这些序列变异体的核酸，被操作性连接到一个报告基因上。
如这里所述，本发明阐明了将具有孕酮活性或抗孕酮活性的化合物与雌激素化合物伴随给予时，能够降低雌激素介导的对DMBT1调控序列控制下基因表达的增量调控作用。这方面本发明为筛选、监测和/或鉴别具有孕酮活性或抗孕酮活性化合物的方法建立了基出。
孕酮受体调节剂(PRM)可包括在一些组织中有孕酮活性而在另一些组织中有抗孕酮活性的化合物，和可用本文所述方法鉴别出的化合物。一个有效的临床PRM的例子是米非司酮，它可在子宫内膜中抑制雌激素的促增殖作用，同时不诱导分泌状态(如同孕酮一样)。已经设想将PRM用于含有雌激素的激素替代疗法，它们将阻碍雌激素的刺激性作用，同时当用它们单独处理子宫内膜时，其表现症状是雌激素依赖性的。
在一个实施方案中这里所述的方法可鉴别出新型的具有孕酮或抗孕酮活性的化合物，例如PRM。可通过确定DMBT1调控序列控制下的基因表达情况来鉴别PRM。例如当一个待测化合物能够降低雌激素诱导的对DMBT1调控序列控制下的基因表达的增量调控作用时，可认为该化合物具有抗孕酮活性，是一种PRM。
因此在另一实施方案中，本发明提供了鉴别或筛选具有孕酮或抗孕酮活性的化合物。该方法步骤包括因此根据这个实施方案，本发明提供了另一鉴别或筛选具有选择性雌激素活性的方法，其步骤包括(a)使雌激素化合物与雌激素和孕酮应答系统接触；(b)使待测化合物与雌激素和孕酮应答系统接触；(c)获取雌激素和孕酮应答系统中DMBT1调控序列控制下的基因表达信息；和(d)使用步骤(c)得到的信息来确定孕酮或抗孕酮活性。
在一个实施方案中步骤(c)可包括相对对照来测量基因表达情况，步骤(d)可包括将应答待测化合物时基因表达的降低与孕酮活性或抗孕酮活性联系起来。具体来说，当一个待测化合物能够降低雌激素介导的对DMBT1调控序列控制下的基因表达的增量调控作用时，它可能有孕酮活性或者有抗孕酮活性，这取决于所用的雌激素和孕酮应答系统。例如一个具有孕酮活性的化合物在大鼠子宫内能够降低雌激素介导的对DMBT1调控序列控制下的基因表达的增量调控作用；而一个具有抗孕酮活性的化合物在猴子宫内能够降低雌激素介导的对DMBT1调控序列控制下的基因表达的增量调控作用。
此外有可能在一些雌激素和孕酮应答系统中，孕酮激动剂和孕酮拮抗剂对DMBT1表达的作用将不能区分，也就是说两者都会降低雌激素介导的对DMBT1调控序列控制下的基因表达的增量调控作用。优选的，本发明的方法进一步包含测量孕酮应答作用的步骤，此应答作用不同于DMBT1调控序列控制下的基因表达。例如在灵长类动物体内，孕酮激动剂和拮抗剂对子宫内膜组织学有截然不同的作用，也就是说前者通过分化诱导分泌表型，而后者通过抑制细胞分裂诱导无增殖、无分泌表型。因此在一些实施方案中，本发明的方法进一步包括测量子宫内膜组织学变化或测量子宫内膜分泌标记物的步骤，或者通过在乳腺中测量特异的孕酮依赖基因标记物。在啮齿动物体内，第二种孕酮作用可通过蜕膜化，一个依赖孕酮的衡量子宫接受胚胎准备情况的分析，来进行测量。
雌激素和孕酮应答系统可以是能够应答雌激素和孕酮的单个细胞、组织或复杂的多细胞生物体。典型的雌激素和孕酮应答系统包含的细胞同时含有雌激素受体和孕酮受体。雌激素和孕酮应答系统也包含DMBT1调控序列控制下的基因，该基因的表达是可测量的。在雌激素和孕酮应答系统中，可利用抗孕酮活性抑制雌激素信号引起的对DMBT1调控序列控制下的基因表达的增量调控作用，例如利用孕酮拮抗剂对孕酮受体的作用。
这里定义的“孕酮受体”指任何能够结合到孕酮并且该结合能够提高和降低孕酮信号途径活性的蛋白。优选的，孕酮受体是能结合孕酮的核受体基因家族中一个成员的产物，并且(1)它含有一个氨基酸序列，该序列与人孕酮受体B(Kastner et al.(1990)EMBO J91603-14；GenBank protein accession NoNP_000917)有高于约60％、65、70、75、80、85、90或95％的氨基酸序列同一性；或者(2)它能与源自抗孕酮受体的抗体如多克隆或单克隆抗体结合，例如这里所述的人孕酮受体B。这里所用的孕酮受体包括人源受体和来自非人哺乳动物的受体(例如兽医学动物如马、牛、绵羊和猪，家庭宠物如狗和猫，实验室动物如小鼠、大鼠、猴、兔和豚鼠。)这里提到的人孕酮受体包括所述的B型异构体，A型异构体缺少B型异构体中的N-末端的第一164个氨基酸残基，和其它任何另外的本领域技术人员认识的异构体。这里定义的“功能性孕酮受体”是一种能够在转录水平调控基因表达的孕酮受体。
在一个具体实施方案中，雌激素和孕酮应答系统是动物体，包括这里所述的天然和遗传修饰(转基因)动物。如本文所述这些动物也可在给予待测化合物之前，用手术或药物方法进行处理以使其产生所需状态。
所用方法包括使待测化合物与雌激素和孕酮应答系统接触的步骤。这一步可在使雌激素化合物与应答系统接触之前、同时或之后进行。接触时间或待测化合物给予时间长度依赖于多个因素，这包括待测化合物本身的性质，雌激素化合物，待测化合物和雌激素化合物剂量，等等。如本文所述雌激素化合物和待测化合物可以接任何适合的形式和方法进行给予。
可用多种方法来在动物体内测量待测化合物的作用。在复杂生物体内例如不如动物体内，雌激素和孕酮当然对不同种类组织都有作用。因此根据该方法，需要使用这样的雌激素和孕酮应答系统，a)它响应雌激素化合物并且在应答雌激素化合物时产生可测量的雌激素作用，和b)它响应孕酮化合物。按这种方法，可评估待测化合物的孕酮或抗孕酮活性。
在本发明的另一实施方案中，使动物与雌激素化合物和待测化合物接触，并在来自该动物的组织中测量DMBT1的表达或者DMBT1调控序列控制下的基因表达。在一些情况下，确定一个组织中(例如子宫内膜组织)DMBT1的表达或者DMBT1调控序列控制下的基因表达，可能已足以确定待测化合物是够具有孕酮或抗孕酮活性。
在本发明的另一实施方案中，在动物的两各或多个组织中测量DMBT1的表达或者DMBT1调控序列控制下的基因表达。典型的，这两个或多个组织不同并且都响应雌激素和孕酮。在这个实施方案中，测量可确定待测化合物是否具有选择性孕酮活性(例如化合物是否是一种PRM/SPRM)。该待测化合物至少在一个组织中将表现抗孕酮活性，例如在雌激素化合物存在时降低DMBT1的表达，同时在其它组中该待测化合物将没有作用或表现出孕酮作用。
在另一实施方案中，通过在一个组织中测量DMBT1的表达或者DMBT1调控序列控制下的基因表达，并且在另一个组织测量待测化合物的另外孕酮作用，这两个组织均已与雌激素化合物和待测化合物接触，来确定选择性孕酮活性。另外的孕酮作用可以是任何种类的作用，只要它是由孕酮化合物产生并且不是DMBT1的表达或者DMBT1调控序列控制下的基因表达。作用种类包括孕酮受体活化引起的胞内作用，包括孕酮受体移动到胞核；诱导的孕酮应答基因的表达；子宫内膜上皮细胞的刺激和分化；黄体的发展和黄体结构-功能的保持。
如本文所述可用任何技术来从被雌激素和待测化合物处理过的雌激素和孕酮应答组织中测量DMBT1基因的表达。此外DMBT1调控序列控制下的基因表达也可如本文所述进行测量。
在本发明的另一实施方案中，雌激素和孕酮应答系统是表达功能性雌激素受体和功能性孕酮受体的细胞。表达这些受体的细胞也至少包含DMBT1调控序列的一部分，以在雌激素受体结合雌激素化合物时驱动操作性连接于其上的基因的表达。因此根据本发明，可通过以下步骤来鉴别或筛选孕酮或抗孕酮化合物，(a)使雌激素化合物与细胞接触，该细胞(i)含有功能性雌激素受体，(ii)含有功能性孕酮受体，(iii)含有一个核酸，包含DMBT1调控序列控制下的基因；(b)使待测化合物与细胞接触；(c)测量相对于对照的基因表达情况；和(d)将在应答待测化合物时该基因表达的降低与孕酮或抗孕酮活性联系起来。
在这个方法中可使用天然细胞或修饰细胞。天然细胞包括分离自雌激素和孕酮应答组织的细胞，例如子宫组织如子宫内膜和子宫肌层组织，乳腺组织和神经组织。
在另一实施方案中，本发明也提供了修饰细胞，它可应答雌激素和孕酮并含有一个核酸，包含操作性连接到一个报告基因上的DMBT1调控序列。这种细胞对筛选抗孕酮活性化合物尤其有效。
根据本发明可使用任何种类的细胞，只要它可表达功能性受体并可产生作用于DMBT1调控序列的雌激素信号。可使用内源性表达雌激素受体和孕酮受体的细胞型，并用一个核酸进行转染，该核酸包含操作性连接到一个报告基因上的DMBT1调控序列。内源性表达雌激素受体和孕酮受体的细胞包括T47D和ZR75-1细胞。首选使用真核细胞。此外如本文所述预期可使用简单真核细胞例如酿酒酵母来作为雌激素和孕酮应答细胞系统的基础。可通过用一个核酸来转染细胞，该核酸包含操作性连接到一个报告基因上的DMBT1调控序列，或者通过从含有雌激素受体的细胞或组织中测量雌激素作用来检测细胞通过DMBT1调控序列的激发蛋白表达的能力。
在另一实施方案中，可用表达雌激素受体、孕酮受体或同时表达两者的核酸来转染细胞。这里已经描述了雌激素受体和孕酮受体以及可启动两者表达的载体。预期可表达雌激素受体变异体和孕酮受体变异体。如本文所述也可用一个包含DMBT1调控序列控制下的基因的核酸来转染细胞。这里也描述了首选的DMBT1调控序列。
接受激素替代疗法的对象患子宫癌的风险增大，这是因为对子宫内膜的刺激作用没有受到抑制。在一个首选的实施方案中，本发明的方法可用于监测对象子宫内的雌激素、SERM或PRM活性，这里本文所述的生物学样品来自对象的子宫，例如子宫内膜活组织切片样品。也可监测怀疑具有这些活性的待测化合物。本领域技术人员认识如何从对象获得子宫内膜活组织切片样品的方法。例如在月经周期的限定时期内使用活组织切片钳，通过穿子宫颈管从子宫头盖形体(cranial uterine body)收集子宫内膜活组织切片样品。也可使用Tao Brush法(Wu et al.(2000)Am.J.Clin.Pathol.，114412-418)、碎片刮除术或手术切开来收集子宫内膜活组织切片样品。
