制备贮存－稳定的多重乳液的方法

专利名称：制备贮存－稳定的多重乳液的方法
技术领域：
本发明涉及制备水/油/水(WOW)型稳定多重乳液的方法，其中外相和内水相都可包含药物活性成分，并且其含油的相包含作为乳化剂的非离子表面活性剂。此种多重乳液是通过将水相透过多孔膜引入到油相中，随后冷却该油包水(W/O)乳液从而形成上述W/O/W双重乳液而制成的，它尤其被用于兽医医疗目的。
背景技术：
多重乳液是主要包括以两种类型存在的乳液的乳液，即，W/O/W和O/W/O乳液。这些体系在许多应用领域具有重大意义。它们首先能保护最内相中的活性物质，其次能将两种能彼此起反应的活性物质结合到相同制剂的两相中。再者，最内相中的活性成分的长效性可以在生物服药后观察到。
然而，目前在医疗和化妆品领域仅有少数几种多重乳液，因为它们的制剂及其稳定性仍然存在问题并且该乳化现象仍未得到完全解释。其原理发表在“多重W/O/W乳液，理论研究”Terrisse，I.；M.Seiller等人(1992)，第六届国际制药技术大会，4328-35中。
在兽医医药中，需要疫苗来获得对一种或多种病原的免疫，其中活性成分以尽可能精细分布的形式存在于疫苗中，并在动物体内散开，尤其是在长期内。
多重乳液代表一种用于疫苗制剂的有趣乳液体系。它们是这样的乳液，在最内相，它包含对应于连续最外相液体的相对小滴。配制此种疫苗的一种可能方式是多重W/O/W乳液。这里，活性成分，例如，被发现以一定粒度不溶性蛋白质的形式存在于最内水相中。由于附加油相的原因，身体对它的摄入延迟了，因此其药效得以延长。再者，油任选起着辅剂的作用，即，它可促进疫苗的抗原作用。
多重乳液形式的制剂在化妆品领域也已公知。公开的说明书DE196 30 176 A1描述其成分的组成，以及借助相逆转制备此种双重乳液的方法。
专利说明书US-6 251 407 B1描述一种可由油、乳化剂、水相和药物活性成分组成的用于制备疫苗的组合物。在该文中，关于各个成分可做如下描述所用油是所谓自-乳化油，由聚乙二醇化的甘油酯组成。该水相包含一种是抗原的活性成分。
此种按照EP-A-489 181或EP-A-481 982的双重乳液是这样制备的将含活性成分的水相“搅拌到”油相中，随后借助温度梯度发生相逆转而形成双重乳液，最后通过搅拌达到均化。
这里在以上给出的工况中制备的W/O/W乳液的缺点是不均一的宽液滴分布和液滴在最终乳液中的分布随着搅拌釜反应器几何参数的不同而重现性很差。再者，此种方法只能以不连续的操作方式实施。
另外，用膜生产多重乳液的方法已是公知的。文献源Joscelyne，S.M.和G.Tragardh(2000)，“膜乳化——文献综述”，《J.Membr.Sci.》169(1)107-117详细描述了该方法。这里，水相，例如，通过膜引入到一个相中。液滴尺寸对应于膜孔隙直径的2～10倍。局限性来自膜孔隙半径限制着粒度。然而，现已发现，膜孔隙的直径对于将活性成分结合到乳液中具有有害作用，如果活性成分颗粒过大的话。
专利申请EP 564 738 A1，一种制备乳液的膜方法，其中通过膜乳化制备第一乳液，双重乳液则通过搅拌形成，或者这两者都由膜乳化实现。该方法用于分步制备双重乳液形式的低脂涂抹食品，其特征在于，节省稳定剂和凝胶-成形剂。其中的最终乳液液滴具有10～16μm的平均直径。
所有所述的方法仅适合一个应用领域，因此无法简单地移植到其它应用领域。

发明内容
本发明的目的是形成一种1)W/O/W型的稳定双重乳液，其中外相和/或内水相包含药物活性成分，例如，抗原形式的，而其含油的相包含作为乳化剂的表面活性剂。
这里油相的液滴尺寸，具体地说，不得超过3μm平均直径，而内水相的不超过0.3μm。另外，该方法，特别是，应具有窄粒度分布并因此重现性高于传统方法。
