专利名称：血管紧张素ii与成像部分的缀合物的制作方法
技术领域：
本发明提供有效治疗心衰、心律失常及其它纤维化突出的疾病以及对于纤维化过程突出的疾病和症状进行诊断的新型药物。本发明还提供了用于制备诊断剂的新型药用组合物及前体。另外，本发明还提供了有效监控治疗的新型药物以及监控治疗的方法。本发明再进一步的目的在权利要求书中是显而易见的。
所述新型药物包含靶向部分，该部分与在疾病区域中可能或可能不被上调和/或过度表达的受体相结合。所述靶向部分包含带有诊断上的可成像部分、任选的接头基团和肽部分的成像剂基团。
所述新型药用化合物对于血管紧张素受体(AngiotensinReceptors)，尤其是对于血管紧张素II(Ang II)1型(AT1)受体具有高亲合力。
背景技术：
血管紧张素II(Ang II)-八肽(Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe)-是一个多效的血管活性肽，该肽与两种不同的受体Ang II 1型(AT1)和2型(AT2)受体相结合。肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)的活化会导致血管肥大、血管收缩、盐和水潴留以及高血压。这些作用主要由AT1受体介导。矛盾的是，其它Ang II-介导的作用，包括细胞死亡、血管舒张及尿钠排泄是由AT2受体活化介导的。对于Ang II信号传输机理仍未完全了解。AT1受体活化引发多种细胞内系统，包括酪氨酸激酶-诱导的蛋白磷酸化作用、花生四烯酸代谢物的产生、反应活性氧化剂种类的活性改变以及细胞内Ca+浓度波动。AT2受体活化导致缓激肽的兴奋、氮氧化物产生以及前列腺素代谢，而这些在很大部分上是与AT1受体作用是相反的。(见BerryC.Touyz R，Dominiczak AF，Webb RC，Johns DG.Am J Heart Circ Physio.2001Dec；281(6)H2337-65.血管紧张素受体信号传输、血管病理生理学以及与神经酰胺的相互作用)。
Ang II是肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)的活性成分。它在调节血压、血浆容积、交感神经活性以及口渴反应中具有重要的生理作用。Ang II还在心脏肥大、心肌梗塞、高血压、慢性阻塞性肺病、肝脏纤维化及动脉粥样硬化中具有病理生理学作用。它通过经典的RAAS产生全身作用并且通过组织RAAS产生局部作用。在经典的RAAS中，循环肾源性肾素将肝源性血管紧张肽原裂开形成十肽血管紧张素I(Ang I)，其可以通过血管紧张素转化酶(ACE)在肺中转化为活性的Ang II。Ang I还可以被组织内肽酶加工成七肽Ang-(1-7)。
所述RAAS系统在此如
图1图示，其是以Foote等人在Ann.Pharmacother.271495-1503(1993)中所著文献中的图1为基础的。
RAAS除了在正常心血管内环境稳定中具有重要作用外，RAAS的过高活性还与多种心血管疾病如高血压、充血性心衰、冠状动脉缺血以及肾功能不全的发展有关。心肌梗塞(MI)后，RAAS是被激活的。尤其是AT1受体似乎在MI后重塑中扮演主要角色，因为在MI后和左心室机能障碍中AT1受体的表达增加。因此，那些干涉RAAS的药物，如ACE抑制剂和AT1受体拮抗剂，均已显示出在此类心血管疾病中具有强大的治疗作用。
对于心脏、肾、肺及肝脏等，纤维化是所述器官衰竭的共有因素。因此人们对了解涉及器官纤维化的病理生理学机理具有相当大的兴趣，尤其是在使保护性药理学战略有可能实现的方面。组织修复涉及炎症细胞，包括单核细胞/巨噬细胞系成员，整体启动修复过程；以及肌成纤维细胞(myofibroblasts)、表型转换间质成纤维细胞，负责胶原更新以及纤维性组织形成。每个在修复微环境中出现的这些细胞都与导致血管紧张素原II(Ang II)的重新生成的分子事件有关。在自分泌/旁分泌方式中，这些肽通过血管紧张素原(AT1)受体配体结合调节TGF-β1的表达。是该细胞因子使得成纤维细胞表型改变为肌成纤维细胞(myoFb)并且调节肌成纤维细胞对胶原的更新。血管紧张素-转化酶(ACE)抑制作用或AT1受体拮抗作用各自阻止了许多此类导致纤维化的分子和细胞反应，因此已被认为是保护性干预。(见Weber KT.Fibrosis，a common to organ failureangiotensin II andtissue repair.Semin Nephrol.1997Sep；17(5)467-91and referencestherein)。
Ang II可以通过激活间质细胞调节组织纤维化。例如，Ang II在体外通过激活AT1刺激心成纤维细胞的增殖。在体外心成纤维细胞上已显示了AT1受体的存在。Ang II的大部分前纤维(profibrotic)作用表现为通过该受体调节；然而，在肥大的人心脏上已检测到AT2在心成纤维细胞上表达增加，并且这两种亚型表达之间的平衡对于判定Ang II的应答可能是关键的。(见Am.J.Respir.Crit.Care Med.，Volume June 2000，1999-2004Angiotensin II is Mitogenic for HumanLung Fibroblasts via Activation of the Type 1Receptor RICHARD P.MARSHALL，ROBIN J.MCANULTY，and GEOFFREY J.LAURENTand references therein)。
所述的Ang II受体可根据特定拮抗剂的抑制作用进行区分。AT1受体可被联苯咪唑类(biphenylimidazoles)选择性地拮抗，如络沙坦(Losartan)，而四氢咪唑并吡啶类(tetrahydroimidazopyridines)特异性地抑制AT2受体。所述的AT2受体还可以被CGP-42112A(这是一个AngII的六肽类似物，其还可抑制AT2受体，取决于浓度)选择性地激活。两种其它的血管紧张素受体已被描述AT3和AT4亚型。
在啮齿类动物中，AT1受体具有两种功能相异的亚型，AT1A和AT1B，具有＞95％的氨基酸序列同源性。
