影响血管发生的多肽、蛋白质和组合物及其使用方法

专利名称：影响血管发生的多肽、蛋白质和组合物及其使用方法
背景技术：
本发明涉及参与血管新生(vasculogenesis)和/或血管发生的多肽和由其编码的蛋白质。在制备用于诊断和治疗血管发生相关病况的材料和方法时可以以这些物质作为靶标。本发明还涉及这些诊断和治疗的方法和物质。
背景技术：
血管新生(包含动脉和静脉的交互血管系统的发育)和血管发生(新血管的产生)都在胚胎发育中起作用。相反，在正常成年人中血管发生只限于胎盘、卵巢、子宫内膜和正在愈合的伤口部位。血管发生或者其缺失在多种不同病理状态的维持中起重要作用。这些状态中的一些特征为血管新生，例如癌症、糖尿病性视网膜病、青光眼和与年龄有关的视黄斑变性。其他的状态，例如中风、不育症、心脏病、溃疡和硬皮症是血管发生不足造成的疾病。
血管发生有几个阶段(参见例如Zhu和Witte，Invest New Drugs 17195-212，1999)。血管发生的早期阶段包括内皮细胞蛋白酶产生、细胞迁移和增殖。早期阶段看来还需要一些生长因子，推测VEGF，TGF-A和选择的趋化因子都在起作用。血管发生的晚期阶段包括血管由壁细胞(周细胞或平滑肌细胞)集群、基底膜产生和血管床特化的诱导。血管形成的最终阶段包括被称为塑形的过程，其中正在形成的血管系统变为稳定、成熟的血管床。因此，这个过程是高度动态的，通常需要在时间和空间上协调的基因表达。
通过对一个或者多个关键步骤的干扰使复杂的血管发生过程被破坏，并且多种疾病状态会由于破坏而产生或加剧。不受调控的血管发生可以导致疾病或者使疾病恶化，例如眼部血管新生是失明最常见的原因，并且是大约20种眼部疾病的病理原因。在某些以前存在的病况例如关节炎中，新形成的毛细血管床侵入关节并且破坏软骨。在糖尿病中，视网膜中形成的新毛细血管侵入玻璃体，造成出血和失明。
除了与不受调控的血管发生有关的病理以外，血管发生不足也可以导致不需要的结果。死亡或者受损的组织可能导致多种病理出现，通过健康、正常的血管发生过程对受损的组织进行血运重建对于防止进一步的并发症是至关重要的。
因此，需要抑制或促进血管发生的新的靶标或者治疗。通过确定更多参与血管发生任何阶段的关键因子，可以产生血管发生相关病理状态的新的诊断方法。另外，阐明和理解参与血管形成的关键因子可以成为研究血管发生相关病况潜在治疗的新型方法的基础。
发明简述根据以上概述的目的，本发明公开了十个核酸序列以及相关的蛋白质，所述蛋白质在血管新生和/或血管发生中起重要作用。本发明的一个目的是提出使用十个新型因子在血管发生相关的疾病状态中作为治疗性干预的分子靶标。本发明的另一个目的是提供材料和方法，它们可以用于筛选具有调节血管发生或血管发生相关病况能力的化合物。
这里鉴别的治疗特异靶向的序列和蛋白质也作为调节血管新生或血管发生的物质或组合物提供。
根据本发明的一个实施方案，提供了根据SEQ ID NO2，4，7，9，12，14，17，19，21，24，26，29，31，34，36，39，41，44，46，49和51任何一项的分离的核酸分子或者其片段或类似物，它们具有刺激或抑制至少一种生物活性的能力(生物活性选自血管新生、血管发生、血管通透，内皮细胞增殖、内皮细胞分化、内皮细胞迁移以及内皮细胞存活)，或者在严谨条件下与前面序列中的一个发生杂交的分离的核酸分子。本发明还涉及与上面描述的核酸分子的互补物杂交的分离的核酸分子，以及至少19个碱基对的分离的siRNA分子，其靶向于以上描述的核酸分子。
根据本发明的另一个实施方案，提供包含新型核酸分子之一的表达载体。核酸可以与控制核酸编码的多肽表达之调控核酸有效连接。
本发明还包含经过遗传工程化以含有如上描述的核酸、或者由以上描述的表达载体转染的宿主细胞。