还存在着以不均一和部分聚集形式存在的活性成分颗粒由于其粒度而不能被所用膜分离或者被剪切作用破坏的问题。
现已惊奇地发现，并且也正是这里要达到的目的的解决方案是，上面提到的、W/O/W型贮存-稳定多重乳液可采用下列作为本发明主题的方法形成a)将活性成分搅拌到水相中，b)通过将水相送过大孔径、多孔膜到油相中使水相乳化，c)通过以至少0.3K/min，优选至少1K/min的冷却速率冷却该混合物使来自b)的乳液相逆转，其中乳化剂被加入到a)中的水相或者到b)中的油相或者到这两相中。
该简单乳液，例如，可通过原则上公知的搅拌方法形成。液滴尺寸(数均)一般介于10～30μm，所述相逆转温度一般介于60～90℃。
本发明方法优选采用多孔无机膜，特别优选陶瓷膜，特别是Al2O3、ZrO2、TiO2以及这些氧化物的混合物的，特别优选Al2O3的。
膜的孔隙尺寸，平均地，优选介于0.2μm～5μm，特别优选0.3μm～3μm。
适合作连续相的成分，例如，一般是油；而作为非连续相，例如，是水溶液，特别是与连续相不混溶的液体。作为油相，优选采用矿物油，白油或植物油。
另一种不可缺少的组分是乳化剂，它最初被引入到水相a)和/或含油相b)中，取决于组合物，在优选的方法中它以在油相b)中的非离子乳化剂的形式存在。
该方法特别优选在，就按照步骤a)的乳化而言，30℃～35℃的温度范围，而就相逆转而言，以30K，但至少15K的温度梯度实施。
现已发现，采用该方法，极窄的粒度分布和1μm～3μm的平均颗粒直径(油相)可通过进料和操作条件的恰当选择达到。
最初引入到含水，即，特别是不连续，相中的活性成分，例如，是药物活性成分，优选用于兽医目的的，特别是疫苗制剂用抗原。
活性成分优选地选自以下系列抗原，例如，病毒、微生物，尤其是细菌或寄生物，或者一种包含肽链的制剂。此种制剂可以是蛋白质或糖蛋白，特别是从微生物获得的蛋白质或糖蛋白，通过遗传操作生产的合成肽或蛋白质或肽。
上面提到的病毒和/或微生物可以是完全钝化的、活的或减毒的。
可举出的代表抗原的病毒优选是狂犬病毒、Aujeszky′s病毒、流感病毒、口蹄疫病毒和HIV病毒。
可举出的是抗原的微生物或细菌类型优选是大肠杆菌和菌珠巴斯德氏、Furonculosis、Vibriosis、葡萄球菌和链球菌。
可举出的寄生物优选是菌珠锥虫(Trypanosoma)、疟原虫和利什曼。
膜两侧的压差(经膜压力)优选是0.5*105Pa～25*105Pa，但是优选0.5*105Pa～5*105Pa，取决于不连续水相中的活性成分浓度。
该方法原则上可连续或间歇地实施。
该方法优选在所有步骤中连续地实施。
连续相优选以0.5～5m/s，特别优选1～3m/s的速度流动。不连续相透过膜的分散相通量在，特别是，50～1500l/(m2*h)，优选800～1200l/(m2*h)的范围。
构成本发明基础的不连续水相优选由电解质构成，后者优选是弱酸与弱碱、弱酸与强碱或者强酸与弱碱的组合。
电解质特别优选包含一种或多种下列化合物硼酸、磷酸、N-2-(乙酰氨基)-2-氨基乙磺酸、N-2-(乙酰氨基)-2-亚氨基二乙酸、丙氨酸、2-氨基-2-甲基-1，3-丙二醇、氨、N，N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸、N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸、2，2-双(羟乙基)亚氨基三(羟甲基)甲烷、2-(环己基氨基)乙磺酸、3-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]-丙磺酸、组氨酸、咪唑、乳酸、2-吗啉代乙磺酸、2-吗啉代丙磺酸、哌嗪-1，4-双(2-乙磺酸)、N-[三(羟甲基)甲基]-2-氨基乙磺酸、N-[三(羟甲基)甲基]甘氨酸、三乙醇胺、三(羟甲基)氨基甲烷、柠檬酸。