雌激素和孕酮的刺激作用也会引起起治疗对象患乳癌的风险增加。在另一首选实施方案中，本发明的方法可用于监测对象乳腺内的雌激素、SERM、PRM活性，这里本文所述的生物学样品来自对象的乳腺。也可监测怀疑具有这些活性的待测化合物。本领域技术人员认识如何从对象乳腺获得生物学样品的方法。例如可用管内吸引术(intraductal aspiration)或者常规挤榨收集法(conventionalsqueezing collection method)来收集乳腺流出液。其它可用的从对象乳房收集生物学样品的方法包括(但不仅限于)体外细针抽吸穿刺术(ex vivo fine-needle aspiration(FNA)(Eliasen et al.(1991)，Mod.Pathol.，4196-200))、乳房穿刺活检(breast core needle biopsies(Ellis etal.(2002)Clin.Cancer Res.，81155-1166))和手术切开。
本发明的方法可任意用于监测试验对象骨骼组织或血管组织中的雌激素、SERM、PRM活性，优选用于实验室动物，例如猴、兔或大鼠，其中本文所述的生物学样品来自对象的骨骼或血管系统。也可监测怀疑具有这些活性的待测化合物。本领域技术人员认识如何从对象的骨骼或血管系统获得生物学样品的方法。
除了影响视丘下部和大脑中其它涉及生殖的区域，卵巢类固醇激素对大脑有广泛作用，包括作用于5-羟色胺能通路(serotoninpathways)、儿茶酚胺能神经元(catecholaminergic neurons)、基底前脑胆碱能系统(basal forebrain cholinergic system)和海马结构(hippocampal formation)，一个涉及空间和提取(declarative)记忆的大脑区域(McEwen(2002)Recent Prog Horm Res.57357-84)。特别的，雌激素被认为对大脑衰老有保护作用，但对这个保护机制所知甚少。
在另一个首选实施方案中，本发明的方法可用于监测对象大脑中的雌激素、SERM、PRM活性，其中本文所述的生物学样品来自对象大脑。也可监测怀疑具有这些活性的待测化合物。本领域技术人员认识如何从对象的大脑获得生物学样品的方法。例如使用活体解剖针，并通过成像引导活检术(imaging-guided biopsy)引导，如CT或MR引导活体解剖来从大脑得到生物学样品。当然，也可在尸体解剖时分析大脑组织。
实施例1鉴别猴子宫内膜中雌激素处理引起的基因表达增量调控以下实施例证明在切除卵巢后随之用雌激素处理的猴的子宫内膜中鉴别出一个特定基因，在受到增量调控的一组基因中，该基因的表达模式为受到强烈的增量调控作用。
简要来说，从切除卵巢猴和对照猴取得组织样品，从该样品中制备标记cDNA，然后用微阵与cDNA杂交。微阵结果显示许多基因较之于对照样品受到增量调控或减量调控。一个在雌激素存在时受到强烈增量调控的基因被鉴别为推定的激素抑制基因DMBT1。
I.动物和给药所有涉及到动物的方法均在美国实验动物科学协会(AmericanAssociation for Assessment and Accreditation of Laboratory AnimalCare，AAALAC)认可的动物实验设备中进行，并符合实验动物饲养管理及使用规范(The Guide for the Care and Use of LaboratoryAnimals，NIH)。处理方案经东弗吉尼亚医学院动物管理及使用委员会(Eastern Virginia Medical School Internal Animal Care and UseCommittee，IACUC)核准。
从Covance Research Products公司获得成年母猕猴(Macacafascicularis)。经历一个完整的月经周期后，在下一周期的卵泡期使用中腹剖腹术(mid-ventral laparotomy)将动物的卵巢摘除。手术四周后用雌激素处理摘除卵巢(OVX)的动物。
为了研究雌激素对基因表达的影响，以三只OVX猴为一组，对各组在19天处理周期的第一天给予雌激素或安慰剂植入物(载体对照)。植入后稳态血浆雌二醇水平达到100-200pg/ml。
此时期后对OVX猴实施安乐死，并从经雌激素和安慰剂处理过的猴子宫内膜取得活组织切片。(OVX猴和OVX并经雌激素处理猴子宫内膜特征的细节在实施例4中描述)。将活组织切片置于无菌容器内并立即用液氮速冻，在后续处理前保存于-80℃。如下文所述从每个子宫内膜活组织切片制备总RNA。
II.从活组织切片制备总RNA如下步骤使用RNAzolTM(Tel-Test，Friendswood，TX)从子宫内膜活组织切片(每个约50mg)制备总RNA。每100mg组织使用2mlRNAzolTM。用Tissue Tearor homogenizer(Model No.985 370；BioSpecProducts，Bartlesville，OK)匀浆化处理组织2-3min，然后转移到玻璃研钵中。组织研磨过程中至少用研棒捣10下直至得到清澈的悬浮液。将匀浆转移到一个聚丙烯锥形烧瓶中，按每1ml匀浆0.1ml加入氯仿。剧烈振荡混合物1min。然后将该悬浮液转移到一个2ml微离心管中，再用Biofuge 17R离心机(Baxter，Deerfield，IL)在一个固定角度的转子中，4℃下12000g离心15min。将水相小心转移到一个新微离心管中，并加入等体积的异丙醇，轻微混匀后4℃下孵育15min。如上文所述4℃下12000g离心混合物15min得到RNA沉淀，除去上清，用75％(v/v)乙醇(Pharmco Products，Brookfield，CT)洗涤RNA沉淀。再4℃7500g离心8min，除去上清，将RNA沉淀粗略吹干并用无RNase水(Promega，Madison，WI)重悬浮。然后用Amplification Grade无RNase DNase I处理以除去任何残余DNA(Invitrogen，Carlsbad，CA)。具体的，每20mgRNA在0.1ml反应液中处理，反应液含有1X Dnase I反应缓冲液和10UDNase I，室温反应15min。消化完毕后，加入0.35ml RNeasy Mini Kit试剂盒(QIAGEN，Valencia，CA)的Buffer RLT并充分混匀，再加入0.25ml100％(v/v)乙醇。将混合物转到RNeasy Mini Kit试剂盒柱子中，在ALC 4214微离心机中10,000rpm离心15秒。丢弃洗出液，RNA保留在柱子上。用Buffer RPE洗涤两次，每次在ALC 4214微离心机中10,000rpm离心15秒。用30μl无RNase水将RNA洗脱到收集管中。如上述进行异丙醇沉淀、乙醇洗涤和离心。从每个组织样品制备100-200mg RNA。
III.探针制品和DNA微阵杂交每种RNA制品各取一份制备与第一种芯片杂交的探针，该芯片含有来自4475个单独基因标识的人互补DNA序列。该基因的冗余约为25％；也就是产生印迹的DNA中有3400个代表单拷贝基因(或基因簇)。人与猴的编码序列平均有95％以上的保守性；因此不能预测芯片上由于猴RNA和人基因间低互补性造成的复杂性。
芯片的产生通过使用GenIII Array Spotter(Molecular Dynamics，Sunnyvale，CA)，将纯化的5M硫氰酸钠中的PCR扩增DNA点到玻片(Corning GAPS slides(Corning，NY))上，再用500mJ紫外照射以发生交联。
然后用子宫内膜RNA样品制备标记cDNA探针。热变性RNA，在三磷酸Cy3-脱氧胞苷(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)存在下用反转录制备标记cDNA探针。用RNase A(AmershamPharmacia Biotech)消化除去RNA，然后用PCR产物纯化试剂盒(QIAquick 96 PCR purification kit(QIAGEN))进行纯化。所有探针在Cytofluor(Applied Biosystems，San Diego，CA)上测量时根据荧光进行标准化。探针制品干燥后，重悬在含有50％(v/v)甲酰胺(JT Baker，Phillipsburg，NJ)和10％(v/v)Cot-1 DNA(Invitrogen)的Version 2 Hyb缓冲液(Amersham Pharmacia Biotech)中。95℃加热混合物2min，冷却后取50μl置于两个芯片上。用盖玻片盖住芯片并用DPX(Fluka，Milwaukee，WI)密封，42℃温育14h。开始用含0.2％(w/v)十二烷基硫酸钠的1X SSC 42℃洗涤，然后用含0.2％(w/v)十二烷基硫酸钠的0.1X SSC 55℃洗涤，每次洗涤5min。干燥芯片并用GenIII ArrayScanner(Molecular Dynamics)扫描芯片。同一实验的原始亮度数据标准化为所有芯片的75％。每个基因标识在每个芯片上点两次，同时副本芯片再与标记样品进行杂交。因此每个基因标识产生了四组数据点(n＝4)。
IV.芯片杂交数据分析使用OrnniViz ProTM软件包(Version 1.611；OnmiViz，Maynard，MA)分析标准化的微阵点强度。从DNA Chip 2.1数据库(La JollaBioInformatics Database，RWJPRI，La Jolla，CA)提取数据。根据实验所用芯片类型下载平均亮度，变异系数和注释。亮度数据阈值设定为35单位；也就是在比率构建以前将低于35单位的值提高到35单位。用实验阈值除以合适的对照阈值建立比值(ratios)。使用相关度量由k-means归类法(k-means clustering(Quackenbush，Nat Rev Genet.(2001)2418-27))处理数据，类数(cluster number)设定为65。随后过滤数据，以除去比值等于或低于2倍的数据(相对于参考样品之一)，和与四个点密度中任一个的变异系数超过50％的任一基因标识。最后，过滤后的数据用平均等级归类法(average hierarchical clustering)处理，使用的相关度量所得树形图产生50类(50clusters)。