第二种主要的血管紧张素异型(isoform)是AT2受体。它与AT1A或AT1B受体具有低的氨基酸序列同源性(～34％)。尽管AT2受体准确的信号路径以及功能角色仍不清楚，但这些受体在生理学条件下可能通过抑制细胞生长和通过减少细胞凋亡和血管舒张来拮抗AT1-介导的作用。AT2受体在心血管疾病中的准确角色仍有待明确。
除了AT1和AT2外，已知还有其它的Ang II受体并且通常称为AT非典型(见Kang等，Am.Heart J.1271388-1401(1994))。
所述Ang II作用的抑制已用于医疗，例如在高血压和心衰的控制上。这已在多种途径上达成通过使用阻断血管紧张素原向血管紧张素I(Ang II的前体)转变的肾素抑制剂；通过使用阻断血管紧张素I向Ang II转化(并且还阻断缓激肽和前列腺素的生物转化)的血管紧张素酶(ACE)抑制剂；通过使用抗-Ang II-抗体；以及通过使用Ang II拮抗剂。
β阻滞剂在抗心律失常治疗中最常用。抗心律失常药物具有有限的全面成功并且钙通道阻滞剂有时可引起心律失常。没有单独的药物显示出优越性，除胺碘酮的可能外。短期的抗心律失常益处，取决于特异性药物，已发现被其在死亡率上的中性或负性的作用所抵消。(Sanguinetti MC和Bennett，PB抗心律失常药物靶向选择及筛选。Circulation 2003，93(6)491-9257-263)。显然需要更好的抗心律失常药物。
Lancet公开的文章(Llindholm，LH等。络沙坦(Losartan)在糖尿病患者中的突发性心脏死亡作用LIFE研究所得数据。The Lancet，2003，362619-620)揭示了AT1受体拮抗剂除了对患有CHF的患者是通常有利的以外，还减少突发性心脏死亡的发生率。有一些研究表明AT1受体拮抗剂对于由心肌梗塞或在LAD结扎后的再灌注中所引起的心律失常作用具有抗心律失常作用(Harada K等。血管紧张素II1a型受体与再灌注心律失常发生有关。Circulation.1998，97315-317.Ozer MK等，卡托普利和络沙坦在小鼠心肌缺血性-再灌注所致的心律失常和坏疽中的作用。Pharmacological research，2002，45(4)，257-263Lynch JJ等，EXP3174，络沙坦全拮抗人代谢物，但既非络沙坦也非血管紧张素转化酶抑制剂卡托普利，避免了在近期心肌梗塞犬模型上的致死性缺血性心律失常。JACC，1999，34876-884)。
相关领域描述
WO 98/18496(Nycomed Imaging AS)公开了包含载体接头-报告物(vector linker-reporter)构造的造影剂，其中所述载体包含血管紧张素或肽血管紧张素衍生物。
美国专利4411881(New England Nuclear Corporation)描述了放射性-标记的化合物的稳定化。放射性-标记的化合物的实例包括如血管紧张素II(5-L-异亮氨酸)[酪氨酰-125I]-(单碘化)。
Ang II可以通过在它们氨基酸组成上进行改变而转化为有效的拮抗剂或部分拮抗剂。例如，在8位用异亮氨酸取代苯氨基丙酸和1位用肌氨酸取代天冬氨酸将所述肽变成了有效的拮抗剂。
与AT1受体的亲和特异性可以通过将氨基酸中的4位和6位进行环合或桥接而增加。类似地，在1位引入肌氨酸和在8位引入甘氨酸使所述肽转变为AT1选择性拮抗剂(见RC Speth.Sarcosinell，甘氨酸8血管紧张素II是AT1血管紧张素II受体亚型选择性拮抗剂Regulatory peptides 115(2003)203-209)。
如上所提及，AT1受体的自然配体为八肽Ang II，Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe，其在纳摩尔范围与AT1受体结合。
当通过将一个组成部分与其它部分尤其是与相对巨大和相对笨重的部分结合来对一个天然结合配体进行修饰时，通常会危及所述肽载体的亲合力。
我们惊奇地发现八肽AngII，Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe及其衍生物，当在该肽的特定位置进行取代时，不仅保留了其结合能力，而且还令人惊奇地提高了其对血管紧张素II受体，尤其是对于AT1受体的亲合性。
发明概述本发明的第一个目的是提供有效治疗心衰、心律失常及其它纤维化突出的疾病，如COPD、肝纤维化和动脉硬化的药物，该药物包含一个靶向部分，该部分显示出对于AT1受体比天然的八肽Ang II具有更强的亲合力。所述药物应该显示出拮抗活性。
本发明的第二个目的是提供在诊断心衰和其它纤维化突出的疾病，如在COPD、肝纤维化及动脉硬化中有效的药物，所述药物包含结合可成像部分的靶向部分。所述可成像部分可以是任何可成像部分，当给予受试者该部分时，会在所述受试者身上至少在部分所述造影剂分布的地方生成一份影像，如通过放射成像、SPECT、PET、MRI、X-射线、光学成像(OI)、超声(US)、电子阻抗或磁力成像形式。结合了可成像形式的靶向部分对AT1受体应该显示出比Ang II更高的亲和性并且应该优选用作拮抗剂，尽管微弱的激动活性仍可以是被接受的。
当所述新型药物带有用于诊断成像的合适可成像部分时，则可以被相继或同时作为治疗剂使用。
进一步的目的包括提供治疗高血压、纤维化、COPD及相关疾病的方法，对于心衰和纤维化的成像方法以及对于此类疾病和病症和相关的心血管疾病和病症治疗进程进行监控的方法。本发明还提供了制备诊断剂的新型的药用组合物和前体。还提供了诊断试剂盒，尤其是制备放射性药用诊断剂的试剂盒。
本发明的药物包含肽V，任选接头L和Z部分，如式(I)所示Z-(L)n-V(I)其中，V表示具有结合序列-X1-X2-Val-Tyr-Ile-His-Pro-X3的肽，L表示任选的接头，Z表示任选可带有成像部分M的基团，n为0或1，X1表示氨基酸，X2表示Arg或N-烷基化Arg，或Arg的模拟物，X3表示包含疏水侧链的氨基酸，其中在3位和5位的缬氨酸(Val)和异亮氨酸(Ile)残基各自可任选被能形成桥的氨基酸置换，
