专利名称：来自于植物的β的制作方法
技术领域：
本发明涉及从莲叶中制备的新型肾上腺素β3激动物质。
背景技术：
随着生活习惯的现代化和西方化，肥胖人的比例在世界范围内有增加的倾向。由于肥胖引起了所谓糖尿病、高血压、动脉硬化症的生活习惯病，使死亡率增高，因此肥胖的预防和治疗是公众卫生上重要的课题。肥胖的治疗基本上有食物疗法和运动疗法，但对于这些方法难以改善的病例往往采取利用药物进行的治疗。
肥胖为在脂肪细胞中积累有过剩中性脂肪(甘油三酸酯)的状态。脂肪细胞中存在白色脂肪和褐色脂肪。白色脂肪细胞为广泛分布于皮下、内脏周围等全身的比较大型的细胞，细胞体的大部分被巨大的脂肪滴占据。另一方面，褐色脂肪细胞的存在部位限于肩胛间、腋下部分等，成为脂肪也分成多个小滴的多室结构，与其近邻存在多个线粒体。白色脂肪和褐色脂肪的生理机能有很大不同，白色脂肪是储存多余能量的场所，与此相对，褐色脂肪是通过氧化分解脂肪而将能量作为热释放的场所。积累于白色细胞的脂肪在能量不足时被分解而成为脂肪酸，释放到血中并被全身消耗，但褐色脂肪通过刺激被分解为脂肪酸时，在褐色脂肪细胞内立即被氧化而变成热(非专利文献1/Saito M.，Sasaki N.实验医学Vol.14NO.16，1996)。
已知β3肾上腺素能受体与脂肪分解相关。β肾上腺素能受体分为β1、β2、β3亚型。任何一个都为由约400个氨基酸构成的7次跨膜型受体，β1、β2的氨基酸相同性仅为约50％。β1受体主要存在于心脏等中，β2受体主要存在于支气管平滑肌等中，与此相对，β3受体除了主要存在于脂肪组织中，还存在于肠管、脑等组织中。
已知β3肾上腺素能受体激动剂(激动性物质)会促进脂肪细胞中的cAMP的积累(非专利文献2/医学进展Vol.192NO.52001.1.29)。β3肾上腺素能受体激动剂在促进白色脂肪细胞中的脂肪分解的同时，还活化褐色脂肪细胞。β3肾上腺素能受体的活化除了带来热产生的增加、褐色脂肪的活化、体脂肪的减少等减轻肥胖的效果，还产生胰岛素抵抗性减轻的效果(非专利文献3/J Clin Invest.1996 Jun 15；97(12)2898-904.，Life Sci.1994；54(7)491-8)。到目前为止，作为减肥药和抗糖尿病药已经开发了大日本制药和武田药品工业生产的“AJ-9677”等几个β3肾上腺素能受体激动剂。
另一方面，作为莲科多年草的莲(Nelumbo nucifera)，除了其根可作为食用而被利用之外，种子和叶子等也被广泛用于中药处方和健康食品等中。已知莲叶具有改善肥胖的效果(专利文献1/日本特开平8-198769)，但目前还没有关于莲的对肥胖显示效果的有效成分及其作用的详细报道。
专利文献1日本特开平8-198769非专利文献1Saito M.，Sasaki N.实验医学Vol.14NO.16，1996非专利文献2医学进展Vol.192NO.5，2001.1.29非专利文献3J Clin Invest.1996Jun 15；97(12)2898-904.，Life Sci.1994；54(7)491-8非专利文献4Biochemical Pharmacology，Vol.47，No.3，pp521-529发明内容本发明鉴于此种情况而完成，其目的在于第一是明确莲科植物的有效成分，第二是提供以该有效成分为基础的新型物质、具体地说是提供β3肾上腺素能受体激动性物质。
为了达到上述目的，本发明人等制备莲叶提取物，为了查明改善肥胖效果的有效成分，继续进行了深入努力的研究，结果发现其有效成分之一为槲皮素。槲皮素为广泛存在于植物中的黄酮类的一种，本申请发明人首次发现槲皮素存在于莲中。作为目前关于槲皮素的知识，有报道指出由于使槲皮素作用于大鼠脂肪细胞的结果为cAMP累积，因此暗示槲皮素具有大鼠β肾上腺素能受体激动剂活性(BiochemicalPharmacology，Vol.47，No.3，pp521-529)，但并未证实其对人的β3肾上腺素能受体(β3AR)具有激动剂活性。本发明人等使槲皮素作用于人β3肾上腺素能受体表达细胞和糖尿病模型小鼠来评价其效果，结果具体发现槲皮素作为β3肾上腺素能受体激动剂发挥作用，由此可产生肥胖改善效果和抗糖尿病作用。本发明人等将含有槲皮素的莲叶提取物投予给人糖尿病临界型受试者，实际上确认了对人的体脂肪降低作用。即，本发明人等发现通过配合莲叶制备物，可以开发出对肥胖改善、糖尿病改善具有效果的药品、食品，进而完成了本发明。
即，本发明涉及从莲叶中制备的新型β3肾上腺素能受体激动性物质，更详细地说，涉及下述发明。
(1)由槲皮素构成的β3肾上腺素能受体激动性物质。
(2)上述(1)的物质，其中槲皮素来自于植物。
(3)上述(2)的物质，其中植物为莲科。
(4)用于糖尿病治疗或预防的药剂，其含有上述(1)～(3)任一项所述的物质。
(5)用于肥胖治疗或预防的药剂，其含有上述(1)～(3)任一项所述的物质，且具有脂肪代谢改善效果。
(6)用于糖尿病治疗或预防的食品，其含有上述(1)～(3)任一项所述的物质。
(7)用于肥胖的治疗或预防的食品，其含有上述(1)～(3)任一项所述的物质。
(8)由含有槲皮素的莲制备物构成的β3肾上腺素能受体激动性物质。