V.在经雌激素处理的猴子宫内膜中诱导出推定的激素抑制基因DMBT1较之于空白对照处理(Ovx/安慰剂)的摘除卵巢的动物，在用雌激素处理(Ovx/E2)动物中共有237个基因标识被增量调控或减量调控了2倍以上。这其中包括已知的受雌激素调控的基因，例如PR(Touitou et al.(1989)Mol.Cell.Endocrinol.，66231 238)，它被增量调控了3倍，和胰岛素样生长因子结合蛋白3(insulin-like growth factorbinding protein 3)(Liu et al.，(1997)，Mol.Hum.Reprod.，321 26)，它被减量调控了10倍。其它出现的基因都不是先前已知的受雌激素调控的基因。推定的肿瘤抑制剂基因DMBT1(Deleted in Malignant BrainTumors 1)是一个令人尤其感兴趣的基因，它被鉴别出受到雌激素的强烈诱导。发现DMBT1的表达被雌激素增量调控了37倍。使用相同的RNA样品和第二种芯片进行第二轮杂交实验，确认了这些包括DMBT1增量调控数据在内的基因表达数据结果。第二种芯片含有约5600个单一基因标识，包括第一种芯片上的所有标识。
根据这些数据，在子宫内膜中DMBT1基因表达在应答雌激素时受到强烈的增量调控，因此DMBT1调控的基因表达的提高与雌激素激动剂活性相关。
为了证实这些结果，使用一些RNA样品进行定量RT-PCR。发现在被雌激素处理后DMBT1表达被提高了3000-9000倍。在所有三只猴子中米非司酮阻碍DMBT1 mRNA水平的提高，与微阵分析和PCR(实施例6)评估结果相同。在用促性腺激素处理的猴子宫内膜中没有检测到DMBT1表达。
实施例2选择性雌激素受体调节剂他莫昔芬和雷洛昔芬提高大鼠子宫内膜中DMBT1的表达以下实施例证明在大鼠子宫内膜中DMBT1表达在应答两种化合物他莫昔芬和雷洛昔芬时受增量调控，这两者在体内具有选择性雌激素活性。本例也证明在大鼠子宫内膜中DMBT1表达在应答有雌激素拮抗剂活性的化合物时不受增量调控。因此这些数据表明DMBT1调控的基因表达可用作标记，以将具有雌激素激动剂活性的化合物和(尤其是)具有选择性雌激素活性的化合物，与没有任何雌激素活性的化合物例如雌激素拮抗剂区分开来。他莫昔芬和雷洛昔芬是SERMs，它们在骨骼中表现为雌激素激动剂活性而在子宫内膜中则表现为弱雌激素激动剂活性(MILLER(2002)CURR.PHARM.DES，.82089-2111)。ICI 182780为雌激素拮抗剂，对许多具雌激素受体的组织有活性。
I.动物模型和药物处理使用10组22天龄的雌Sprague Dawley大鼠(每组三只)来评估雌激素、他莫昔芬、雷洛昔芬和ICI 182780在子宫中对DMBT1的作用。下列组中大鼠按下文所述处理3天组处理(1)无处理(对照)(2)70μg/kg/天雌激素(3)1mg/kg/天他莫昔芬(4)1mg/kg/天雷洛昔芬(5)1mg/kg/天ICI 182780(6)70μg/kg/天雌激素+1mg/kg/天他莫昔芬(7)70μg/kg/天雌激素+1mg/kg/天雷洛昔芬(8)70μg/kg/天雌激素+1mg/kg/天ICI 182780所有处理均在0.5％甲基纤维素口服给药。处理后无痛处死动物并收集子宫，称重并用液氮冷冻，-20℃下保存。使用1.0ml TRIzolReagent(Invitrogen)和PowerGen 25组织匀浆机(Fisher Scientific)按使用说明书从冷冻子宫中纯化RNA。
尸检时称量子宫重量，数据列于图1。在大鼠体内，子宫尺寸在雌激素增殖影响作用下增加，这种增加可通过称量组织重量来测量。如图示，用雌激素(E)处理的子宫重增加1倍，而他莫昔芬(T)处理仅中等增加子宫重，雷洛昔芬(R)处理没有显著影响子宫重，无论是增是减(对照子宫重与雷洛昔芬处理子宫重在计算误差范围内相等)。雌激素拮抗剂ICI 182780(I)处理则显著减小了子宫重。
用雌激素和他莫昔芬(E+T)共处理与用雌激素和雷洛昔芬(E+R)共处理较之于雌激素(E)处理的子宫重要低，而与他莫昔芬(T)处理和雷洛昔芬(R)处理子宫重相似。用雌激素和ICI 182780(E+I)共处理得到的平均子宫重，约在单独用雌激素(E)处理和ICI 182780(I)处理的子宫重之间。这些数据显示雷洛昔芬和ICI 182780是雌激素诱导子宫重提高的拮抗剂，同时他莫昔芬是一个弱子宫重刺激物，也就是说它是一个弱雌激素激动剂。
II.基因表达分析A.样品分离和印迹使用Northern分析来确认对照组和处理组子宫内的基因表达，包括DMBT1表达。将含有2μg总RNA的2μL水加到6ml甲醛上样染色液(Ambion)中，并在65℃下孵育20min用以凝胶电泳。每个样品中加入1ml 0.1mg/ml的溴化乙锭溶液。将样品加到凝胶(1XMOPS，1.25％SeaKem Gold Agarose Reliant(BioWhittaker MolecularApplications))上，在缓冲液(1X NorthernMax 10X MOPS Gel RunningBuffer(Ambion))中电泳分离，电压为70v。直到染料穿过凝胶移动到约1/3处(二甲苯胺)和2/3处(溴苯酚蓝)时为止。使用毛细管转印(capillary transfer blotting)和10X SSC(0.15M柠檬酸钠，pH7.0，1.5M NaCl)将RNA转印到膜上(Hybond-N membrane(Amersham))，持续7d。然后用溴化乙锭染色，再用水使膜退色，并拍照用以进行泳道上样比对。吹干膜后，在杂交前保存于室温。
B.DMBT1探针制备从Incyte Genomics获得细菌克隆(ID#0000101155000011)的甘油原种，它含有的一个质粒(pINCY)包含大鼠ebnerin(DMBT1)基因。将甘油原种划线培养于LB琼脂糖平板上(含有100μg/ml氨苄)(KD Medical)上并在37℃下培养过夜。选择单克隆并接种到200ml含有50μg/ml氨苄(Sigma)的Lennox L Broth(Sigma)培养基中。在37℃下将液体培养物培养过夜，并离心收集细菌。使用试剂盒(QIAfilterplasmid maxi kit(QIAgen))按照使用说明书纯化质粒。
纯化的pINCY/DMBT1质粒用限制性酶EcoRI和NotI(Promega)处理以制备并纯化一个1,174bp DNA片段，该片段包含有ebnerin探针(DMBT1)。酶消化产物用电泳分离，使用1％SeaKem GoldAgarose Reliant凝胶，在1X TAE中进行，然后切下相应于该1,174bpDNA片段的条带。使用试剂盒(QIAquick Gel Extraction Kit(QIAgen))按照使用说明书从切下的胶中纯化ebnerin DNA探针。吸附在QIAgen柱子上的DNA用50μl洗脱缓冲液洗脱下来。凝胶电泳后通过比较洗脱液中的ebnerin DNA探针条带DNA标准品条带对比得到其含量。ebnerin DNA探针然后被稀释到终浓度25ng/μl。
使用试剂盒(DECAprime II kit(Ambion))和Redivue-32P dATP(10mCi/ml)(Amersham)，从25ng ebnerin DNA制备随机引物探针，除了反应在37℃孵育30min外，所有操作按照使用说明书进行。在加入EDTA停止反应后，使用试剂盒(QIAquick Nucleotide RemovalKit(QIAgen))按照使用说明书纯化被标记的探针，最终洗出的探针溶液为50μl。取2μl在闪烁计数器中测量以保证标记达到最优的放射性强度(＞2×106cpm/μl)。
C.探针杂交与分析A节所述的印迹膜在2X SSC缓冲液(Sigma)中浸湿15min，然后在10ml RapidHyb液(Amersham)中65℃下预杂交20min。将探针溶液煮沸10min，取25μl加入到10ml RapidHyb液中并预热到65℃。将印迹膜加入到稀释的探针溶液中，在杂交培养箱中旋转孵育杂交约10h。
从探针溶液中取出膜，并用含0.5％SDS和0.5％焦磷酸的2XSSPE液漂洗两次，然后再用该液室温下洗涤30min，其间轻轻搅拌。随之用含0.5％SDS和0.5％焦磷酸的0.5X SSPE液65℃下洗涤两次，每次30min。洗涤完成后，将膜印在纸巾上，用Saran Wrap包裹起来，并暴露在磷光成像屏(phosphor-imaging screen)上5h。然后用STORM 840(Molecular Dynamics)和IQ Tools 2.2(MolecularDynamics)软件进行磷光成像屏扫描，再用Image Quant 5.2(MolecularDynamics)使探针成像并进行量化分析。
各种处理对DMBT1表达的影响见图2和图3。图2表明在雌激素处理(E)子宫组织中(～5倍)、他莫昔芬处理(T)(～5倍)和雷洛昔芬(R)处理子宫组织中(～6.5倍)DMBT1表达被显著提高。但是用ICI 182780处理(I)的结果为子宫中DMBT1的表达检测检测不到。图3A表明他莫昔芬和雌激素共处理(E+T)使得DMBT1表达些微提高，雌激素和雷洛昔芬共处理(E+R)使DMBT1表达额外提高。使用雌激素和ICI 182780共处理(E+I)使得表达中度降低。
这些结果表明DMBT1表达可被具有雌激素活性的化合物提高，例如雌激素(E)。令人吃惊的是，具有选择性雌激素活性的化合物例如他莫昔芬(T)和雷洛昔芬(R)也可强烈刺激DMBT1表达，尽管它们至多对子宫生长只有中等的作用。这些结果表明DMBT1可被用于鉴别具有雌激素活性的化合物，包括具有选择性雌激素活性的化合物例如SERMs，特别可以鉴别那些对子宫生长有促进作用的化合物。
这个例子也表明根据DMBT1表达的差异，可将具有雌激素活性或者选择性雌激素活性的化合物与具有雌激素相反活性例如拮抗剂活性的化合物区别开来。总体来说，这些数据表明DMBT1表达或者DMBT1序列调控表达可与雌激素活性获选择性雌激素活性联系起来。
此外本实施例中的数据也表明本发明在大鼠模型系统中的可操作性，实施例1的数据详述了本发明在猴模型系统中的可操作性，二者共同支持了前文假定，即总体上在哺乳动物中，DMBT1表达或者DMBT1调控序列控制的基因表达可与雌激素激动剂活性和选择性雌激素活性联系起来。
实施例3改进的选择性雌激素受体调控剂在大鼠子宫内膜中提高DMBT1的表达本例证明在大鼠子宫内膜中，DMBT1表达在应答化合物5SA-DCC时受到增量调控。5SA-DCC是一种新近发现的化合物，具有体内选择性雌激素活性。本例也证明一种在子宫内膜组织中具有阴性雌激素活性和阻碍雌激素活性，但对血液和骨骼标记有雌激素活性的化合物，不能在大鼠子宫内膜中增量调控DMBT1表达。