Z任选通过接头L与氨基酸X1成键，并且M存在时表示能成像的部分，其可以在诊断成像程序中被直接或间接检测。
发明详述本发明在发明权利要求书中被描述。本发明的具体特征在下列详细描述及实施例中列出。
在式(I)的靶向部分中，上述的V表示肽序列-X1-X2-Val-Tyr-Ile-His-Pro-X3。
除另有说明外，在式(I)的肽V中的氨基酸为天然Ang II中的L-氨基酸。
用于氨基酸的三个字母缩写具有下列意义Arg-精氨酸Asp-天冬氨酸Cys-半胱氨酸Hcy-高半胱氨酸Gly-甘氨酸Sar-肌氨酸Val-缬氨酸Tyr-酪氨酸Ile-异亮氨酸His-组氨酸Pro-脯氨酸Phe-苯丙氨酸Abu-2-氨基-丁酸Nva-2-氨基-戊酸Nle-2-氨基-己酸Phg-2-氨基-2-苯乙酸Hph-2-氨基-4-苯基丁酸Bip-2-氨基-3-联苯基丙酸
Nal-2-氨基-3-萘丙酸Cha-2-氨基-3-环己基丙酸所述V的氨基酸优选为独立选择X1表示-NY1-(CH2)m-CO-，其中m为1-10的整数并且Y1为H或含有取代基的烷基或芳基，最优选GlyX2表示Arg或N-甲基-Arg或者Arg模拟物Phe[4-胍基]和Gly-4-哌啶基[N-脒基]，X3表示Phe、D-Phe、Ile、Abu、Nva、Nle、Phg；Hph、Bip、Nal或Cha，最优选D-Phe、Bip、Ile或Hph。
优选其中X1表示Gly，X2表示Arg或N-甲基-Arg并且X3表示D-Phe、Bip、Ile或Hph的药物。
仍进一步优选其中X1表示Gly，X2表示Arg并且X3表示Ile的药物。
如果3位和5位的氨基酸被选择形成一个桥单元，则该桥优选含有-CH2-CH2-、-S-CH2-、-S-CH2-S-、内酰胺或-S-S-单元。更优选共价键为由2个半胱氨酸或高半胱氨酸配对氧化所形成的二硫键。
在专利WO 98/18496和WO 01/77145(23-27页)中描述了合适的接头L的实例，其内容通过引用一并结合到本文中。L可以优选代表聚亚烷基二醇单元，如聚乙二醇(PEG)和聚丙二醇(PPG)，糖类、葡聚糖或1-10氨基酸。所述接头还可以作为生物修饰剂，如在WO03/006491中所述。
所述接头L还可以从烷基胺或芳胺中衍生，优选为式NH-(CH2)m-的化合物，该化合物任选与-CO-(CH2)m-CO-结合，其中m表示1-10的正整数。
所述接头还可以包含一或多个如下文中式IV中所定义的PEG单元，其中n为1-10整数。
最优选为由式(V)和式(VI)定义的接头
式(V) 式(VI)Z部分包含具有分子量超过50D(道尔顿Dalton)的非肽部分，更优选在100-1000D之间并且再更优选在300-700D之间。只要最终的式(I)靶向部分显示出对AT1受体具有比天然配体Ang II更高的亲和性，则Z部分可以为任意药学可接受的化学实体。更明确地，Z表示具有合适官能团的有机基团，以便Z可以与接头L或直接与肽V反应形成稳定的共价键。
Z可表示直链或支链的烃基，所述烃基任选包含一或多个双或三键并且任选被卤素、氧、硫或磷原子取代或者任选包括如氧、氮或硫的杂原子。更明确地，烃基可表示取代或未取代的分子量至少为50D的烷基、烯基、炔基。
Z还可表示一或多个包含单环、双环或三环系统的连接的碳环残基，所述环系统可以是饱和的、部分不饱和或芳香的，可以是被取代或未取代的并且其分子量至少为50D。此类环系统的实例为芳基、芳烷基、环己基、金刚烷基和萘基。
Z可进一步表示一个或多个连接的杂环化合物，如5、6、7、8、9或10-元环系统，其可以是单环、双环或三环并且可以包含一个或多个N、O、S和P作为杂原子。此类环系统还可以与烃基和碳环基团连接并且如上所定义或与碳环基团稠合。此类基团的实例如吖啶基、苯并呋喃基、吲哚基、吡啶基、哌啶基、morphoridinyl和噻吩基。
Z还可以表示聚亚烷基二醇，如聚乙二醇(PEG)和聚丙二醇(PPG)，所有分子量超过50D的糖类如单或多糖。聚亚烷基二醇类还可另外用作生物修饰剂。
特定的Z表示螯合剂，如在美国专利4,647,447(Schering AG)和WO 86/02841(Nycomed Saluta，Inc.)中所描述的非环状或环状聚氨基羧酸酯(如DTPA、DTPA-BMA、DOTA和DO3A)，在此通过引用结合到本文中。螯合剂还包含胺硫醇，如二胺二硫醇、胺化肟(amineoximes)和肼以及在专利WO 01/77145中所描述的相关试剂(见其中的表1)，在此通过引用结合到本文中。式(VIII)的螯合剂cPN216为特别优选的。
对于治疗有效的药物，Z可以为如上所述的任意的实体。
对于在诊断中尤其是在体内诊断中有效的药物，所述的Z部分必须能带有可成像部分或由M表示的部分。带有指的是在Z和M部分之间的任何形式的连接，如化学健，如共价键或电价键或离子健或者通过吸附或任何其它类型的连接。
Z可以为任何可成像部分。其中M指金属实体，Y1代表螯合剂。Z和/或Y1M的性质将取决于在诊断中使用的成像形式。Z和/或Y1M在体内诊断成像过程中必须能被直接或间接检测，如发射或可以引起发射可检测射线(如通过放射性衰变、荧光激发、自旋共振激发等)的部分，影响局部电磁场的部分(如顺磁性的、超顺磁性的、亚铁磁性的或铁磁性类)，吸收或散射放射能量的部分(发色团、粒子(包括含有气体或液体的囊泡)，重元素及其化合物等)，以及产生可检测物质的部分(如气体微泡发生器)。
在一个优选实施方案中，一个Z部分与X1直接共价键合形成N-烷基甘氨酸单元。
下文中的式(VII)和式(VIII)的螯合剂也为特别优选的。
大范围的适合的可成像部分可从WO 98/18496中了解，所述内容通过引用结合到本文中。
成像形式以及成像部分Z和M在下文有更详细的描述在第一个实施方案中，式(I)化合物包含带有一个或多个在Radio和SPECT成像形式中有效的可成像部分M的Y1部分。优选的M为具有低或无α-和β-发射的γ发射体，并且具有超过一个小时的半衰期。优选的M基团为放射性核67Ga、111In、123I、125I、131I、81mKr、99Mo、99mTc、201Tl和133Xe。最优选为99mTc。