图1为表示由莲叶提取物的添加产生的在CHO-K1细胞中cAMP的积累的图。平均值±S.D.(n＝3)图2为表示由槲皮素产生的在CHO-K1细胞中cAMP的积累的图。平均值±S.D.(n＝3)图3为表示由槲皮素和Q3GA(槲皮素3-O-β-D-葡萄糖苷酸)产生的在CHO-K1细胞中cAMP的积累的图。平均值±S.D.(n＝3)图4为表示由莲叶提取物、槲皮素产生的甘油从3T3-L1细胞的释放量的图。平均值±S.D.(n＝3)图5为表示对2型糖尿病模型小鼠投予莲叶提取物时的血糖降低作用的图。平均值±S.D.(n＝10)图6为表示在投予莲叶提取物开始后第25天的2型糖尿病模型小鼠的血糖值的图。平均值±S.D.(n＝10)图7为表示莲叶提取物投予组(人)和对照组(人)的葡萄糖耐量试验的结果的图。将相对于葡萄糖负荷前血糖值的各经过时间后的血糖值作为葡萄糖相对值(％)。平均值±S.D.S组(无效对照)n＝30，T组(莲叶提取干燥物1g/日)n＝34，R组(莲叶提取干燥物2g/日)n＝31。
具体实施例方式
本发明提供由槲皮素构成的β3肾上腺素能受体激动性物质。本发明以下述发现为基础即如上所述，发现莲叶提取物中含有槲皮素作为有效成分，并且发现该槲皮素具有β3肾上腺素能受体激动活性。
槲皮素，正式地是称为3，3’，4’，5，7-五羟基黄酮(3，3’，4’，5，7-pentahydoroxyflavone)，CAS号为117-39-5，是广泛存在于植物界的黄酮类的一种。其性状为黄色微细针状晶体、熔点为316～317℃、且含有2分子结晶水。其不溶于冷水，稍可溶于热水，易溶于热醇和冰醋酸，难溶于冷醇和醚。由于3位、7位或两个部位结合有多种糖，因此可见多个糖苷，在植物中槲皮素主要以糖苷形式存在(生化学辞典(第3版)东京化学同人、化学大辞典东京化学同人)。这样，通常槲皮素是指未被糖苷化的状态(苷元)，但本说明书中的“槲皮素”，只要作为β3肾上腺素能受体激动性物质发挥功能，则并不仅限于上述非糖苷(3，3’，4’，5，7-五羟基黄酮)，也可以包括槲皮素糖苷。作为糖苷的例子，可列举出槲皮素-3-葡萄糖苷酸、槲皮素-3-葡萄糖苷(异槲皮苷)、槲皮苷、槲皮黄苷、芸香苷等。其中，槲皮素-3-葡萄糖苷酸也标记为quercetin3-O-β-D-glucuronide、Q3GA，分子量为478，熔点为182～195℃，CASNo.22688-79-5。本发明人等实际上确认了作为槲皮素糖苷的Q3GA具有β3肾上腺素能受体激动活性。这种糖苷是否具有β3肾上腺素能受体激动活性，可根据刺激β3肾上腺素能受体时细胞内的cAMP积累促进来确认。更具体地说，作为β3肾上腺素能受体激动性物质的活性，如实施例所示，在可以使β3肾上腺素能受体表达的细胞中添加被测物质，通过测定cAMP的积累来确认。cAMP活性可通过EIA法、ELISA法、RIA法等本领域技术人员周知的免疫分析进行测定。还可以使用市售的试剂盒。
另外，只要是槲皮素，则不限定来源的植物种类、植物部位，都可制成本申请发明的由槲皮素构成的β3肾上腺素能受体激动性物质。本发明是从莲叶提取物中发现的，但只要具有β3肾上腺素能受体激动活性，则可以包括从莲以外的植物制备的槲皮素。例如，作为含有槲皮素的植物，现在已知有洋葱、花椰菜、茶、银杏叶、菠菜、羽衣甘蓝、欧芹、旱芹、抱子甘蓝、芦笋、苹果、梨、番石榴叶、豆类、青椒、Jew’s mellow、柑桔、草莓等。除此以外，还包含在莲所属的莲科植物、近缘的睡莲属、芡属、萍蓬草属、莼菜属中。另外，已知在荞麦、番茄中存在芸香苷。因此，作为β3肾上腺素能受体激动性物质的槲皮素可从这些植物中得到。作为从植物制备槲皮素的一例，可以列举出后述实施例所示的从莲叶中提取槲皮素的例子。
作为用于得到槲皮素的植物部位的代表例，可以列举出叶子，但只要是含有槲皮素的部位，则也可使用花、根、茎、果实、果皮、树皮、根茎、块茎、种子、柱头、树液、精油等其他部位。根据植物不同也可以使用不同部位。
另外，上述槲皮素可以利用本领域技术人员公知的方法从植物中有效地进行精制。例如，可将植物原样或粉碎、切断处理，在该植物(或植物处理物)中添加水或乙醇等溶剂进行提取，根据公知的槲皮素性状，利用液相色谱法等本领域技术人员的技术常识，从该提取液中进行精制。作为从植物中的分离例，在Rangaswami et al.，Proc.IndianAcad.Sci.56A，239(1962)中报道了从Rhododendron cinnabarinum hook，Ericaceae中分离了槲皮素。从豆类中分离Q3GA的例子在Price KR et al.，J AgricFood Chem，46(12)，4898-4903(1998)中有所记载。另外，除了来自于植物的精制品以外，从植物以外的天然物等精制得到的物质、化学合成的物质、使用微生物进行生物学合成的物质等也可用作本申请发明的由槲皮素构成的β3肾上腺素能受体激动性物质。除了植物以外，已知槲皮素还存在于蜂胶和红葡萄酒中。作为生物合成的例子，已知有Watkin et al，ibid.229；Grisebach，Biochem.J.85，3p(1962)；Patschke et al.，Z.Naturforsch.21b，201(1966).Synthesis；Shakhova et al.，Zh.Obshch.Khim.32，390(1962)，C.A.58，1426f(1963)。另外，Q3GA的合成例在Tetrahedron Letters，43(35)，6263-6266(2002)和Moon，Jae-Haka et al.，FreeRadical Biology & Medicine，30(11)，1274-1285(2001)中有报道。