因此类似实施例2，这些数据表明DMBT1调控的基因表达可作为标记，用以区别具有雌激素化合物尤其是具有选择性雌激素活性化合物，与具有阴性雌激素活性的化合物，尤其是对子宫内膜组织有阴性雌激素活性的化合物。
I.动物模型和药物处理用类似实施例2的方法，使用6组22天龄的Sprague Dawley雌鼠(每组3只)来评估雌激素、SERMs 5RA-DCC(5R-芳基-5，11-二氢-苯并吡喃并(4，3-c)苯并吡喃)和5SA-DCC(5S-芳基-5，11-二氢-苯并吡喃并(4，3-c)苯并吡喃)对DMBT1表达的作用。5RA-DCC和5SA-DCC在共同转让的(commonly assigned)美国专利申请No.60/341957《作为选择性雌激素受体调节剂的新型含杂原子四环衍生物》(Novel Heteroatom Containing Tetracyclic Derivatives as SelectiveEstrogen Receptor Modulators，Kanojia，R.et al)。动物处理按下表处理3天组处理(1)对照(2)70μg/kg/天雌激素(3)1.4mg/kg/天5RA-DCC(4)1.4mg/kg/天5SA-DCC(5)70μg/kg/天雌激素+1.4mg/kg/天5RA-DCC(6)70μg/kg/天雌激素+1.4mg/kg/天5SA-DCC用实施例2中描述的方法进行药物处理，组织样品收集，RNA纯化和印迹，及杂交到放射性标记的大鼠ebnerin cDNA上。
雌激素、SERM 5RA-DCC和5SA-DCC处理对大鼠子宫重量的影响，折算为体重，见于图4。如同实施例2(图1)，本例再次(图4)表明，雌激素处理(E)使子宫重量提高到2倍以上，反映出它对该组织的激动剂活性。5RA-DCC本身微弱刺激了子宫重量，而当与雌激素共同出现时，它表现出对子宫重量提高的拮抗作用。这方面5SA-DCC与他莫昔芬作用类似(图1)。
与其它增量调控DMBT1表达的雌激素化合物或选择性雌激素化合物相反，5RA-DCC证明有阴性雌激素活性，并且对子宫生长表现出雌激素阻碍活性。
II.DMBT1表达雌激素、5RA-DCC和5SA-DCC处理对大鼠子宫内膜中DMBT1mRNA水平的影响见图5。雌激素对DMBT1 mRNA表达的作用类似实施例2中所述(图2)。5SA-DCC在大鼠子宫内膜中强烈刺激DMBT1表达(高于4倍)。有趣的是，5SA-DCC与雌激素的联合使用得到一个对DMBT1表达互相促进的结果，提高它高于8倍。这些结果与他莫昔芬对DMBT1表达的作用类似，尤其与雷洛昔芬类似。
相反的，5RA-DCC本身并不刺激DMBT1基因的表达。有趣的是5RA-DCC强烈阻碍了雌激素对DMBT1表达的增量调控，降低DMBT1表达水平约6倍。
实施例4基于DMBT1序列调控细胞的实验可有效鉴别雌激素激动剂本例说明了雌激素应答细胞的构建，它含有的核酸包含连接到报告基因上的DMBT1调控序列。在应答雌激素时，细胞启动该报告基因的转录，使用实验反应物可检测到这种转录。本例表明这个细胞系统可有效检测对DMBT1调控序列控制下的基因表达增量调控的化合物，以及雌激素激动剂相关化合物和具有选择性雌激素激动剂活性的化合物。表2列出包含DMBT1调控序列的DMBT1基因5′区域和用以制备包含DMBT1调控序列的载体的引物。
I.构建DMBT1调控序列/荧光素酶报告核酸A.pDMBT1/1将人DMBT1基因的一个上游区域-1347-+41核苷酸(SEQID No1 2259-3647)克隆到pGL3basic质粒中(Promega)，以构建包含DMBT1调控序列的质粒载体。所得质粒命名为pDMBT1-1/luc。
首先使用人基因组DNA(Clontech)PCR扩增DMBT1基因的一个5′区域-1347-+41核苷酸。使用1X VENT DNA聚合酶缓冲液，引物各40pm，40nM dATP、40nM dGTP、40nM dCTP、40nM dTTP，1ng DNA模板，和4 U VENT DNA聚合酶(New England Biolabs)，反应体系总体积100μl。模板94℃变性5min，然后是5套5循环递减PCR，参数为第一步，94℃变性30s；第二步，退火1min，温度从60℃到70℃，每5个循环上升2度；第三步，72℃延伸2min。30个循环后，最后72℃延伸5min。使用寡核苷酸oDMBT1-15’-GAATTCACGCGTGATCCCAGACCCAGCTGCATTATCATTCTC-3’(SEQ ID No2)和oDMBT1-25’-GAATTCAAGCTTGGTGTGTCCTCTAGGGTGGTATATT TCTGC-3’(SEQ ID No3)作为引物。为方便克隆，将限制性位点MluI和HindIII(下划线部分)分别包括进SEQ IDs No2和3。
使用试剂盒(QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN))按照使用说明书将1.4kb的DMBT1 PCR产物从反应混合物中纯化。纯化的片段用乙醇沉淀并连接到pGEM-T Easy(Promega)以构建pDMBT1-1/GEM-T。连接反应物转化到JM109感受态细胞，并在含100μg/ml氨苄，X-gal和IPTG(Sigma)的LB琼脂糖培养基(KD Medical)上培养。白色表示阳性转化子，挑取接种到3ml含100μg/ml氨苄的Lennox L broth培养基中(Sigma)进行培养。使用试剂盒(QIAGENDNA minipreparation kit)按照使用说明书从细胞中纯化质粒，然后用限制性酶消化以鉴别出含有DMBT1 PCR产物的质粒。
B.pDMBT1-1/luc如下文所述将1.4kb的DMBT1启动子片段-，-1347-+41核苷酸(SEQ ID No1 2259-3647)亚克隆到pGL3basic(Promega)中，这是一个缺乏真核启动子或增强子序列的荧光素酶报告载体；所得质粒命名为pDMBT1-1/luc。使用试剂盒(QIA filter maxi kit(QIAGEN))按照使用说明书从200ml培养液中纯化质粒pDMBT1-1/GEM-T。用限制性酶消化除去1.4kb的HindIII-MluI DMBT1片段，并电泳分离(使用1X TAE，1％SeaKem Gold Agarose Reliant凝胶)，然后用试剂盒(QIAquick Gel Extraction Kit)从凝胶中纯化。该DNA被用50μl洗脱缓冲液洗脱到QIAGEN柱子上，然后用乙醇沉淀。纯化的DNA片段随即连接到已被HindIII和MluI消化并纯化的质粒pGL3basic上。连接反应产物DNA转化大肠杆菌，所得克隆如上文所述进行分析。对pDMBT1/1-luc克隆测序(Lark Technologies)，贯穿其整个PCR得来的区域，以核实克隆的序列。
C.pDMBT1-2/luc通过将人DMBT1基因的一个上游区域-2921-+41核苷酸(SEQ ID No1 685-3647)克隆到pGL3basic质粒中(Promega)中，得到另一个携带有DMBT1基因调控序列的一个较大部分的质粒载体，所得质粒命名为pDMBT1-2/luc。首先PCR扩增DMBT1基因的一个5′区域-，-2921--926核苷酸(SEQ ID No1 685-2680)。所用引物为oDMBT1-35′-GAATTCGGTACCGCATTCCACTGGCCTGTTTTATGTTTTGGG-3′(SEQ ID NO4)，和oDMBT1-45′-GCTTCTTTGCCATGCACTGTTCATCAGTAG-3′(SEQ ID NO5)。如上文所述将2kb的PCR产物连接到pGEM-T Easy(Promega)上以构建pDMBT1-2/GEM-T。
如上文所述，用KpnI消化pGEM-T载体将PCR产物切下，并亚克隆到经KpnI消化的pDMBT1-1/luc中。所得亚克隆用NdeI消化以筛选按正确方向插入的2kb片段。所得pDMBT1-2/luc构建体含有的调控区域由DMBT1基因的-2921-+41核苷酸组成。
D.pDMBT1-3/luc通过将人DMBT1基因的一个上游区域-2766至-2734核苷酸(SEQ ID No1 840-872)克隆到质粒中pTA-luc plasmid(BDBiosciences Clontech)中，得到另一个携带有DMBT1基因调控序列的一个小部分的质粒载体。这个启动子区域，5′-CAAGGTCAAGAGATCGACACCATCCTGGCCAAC-3′(SEQ IDNO6)，是Alu重复序列的一部分。合成(Sigma Genosys)SEQ ID NO5所示序列的寡核苷酸和其补足物5′-GTTGGCCAGGATGGTGTCGATCTCTTGACCTTG-3′(SEQ ID NO7)。两者的互补序列分别与其退火，步骤为加热到96℃3min，然后缓慢冷却。退火后的核酸用3％BIO-gel琼脂糖凝胶(BIO101)纯化，然后按使用说明书用试剂盒(MERmaid kit(BIO101))将其从凝胶中提取出来。如上文对pGL3basic操作，将该寡核苷酸平端连接到经SmaI处理过的pGL3启动子载体上(Promega)。连接产物转化大肠杆菌JM109，然后对发现的含有合适大小插入体的质粒进行测序。选出一个含有正确序列的克隆以备进一步使用。使用试剂盒(QIAfilter Plasmid Maxi Kit)纯化这个质粒，然后用BglII和MluI消化切下插入体，并连接到也经BglII和MluI消化的pTA-luc(BD Biosciences Clontech)上。所得质粒命名为pDMBT1-3/luc，用试剂盒(QIAfilter Plasmid Maxi Kit)纯化。
E.pERE-luc将前后各有一个来自鸡卵黄原蛋白基因(Klein-Hitpass et al.，(1986)Cell 461053-1061)的雌激素受体元件(EREs)的调控区域连接到荧光素酶报告基因上，构建得到一个阳性对照载体。当将这个载体转化到雌激素应答细胞中后，它也能够在应答雌激素起源信号时驱动荧光素酶基因的表达。这个载体命名为pERE-luc。