M可以进一步由下列用于成像和治疗而不需要改变放射性标记方法学或螯合剂的同位素或同位素对表示47Sc21；141Ce58；188Re75，177Lu71；199Au79；47Sc21；131I53；67Cu29；131I53和123I53；188Re75和99mTc43；90Y39和87Y39；47Sc21和44Sc21；90Y39和123I53；146Sm62和153Sm62；以及90Y39和111In49。
当M表示金属放射性核素时，则Y1表示适于与M形成稳定螯合物的螯合剂。此类螯合剂为本领域所熟知并且在WO 01/77145的表1中描述了此类螯合剂的典型的实例。
式(VII)螯合剂为特别优选 其中每个R1、R2、R3和R4独立为H或C1-10烷基、C3-10烷基芳基、C2-10烷氧基烷基、C1-10羟基烷基、C1-10烷基胺、C1-10氟烷基，或2个或多个R基，与连接它们的原子一起形成饱和的或不饱和的碳环或杂环。
更特别优选的螯合剂为式(VII)，其中R1、R2和R3为氢或者甲基并且R4为烷基胺基团，最特别为式(VIII)化合物，在此以cPN216表示。
式(VIII)对Y1而言最优选的是当螯合剂为cPN216时，成像因子M为99mTc。
在WO 03/006070中描述了式(VII)和(VIII)螯合剂的合成。
其它优选的螯合剂为具有式(XI)的化合物 式(XI)其中Q1-Q6为独立的Q基团，其中Q为H、烷基、芳基或胺保护基团。
W1为-NR-、-CO2-、-CO-、-NR(C＝S)-、-NR(C＝O)-、-CONR-或Q基团；每个Y独立为D-或L-氨基酸、-CH2-、-CH2OCH2-或-OCH2CH2O-或X基团；p为数值为1-8的整数；q为数值为0-30的整数；R为H、C1-4烷基、C2-4烷氧基烷基、C1-4羟基烷基或C1-4氟烷基；Q为
A为抗衡离子；式(XI)的四胺螯合剂的合成可在申请号为GB 0416062.8的英国专利中找到。
非金属放射核素，如123I、125I和131I可以和L部分(当出现L时)或者和X1通过本领域所熟知的取代或加成反应共价连接。
在第二个实施方案中，式(I)化合物包含在PET成像形式中有效的Z部分。Z则表示具有正电子-发射特性的放射发射体。优选的Z基团为放射核素11C、18F、68Ga、13N、15O和82Rb。18F为特别优选。金属放射发射体82Rb和68Ga与螯合剂Y1螯合也是优选的。
硫醇偶联化学、18F-合成元和标记肽由WO 03/080544中描述的采用硫醇偶联化学作用制备，所述内容通过引用结合到本文中。
通过采用硫醇偶联化学作用标记肽的描述可以在申请号为0317815.9的英国专利中找到，所述内容在此通过引用结合到本文中。
当M表示金属放射核时，则Y1表示适于与M形成稳定螯合物的螯合剂。此类螯合剂为本领域现阶段所熟知的，在WO 01/77145的表1中以及前文在Radio和SPECT成像部分中描述了此类螯合剂的典型实例。
在另一个优选的实施方案中，Y1为DOPT螯合剂并且M为68Ga，其可以采用微波化学容易地引入到螯合物中。
非金属放射核素如18F，当有L部分时可以与L部分共价连接，或者通过本领域现阶段已知的取代或加成反应与X1连接，这些反应在WO03/080544中也有描述，在此一并通过引用结合到本文中。
在第三实施方案中，式(I)化合物包含带有一个或多个在MR成像形式中有效的M可成像部分的Y1部分。此处的M表示顺磁性金属，如美国专利4647447中所描述，Gd3+、Dy3+、Fe3+和Mn2+为特别优选的并且Y1表示螯合剂，特别是如在美国专利4 647 447和WO86/02841中所描述的非环状或环状聚氨基羧酸酯(如DTPA、DTPA-BMA、DOTA和DO3A)。M还可以表示被Z吸收的金属氧化物，如超顺磁性的、亚铁磁性的或铁磁性的种类，因此Z用作金属氧化物的涂料。美国专利6 223 777中描述了用作MR造影剂的金属氧化物，在此通过引用结合到本文中。
在第四实施方案中，所述式(I)化合物包含带有一或多个在X-射线成像形式中可成像M部分的Y1部分。M在此表示一种重金属，如W、Au和Bi，优选为可以被Z吸收的氧化物形式。Z还可由特别是已知作为X-射线造影剂的碘化芳基衍生物代表，如IopamironTM和OmnipaqueTM。这些试剂可以通过它们的酰胺或胺官能团与式(I)的肽V连接。
在另一个实施方案中，式(I)化合物包含充满气体的囊泡形式的Z。此类超声波成像剂可在受体成像中应用，如当它们用于与肽结合时，在本领域现有技术，如在WO98/18500中所述。
在本发明的第六个实施方案中，式(I)的Z部分可以是在光学成像程序中可被直接或间接检测的任意部分。所述可被检测部分可以是光散射体(如，有色的或无色的粒子)、光吸收体或光发射体。更优选Z由染料所代表，如发色团或荧光化合物。Z部分可以是能与光在电磁波谱中与波长从紫外线到近红外的光线相互作用的任意染料。在优选版本中，Z具有荧光性质。
优选的有机染料部分包括具有广泛离域电子系统的基团，如花青类(cyanines)、部花青类(merocyanines)、靛青类(indocyanines)、酞菁类(phthalocyanines)、萘菁类(naphthalocyanines)、三苯基次甲基类(triphenylmethines)、卟啉类(porphyrins)、吡喃(pyrilium)染料、噻喃(thiapyrilium)染料、squarylium染料、croconium染料、azulenium染料、吲哚苯胺类(indoanilines)、苯并吩嗪(benzophenoxazinium)染料、苯并硫杂吩噻嗪(benzothiaphenothiazinium)染料、蒽醌类(anthraquinones)、萘醌类(napthoquinones)、阴丹士林类(indathrenes)、邻苯二甲酰吖啶酮类(phthaloylacridones)、trisphenoquinones、偶氮(azo)染料、分子内和分子间电荷转移染料和染料复合物、环庚三烯酮类(tropones)、四嗪类(tetrazines)、双(二硫杂环戊烯(dithiolene))复合物、联(苯-连二硫酸盐(dithiolate))复合物、碘代苯胺染料、双(S，O-二硫杂环戊烯(dithiolene))复合物。荧光蛋白质，如绿荧光蛋白(GFP)和具有不同的吸收/发射性质的GFP修饰物也是有效的。某些稀有土金属(如铕、钐、铽或镝)的复合物在某些情况下中使用，如荧光纳米晶体(量子点)。