由于槲皮苷对人、小鼠的受体的上述β3肾上腺素能受体激动活性可确认，因此可用作对这些人、包括小鼠等啮齿类的哺乳动物的β3肾上腺素能受体的激动剂(激动性物质)。据报道β3肾上腺素能受体激动剂具有在促进白色脂肪细胞中脂肪分解促进的同时活化褐色脂肪细胞的作用、增加热的产生、活化褐色脂肪、以减少体脂肪等为基础的减肥、减轻胰岛素抵抗性等的效果。因此，本发明的槲皮素可特别用作用于肥胖的治疗或预防的药剂、用于糖尿病的治疗或预防的药剂。另外，除此之外，也可以根据β3肾上腺素能受体激动性而用于疾病的治疗。当将槲皮素用作上述β3肾上腺素能受体激动剂时，从上述植物中收集到的槲皮素可直接使用，并且在不损害作为β3肾上腺素能受体激动剂活性的范围内，或者为了进一步有效利用该活性，还可在从植物等中收集后实施修饰。槲皮素没有必要一定进行精制，只要含有槲皮素，就可将植物等的提取液、提取干燥物、以及将植物等制成粉末状等的植物等制备物作为由槲皮素构成的β3肾上腺素能受体激动性物质。
本发明提供含有由槲皮素构成的β3肾上腺素能受体激动性物质且用于糖尿病治疗或预防的药剂和食品。糖尿病以胰岛素作用不足导致的持续高血糖为特征，是发病与遗传因素和环境因素相关的疾病群。其成因和病理并非单一，糖尿病根据发病原因或胰岛素作用不足的程度而分类。根据发病原因分类为1型糖尿病、2型糖尿病、其他特定型和妊娠糖尿病。1型糖尿病以胰脏胰岛β细胞的破坏作为发病的特征。2型糖尿病中，胰岛素分泌下降和胰岛素敏感性降低(胰岛素抵抗性)两者与发病有关。伴有其他疾病的类型等被分类为其他特定型。根据胰岛素作用不足程度分类为胰岛素依赖状态、胰岛素非依赖状态。胰岛素依赖状态中1型占多数。胰岛素非依赖型种2型占多数，并且，分类为对于高血糖改善而需要胰岛素治疗的状态和不需要胰岛素治疗的状态。如上所述，已知β3肾上腺素能受体的活化产生胰岛素抵抗性减轻的效果，因此含有作为β3肾上腺素能受体激动性物质的槲皮素的药剂可用于糖尿病的治疗或预防。作为本发明的药剂是有效的糖尿病，可列举出2型糖尿病，但只要是含有由槲皮素构成的β3肾上腺素能受体激动性物质的药剂、且以糖尿病的治疗或预防为目的，则对其他型糖尿病有效的药剂也包含在本发明中。
药剂、食品是否对糖尿病有效，如本发明的实施例所示，可通过将药剂投予给患有糖尿病的受试动物、并测定该受试动物的血糖值来了解。在药剂投予组和对照组之间比较药剂投予前后的随时间变化的血糖值或空腹时血糖值，如果药剂投予组的血糖值低于对照组，则该药剂对糖尿病有效。作为受试动物，可以使用II型糖尿病自然发病模型动物(例如KK-Ay小鼠)、高脂肪食物负荷肥胖模型动物。另外，还可使用链脲佐菌素投予而引发的人为发病模型动物、I型糖尿病自然发病模型动物。
进而，本发明提供含有由槲皮素构成的β3肾上腺素能受体激动性物质且具有脂肪代谢改善效果的用于肥胖的治疗或预防的药剂和食品。如上所述，由于β3肾上腺素能受体激动性物质具有脂肪代谢效果，因此作为β3肾上腺素能受体激动性物质的槲皮素可用作用于人的肥胖的治疗或预防的药剂。如后述实施例所示，本发明人等实际上确认了含有槲皮素的莲叶提取干燥物对人和小鼠具有脂肪代谢改善效果。含有槲皮素的莲叶提取干燥物不仅对人，对于包括小鼠等啮齿类在内的哺乳动物，作为肥胖治疗或预防用药剂和食品都是有用的。将含有槲皮素的莲叶提取干燥物用于肥胖治疗或预防来使用时，只要在可安全且有效摄取的范围内，摄取量没有限制。如果列举出摄取量的例子，则在对象为人的情况下，摄取量可为0.01g/日～100g/日、优选为0.1g/日～10g/日。如果表示为含有苷元和糖苷的槲皮素量，则优选范围的例子是摄取量为0.88mg/日～8.82g/日、优选为8.82mg/日～0.88g/日。体外的脂肪代谢改善效果例如可通过在脂肪细胞中添加被测物质来测定作为脂肪分解物的甘油量进行评价。甘油量可如下得到通过甘油激酶等进行分解并最终测定吸光度，由此得到。如果由于被测物质导致细胞中甘油量增加，则可评价为被测物质存在脂肪代谢改善效果。另外，关于体内效果，对受试动物的一部分的组给予高脂肪食物和被测物质，在另一组不给予被测物质而仅给予高脂肪食物，在其他条件相同的情况下饲养两动物组一定期间后，比较动物组的内脏脂肪量，由此进行评价。给予了被测物质的组的内脏脂肪量如果少于仅给予高脂肪食物的组，则可评价为被测物质存在脂肪代谢改善效果。