克隆方法与pDMBT1-3/luc相似，只是要进行定向克隆。寡核苷酸oERE-15′-GGAGCTAGCTAGAGGTCACAGTGACCTACGAGTCCCTAGAGGTCACAGTGACCTACGAGATCTGGA-3′(SEQ ID NO8)，两端有限制性位点NheI和-BglII(下划线部分)，它与寡核苷酸oERE-2TCCAGATCTCGTAGGTCACTGTGACCTCTAGGGACTCGTAGGTCACTGTGACCTCTAGCTAGCTCC(SEQ ID NO9)进行退火，然后用NheI和BglII进行消化，所得片段克隆到经NheI和BglII消化的pTA-luc中。
pERE-luc用作对雌激素诱导的报告物荧光素酶表达的阳性对照。pTAbasic，pGL3basic和空载体用作阴性对照。
II.构建表达人雌激素受体的载体构建编码一个人雌激素受体蛋白的载体以制备表达功能性雌激素受体的转染细胞。从睾丸RNA RT-PCR得到全长(2.0kb)人雌激素受体αcDNA，所用引物为oER-15′-ACGGACCATGACCATGACCCT-3′(SEQ ID NO10)和oER-25′-AGCTCTCAGACTGTGGCAGGGAAA-3′(SEQ ID NO11)。将扩增的cDNA克隆到TA克隆载体pCR2.1(Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA)中。核实序列后，将其亚克隆到经EcoRI消化的pCI-neo(Promega，Madison，WI)中，pCI-neo包含一个巨细胞病毒调控区域，一个SV40 poly(A)区域和一个新霉素选择标记。pCI-ERα-neo序列用序列分析证实。
III.构建表达功能性雌激素受体并含有DMBT1-荧光素酶报告物的宿主细胞将HEK293人胚胎肾细胞(ATCC)接种于96孔培养板上，每孔20,000个细胞，检测培养基含DMEM-F12[Sigma]、10％热失活活性炭/葡聚糖处理的胎牛血清[Hyclone]、青霉素/氨苄。24到30小时后，与上文I.A.到I.E.节所述的报告构建体(每孔10ng)，在有或无pCI-ERα-neo(对照)(每孔55ng)存在下--，使用1μl Lipofectamine2000(GibcoBRL)进行共转染。转染约18h后，用溶有不同浓度的17β-雌二醇的新鲜检测培养基处理24h。
IV.荧光素酶检测使用Steady-Glo Luciferase试剂(Promega)按照使用说明书检测报告细胞的荧光素酶活性。用17β-雌二醇处理24h后，向每孔转染的细胞(III节所述)-直接加入100μl Steady-Glo Luciferase试剂。孵育1h后，将整个上清液转移到白色96孔板上，用MLX MicrotiterPlate Luminometer或者Luminoskan Ascent Luminometer确定荧光素酶活性，每孔读数时间为2秒。经雌激素处理并被报告构建体和pCI-ERα-neo共转染的细胞的荧光素酶活性标准化为1)用多个报告构建体转染而非用一个报告构建体转染细胞的荧光素酶活性，和2)用报告构建体和pCI-ERα-neo共转染但未用17β-雌二醇处理的细胞的荧光素酶活性。
共转染实验的结果见图6。用pCI-ERα-neo和列于图右侧的载体对细胞进行共转染。分别用对照载体pTA和pGL3(没有连接调控区域)和pCI-ERα-neo共转染的细胞，在用宽范围浓度雌二醇处理时产生很低的信号。用pCI-ERα-neo和pERE-luc共转染的细胞产生一个强信号，依赖与所用雌二醇浓度。这些对照转染提供的数据确认了基于细胞的报告系统的有效性。
用不同DMBT1调控区域/荧光素酶载体共转染的细胞产生以下结果。首先，用pCI-ERα-neo和pDMBT1-1/luc(它含有DMBT1调控区域的-1347-+41核苷酸(SEQ ID No1 2259-3647))共转染的细胞对任何浓度的雌二醇处理均不表现被雌激素诱导。用pCI-ERα-neo和pDMBT1-2/luc(它含有DMBT1调控区域的-2921-+41核苷酸(SEQ ID No1 685-3647))共转染的细胞对试验所用浓度的雌二醇浓度表现出稍微被雌激素诱导。最后用pCI-ERα-neo和pDMBT1/3-luc(它含有DMBT1调控区域的最小部分(33bp)，-2766--2734核苷酸(SEQ ID No1 840-872))共转染的细胞，表现出剂量依赖性的雌激素强烈诱导(最高浓度雌激素下，达到5倍以上)。
这些结果证明DMBT1调控区域的上游部分，特别是-2766--2734的区域，对雌激素应答作用是非常重要的。令人惊讶的是，pDMBT1-2/luc载体(含有-2921-+41核苷酸，这包括-2766--2734的区域)几乎不与pDMBT1-3/luc载体(仅包括-2766--2734的区域)表现出相同的雌激素应答活性。尽管不希望被理论束缚，但在DMBT1调控区域上游-2766和/或下游-2734，可能存在多个元件，它们至少在这种基于细胞的系统中通过Alu序列干涉了雌激素应答活性。
本例阐述了构建一种新型基于细胞的系统，它表达功能性雌激素受体和含有操作性连接到报告基因的DMBT1调控序列的载体，以及该系统的有效性。更为特别的是，本例证明了新型基于细胞的系统，它含有一个编码功能性雌激素受体的载体和一个包含操作性连接到报告基因的DMBT1调控序列的载体。
本例也阐述了构建一种新型分离的核酸分子，它包含操作性连接到报告基因的DMBT1调控序列，并可在细胞系统中应答雌激素诱导的信号，以及这种核酸分子的有效性。有效的核酸包含DMBT1调控序列的-2766--2734区域(SEQ ID No1 840-872)。其它有效的核酸分子包含DMBT1调控序列的-2734上游序列和-1347上游序列(包括-2766--2734区域(SEQ ID No1 840-872))，同时这些序列被操作性连接到一个报告基因序列上。
实施例5孕酮受体调节剂(PRM)对猴子宫内膜组织的作用在探索PRM对DMBT1表达的作用时，第一步是研究经雌激素和PRM共处理过的OVX猴子宫内膜组织的基因表达。OVX猴经雌激素和PRM共处理相对于单独用雌激素处理，在处理一段时间后总体上表现出显著的子宫内膜变薄。
I.动物和给药除了以下内容，动物和药物处理措施与例1相同。为了研究PRM对子宫内膜和基因表达的作用，给摘除卵巢猴(OVX)组(每组3只)注射雌激素植入物(E2)，附加如下每日口服给药PRM 19天，米非司酮10mg/kg/d；17N11-DE(17β-N-取代-11β-二甲基氨基苯基-雌甾-4，9-二烯-3-酮)1.0，3.0，或者10mg/kg/d；17N-11-PE(17β-N-取代-11β-哌啶苯基-雌甾-4，9-二烯-3-酮)1.0，3.0，或者10mg/kg/d。使用0.5％甲基纤维素作为对照给予安慰剂。17N11-DE和17N11-PE是两种已经在PCT公布说明书No.WO 99/62928中描述过的PRM。从子宫内膜和子宫基层取得组织样品用以组织学分析。
如实施例5所述也从子宫内膜取得组织样品用以后续基因表达研究。将活组织切片置于无菌容器中并立即用液氮速冻，然后转移到-80℃冰箱保存直到取用。
II.结果表1中列出经处理和对照OVX猴的平均子宫内膜厚度。在由于摘除卵巢或接受亮丙瑞林(leuprolide)40天而缺乏雌激素的动物中，子宫内膜萎缩，同时基质层也薄或者不存在。参考表1，摘除卵巢组(A)的子宫内膜厚度约低于亮丙瑞林处理组(B)三倍。这个结果可用两组的血浆残留激素水平不同来解释，整个研究中亮丙瑞林处理组的残留激素浓度高于摘除卵巢组2到3倍，前者是20-30pg/ml，后者约10pg/ml。在用雌激素处理19天后，观察到典型的激素的过度增殖作用(hyper-proliferative)基质层急剧变厚，同时形成新生的分泌腺体。每组中三只猴的数据平均后，雌激素刺激的子宫内膜(C)厚度高于摘除卵巢对照组(A)7到8倍，高于化学阉割组(B)2.5倍。
当用PRM(例如米非司酮、17N11-DE或17N11-PE)大剂量(最大有效浓度)共处理动物时，子宫内膜收缩至亮丙瑞林处理组的厚度(表1)。有一些分泌腺体形成，但是这些腺体表现出扁平和紊乱。当用较小剂量共处理时，17N11-DE处理的子宫内膜厚度减小幅度高于17N11-PE(表1)。
表1经处理猴子宫内膜平均厚度*
*表示除特别说明外均为三只猴的平均厚度两只猴的平均厚度。第三只中未出现子宫内膜。
实施例6在雌激素/PRM处理猴子宫内膜中PRM抑制DMBT1基因表达如实施例5所述分别从用雌激素和PRM或雌激素与安慰剂共处理的切除卵巢猴取得组织样品。以下按照例1所述方法，从这些样品制备总RNA，制备探针，进行DNA芯片杂交。
使用增量调控2倍作为整个实验标识的数据分割点(cut-offpoint)，相比单独用雌激素处理，与米非司酮(10mg/kg/d)共处理有164个基因标识发生改变，与17N11-PE(10mg/kg/d)共处理有163个基因标识发生改变，与17N11-DE(10mg/kg/d)共处理有467个基因标识发生改变。17N11-DE另外改变的大多数基因增量调控低于2.5倍。
PRM剂量依赖性的抑制由雌激素诱导的DMBT1基因表达。参考图7，微阵分析揭示由雌激素诱导的DMBT1 mRNA水平被10mg/kg的米非司酮抑制了约20倍，被1mg/kg的17N11-DE抑制了约5倍，被3mg/kg的17N11-DE抑制了约25倍，被1mg/kg的17N11-PE抑制了约2倍，被3mg/kg的17N11-PE抑制了约4倍。
根据这些数据当用PRM和雌激素共处理时，在子宫内膜中DMBT1基因表达在应答PRM时受到减量调控。
实施例7一个基于DMBT1调控细胞的检测可有效鉴别孕酮激动剂(和PRM)构建孕酮和雌激素应答细胞，它并且含有一个包含连接于报告序列的DMBT1调控序列的核酸，并将该细胞用于筛选出具有孕酮激动剂活性的待测化合物，例如PRM。如实施例4所述，用ER和DMBT1载体共转染的细胞能够在雌激素的作用下产生一个信号。用一个表达功能性孕酮受体的载体转染这些细胞，并用以鉴别出通过孕酮受体来调控ER起始信号的待测化合物。