对于在光学成像程序中合适部分的进一步描述可以在申请号为200303115的挪威专利中找到，所述内容通过引用结合到本文中。
式(I)的药物可以通过连接一或多个生物修饰剂基团进行进一步的修饰，如聚亚烷基二醇单元，如聚乙二醇(PEG)和聚丙二醇(PPG)。在WO 03/006491中描述了生物修饰剂基团的实例，其内容通过引用结合到本文中。所述的生物修饰剂基团可以与式(I)化合物中的任意位置相连，只要它对所述化合物与靶向受体的连接无明显的消极作用。
所述的生物修饰剂优选以单分散PEG构建模块为基础，包含1-10个所述构建模块单元，所述生物修饰剂具有改变所述药剂的药代动力学和血桨清除率的功能。在本发明的一个优选实施方案中，式IV化合物，表示一个由单分散PEG-样结构聚合组成的生物修饰剂单元，17-氨基-5-氧代-6-氮杂-3，9，12，15-四氧杂十七烷酸。
其中n等于1-10的整数，并且其中的C-端单元形成酰胺键。
式(I)药物的实例由下列表示式(II)和式(III)化合物
Z-CO-NH-(CH2)m-X1-X2-Val-Tyr-Ile-His-Pro-X3(II)Z-CO-(CH2)m-CO-NH-(CH2)m-X1-X2-Val-Tyr-Ile-His-Pro-X3(III)其中m为1-5之间的整数，并且Z、X1、X2和X3如前文所定义。
式Va和VIa定义的化合物 其中Z和V如前文所定义。
式(IX)化合物 其中Y2为烷基、芳基或包含短PEG的部分并且Y2优选为-CH2-CH2-CH2-并且X3如上定义。
式(I)药物的优选实例由下列表示cPN216-Gly-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Ile-OHcPN216-Gly-MeArg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-D-Phe-OHcPN216-Gly-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Bip-OHN-((CH2)6-四胺)-Gly-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Ile-OH如上所注，出于在体内诊断中使用的目的，带有99mTc或18F的化合物的螯合物为特别优选。
尤其优选的是化合物cPN216-Gly-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Ile-OH，其化学结构式由式(X)所示
式(X)以及它与99mTc的螯合物。
特别优选化合物N-((CH2)6-四胺)-Gly-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Ile-OH，其结构式由式(XII)所示 式(XII)以及它与99mTc的螯合物。
式(I)的药物优选作为包含式(I)化合物的药物制剂以适合给予哺乳动物(如人类)的形式给药。所述给药是通过适于注射或输注的制剂进行的，如水性溶液。所述制剂可含有一或多个药学上可接受的添加剂和/或赋形剂，如缓冲剂；增溶剂如环糊精；或表面活性剂如普卢兰尼克(Pluronic)、吐温(Tween)或磷脂。另外还可加入稳定剂或抗氧化剂如抗坏血酸、龙胆酸或对氨基苯甲酸以及冻干所用的填充剂如氯化钠或甘露醇。
在本发明的其中一个方面，式(I)的药物在治疗以及治疗监控中是有效的。在对心衰以及其它纤维化突出的疾病，尤其是COPD、肝纤维化以及动脉硬化治疗进展的监控中，其中一种方法是给予受治疗的受试者式(I)的药物并随之对所述受试者全身或所述受试者的局部生成影像。
在再进一步方面中提供了一种制备式(I)的放射性药用组合物的试剂盒，该试剂盒包含一种肽-螯合物缀合物和一种还原剂。优选的试剂盒的还原剂是亚锡盐。所述试剂盒还可以包含一种或多种稳定剂、抗氧化剂和用于冻干的填充剂和增溶剂。
制备药物及其前体的通用程序所使用的缩写具有下列意义Fmoc9-芴甲氧基羰基Boc叔-丁氧基羰基tBu叔-丁基Trt三苯甲基Pmc2，2，5，7，8-五甲基苯并二氢吡喃(chroman)-6-磺酰基TFA三氟乙酸HBTUO-苯并三唑-1-基-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸盐DMF二甲基甲酰胺NMPN-甲基吡咯烷酮TIS三异丙基甲硅烷NHSN-羟基琥珀酰亚胺基NMMN-甲基吗啉RP-HPLC反相高效液相色谱法Wang resin对-苯甲氧基苯甲醇树脂V的合成本发明中所述的肽V可通过采用所有已知的化学合成方法合成但特别有效的是应用自动肽合成仪的Merrifield固相法(J.Am.Chem.Soc.，852149(1964))。典型地，所需序列由固相肽合成装配。本发明实例中采用的合成策略的标准程序如E.Atherton&R.C.Sheppard，“固相肽合成实际方法″，1989，IRL Press，Oxford中描述。
例如，使用带有酸-不稳定接头基团的树脂，该树脂中所需的氨基保护的C-端氨基酸残基已被酯化。所述的氨基保护基团随后被移除并且在该序列中的第二氨基酸采用合适的缩合试剂进行偶联。使用带有半-永久氨基保护基团的氨基酸和带有永久保护基团的功能性侧链。然后氨基-脱保护及偶联循环以交替步骤方式重复进行直至完成目的序列的装配。
另外，所述的肽V可以通过本领域内已知的液相肽合成方法合成，以分步方式从羧基端和/或通过应用片段缩合或连接方法，采用全面或最小保护策略进行合成。也可以应用联合的液相-固相片段缩合方法。
通常，存在的反应活性侧链基团(例如氨基、羟基、胍基和羧基基团)将会如上所述在整个合成中被保护。已知有许多氨基酸保护基团可供选择(见Grene，T.W.&Wuts，P.G.M(1991)在有机合成中的保护基团，John Wiley&Sons，New York)。可以采用的氨基保护基团包括9-芴甲氧基羰基(Fmoc)和叔-丁氧基羰基(Boc)。可以采用的侧链保护基团包括叔-丁基(tBu)、三苯甲基(Trt)、Boc和2，2，5，7，8-五甲基苯并二氢吡喃-6-磺酰基(Pmc)。应该了解的是大范围的其它此类基团在本领域中是已知的。