根据本发明的另一个实施方案，提供了治疗细胞、细胞群或者生物中血管发生相关病况的方法，包括向细胞、细胞群或者生物施用如上描述的表达载体。
本发明还包含对以上描述的核酸具有特异反应性的抗体。抗体可以是多克隆或者单克隆的，并且还可以包含可检测的标记例如荧光标记。
根据本发明的另一个实施方案，提供了转基因的非人动物，该动物被遗传工程化以含有包含如上描述的核酸的转基因，且该动物含有并表达转基因。
根据本发明的另一个实施方案，提供了包含如上描述的核酸序列的药物组合物。可以向细胞、细胞群或生物施用化合物以影响血管新生或者血管发生。影响的效果可以是增加或者降低血管新生或血管发生，可以在细胞、细胞群或生物具有血管发生相关病患时使用该方法。这些血管发生相关病患包括癌症、视网膜病、视黄斑变性、角膜溃疡、中风、局部缺血性心脏病、不育症、溃疡、硬皮症、伤口愈合、局部缺血症、局部缺血性心脏病、心肌梗塞、非炎症性心肌病、心绞痛、不稳定心绞痛、冠状动脉硬化、闭塞性动脉硬化症、Berger′s病、动脉栓塞、动脉血栓、脑血管阻塞、脑梗塞、脑血栓、脑栓塞、增生性玻璃体视网膜病变、慢性炎症、炎症性肠病、银屑病、肉状瘤病以及类风湿性关节炎。
根据本发明的另一个实施方案，提供了分离的多肽，多肽包含的氨基酸序列基本上对应于SEQ ID NO3，5，8，10，13，15，18，20，22，25，27，30，32，35，37，40，42，45，47，50和52中任何一项或者其片段或类似物的氨基酸序列，上述分离的多肽能够在细胞、细胞群或者生物中影响血管生成。
本发明还包含经过遗传工程化以表达如上描述多肽的宿主细胞，以及与上述多肽特异反应的抗体。抗体可以是多克隆或单克隆的，并且可以包含可检测的标记例如荧光。
根据本发明的另一个实施方案，提供了转基因的非人动物，该动物已经被遗传工程化含有包含如上描述多肽的编码核酸的转基因，以及含有和表达该转基因的动物。
本发明还提供了包含如上描述的分离的多肽的药物组合物。可以向细胞、细胞全或者生物施用该药物组合物，目的是影响其中的血管新生或者血管发生。血管新生或血管发生可以增加或者减少。细胞、细胞群或生物可以具有血管发生相关的病患。代表性的血管发生相关病患在以上提到。
根据本发明的另一个实施方案，提供了检测患者的细胞中血管发生相关转录物的检测方法，该方法包括使来自患者的生物样品与多核苷酸接触，所述多核苷酸同根据SEQ ID NO2，4，7，9，12，14，17，19，21，24，26，29，31，34，36，39，41，44，46，49和51任何一项的序列有至少80％一致性的序列选择性杂交，其中在检测到杂交时检测到血管发生相关转录物。多核苷酸可以包含根据SEQ ID NO2，4，7，9，12，14，17，19，21，24，26，29，31，34，36，39，41，44，46，49和51任何一项的序列。生物样品可以是组织样品或者分离的核酸样品例如mRNA。根据该方法，可以在生物样品与多核苷酸接触之前对核酸进行扩增。此外，多核苷酸固定在固体表面上。
根据本发明的另一个实施方案，提供了在脊椎动物中影响至少一种选自血管发生和血管新生的生物活性的方法，其中该方法包括步骤向生物施用有效量的这里描述的影响血管新生或血管发生的核苷酸或者多肽。生物可以是哺乳动物例如小鼠、大鼠、兔、豚鼠、猫、狗、猪、奶牛、猴和人。血管新生或血管发生可以被增强、增加、抑制或减少。该方法可以用于具有血管发生相关病患(例如上面描述的病患)的生物体。
根据本发明的另一个实施方案，提供了血管发生增加的转基因实验动物，该动物包含一个或者多个细胞，其中根据SEQ ID NO2，4，7，9，12，14，17，19，21，24，26，29，31，34，36，39，41，44，46，49和51任何一项的序列的表达被上调。还提供了血管发生减少的转基因实验动物，该动物包含一个或者多个细胞，其中根据SEQ ID NO2，4，7，9，12，14，17，19，21，24，26，29，31，34，36，39，41，44，46，49和51任何一项的序列的表达被下调或者消失。