I.DBMT1/荧光素酶报告载体如实施例4所述将载体导入到合适类型的细胞中用以检测。特别有用的报告载体例如pDMBT1-3/luc，包含了DMBT1调控序列的Alu序列，并且该序列融合在荧光素酶基因中。其它可用的报告载体可使用包含操作性连接到其它报告基因(例如氯霉素乙酰转移酶或半乳糖苷酶)的DMBT1调控序列(或其部分序列)的载体来构建。
II.雌激素和孕酮受体载体使用表达功能性雌激素和孕酮受体的细胞来评估PRM的活性。编码功能性雌激素受体的载体，例如实施例4描述过的pCI-ERα-neo，被导入到合适类型的细胞中用以检测。
与此类似，构建编码功能性孕酮受体(PR)的载体并导入到与ER载体宿主相同的细胞中。先前构建表达PR受体的载体的例子如Conneely et al.(1987)Biochem.Biophys.Res.Commun.149493-501。将PR受体克隆到一个可在真核细胞例如哺乳动物细胞中表达的载体中。PR载体可包含驱动PR表达的增强子和启动子序列，Poly(A)信号序列和胞内维持选择信号例如新霉素基因。包含这些元件的载体有商品供应，例如Promega(Madison，WI)，同时已知的技术可将PR基因按任何所需方式克隆到合适的表达载体中。
在一些情况下将ER和PR基因同时置于同一表达载体中，并导入细胞进行表达。
另一导入含ER和PR基因的载体的选择是，将一个单独含ER或PR基因的载体分别导入可内源性表达PR或ER的细胞中。下文将详述合适的细胞类型。
III.表达内源性ER或PR的细胞将DMBT1/荧光素酶报告载体与PR-或与ER-表达载体分别导入到可内源性表达ER或PR的细胞系中。报告载体和ER载体被导入到乳房细胞系T47D(Horwitz，K.B.et al.(1982)Cell 28633)中，它表达PR(和低水平的ER)，或者将报告载体和ER载体导入到乳房细胞系MCF7(Shupnik M A et al.(1989)Mol.Endocrinol.3660)中，它表达ER。另一选择是，如上文所述将报告载体、ER和PR基因都导入到同一个合适的细胞系中。
用本领域技术人员已知的技术将载体导入细胞。这些方法包括但不仅限于磷酸钙沉淀和电穿孔。用于这些技术的商品试剂盒和设备例如有CellPhectTransfection kit(Pharmacia(Piscataway NJ))，Cellporator和Lipofectin(Invitrogen Life Technologies(Gaithersburg，MD))。用任何这些方法将载体导入细胞后，可根据以下因素来选择细胞选择性标记，组成型报告物产生，雌激素诱导报告基因表达的情况，PRM对雌激素的抑制，细胞与所用高通量筛选微量滴定板的满意结合，多倍数雌激素诱导报告基因表达检测所需的标准偏差(standard deviation)。选出满足高通量筛选必须标准的克隆备用。
另一得到稳定克隆的途径的选择是使用瞬时转染，12到14h后检测转染细胞。
IV.生物发光检测为检测转染细胞的荧光素酶表达，在怀疑有抗孕激素活性的待测化合物存在下(或不存在)，将细胞与不同浓度的雌激素孵育。然后按实施例4所述方法检测处理过的细胞。具体来说，细胞溶解于含有溶胞试剂和荧光素酶底物(例如Steady-GloTM(Promega，Madison，WI)和LucLiteTM Plus(Packard，Meriden CT))的缓冲液中。溶胞产物在室温下孵育，测量在2h的溶胞过程中进行。使用光敏仪器检测光子，例如照度计(如Luminoscan Ascent(ThermoLab Systems，Franklin，MA))和闪烁计数器(如TopCount(Packard))。典型的，每孔读数时间为0.1-2秒。
V.高通量筛选根据Sigma Chemical Company，St.Louis，MO提供的方法，首先用PBS洗涤荧光素酶报告细胞(克隆细胞或者瞬时转染细胞)，收集后按锥虫蓝排除法(Trypan Blue exclusion method)和血球计进行计数。然后用培养基稀释细胞，使用本领域技术人员已知的方法将0.2ml细胞悬浮液加入到96孔微滴定板的每个孔中。12-24h后，向微滴定板上的细胞中加入雌激素到其终浓度为0.1-10nM。同时也加入待测化合物，或者加入与待测化合物溶液同体积的溶剂。因此，检测板上的每个试验孔含有荧光素酶报告细胞、雌激素和待测化合物，而检测板上的每个对照孔含有荧光素酶报告细胞、雌激素和溶剂对照。另外的对照孔设置仅含有报告细胞和溶剂对照。检测板在37℃和5％CO2下孵育12-48h。然后如上文所述溶解细胞并检测荧光素酶，处理数据。
试验空中检测到的生物发光信号与雌激素-对照孔检测到的信号进行对比。一个具有抗孕酮活性的待测化合物与后者对照相比将降低生物发光信号。
尽管前文详述讲述了本发明的原理，并描述了用以说明的实施例，但显然本发明的实践可在下文权利要求及其等价物的范围内包含常规变化、修改和/或改变。
实施例8孕酮对大鼠子宫内膜组织的作用使用切除卵巢的6周龄Wistar大鼠(Charles River，Wilmington，MA)，给予空白对照或待测化合物，持续1天或6周。所有给药均通过口服给药，每天一次，药物溶于0.5％甲基纤维素或芝麻油中。处理后切除子宫，使用TRIzol reagent(Invitrogen，Carlsbad，CA)按照使用说明书从组织中纯化总RNA。
以大鼠RNA样品为模板进行一步反转录PCR(RT-PCR)得到DMBT1，使用试剂盒(One-Step RT-PCR Master Mix Kit(AppliedBiosystems，Foster City，CA))和ABI Prism 7000 Sequence DetectionSystem(Applied Biosystems)，按照说明书进行。从Applied Biosystems(Foster City，CA)得到商品化的人和大鼠DMBT1(目录号分别为Hs00244827_ml和Rn00575705_ml)引物和FAM标记的MGB探针。信使RNA水平相对18S核糖体RNA水平进行标准化，使用来自同一卖主的引物和由VIC和TAMRA标记的探针确定18S核糖体RNA水平。
定量PCR评估得到结果见图3B。用乙炔基雌二醇处理1天(在单次给药后约24h制备RNA)结果DMBT1 mRNA水平显著提高。在雌二醇剂量为0.3mg/kg诱导作用达到最大值6倍。同时使用孕酮(醋酸甲羟孕酮)共处理时，它剂量依赖性的阻碍mRNA水平的提高，而这种阻碍作用又能被10mg/kg的孕酮拮抗剂米非司酮所阻碍。
实施例9子宫表达的免疫组化分析使用成熟的6周龄切除卵巢或假处理的Wistar大鼠(CharlesRiver)，给予乙炔雌二醇、他莫昔芬或雷洛昔芬6周。然后切除子宫并切片，使用山羊抗人蛋白多克隆抗体对DMBT1表达进行免疫组化分析。
使用常规方法整理组织并埋入石蜡中。切下5微米的切片，置于显微载玻片(SuperFrost Plus+(Fisher Scientific，Pittsburgh，PA))上并干燥过夜。进行常规单一免疫组织化学(single immunohistochemistry(IHC))分析的方法已有描述(D’Andrea et al.，2001，BiotechnicHistochem.7697-106)。简要来说，显微载玻片上的组织切片进行脱蜡并重新与水结合。将载玻片置于Target缓冲液(Dako，Carpenturia，CA)中用微波处理5min，冷却后置于磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4)中，然后用3％(v/v)双氧水室温下处理10min。孵育30min后室温下洗涤。将常规兔封闭血清(Vector Labs，Burlingame，CA)加到载玻片上10min。在用PBS简单漂洗，再用山羊多克隆DMBT1初级抗体(1∶25，Hypromatrix，Worcester，MA)处理切片。再用PBS洗涤切片，然后用生物素酰化的兔抗山羊二级抗体(Vector Labs)处理切片。用PBS洗涤后，加入抗生物素-生物素-辣根过氧化物酶复合物(HRP，VectorLabs)。然后洗涤所有玻片并用3，3′-二氨基联苯胺(DAB，Biomeda，Foster City，CA)处理两次，每次5min。用蒸馏水洗涤后，用苏木精复染色。
二重IHC(double IHC)的方法已有描述(D’Andrea et al.，2001，supra)。使用与单免疫组化相同的方法(除了使用SG色原体(VectorLabs))和HRPSG检测系统检测兔多克隆PCNA(增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen))抗体(1∶4000；Sigma，St.Louis，MO)。第二种对DMBT1特异的初级抗体，与上文相似在组织上进行孵育。洗涤后，将生物素酰化的二级山羊抗山羊抗体(Vector Labs)加到玻片上，室温下保持30min。随后，用碱性磷酸酶ABC试剂(AP-ABC，Vector Labs)处理玻片30min。然后用Fast Red色原体(Sigma，St.Louis，MO)检测DMBT1。再将玻片浸蘸苏木精，并盖上有水基封固剂(water-based mounting medium(Dako))的盖玻片。阴性对照包含1)将每种初级抗体用无免疫活性的血清代替，2)每种初级抗体的省略部分(omission)，3)双重阴性对照。
结果发现相比假处理(泳道A)和切除卵巢对照，用雌激素处理产生了意料中的腔上皮增厚，这种现象在用他莫昔芬处理结果中甚至更加显著，但是用雷洛昔芬处理则不这样(数据未列出)。这种对子宫内膜的作用与对子宫重量的总作用相关(图1)。DMBT1染色严格限制在腔上皮中，在腺上皮或基质细胞中只有少许或没有染色。但是在腔上皮中的染色情况有变化，一些细胞染色深，另一些染色浅，还有一些根本没有染色。雷洛昔芬和(尤其是)他莫昔芬比雌激素产生更高细胞水平的DMBT1。所有情况下染色均发生在核外。在假处理和切除卵巢动物中，用雌激素处理的子宫上皮染色主要发生在细胞腔面。相反，在用SERM处理的子宫中，染色均一的分布在上皮的整个阳性细胞中。