最后，通常同时通过用合适的酸性试剂，如三氟醋酸(TFA)处理可将所述永久侧链保护基团移除并且将所述肽从树脂上切下。
L与V的缀合可使用所有已知的化学合成方法使L与V缀合。特别有效的是亲核取代反应，其中在肽N-端的离去基团被L上的亲核基团置换。此类离去基团可以是在羰基α位上连接的溴，并且该亲核试剂可以是氮。
Z与V或与L缀合采用如L与V缀合的相同方法，Z可以直接与V缀合。在Z与V通过L连接的情况下，任意化学合成方法都可以用于Z与L的缀合中。特别有效的是形成酰氨键。
实施例实施例1 带光学成像染料的Ang II类似物荧光素-NH-(CH2)2-Gly-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Ile-OHAng II的肽类似物是从0.1mmol Fmoc-Ile-Wang树脂开始，在应用生物系统(Applied Biosystems)433A肽合成仪上合成的。在止于精氨酸的偶合步骤中采用过量的1mmol预活化氨基酸(采用O-苯并三唑-1-基-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU))。N-端采用0.5mmol在DMF中的溴乙酐进行溴乙酰化30分钟。溴乙酰化后的树脂随后用0.5mmol溶解在N-甲基吡咯烷酮(NMP)中的N-Boc-乙二胺溶液处理30分钟。在5mL含有2.5％三异丙基甲硅烷(TIS)和2.5％水的TFA中处理两小时，将肽从树脂上切下并且同时去除侧链保护基团。真空除去TFA，向残留物中加入乙醚并用乙醚洗涤沉淀所得的肽，风干。
将23mg的粗制肽、16mg荧光素NHS酯和12μL N-甲基吗啉(NMM)溶于二甲基甲酰胺(DMF)中，该反应混合物搅拌过夜。所得反应产物通过制备RP-HPLC(条件5-50％B 40分钟内，其中A＝H2O/0.1％TFA并且B＝CH3CN/0.1％TFA；流速，10ml/min；柱，Phenomenex Luna 5μC18(2)250×21.20mm)纯化得19mg纯的荧光素-肽缀合物。该肽通过分析HPLC(条件梯度，5-50％B 10分钟内，其中A＝H2O/0.1％TFA并且B＝CH3CN/0.1％TFA；流速，1mL/min；柱，Phenomenex Luna 3μC18(2)50×4.6mm；检测，UV214nm；产物保留时间8.91min)进行分析。进一步的产物鉴定通过电喷雾质谱进行(MH+计算值，1355.6；MH+实测值，1355.2)。
以类似的方式，Cy5.5 NHS酯(一种染料，由Amersham Bioscience提供)可以用于合成染料-肽缀合物Cy5.5-NH-(CH2)2-Gly-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Ile-OH。
实施例2 用于PET成像的带18F的Ang II类似物18F-(CH2)3-S-CH2CO-NH-(CH2)2-Gly-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Ile-OHATII肽类似物是从0.1mmol Fmoc-Ile-Wang树脂开始，在应用生物系统433A肽合成仪上合成的。在止于精氨酸的偶合步骤中采用过量的1mmol预活化氨基酸(采用HBTU)。N-端采用0.5mmol在DMF中的溴乙酐进行溴乙酰化30分钟。溴乙酰化后的树脂随后用0.5mmol溶解在NMP中的N-Boc-乙二胺溶液处理30分钟。
在10mL含有2.5％TIS和2.5％水的TFA中处理两小时，将肽从树脂上切下并且同时去除侧链保护基。真空除去TFA，在残留物中加入乙醚并用乙醚洗涤沉淀的肽，风干。
所得的粗品肽用一当量溶于DMF中的氯乙酸酐处理30分钟。所得的氯乙酰化肽采用制备RP-HPLC进行纯化。F18-丙基硫醇与纯化的氯乙酰化肽缀合得到用于PET成像的18F-标记的肽。
实施例399mTc标记的Ang II类似物cPn216-Gly-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Ile-OH Ang II肽类似物是从0.1mmol Fmoc-Ile-Wang树脂开始，在应用生物系统433A肽合成仪上合成的。在止于精氨酸的偶合步骤中采用过量的1mmol预活化氨基酸(采用HBTU)。N-端采用0.5mmol在DMF中的溴乙酐进行溴乙酰化30分钟。所得溴乙酰树脂随后用溶解在DMF中的0.2mmol cPn216和0.4NMM溶液处理16小时。
在5mL含有5％TIS、5％水和2.5％苯酚的TFA中处理两小时，将肽从树脂上切下并且同时去除侧链保护基。真空除去TFA，在残留物中加入乙醚并用乙醚洗涤沉淀的产物，风干。
用制备RP-HPLC(0-30％B 40分钟内，其中A＝H2O/0.1％TFA并且B＝CH3CN/0.1％TFA，在一根Phenomenex Luna 5μC18(2)250×21.20mm柱子上流速为10mL/min)纯化所得产物得12mg纯的螯合物肽缀合物。所得产物通过分析HPLC(条件梯度，5-50％B 10分钟内，其中A＝H2O/0.1％TFA并且B＝CH3CN/0.1％TFA；流速，2mL/min；柱子，Phenomenex Luna 3μC18(2)50×4.6mm；检测，UV214nm；产物保留时间7.02min)进行分析。进一步的产物鉴定通过使用电喷雾质谱进行(MH+计算值，1280.8；MH+实测值，1280.5)实施例4 用于99mTc标记的Ang II类似物cPn216-CO-(CH2)3CO-NH-(CH2)2-Gly-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Ile-OHAng II肽类似物是从0.15mmol Fmoc-Ile-Wang树脂开始，在应用生物系统433A肽合成仪上合成的。在止于精氨酸的偶合步骤中采用过量的1mmol预活化氨基酸(采用HBTU)。N-端采用0.75mmol在DMF中的溴乙酐进行溴乙酰化30分钟。所得树脂随后用0.75mmol溶解在NMP中的N-Boc-乙二胺溶液处理60分钟。在10mL含有2.5％TIS和2.5％水的TFA中处理90分钟，将肽从树脂上切下并且同时去除侧链保护基。真空除去TFA，在残留物中加入乙醚并用乙醚洗涤沉淀的产物，风干。