当将由槲皮素构成的β3肾上腺素能受体激动性物质制剂化而制成药品时，可根据治疗目的和给药途径等选择剂型，例如可列举出片剂、丸剂、散剂、液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、胶囊剂、注射剂、栓剂、西也剂、糖浆剂、浸剂和煎剂、酊剂等。并且，为了制剂化，根据需要可使用填充剂、增量剂、粘合剂、保湿剂、崩解剂、表面活性剂、润滑剂等稀释剂或赋形剂。另外，在该医药制剂中还可以含有着色剂、保存剂、香料、调味剂、甜味剂等其他药品。
作为含有由槲皮素构成的β3肾上腺素能受体激动性物质的食品形态，例如可列举出茶、健康茶、健康食品、特定保健用食品、营养辅助食品、经肠营养食品等。适当添加并混合由槲皮素构成的β3肾上腺素能受体激动性物质和食品卫生上允许的配合物、如稳定剂、保存剂、着色剂、香料、维生素等配合物，根据常法可制成片剂、粒状、颗粒状、粉末状、胶囊状、液状、膏状、饮料等食品。莲等含有槲皮素的植物可以优选用作在制造这些药品和食品时的含有由槲皮素构成的β3肾上腺素能受体激动性物质的原料。从植物中制备由槲皮素构成的β3肾上腺素能受体激动性物质的方法如上所述。详细制备法的一例示于后述实施例。
另外，本发明中引用的所有现有技术文献作为参考编入本说明书中。
实施例以下通过实施例更详细的说明本发明，但本发明并不受这些实施例的限制。
莲叶提取物的制造法在1kg干燥莲叶中加入10L水。将pH调整至6.0，室温下静置30分钟。其后，在减压、90℃下沸腾提取1小时。分离滤液(i)和残渣，在残渣中加入10倍量的水，在减压、90℃下沸腾提取1小时。分离滤液(ii)和残渣，合并滤液(i)和滤液(ii)。在减压下通过加热浓缩，浓缩至比重为1.1后，使用喷雾式干燥器得到约100g的干燥粉体。
槲皮素和槲皮素糖苷的鉴定和精制利用LC/MS分析莲叶提取物。色谱柱使用Capcell Pak C18 UG120Φ2.0×150mm(资生堂)。流动相选择A液(含有1％醋酸的5％乙腈水溶液)和B液(含有1％醋酸的乙腈)，在30分钟内加以从A液到B液的直线浓度梯度，进行洗脱。反相HPLC条件为，柱温40℃、进样量5μL、洗脱速度200μL/min。离子化采用ESI法(阴性)进行。标准品使用市售槲皮素(和光纯药工业(株)槲皮素二水合物)、市售槲皮苷(槲皮素-3-鼠李糖苷)(东京化成工业(株))和市售异槲皮苷(槲皮素-3-葡糖苷)(EXTRASYNTHESE公司)，同样进行分析。
RT16.4min，m/z301的峰与标准品的RT和m/z一致，因此确认在莲叶提取物中存在槲皮素(分子量为302)。同样，确认了在莲叶提取物中槲皮苷(分子量为448)的存在(RT13.8min，m/z447)和异槲皮苷(分子量为464)的存在(RT12.9min，m/z463)。并且，推测RT13.2min，m/z477的峰为槲皮素-3-葡萄糖苷酸(Q3GA)(分子量为478)。
从莲叶提取物中精制Q3GA和结构确定如下进行。
首先，使用500mL超纯水(MilliQ水)溶解1g莲叶提取物，用6N盐酸将pH调整至3。用500mL乙酸乙酯提取3次，用无水硫酸镁进行脱水。减压下浓缩该乙酸乙酯层，得到酸性馏分(147mg、收率为14.7％)。接着，将上述酸性馏分分成30份、每份5mg，使用HPLC进行精制。HPLC的精制条件如下。精制用色谱柱使用Capcell Pak C18UG120Φ20×250mm(资生堂)。柱温40℃、进样量200μL。流动相使用含有1％醋酸的50％乙腈水溶液，以规定的洗脱速度(5mL/分)进行洗脱，在360nm下进行检测。利用该条件得到含有Q3GA的馏分(63.1mg、收率为42.1％)。进一步使用Sephadex LH-20(Φ12×350mm、甲醇)精制上述馏分，得到推测为Q3GA的化合物(13.5mg)。
接着，利用NMR对所得化合物进行解析。测定1H-NMR、13C-NMR、DEPT、H-HCOSY、HMQC和HMBC，与文献值(J.Agric.Food Chem.，46，pp.4898-4903(1998))比较，结果是由于测定值与Q3GA的文献值一致，因此确认莲叶提取物中存在Q3GA。
另外，计算如上制备的莲叶提取干燥物中的槲皮素及其糖苷的浓度，苷元(槲皮素)及其糖苷整体为88.2mg/g。
人β3肾上腺素能受体表达重组体细胞的制作人β3肾上腺素能受体cDNA以来自于人小肠的cDNA文库(宝酒生产)为模板、通过以如下所示的合成寡DNA为引物的PCR法来合成。
5’端寡引物ccgctagccaccatggctccgtggcctcacgagaag(序列号1)3’端寡引物ccgaattctacccgtcgagccgttggcaaag(序列号2)PCR合成的cDNA使用丙烯葡聚糖凝胶(Sephacryl)S-300脱盐并将未反应的引物除去后，使用通过在引物设计时预先插入在末端的限制性酶位点NheI和EcoRI进行消化、进而通过SpeI和EcoRI限制性酶进行消化的动物表达遗传媒介(vector)的pTracer-EF A(Invitrogen)和连接反应试剂盒(宝酒生产)进行连接反应。连接反应后的DNA用乙醇沉淀，混悬于适当量的10％甘油水溶液。使用该DNA溶液利用电穿孔法将大肠菌DH5α株进行转化。操作后的细胞接种于含有氨苄青霉素的LB琼脂平板培养基，在37℃下培养一夜，得到转化体的菌落。用Applied Biosystems公司的自动测序仪确认10个转化体中的人β3肾上腺素能受体cDNA的碱基序列，从而选择正确的人β3肾上腺素能受体cDNA插入至动物表达用遗传媒介而形成的复合质粒。