为了区分那些表达DMBT1蛋白的细胞和那些不在它们增殖状态的细胞，用DMBT1抗体和PCNA抗体对玻片进行共染色。虽然很多表达DMBT1的细胞也发生了PCNA染色，但两者没有绝对的重叠(数据未显示)，这表明DMBT1表达有可变性的原因不只是由于细胞处于增殖状态。
表2SEQ ID NO.1gggggagtga gtgaaggang gtaggaaggg gtccccttat aacccaattg ggaagaccgg 60ctctctgagc aacaaaaatg agcgacatta taaatatcan acatacaatg tcaaaagatt 120
gttacaacag taacaatgac cggcaattat ggtgtgctac tcaatgaggg taaaattaga 180gtttggggtc agactgacac ctgaagggga gccctggtca cacagattac nggattcagg 240gactggaagg caaacagcag cagccggaag gtgctacagc cccgaccctt cccaccaggc 300tccccgtcct tctgtccccc tcgtctgtca ggtcacaggg ctcctggctc agaaatcaga 360gacccctcag aggtgggagg tgggaggggc cctgggctgc ctccctgatc tccgtcttcc 420tctggcttcc cagggcactg gtctgtgggt agaaagaatc tttagaagaa ggagaacaac 480gggctgtttt gggaagtctg cctgggaccc cagctcagct tcgtggcagg gatgtgtgcc 540tggcagcccc aggggccctg ctgggcctct cagtgccctg tcttatgaag ggaggtcttg 600gcttcccaca ggtaatcctc agctctgacg gcaggtggcc ctaggggagg ggcctggaag 660aggactccct caccacagtc aggagcattc cactggcctg ttttatgttt tggggcttcc 720ccatgaattc caatttagga aaggattctg tagctttaaa aaaaaaagcc atacatggcc 780gggcgtggtg actcatgcct gtaatctcag aactttgaga ggccgaggca ggcagatcgc 840aaggtcaaga gatcgacacc atcctggccg acatggtgaa accctgtctc tactaaaaat 900acaaaagtta gctgggtgtg gtgatgcacg cctgtagttc cagctactcg ggaggctgag 960gcaggagaat cgcttgaact cgggaggcgg aggttgtagt gagccgagattgcaccactg 1020cactccagcc tgggcgacag aacaagactc cgtcttaaaa taaataagta aataaataaa 1080taaatggcca catatgatcc agggggctct tccccataac gaccagtcct ctggtgctgg 1140gatttagggg cttggtccca cctcctggag tgtgctgtgg gggtgccgct ggcttaattg 1200cctggggaag gtgctttgca aatggggccc gggcgccgag tctctgagct ttaatgggct 1260tatcttgctt cctgttgttc ttcatggcag ttctggggtg aataaaatgg aactttgtgg 1320ttgtggtctt ccaacccctg ctgtttaagc agatgcttct aaccagtnng aaggggaaga 1380tgagggtcct ctggcagggg ctgctgctgg agaaggttgt ccccctgaac ccttctcttc 1440gtccaaggaa agacctccct aaatggtgtc ttatgagcca caaaatggcc ttgggacaag 1500atgaggcacc tgacggtgaa ggctgaggtc ccacacggtg ttggcaggtg gccctcaagc 1560ccattgtctt ctgcccgcat gcccaggacc gccacatcct tcctgttcca ctgacgtcac 1620ccatttccca cctgggatgc ctacctgggc tggctttgaa atgacagcta ggcttcacca 1680cttccttctt cctggtgtct cctgaacaaa aagctcacaa acccttattg tctcaggatc 1740ttttctgcta actaccatgg gcaaaagatg cagtcaaaac aacaaaaacg gggaggttac 1800
gcagttcaga aaatcccaca cattctcaag aagggtgtcc ccgccaagct gagagatacc 1860tgggacatca tgctttcctg gaggggaagg ctccctgccc ccattcctgt acagccggga 1920gagtcgctcc tgttcgtcat cccatcttct cgctctcatt tgctgggctg acctctgctg 1980gtatttcaag actgtttggt gccaccctct ctgagagatg gcctccctca tctgatttag 2040atgcttttct ttaccttctc atagcagctt gtactaatac ttgctacccc ctgttgaaat 2100tgtcaccagg caggtctgtc tctaagacca gacagtctgc ttttgtcttg gaaggacact 2160tattacccna ncntgttcac aggtatttag tattcttacc atcatctttc cctgctgtgc 2220tcccggcaga caattctaat ctgtcatgac actctgatga tcccagaccc agctgcatta 2280tcattctcag tccaacactc caggaaccaa gggatcacaa tccccttcta agaggaatcc 2340agcatgtgcc tggtcttggg cattccctgg tangtgagta accctgttct ctcgtcaccc 2400agtgcttatc agttgctgat ctggcagtag gaggatgaaa cacagtgagc ctattctgtg 2460ttcctattct actcaagggg tgaagaggca cctggaaaca acaggaagag ttgtaggatt 2520aaaaaggaca tccaagattg aatgtaactt tcatctggat gaagccaaag gcagacttcc 2580agccctaaat tctgactggt ggctgacaca ggacatgggt tcatggtacc cttctagaat 2640gcagcataga ctactgatga acagtgcatg gcaaagaagc caagtgtcat ttcatggcct 2700cagcctctca gctgagaagc agggcacagc tcacccaggc taggaaaaac agaggcaagt 2760cctggaaagc tgtctgcttt taaccaagag ttactggcca tcaagtgtct tggttaaaaa 2820ataagtgtca ggcaaccttc ttggtagata gagtgtgttg ggggcgatta tcagagtctg 2880gtaatgactt ctgagggtcc caaagagtga agtgatattt acatagcaaa tccaaggang 2940gggattgtgt gcaatatang tggangtggg ggcaggtttt gtgggtttgc caagctccaa 3000ggtcatacaa tgtgcatgtc aaggacaaga aatcaaagcc atgtgaaatg gttggaggtg 3060gttcagtttg aggtcatgtg tttctcagct cctgttgtgg aattagtgtg agacccagaa 3120gactgtggcc aaagctatta tggacccatg gtctctgtgg actcatccct catgccttct 3180gctctctgat cacatccaca ctcatgtcat cctcgttctt ccaaggtgag gttactagca 3240ctgcacaggg gctgatgaga gcatgtcctg ccaggaaaaa ccatcccaaa gagatgcttt 3300cccccttggc actgtgtcct gtatttgctc agcagcccac atcctgttct gccccaaacc 3360ttggggcaga cttcccacag gtgaatttga actccccaag attaaaatca agcctgtatt 3420caggaaacac ttgggagtcc tcgaggttca ccgagaggga agttggaaat ttttcactta 3480