该方法原则上可在无菌条件下操作。
该方法也可修改成适用于大量不同的不连续水相，有各种不同成分透过大量不同的膜在油相的不同点计量加入。这在各个活性成分彼此不相容或彼此间能起反应的工况中特别有利。
该方法的一个优势的次要效应是，该膜一方面作为乳化膜，同时另一方面，又作为过滤措施使用，例如，用于分离掉不希望的聚集体、杂质或那些直径大于膜孔隙并能对所要求的产物质量产生负面影响的过大活性成分颗粒。
上面提到的不希望的次要组分的分离可以在一个工艺步骤中也可在多个步骤方法中完成。
膜乳化以后的膜过滤也可用于产品的浓缩和/或使产品去离子。
所描述的本发明特别适合在动物保健中通过上面描述的制备方法配制疫苗，并同样也用于人类医疗中配制药物活性成分，其特征在于，期望的药剂形式和适应性强的“受控释放”性能。
下面的实施例涉及本发明的有利实施方案。数值全部指重量百分数，以制剂总重量为基准计，除非另行指出。
附图的简要说明附图显示

图1实施例中使用的试验装置的示意表示。
图2实施该方法的多阶段装置示意图。
具体实施例方式
实施例实施例1材料A. 50mM HEPES缓冲液pH8.32 50.00％B. Montanide ISA 206 49.95％C. 三乙胺(TEA) 0.05％采用下面的装置2个玻璃容器1、2，各2L蠕动泵3 Verder SF1500HPLC泵4膜组件5膜6 Inocermic，孔隙尺寸1.0μm三通阀7软管，软管接头热交换器8产品容器9，玻璃容器2L下面的装置按照图1所示示意图在实验室规模上使用油相1，包含TEA，以及水相2，由HEPES缓冲液组成，均被加热至33℃。达到此温度之后，这两相透过陶瓷膜6彼此接触，陶瓷膜位于被称作组件的外鞘5内，其孔隙直径等于1.0μm，并依靠泵3和4打循环直至全部用量的水相都与油相结合。在此种所谓膜乳化之后，形成的W/O乳液通过阀7被送过热交换器8，在此它被冷却至4℃，期间发生相逆转。冷却速率是2.5K/min。形成的多重W/O/W乳液收集在产品容器9中。
它具有2.3μm液滴直径的液滴。
全部实验参数总括在表1中。
图2显示一种修改的装置，以便将多达n种活性成分结合进去。在此种方案中，连续相1通过泵3相继送过大量膜组件5。该相可接受热处理。在达到所要求的温度后，各种不同，同样可加热的、不连续相2、7、9、n可随着各种活性成分和电解质透过膜6、8、10、n+1而乳化，其中在材料和孔隙尺寸方面可不同。借助阀11，形成的W/O乳液被送过热交换器12，在此，它被再次热处理以便诱导相逆转。形成的乳液可收集在产品容器13中。
实施例2材料A. 50mM HEPES缓冲液pH8.32 48.50％B. MKS浓缩物(单价) 1.50％C. Montanide ISA 206 49.95％D. 三乙胺(TEA) 0.05％采用下面的装置对比例1膜6 Inocermic，孔隙尺寸1.0μm由HEPES缓冲液和MKS浓缩物组成的水相和包含TEA的油相被加热到33℃。在达到33℃以后，这两相透过孔隙直径等于1.0μm的陶瓷膜彼此接触，并打循环直至全部用量的水相都与油相结合。形成的W/O乳液被送过热交换器以冷却至4℃，其间发生相逆转。冷却速率是2.5K/min。形成的多重W/O/W乳液具有2.0μm液滴直径的液滴。可心的实验参数对应于实施例1和表1。