上述人β3肾上腺素能受体表达用复合质粒通过利用大肠杆菌细胞的碱溶解法(Sambrook & Russell，Molecular Cloning，3rd Edition)进行提取、精制。精制的复合质粒转染至作为中国仓鼠卵巢细胞的CHO-K1细胞中。转染是通过使用了TransIT-LT1试剂(宝酒生产)的脂质体转染法(lipofectin method)进行的。相对于在10cm的皿中以20～30％细胞密度增殖的细胞，加入与10μg复合质粒混合的TransIT-LT1，使其进入细胞中。转染处理后，在添加了10％胎牛血清(以下略写为FCS)的Dulbecco’s modified Eagle培养基(以下略写为DMEM)(Sigma)中、37℃和5％CO2条件下培养细胞3天，其后换为以500μg/mL添加有Zeocin(invetrogen)的DMEM培养基，在同样条件下进行培养。用胰蛋白酶将在Zeocin的存在下生成并形成了菌落的细胞剥离，进而用含有Zeocin和10％FCS的DMEM培养基使其增殖。
所得重组体细胞在96孔微板中进行培养，以使达到100％的细胞密度。除去培养基，用Dulbecco’s modified磷酸缓冲液(以下略写为PBS)(宝酒生产)洗涤细胞一次，添加100μL含有10μM异丙肾上腺素的分析用缓冲液(DMEM、10％FCS、20mMHEPES(pH为7.2)、0.1mM异丁基甲基黄嘌呤)。此时的对照为不含异丙肾上腺素的分析用缓冲液。在37℃下培养20分钟后用PBS洗涤细胞一次，供于使用了cAMP定量用EIA试剂盒(Amersham Bioscience)的细胞内cAMP的定量。其结果是选择了通过作为β肾上腺素能受体激动剂的异丙肾上腺素的添加、细胞内cAMP量大大上升的重组体细胞。进一步培养所选的重组体细胞，利用胰蛋白酶剥离后用培养用的培养基稀释，分注入96孔微板中，每孔1个细胞。进一步培养这些细胞，通过同样的操作确认对异丙肾上腺素的反应性，由此进行反应性良好的重组体细胞的纯化，最终得到1个人β3肾上腺素能受体表达重组体6H-4d3。
人β3肾上腺素能受体激动剂活性的测定人β3肾上腺素能受体表达重组体6H4-2d3在96孔微板中、利用含有10％FCS和500μg/mL Zeocin的DMEM培养基、于37℃下、5％CO2的条件下培养。培养2～3天，生长到约100％的细胞密度后，除去培养基，用PBS洗涤细胞一次，将添加有要测定的检体的分析用缓冲液(DMEM、10％FCS、20mMHEPES(pH为7.2)、0.1mM异丁基甲基黄嘌呤)以100μL/孔进行添加。在37℃下培养10分钟后用PBS洗涤细胞一次，供于使用了cAMP定量用EIA试剂盒(Amersham Bioscience)的细胞内cAMP的定量。作为阴性对照，使用仅为分析用缓冲液、或用在分析用缓冲液中等量添加了溶解有检体的溶剂的溶液处理过的6H4-2d3细胞；作为阳性对照，使用用异丙肾上腺素处理过的6H4-2d3细胞。另外，为了确认通过对人β3肾上腺素能受体的特异性反应是否引起了细胞内cAMP的上升，对作为6H4-2d3细胞的亲本细胞的CHO-K1细胞也进行了完全相同的处理，确认了细胞内cAMP的变化。测定是对同一检体进行3次测定，使用了平均值和标准偏差。
为了研究莲叶提取干燥物的β3肾上腺素能受体激动剂活性，将莲叶提取干燥物作为检体，进行上述测定。即，以0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL的浓度在被测培养基中添加莲叶提取干燥物，观察对使人β3肾上腺素能受体表达的CHO-K1细胞和不表达的CHO-K1细胞的反应。另外，作为阳性对照，放有1μM异丙肾上腺素。其结果可知，通过莲叶提取干燥物的添加，可见仅在使人β3肾上腺素能受体表达的CHO-K1细胞中cAMP显著积累，表明具有β3肾上腺素能受体激动剂活性。结果示于图1中。
另外，为了对槲皮素的人β3肾上腺素能受体激动剂活性也进行研究，将槲皮素作为检体，同样进行测定。以15μM、30μM、60μM的浓度在被测培养基中添加作为莲叶提取干燥物主成分的槲皮素，观察对使人β3肾上腺素能受体表达的CHO-K1细胞和不表达的CHO-K1细胞的反应。另外，作为阳性对照，放有2μM异丙肾上腺素。其结果可知，通过槲皮素的添加，可见仅在使人β3肾上腺素能受体表达的CHO-K1细胞中cAMP显著积累，表明槲皮素具有β3肾上腺素能受体激动剂活性。结果示于图2中。
对Q3GA也进行了关于β3肾上腺素能受体激动剂活性的研究。以1μM、10μM、100μM、1000μM的浓度在被测培养基中添加Q3GA，观察对使人β3肾上腺素能受体表达的CHO-K1细胞的反应。为了比较，对槲皮素也进行了同样操作。另外，作为阳性对照，使用了异丙肾上腺素。其结果可知，糖苷Q3GA的添加，具有与作为苷元的槲皮素同样的β3肾上腺素能受体激动剂活性。结果示于图3中。