将5.5mg肽、23mg cPn216四氟苯硫基酯(tetrafluorothiophenylesters)和10μL NMM溶于DMF中并且所得反应混合物搅拌3小时。所得产物通过制备RP-HPLC(条件0-30％B 40分钟内，其中A＝H2O/0.1％TFA并且B＝CH3CN/0.1％TFA；流速，10mL/min；柱子，Phenomenex Luna 5μC18(2)250×21.20mm)纯化得到4.3mg纯的螯合物-接头-肽缀合物。该产物通过分析HPLC(条件梯度，5-50％B10分钟以上，其中A＝H2O/0.1％TFA并且B＝CH3CN/0.1％TFA；流速，0.3mL/min；柱子，Phenomenex Luna 3μC18(2)50×2mm；检测，UV214nm；产物保留时间6.51min)进行分析。进一步的产物鉴定通过使用电喷雾质谱进行(MH+计算值，1436.9；MH+实测值，1436.7)实施例5 在心肌梗塞(MI)后的猪模型中的抗心律失常作用药物cPn216-Gly-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Ile-OH(X)通过下列程序检验将一只猪麻醉并置于人工超压通风装置中。通过中线胸骨切开术接近心脏并除去前心包。LAD动脉通过在第二支管上结扎闭合并且其中一个侧支也如此闭合。这会导致频繁的室性期外收缩的发生，并从先前的相同类型标本的实验中得知其会在数分钟内发展为室性心动过速以及纤维性颤动。静脉注射0.5mg式(X)化合物后几分钟内，该症状完全稳定，恢复窦性节律。此时注意到平均血压开始上升。室性期外收缩在约15分钟后逐渐再次出现并且再次给予注射0.5mg式(X)化合物。该症状再次稳定，具有规则的窦性节律。在接下来的一小时中，记录到稳定的窦性节律以及轻微的降低但基本恒定的血压。这只猪随后被给予致死量的氯化钾以终止该试验。对第一次注射化合物(X)之前和之后的ECG记录的分析表明QRS波群持续时间的缩短，暗示了所述的抗心律失常作用可能与提高心肌传导速率有关。
在第二只猪试验中得出一套类似的观察结果。
因此，式(X)化合物显示出在该标本中用作一种抗心律失常药物。
实施例6 N-((CH2)6-四胺)-Gly-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Ile-OH的合成 从0.25mmol Fmoc-Ile-Wang树脂开始，采用Fmoc/叔丁基策略，在应用生物系统433A肽合成仪上合成了Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Ile肽序列。在偶合步骤中采用过量的1mmol用O-苯并三唑-1-基-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)预活化的氨基酸。游离的N-端用1mmol在二甲基甲酰胺中的溴乙酸酐溶液进行溴乙酰化30分钟。所得的溴乙酰化树脂(0.05mmol)随后用0.15mmol溶解在二甲基甲酰胺中的四-Boc-四胺螯合物溶液处理60分钟。
用5mL含有2.5％三异丙基甲硅烷和2.5％水的三氟醋酸处理90分钟，将肽从树脂(0.025mmol)上切下并且同时去除侧链保护基。真空除去三氟醋酸，在残留物中加入乙醚并且用乙醚洗涤沉淀，风干，得25mg粗制品。
该25mg粗制品用制备RP-HPLC(0-30％B 40分钟内，其中A＝H2O/0.1％TFA并且B＝CH3CN/0.1％TFA，在一根Phenomenex Luna5μC18(2)250×21.20mm柱子上流速为10mL/min)进行纯化得6.5mg半纯化产品。半纯化产品的第二次纯化步骤(A＝H2O/0.1％HCOOH以及B＝CH3CN/0.1％HCOOH，其余为与上述相同的条件)得3mg纯品。该产品通过分析HPLC(条件梯度，0-30％B 10分钟内，其中A＝H2O/0.1％HCOOH以及B＝CH3CN/0.1％HCOOH；流速，0.3mL/min；柱子，Phenomenex Luna 3μC18(2)50×2mm；检测，UV214nm；产品保留时间，5.34min)进行分析。进一步的产品鉴定采用电喷雾质谱进行(MH+计算值，1196.8；MH+实测值，1196.7)实施例7 Hcy3-5；N-cPn216-Gly-Arg-Hcy-Tyr-Hcy-His-Pro-Ile-OH的合成
从0.25mmol Fmoc-Ile-Wang树脂开始，采用Fmoc/叔丁基策略，在应用生物系统433A肽合成仪上合成了Arg-Hcy-Tyr-Hcy-His-Pro-Ile肽序列。在偶合步骤中采用过量的1mmol用O-苯并三唑-1-基-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)预活化的氨基酸。游离的N-端用1mmol在二甲基甲酰胺中的溴乙酸酐溶液进行溴乙酰化30分钟。所得的溴乙酰化树脂(0.05mmol)随后用0.25mmol溶解在二甲基甲酰胺中的cPn216(99mTc-螯合剂1)(1合成详见专利WO20030049)溶液处理60分钟。
在10mL含有2.5％三异丙基甲硅烷和2.5％水的三氟醋酸中处理2小时20分钟，将肽从树脂上切下并且同时去除侧链保护基。真空除去三氟醋酸，在残留物中加入乙醚并用乙醚洗涤沉淀，风干，得70mg粗制线性产品。
该粗制线性产品通过制备RP-HPLC(5-50％B40分钟内，其中A＝H2O/0.1％TFA并且B＝CH3CN/0.1％TFA，在一根Phenomenex Luna5μC18(2)250×21.20mm柱子上流速为10mL/min)进行纯化得20mg纯的线性产品。该线性产品溶解在2mL DMSO和200mL水中，并且所得溶液用氨水调节到pH8。所得溶液搅拌26小时后用三氟醋酸调至pH2。