如这里所使用，术语“血管发生相关的病况”或“血管发生相关的疾病(状态)”所指的状况其特征是血管发育过量或缺乏，或者该状况可以由于血管发育的增加或减少而改善。与增加的血管发生有关的疾患包括，但是不止限于，癌症(包括实体肿瘤、白血病以及肿瘤转移)、良性肿瘤(包括血管瘤、听神经瘤、神经纤维瘤、沙眼和化脓性肉芽肿)、视网膜病、视黄斑变性以及角膜溃疡。与降低的血管发生有关的病理状态或者可以由于血管发生的增加而被改善的状态包括，但是不止限于，局部缺血性心脏病、不育症、溃疡、硬皮症、(不足的)伤口愈合、局部缺血症、局部缺血性心脏病、心肌梗塞、非炎症性心肌病、心绞痛、不稳定心绞痛、冠状动脉硬化、闭塞性动脉硬化症(ASO)、Berger′s病、动脉栓塞、动脉血栓、脑血管阻塞、脑梗塞、脑血栓、脑栓塞和中风。其他与血管发生相关的疾病包括，但是不止限于，与虹膜发红有关的疾病(虹膜角的血管新生)以及由于维管或含纤维组织的异常增殖导致的疾病，包括所有形式的增生性玻璃体视网膜病变(不论是否与糖尿病有关)、具有慢性炎症症状的疾病(例如炎症性肠病、银屑病、肉状瘤病和类风湿性关节炎)。
“宿主细胞”是天然存在的细胞或转化的细胞，它含有表达载体并且支持表达载体的复制或表达。宿主细胞可以是培养细胞、外植体、体内的细胞等等。宿主细胞可以是原核细胞例如大肠杆菌，或者真核细胞例如酵母、昆虫、两栖类或哺乳类细胞例如CHO、HeLa等等(参见例如美国典型培养物保藏中心目录或者网站www.atcc.org)。
术语“多肽”、“肽”和”蛋白质”在这里互换使用，指的是氨基酸残基的多聚体。这些术语应用于氨基酸的多聚体(其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在氨基酸的人工化学模拟物)，也应用于天然存在的氨基酸多聚物和非天然存在的氨基酸多聚物。
术语“氨基酸”指的是天然存在的和合成的氨基酸，以及以与天然存在氨基酸类似的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是那些由遗传密码编码的氨基酸以及后来被修饰的氨基酸，例如羟脯氨酸，γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。“氨基酸类似物”指的是与天然存在氨基酸具有相同的基本化学结构的化合物。这些类似物具有修饰的R基团(例如正亮氨酸)或者修饰的肽骨架，但是保持了与天然存在氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物指的是具有与氨基酸的一般化学结构不同结构，但是以与天然存在氨基酸类似方式起作用的化学化合物。在这里提及氨基酸时可以使用通常知道的氨基酸三字母符号或者IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号。类似地，在提及核苷酸时可以使用通常被接受的核苷酸单字母符号。
如这里所使用，术语“保守修饰”或“保守修饰的变体”应用于氨基酸和核酸序列。就特殊的核酸序列而言，保守修饰的变体指的是那些编码相同或基本相同氨基酸序列的核酸，或是在核酸不编码氨基酸序列时指的是大致相同的序列。由于遗传密码的简并性，大量功能相同的核酸编码任何给定的蛋白质。例如，密码子GCA，GCC，GCG和GCU都编码丙氨酸。因此在每一个由密码子确定为丙氨酸的位置，密码子都可以改变为以上描述的相应密码子而不会改变编码的多肽。这种核酸变体是“沉默变体”，这是一种保守修饰的变体。这里编码多肽的每一个核酸序列也描绘了该核酸每一种可能的沉默变体。技术人员应该认识到核酸中的每一个密码子(除了AUG，它通常是甲硫氨酸唯一的密码子，以及TGG，它通常是色氨酸唯一的密码子)都可以被改变产生功能上相同的分子。因此在每一个描述的序列中对表达产物来说(而不是对实际的探针序列来说)多肽编码核酸的每一个沉默变体是不言自明的。