使用了3T3-L1细胞的脂肪分解作用的测定将作为来自于小鼠的前体脂肪细胞的3T3-L1细胞(购自HumanScience Research Bank)以1×104/孔加入至96孔板中，在添加10％胎牛血清(FCS)的Dulbecco’s modified Eagle培养基(D-MEM，GIBCO公司生产)中，在5％CO2存在下、37℃下培养。在细胞刚要融合前，换为添加了0.5mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、2×10-7M地塞米松和0.8μM胰岛素的含10％FCS的D-MEM，诱导向脂肪细胞的分化。2天后换为仅添加了0.8M胰岛素的含10％FCS的D-MEM，之后每2～3天更换培养液继续培养，使其向脂肪细胞分化。其后，换为含10％FCS的D-MEM培养2天。将在96孔板中培养的该细胞的培养液吸除，以100μL/孔添加含有被测物的含10％FCS的D-MEM，培养3天后，每孔各取80μL培养液，使用“F-试剂盒甘油”(Boehringer Mannheim公司生产)测定培养液中的甘油量。平均值的显著性检验通过Student’s t-test进行，p＜0.05为有显著性。
为了研究莲叶提取干燥物和槲皮素的脂肪细胞中的脂肪分解作用，进行了上述测定。被测培养基中添加0.5～500μg/mL的莲叶提取干燥物、0.5～500μM的槲皮素，作为阳性对照的10-8M～10-5M的异丙肾上腺素，蓄积在脂肪细胞3T3-L1中的脂肪被分解，测定释放到培养基中的甘油量。其结果可知，加入500μg/mL的莲叶提取干燥物、5μM～500μM的槲皮素会显著促进脂肪分解。结果如图4所示。
预备培养Wistar系雌性5周龄大鼠4天后，进行分组，以使大鼠的平均体重几乎相同。分组为每组8只，分为以下4组一般食物摄取组、高脂肪食物组、高脂肪食物+莲叶提取物0.01g/g摄取组(每1g高脂肪食物的莲叶提取物为0.01g，以下相同)、高脂肪食物+莲叶提取物0.05g/g摄取组。高脂肪食物组的饲料中添加了淀粉、蔗糖、猪油(10％)、玉米油(5％)、胆固醇(1％)。各组饲养2周后解剖。在解剖开始6小时前拿去饲料，使其绝食。摘出腹腔内脂肪，测定重量。每100g体重的腹腔内脂肪分别为一般食物摄取组2.2340±0.6427g、高脂肪食物摄取组3.9071±1.2562g、高脂肪食物+莲叶提取物0.01g/g摄取组3.5564+0.8805g、高脂肪食物+莲叶提取物0.05g/g摄取组2.7745+0.9099g。上述测定值均为平均值±S.D.。
莲叶提取物对2型糖尿病模型小鼠KK-Ay小鼠的血糖降低作用对2型糖尿病模型小鼠雄性4周龄的KK-Ay小鼠进行3天的预备饲养后，根据体重以每组10只分为2组。分组后测定血糖值。溶剂对照组中饮用自来水，莲叶提取物给水组中饮用以10mg/ml溶解有莲叶提取干燥物的莲叶提取物水。饮水自由摄取。另外，饲料(CRF-1)也自由摄取。每周进行血糖值的测定。血糖值的测定在6小时的绝食后进行。并且，也同时测定投予开始后第25天的非绝食下的血糖值。结果示于图5、6。
莲叶提取干燥物对高脂肪食物负荷肥胖小鼠的肥胖改善效果的研究8-(1)实验材料及实验方法对高脂肪食物负荷小鼠投予莲叶提取干燥物作为被测物质，研究其影响。从日本CLEA株式会社购入雌性6周龄的ICR小鼠，在与试验同样的饲养环境下进行14天的检疫和驯化饲养。将40只在投予开始日检疫和驯化期间中体重增加正常、一般状态中未见异常的动物用于试验，通过以体重分层随机取样法为基准的方法进行分组。试验组构成为下列4组，每组10只，A组基本饲料摄取组、B高脂肪食物摄取组、C组含2％莲叶提取干燥物的高脂肪食物摄取组、D组含5％莲叶提取干燥物的高脂肪食物摄取组。同组的小鼠每5只1个笼子，各组2个笼子进行饲养。基本饲料使用粉末饲料CE-2(日本CLEA株式会社)。关于其他饲料高脂肪食物、含莲叶提取干燥物的高脂肪食物，示于表1。表中的数值表示制备1kg总量的混合饲料时的各混合量。
表1高脂肪食物的制备和被测物质的称取量
所有组中，喂食方法为将饲料放在粉末喂食器中自由摄取。给水为将自来水放在给水瓶中，通过喷嘴自由摄取。在上述条件下将被测物质投予给小鼠，连续进行10周，对该小鼠进行一般状态观察、体重测定、摄食量测定、解剖学检查，得到以下结果。以下结果所示的数据中，体重、摄食量和器官重量以平均±标准偏差(mean+S.D.)表示。基本饲料摄取组与高脂肪食物摄取组的显著性差异检验和高脂肪食物摄取组与被测物质摄取组的显著性差异检验通过Student’s t-test或多重比较检验(Dunnett’s test)进行。
8-(2)一般状态观察一般状态观察为1日1次对每个笼子进行。整个试验期间中，各个体的一般症状中未见任何异常。
8-(3)体重体重是使用电子上皿天平，每周1次在被测物质刚要投予前和投予后进行测定。将各组的结果分别示于表2中。
表2小鼠高脂肪食物耐量试验的体重(g)
各值表示平均±标准偏差(n＝10)。