tgtcagtgcg tttgcagttg ggcaacagcc agattgttca tatggcaatc aatcaaacac 3540acctaagttt tttccacata ttagccatcg actgttagca aaagccctca cttcctttat 3600attgatttat agcagcagca gaaatatacc accctagagg acacacctcc ttttagctag 3660gtacctataa atgtccagga ttttctattc aattgagaag aacccagcaa aatgg 3715SEQ ID NO.2gaattcacgc gtgatcccag acccagctgc attatcattc tcSEQ ID NO.3gaattcaagc ttggtgtgtc ctctagggtg gtatatttct gcSEQ ID NO.4gaattcggta ccgcattcca ctggcctgtt ttatgttttg ggSEQ ID NO.5gcttctttgc catgcactgt tcatcagtagSEQ ID NO.6caaggtcaag agatcgacac catcctggcc aacSEQ ID NO.7gttggccagg atggtgtcga tctcttgacc ttgSEQ ID NO.8ggagctagct agaggtcaca gtgacctacg agtccctaga ggtcacagtg acctacgagaSEQ ID NO.9tccagatctc gtaggtcact gtgacctcta gggactcgta ggtcactgtg acctctagct agctcc
SEQ ID NO.10acggaccatg accatgaccc tSEQ ID NO.11agctctcaga ctgtggcagg gaaa
序列表<110>詹森药业有限公司<120>作为临床标记的DMBT1及其用途<130>PRD 2102<160>11<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>3715<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>misc_feature<222>(19)..(19)<223>n为a、c、g或t<220>
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<210>8<21>60<212>DNA<213>引物<400>8ggagctagct agaggtcaca gtgacctacg agtccctaga ggtcacagtg acctacgaga60<210>9<211>66<212>DNA<213>引物<400>9tccagatctc gtaggtcact gtgacctcta gggactcgta ggtcactgtg acctctagct60agctcc 66<210>10<211>..21<212>DNA<213>引物<400>10acggaccatg accatgaccc t 21<210>11<211>24<212>DNA<213>引物<400>11agctctcaga ctgtggcagg gaaa 2权利要求
1.一种方法，包括以下步骤(a)使雌激素应答系统与待测化合物接触；(b)确定雌激素应答系统中操作性连接到DMBT1调控序列上的基因的基因表达；和(c)检测待测化合物产生的雌激素活性。
2.权利要求1的方法，其中步骤(c)包括测量相对于对照的基因表达，并鉴别提高基因表达因而具有雌激素活性的化合物。
3.权利要求1的方法，其中所述基因是DMBT1。
4.权利要求3的方法，其中所述确定步骤包括测量DMBT1核酸的量。
5.权利要求3的方法，其中所述测量步骤包括测量DMBT1蛋白。
6.权利要求1的方法，其中所述雌激素应答系统包含子宫组织。
7.权利要求1的方法，其中所述雌激素应答系统包含乳腺组织。
8.权利要求1的方法，其中所述雌激素应答系统包含类骨质组织。
9.权利要求1的方法，其中所述雌激素应答系统是动物。
10.权利要求9的方法，其中所述动物是灵长类动物。
11.权利要求10的方法，其中所述灵长类动物是猴。
12.权利要求9的方法，其中所述动物是啮齿类动物。
13.权利要求9的方法，其中所述动物经过处理以降低雌激素的系统水平。
14.权利要求1的方法，其中所述雌激素应答系统包含细胞。
15.权利要求14的方法，其中所述细胞含有雌激素受体。
16.权利要求15的方法，其中所述细胞含有操作性连接到DMBT1调控序列的报告基因。
17.权利要求16的方法，其中所述报告基因编码的蛋白选自绿色荧光蛋白(GFP)、β-半乳糖苷酶(lacZ)、荧光素酶(luc)、氯霉素乙酰转移酶(cat)、β-葡糖醛酸糖苷酶、新霉素磷酸转移酶和鸟嘌呤黄嘌呤磷酸核糖转移酶。
18.权利要求2的方法，其中所述对照是没有与待测化合物接触的雌激素应答系统。
19.权利要求2的方法，其中所述对照包含不应答雌激素的细胞和组织。
20.权利要求1的方法，其中步骤(c)包括检测不激发雌激素活性或激发抗雌激素活性的化合物。
21.一种方法，包括以下步骤(a)使第一雌激素应答系统与待测化合物接触；(b)使第二雌激素应答系统与该待测化合物接触；(c)测量第一雌激素应答系统中DMBT1调控序列控制的基因表达，并测量第二雌激素应答系统中DMBT1调控序列控制的基因表达；和(d)将(i)第一雌激素应答系统中表达提高而第二雌激素应答系统中表达降低或表达检测不到，或者(ii)第一雌激素应答系统中表达降低或表达检测不到而第二雌激素应答系统中表达提高，与选择性雌激素活性相互关联。
22.一种方法，包括以下步骤(a)使第一雌激素应答系统与待测化合物接触；(b)使第二雌激素应答系统与该待测化合物接触；(c)测量第一雌激素应答系统中包含DMBT1调控序列控制的基因表达的第一雌激素作用；(d)测量第二雌激素应答系统中第二雌激素作用；和(e)将(i)第一雌激素应答系统中表达提高而第二雌激素应答系统中没有雌激素作用或者有抗雌激素作用，或者(ii)第一雌激素应答系统中表达降低或无表达而第二雌激素应答系统中有雌激素作用，与选择性雌激素活性相互关联。
23.权利要求22的方法，其中所述第一雌激素应答系统是来自动物的雌激素应答组织或细胞，所述第二雌激素应答系统则不同于第一雌激素应答系统。
24.权利要求22的方法，其中所述第一雌激素应答系统包含的细胞中有一段核酸具有操作性连接到报告基因的DMBT1调控序列，所述第二雌激素应答系统包含来自动物的雌激素应答组织或细胞。
25.权利要求22的方法，其中测量第二雌激素应答系统中另一雌激素作用包括测量细胞增殖或组织大小。
26.权利要求22的方法，其中测量第二雌激素应答系统中另一雌激素作用包括测量第二雌激素应答系统中产生的成分的量。
27.一种方法，包括以下步骤(a)使雌激素和孕酮应答系统与雌激素化合物接触；(b)使雌激素和孕酮应答系统与待测化合物接触；(c)得到相对于对照的显示雌激素和孕酮应答系统中DMBT1调控序列控制的基因表达的信息；和(d)使用步骤(c)中得到的信息确定孕激素活性或者抗孕激素活性。
28.权利要求27的方法，其中步骤(c)包括测量相对于对照的该基因的表达，步骤(d)包括将表达下降与孕激素活性或抗孕激素活性相互关联。
29.权利要求27的方法，其中所述雌激素和孕酮应答系统含有功能性雌激素受体和功能性孕酮受体。
30.权利要求27的方法，其中所述具有抗孕激素活性的待测化合物是孕酮受体调节剂。
31.权利要求27的方法，进一步包括测量不同于DMBT1调控序列控制的基因表达的孕酮应答作用的步骤。
32.一种方法，包括以下步骤(a)用能刺激受试者表达的DMBT1表达的化合物处理该受试者；(b)检测受试者中DMBT1表达，以此作为雌激素作用的标记。
32.权利要求32的方法，其中步骤(b)包括测量相对于对照的受试者的DMBT1的表达。
33.权利要求32的方法，其中步骤(b)包括从受试者得到生物样品并测量生物样品中的DMBT1的表达。
34.一种雌激素应答系统，其中包含的核酸具有操作性连接到报告基因的DMBT1调控序列。
35.权利要求34的系统，其中所述雌激素应答系统包含的细胞具有雌激素受体。
36.权利要求35的系统，其中所述细胞选自Ishikawa、MCF-7、MG63、HUVEC和SK-N-MC细胞。
37.权利要求36的系统，其中所述报告基因编码的蛋白选自绿色荧光蛋白(GFP)、β-半乳糖苷酶(lacZ)、荧光素酶(luc)、氯霉素乙酰转移酶(cat)、β-葡糖醛酸糖苷酶、新霉素磷酸转移酶和鸟嘌呤黄嘌呤磷酸核糖转移酶。
38.权利要求37的系统，其中所述报告基因编码荧光素酶。
39.权利要求34的系统，其中所述DMBT1调控序列包含SEQ IDNO.1的核苷酸840-872。
40.权利要求39的系统，其中所述DMBT1调控序列由来自SEQID NO.1的核苷酸1-2259的至少50个连续核苷酸组成。
41.一段分离的核酸，包含操作性连接到报告基因的DMBT1调控序列，其中所述DMBT1调控序列包含SEQ ID NO.1的核苷酸840-872。
42.权利要求41的分离的核酸序列，其中所述DMBT1调控序列能够指导操作性连接于其上的基因的表达，并且与SEQ ID NO1中任何连续30-mer有至少85％的序列同一性。
43.权利要求41的分离的核酸序列，其中所述DMBT1调控序列由SEQ ID NO.1的核苷酸1-2259组成。
44.权利要求41的分离的核酸序列，其中所述DMBT1调控序列由SEQ ID NO.1的核苷酸840-872组成。
45.一种降低DMBT1的增量调控的方法，包括给予具有抗孕酮活性化合物和具有雌激素活性化合物的步骤。
46.一种鉴别具有雌激素活性化合物的方法，包括筛选DMBT1基因表达的增量调控。
47.一种鉴别具有抗孕酮活性化合物的方法，包括筛选降低DMBT1表达的化合物。
全文摘要
本发明提供了确定一种化合物所具有的雌激素活性的方法，包括使含有在DMBT1调控序列控制下的基因的雌激素应答系统，与待测化合物接触，并确定该待测化合物如何影响该基因的表达。本发明进一步提供了确定一种化合物所具有的孕酮活性的方法，包括使含有在DMBT1调控序列控制下的基因的雌激素和孕酮应答系统，与雌激素活性化合物和待测化合物接触，并确定该待测化合物如何影响该基因的表达。也提供了可有效用于这些方法的核酸和基于细胞的系统，该系统包含DMBT1调控序列的一部分。
文档编号A61K31/56GK101072590SQ200480035474
公开日2007年11月14日 申请日期2004年10月1日 优先权日2003年10月3日
发明者G·阿伦, S·H·泰南, J·－Z·郭, E·帕西亚, S·伦迪恩 申请人:詹森药业有限公司