实施例3材料A. 50mM HEPES缓冲液pH8.32 45.50％B. MKS浓缩物(三价)4.50％C. Montanide ISA 206 49.95％采用下面的装置对比例1膜6 Inocermic，孔隙尺寸3.0μm由HEPES缓冲液和MKS浓缩物组成的水相以及包含TEA的油相被加热到33℃。在达到33℃以后，这两相透过孔隙直径等于3μm的陶瓷膜彼此接触，并打循环直至全部用量的水相都与油相结合。形成的W/O乳液被送过热交换器以冷却至4℃，期间发生相逆转。冷却速率是2.3K/min。形成的多重W/O/W乳液具有2.0μm液滴直径的液滴。
全部实验参数总括在表1中。
实施例4材料A. 50mM HEPES缓冲液pH8.32 45.50％B. MKS浓缩物(单价)4.50％C. Montanide ISA 206 49.95％D. 三乙胺(TEA)0.05％采用下面的装置对比例1膜6 Inocermic，孔隙尺寸3.0μm整个实验装置预先在121℃下接受蒸汽灭菌处理30min，并且整个实验是在绝对无菌条件下进行的。该实验的其它方面对应于实施例3。冷却速率是1.4K/min。所用膜的孔隙直径是3μm。形成的多重W/O/W乳液具有2.0μm的液滴直径的液滴。随后给动物的注射给出100％的有效率，以采用传统方法制备的疫苗的有效率为基准计。
全部实验参数总括在表1中。
表1实施例1～4的实验参数

权利要求
1.一种制备包含一种或多种活性成分的水/油/水(W/O/W)型贮存-稳定、多重乳液的方法，该方法具有下列步骤a)将活性成分搅拌到水相中，b)通过将水相送过大孔径、多孔膜到油相中使水相乳化，c)通过以至少0.3K/min的冷却速率冷却该混合物使来自b)的乳液相逆转，其中乳化剂被加入到a)中的水相或者到b)中的油相或者到这两相中。
2.权利要求1的方法，其特征在于，所用膜是多孔无机膜，优选陶瓷膜，特别优选氧化铝、氧化锆或氧化钛的膜，优选氧化铝膜的。
3.权利要求1～2的方法，其特征在于，所用膜的孔隙尺寸是0.2～5μm，优选0.3～3μm。
4.权利要求1～3之一的方法，其特征在于，用于油相的油是选自系列矿物油、白油或植物油的物质。
5.权利要求1～4之一的方法，其特征在于，所用乳化剂是非离子乳化剂，它是最初被引入到油相中的。
6.权利要求1～5之一的方法，其特征在于，步骤a)中的乳化在30～35℃的温度实施。
7.权利要求1～6之一的方法，其特征在于，按照步骤c)的相逆转以至少1K/min的冷却速率实施。
8.权利要求1～7之一的方法，其特征在于，膜两侧的压差是0.5*105Pa～25*105Pa，优选0.15*105Pa～5*105Pa。
9.权利要求1～8之一的方法，其特征在于，该方法在所有步骤中连续地进行。
10.权利要求1～9之一的方法，其特征在于，活性成分是药物活性成分，优选用于兽医目的的药物活性成分，特别优选疫苗制剂用抗原。
11.权利要求10的方法，其特征在于，活性成分选自包含下列的系列抗原，优选病毒或微生物，尤其是细菌或寄生物，或者一种包含肽链的制剂，优选蛋白质或糖蛋白，特别优选从微生物获得的蛋白质或糖蛋白，通过遗传操作生产的合成肽或蛋白质或肽。
12.可由权利要求1～11之一的方法获得的W/O/W型多重乳液。
13.权利要求12的乳液作为用于人用或兽医医疗目的的疫苗的应用。
全文摘要
本发明描述了制备包含一种或多种活性成分的水/油/水(W/O/W)型贮存－稳定、多重乳液的方法。该方法包括步骤a)将活性成分搅拌到水相中，b)通过将水相送过大孔径、多孔膜到油相中使水相乳化，c)通过以至少0.3K/min的冷却速率冷却该混合物使来自b)的乳液相逆转，其中乳化剂被加入到a)中的水相或者到b)中的油相或者到这两相中。
文档编号A61K9/00GK1901883SQ200480039313
公开日2007年1月24日 申请日期2004年10月29日 优先权日2003年11月5日
发明者O·斯坦格, M·穆特, T·奥斯沃尔德, M·施米特兹 申请人:拜尔技术服务有限责任公司