*p＜0.05、**p＜0.01(基本饲料组vs高脂肪食物组Student’s t-test)#p＜0.05、##p＜0.01(高脂肪食物组vs高脂肪食物+莲叶提取干燥物投予组Dunnett’s test)
为了研究高脂肪食物导致的影响，比较A组(基本饲料摄取组)和B组(高脂肪食物摄取组)，在试验开始后两组的体重都正常增加，但B组体重比A组体重增加较多。从试验开始2周后至结束时，两组的体重值有显著性差异，试验结束时在两组之间产生平均为6.9g的差异(A组39.3±3.0g、B组46.2+5.6gp＜0.01)。
为了研究莲叶提取干燥物导致的影响，比较B组和C组(含有2％莲叶提取干燥物的高脂肪食物摄取组)、D组(含有5％莲叶提取干燥物的高脂肪食物摄取组)，任何组在试验开始后体重增加都正常，但C组和D组的体重增加量有少于B组的倾向。特别是在D组中，在试验开始5、7、8和9周后的时间点与B组之间有显著性差异，确认了莲叶提取干燥物的体重增加抑制作用。
8-(4)摄食量摄食量在被测物质投予后1周2次、即每3天或4天进行测定。使用电子上皿天平测定每个笼子包括喂食器的重量，从喂食量中减掉剩余食量进行计算。
每个笼子求出的每只每日平均摄食量示于表3。各笼子n＝5、各组n＝10。
表3各饲养笼每只的平均摄食量
A组的每只每日平均摄食量为5.2～7.9g/日，B组的每只每日平均摄食量为3.0～6.8g/日，C组的每只每日平均摄食量为2.7～6.1g/日，D组的每只每日平均摄食量为3.1～5.6g/日。很明显，A组的摄食量多于其它组。B～D组有试验开始前半段(第二周左右)的摄食量多、后半段(第6周后)的摄食量少的倾向，但未见B～D各组的特异性变化。
8-(5)器官重量从试验开始至10周后的观察期间结束时，解剖小鼠，测定器官重量(肝、肾、脂肪湿重量)。结果示于表4。各组n＝10。
表4小鼠的高脂肪食物耐量试验在试验结束时的器官重量
各值表示平均±标准偏差。
*p＜0.05、**p＜0.01(基本饲料组vs高脂肪食物组Student’s t-test or Aspin-Welch’s t-test)#p＜0.05、##p＜0.01(高脂肪食物组vs高脂肪食物+莲叶提取干燥物投予组Dunnett’s test)为了研究高脂肪食物导致的影响，比较A组和B组，肝脏重量未见有显著性差异，但肾脏重量在B组中显著地轻、脂肪重量在B组中显著地重。
为了研究莲叶提取干燥物导致的影响，比较B组和C组、D组，肝脏和肾脏重量未见显著性差异，但脂肪重量在C组和D组都显示低值。特别是可见D组与B组之间的显著性差异，可见脂肪减少作用。
8-(6)总结如上所述，在2％莲叶提取干燥物摄取组中可见体重增加抑制倾向，但不是显著的作用，另一方面，在5％莲叶提取干燥物摄取组中可见显著的体重增加抑制。但是，由于摄食量存在一些差异，因此有必要研究体重减少是由摄食量导致的效果、还是由莲叶提取干燥物导致的效果。所以，当从各组在试验结束时的体重增加量和试验中的总摄食量求出用于增加1g体重所需的饲料的量时，高脂肪食物摄取组为19.1g、2％莲叶提取干燥物摄取组(高脂肪食物+2％莲叶提取干燥物)为20.2g、5％莲叶提取干燥摄取组(高脂肪食物+5％莲叶提取干燥物)为22.7g，确认有依赖于用量而增加的倾向。因此，可得出以下结论在本实施例中所观察的体重增加抑制是由莲叶提取干燥物导致的效果。另外，解剖时的脂肪重量在2％莲叶提取干燥物摄取组中有减少的倾向、在5％莲叶提取干燥物摄取组中有显著的脂肪重量减少，这是可支持上述结论的结果。
莲叶提取干燥物对人的糖代谢和脂质代谢的作用9-(1)实验材料和实验方法本实施例的目的在于研究莲叶提取干燥物对人的糖代谢和脂质代谢的影响。每次进行上述目的研究时，人受试者必须满足一定条件。本实施例的受试者所应满足的条件如下所示。
(1)是所谓的临界型，即空腹时血糖值为110～126mg/dl或75g葡萄糖耐量试验(OGTT)的2小时血糖值为140～200mg/dl。由于空腹时血糖值在126mg/dl或以上或75g OGTT 2小时值为200mg/dl或以上即变为糖尿病型，因此从本实施例的受试者中去除。
(2)BMI(Body Mass Index)为22或以上。BMI也被称为体格指数，是指体重(kg)除以身高(m)的平方而得到的数值。BMI＝体重(kg)÷身高(m)2。
(3)没有糖尿病的药物治疗经验。
(4)未患有严重的肝功能障碍、肾功能障碍、心血管功能障碍、食物过敏疾病。
(5)年龄为男性40～58岁、女性40～55岁、且进行与健康人同样的日常生活。
(6)一日的茶饮料在2L或以下。
在满足以上6条件的人中实施调查等来选择受试者。在调查和问诊表中，对A.一日卡路里摄取量、B.饮食的嗜好、C.以往病史、家族史、工作及生活环境、运动习惯、吸烟和饮酒进行询问。
选拔了满足上述受试者条件的95名受试者。使所选受试者分组为莲叶提取干燥物摄取组2组(T组、R组)、无效对照摄取组(S组)的3组，以使在年龄、性别、空腹时血糖值上没有差别。作为对照组，将摄取不含莲叶提取物的基础茶饮料(200ml/瓶)的组作为S组，作为被测物质摄取组，将摄取含有0.5g/200ml莲叶提取干燥粉末的茶饮料的组作为T组、将摄取含有1.0g/200ml莲叶提取干燥粉末的茶饮料的组作为R组。各组的构成和平均年龄示于表5。S组(无效对照)n＝30，T组(莲叶提取干燥物1g/日)n＝34，R组(莲叶提取干燥物2g/日)n＝31。