所得环状产物通过制备RP-HPLC(0-30％B，其余为与上述相同的条件)纯化得12mg纯的环状产物。所得产品通过分析HPLC(条件梯度，5-50％B10分钟内，其中A＝H2O/0.1％TFA并且B＝CH3CN/0.1％TFA；流速，0.3mL/min；柱子，Phenomenex Luna 3μC18(2)50×2mm柱子；检测，UV214nm；产品保留时间，6.01min)进行分析。进一步的产品鉴定通过采用电喷雾质谱(MH+计算值，1300.7；MH+实测值，1300.6)进行。
序列表<110>Amersham Health AS<120>Angiotensin II analogues<130>PN0380<160>5<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>8<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成肽<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(1)<223>任何氨基酸<220>
<221>misc_feature<222>(2)..(2)<223>Arg、N-烷基化Arg或Arg模拟物<220>
<221>misc_feature<222>(8)..(8)<223>含疏水侧链氨基酸
<400>1Xaa Xaa Val Tyr Ile His Pro Xaa1 5<210>2<211>8<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成的血管紧张素II<400>2Asp Arg Val Tyr Ile His Pro Phe1 5<210>3<211>8<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成肽<400>3
Gly Arg Val Tyr Ile His Pro Ile1 5<210>4<211>8<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成肽<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(2)..(2)<223>甲基化Arg<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(8)..(8)<223>D-Phe<400>4Gly Xaa Val Tyr Ile His Pro Xaa1 5
<210>5<211>8<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成肽<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(8)..(8)<223>Bip-2-氨基-3-联苯基丙酸<400>5Gly Arg Val Tyr Ile His Pro Xaa1 权利要求
1.一种药物，其特征为式(I)Z-(L)n-V (I)其中，V表示具有结合序列-X1-X2-Val-Tyr-Ile-His-Pro-X3的肽，L表示任选的接头，Z表示任选可带有成像部分M的基团，n为0或1，X1表示氨基酸，X2表示Arg或N-烷基化Arg或Arg模拟物，X3表示包含疏水侧链的氨基酸，其中在3位和5位的Val和Ile残基各自可任选被能形成桥的氨基酸置换，Z任选通过接头L与氨基酸X1成键，并且M存在时表示可成像部分，其能在诊断成像程序中被直接或间接检测。
2.权利要求1的药物，所述药物有效治疗心衰、心律失常和其它纤维化突出的疾病并有效治疗COPD、肝脏纤维化和动脉硬化。
3.权利要求1的药物，所述药物用于诊断，其中M为体内可成像部分。
4.权利要求1-3中任一项的药物，其中Z表示式(VII)的螯合剂 其中每个R1、R2、R3和R4独立为H或C1-10烷基、C3-10烷基芳基、C2-10烷氧基烷基、C1-10羟基烷基、C1-10烷基胺、C1-10氟烷基，或2个或多个R基团与连接它们的原子一起形成饱和的或不饱和的碳环或杂环。
5.权利要求1-4中任一项的药物，其中Z表示式(XI)的螯合剂 其中Q1-Q6独立为Q基团，其中Q为H、烷基、芳基或胺保护基团，W1为-NR-、-CO2-、-CO-、-NR(C＝S)-、-NR(C＝O)-、-CONR-或Q基团；每个Y独立为D-或L-氨基酸、-CH2-、-CH2OCH2-或-OCH2CH2O-或X基团；p为数值为1-8的整数；q为数值为0-30的整数；R为H、C1-4烷基、C2-4烷氧基烷基、C1-4羟基烷基或C1-4氟烷基；Q为 A为抗衡离子。
6.权利要求1和3-5中任一项的药物，其中M代表用于Radio或SPECT成像的γ放射部分，包含67Ga、111In、123I、125I、131I、81mKr、99Mo、99mTc、201Tl和133Xe。
7.前述权利要求中的药物，所述药物用于治疗，具有式(X)或式(XII) 式(X) 式(XII)或用作诊断剂，具有式(Xa)或(XIIa)
8.一种药物制剂，所述药物制剂包含权利要求1中所述的式(I)化合物以及一种或多种药学上可接受的添加剂和/或赋形剂。
9.权利要求1的药物的用途，所述用途为治疗和/或诊断心衰、心律失常以及其它纤维化突出的疾病，尤其是COPD、肝脏纤维化及动脉硬化等疾病。
10.一种对受试者的心衰及其它纤维化突出的疾病，尤其是COPD、肝脏纤维化和动脉硬化的体内诊断方法，所述方法包括给予权利要求1中所述的式(I)药物并随后对所述受试者进行局部或全身成像。
11.一种制备式(I)的放射性药用组合物的试剂盒，所述试剂盒包含肽-螯合物缀合物和还原剂。
全文摘要
本发明包含式(I)Z－(L)
文档编号A61P9/10GK1901941SQ200480039758
公开日2007年1月24日 申请日期2004年11月5日 优先权日2003年11月6日
发明者A·库思伯特森, B·因德雷沃尔, M·埃里克森 申请人:通用电气医疗集团股份有限公司