表5人试验组构成及平均年龄
试验以将无效对照作为对照的双盲检验法进行。受试者在摄取被测食品前的2周观察期间后，将上述茶饮料分为上午和下午、每日2瓶(200ml×2/日)进行摄取，历时12周。对受试者实施身体测定和糖耐量试验，研究莲叶提取干燥物的影响。
9-(2)身体测定对各受试者，在摄取前、摄取6周后、摄取12周后的各时间点实施身体测定。测定项目测定了身高、体重、腰围、BMI、臀围、体脂肪率、内脏脂肪水平。体脂肪率和内脏脂肪水平的测定使用OmronBody Composition Monitor HBF-352进行实施。内脏脂肪水平10相当于内脏脂肪面积100cm2。
结果示于表6和表7。在表6和表7中，S组(无效对照)n＝30，T组(莲叶提取干燥物1g/日)n＝34，R组(莲叶提取干燥物2g/日)n＝31。
表6人试验(体格指数1)平均值±S.D.
p＜0.05#[S vs R]p＜0.05*(Dunnett’s test)
表7人试验(体格指数2)平均值±S.D.
p＜0.05#[S vs R]p＜0.05*(Dunnett’s test)通过摄取6和12周2g/日的莲叶提取干燥物，体重、BMI、体脂肪率、内脏脂肪水平、腰围、臀围与对照组相比显著降低，可确认莲叶提取干燥物导致的降低作用。另外，通过摄取6周1g/日的莲叶提取干燥物，与对照组相比，体重、体脂肪率显著降低。12周的摄取中，体重、BMI、体脂肪率、内脏脂肪水平、腰围与对照组相比显著降低。
9-(3)糖耐量试验对各受试者在摄取前、摄取12周后实施2次糖耐量试验(75g葡萄糖/人)。受试者避免在采血前夜晚上21点后进食。试验当天，最初在空腹状态下采血，作为葡萄糖负荷前的血液。接着负荷75g葡萄糖，随时间变化采集负荷30、60、90分钟后的血液。试验在上午11点之前完成。使用日立自动分析装置7075测定血浆中的血糖值。
结果如图7所示。在图7中，将相对于葡萄糖负荷前血糖值的各经过时间后的血糖值作为葡萄糖相对值(％)表示。以各经过时间的葡萄糖相对值为基础求出0～120分钟的AUC(Area Under Curve)。S组(无效对照)n＝30，T组(莲叶提取干燥物1g/日)n＝34，R组(莲叶提取干燥物2g/日)n＝31。通过摄取12周的莲叶干燥提取物，可见葡萄糖负荷30分钟后及60分钟后的血糖上升抑制。
9-(4)总结如上所述，与动物试验相同，对人也可见莲叶提取干燥物导致的体脂肪降低作用，对于人，通过摄取6周2g/日的莲叶干燥提取物，体脂肪量降低，反映为体重的降低。另外，摄取12周1g/日时也得到同样效果。由这些效果和葡萄糖耐量试验的结果认为，在降低体脂肪量的同时有减轻胰岛素抵抗性的作用。
综上所述，通过本发明，能够提供槲皮素作为β3肾上腺素能受体激动性物质。本发明的物质可特别用作改善肥胖、糖尿病治疗的新的选择。
序列表<110>明治乳业株式会社<120>来自于植物的β3肾上腺素能受体激动性物质及其利用<130>M1-A0302P<150>JP 2003-374836<151>2003-11-04<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>36<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>An artificially synthesized primer sequence<400>1ccgctagcca ccatggctcc gtggcctcac gagaag 36<210>2<211>31<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>An artificially synthesized primer sequence<400>2ccgaattcta cccgtcgagc cgttggcaaa g 3权利要求
1.一种由槲皮素构成的β3肾上腺素能受体激动性物质。
2.如权利要求1所述的物质，其中槲皮素来自于植物。
3.如权利要求2所述的物质，其中植物为莲科。
4.一种用于糖尿病治疗或预防的药剂，其含有权利要求1～3任一项所述的物质。
5.一种用于肥胖的治疗或预防的药剂，其含有权利要求1～3任一项所述的物质，且具有脂肪代谢改善效果。
6.一种用于糖尿病治疗或预防的食品，其含有权利要求1～3任一项所述的物质。
7.一种用于肥胖的治疗或预防的食品，其含有权利要求1～3任一项所述的物质。
8.一种由含有槲皮素的莲制备物所构成的β3肾上腺素能受体激动性物质。
全文摘要
本发明制作莲叶提取物，发现其有效成分之一为槲皮素。并且，使槲皮素作用于人β
文档编号A61P3/04GK1902189SQ200480039800
公开日2007年1月24日 申请日期2004年11月4日 优先权日2003年11月4日
发明者坪井洋, 池上秀二, 神山智敬, 纪再思, 浅见幸夫, 伊藤裕之, 小田宗宏, 进和男 申请人:明治乳业株式会社