就氨基酸序列而言，技术人员应该认识到核酸、肽、多肽或蛋白质序列中的单个取代、删除或添加(在所编码的序列中改变、添加或删除了单一氨基酸或很小百分比例的氨基酸)是“保守修饰的变体”，其中改变使氨基酸被化学上相似的氨基酸取代。提供功能上相似氨基酸的保守取代表格在本领域内是众所周知的。这种保守修饰变体是在本发明的多态变体、种间同源物以及等位基因之外的并且不包括多态变体、种间同源物以及等位基因。
如这里所使用，“标记”或者“可检测分子”指的是可以由分光镜、光化学、生化、免疫化学、化学或者其他物理方法检测的组合物。这些标记的示例包括32P、荧光染料、电子密度试剂、酶、生物素、地高辛或者半抗原以及蛋白质(可以通过例如向肽中掺入放射性标记使蛋白质被检测到或者使用蛋白质检测与肽特异反应的抗体)。
如这里所用，“载体”或“表达载体”指的是通过重组或合成产生的核酸构建体，其具有一系列允许特定核酸在宿主细胞中转录的特异核酸元件。表达载体可以是质粒、病毒或者核酸片段的一部分。通常表达载体包括与待转录的核酸有效连接的启动子。
如这里所所用，短语“严谨杂交条件”指的是序列能够杂交的条件。严谨条件是取决于序列的并且在不同条件下是不同的。本领域技术人员可以获得到大量的描述性材料，在这些材料中对适宜给定序列的反应条件有详细描述。一个示例是Innis等人，(1990)PCR Protocols，A Guideto Methods and Applications，Academic Press，Inc.N.Y.)。
如这里所用，术语血管发生多肽的“抑制剂”、“激活剂”和“调节剂”以及多肽序列的血管发生活性指的是抑制、激活或调节分子。“抑制剂”是例如与血管发生蛋白质结合、部分或完全抑制活性、降低、阻止、延迟活化、使其失活、去敏化或者下调其活性或表达的化合物，例如拮抗剂。“激活剂”指的是提高、打开、活化、促进、增强活化、敏化、兴奋或上调血管发生蛋白质活性的化合物。抑制剂、激活剂或者调节剂包括遗传修饰版本的血管发生蛋白质，例如具有改变活性的版本以及天然存在和合成的配基、拮抗剂、激动剂、抗体、小的化学分子等等。抑制剂和激活剂的检测包括例如在体外、细胞中或者细胞膜中表达血管发生蛋白质，应用推定的调节化合物，然后如上描述测定对活性的功能效果。
附图简述

图1显示在与胚胎脑内皮细胞部分与胚胎脑剩余部分的比值以及成年脑内皮细胞部分与成年脑剩余部分的比值进行比较时，使用cDNA文库中基因的表达比值取log2，绘制的比率-比率图。
图2显示在与胚胎脑、心脏和皮肤内皮细胞与剩余胚胎部分的比值、与全部成年内皮细胞的比值和与剩余部分的比值进行比较时，平均强度对cDNA文库中基因表达比率取log2的比率-强度图。
图3示意描绘了基因OJC8009J7的微阵列数据；图4显示了28hpf时的野生型斑马鱼胚胎；图5显示了28hpf时的OJC8009J7morphant胚胎；图6显示了56hpf时的野生型斑马鱼胚胎；图7显示了56hpf时的OJC8009J7吗啉代反义寡核苷酸处理的靶基因表达减弱的生物体(morphant)胚胎；图8显示了48-56hpf时的野生型斑马鱼胚胎；图9显示了48-56hpf时的OJC8009J7morphant胚胎；图10示意描绘了基因HUP8001K17的微阵列数据；图11显示了28hpf时的HUP8001K17morphant胚胎；图12显示了56hpf时的HUP8001K17morphant胚胎；图13显示了48-56hpf时的HUP8001K17morphant胚胎；图14示意描绘了基因HUP8001K21的微阵列数据；图15显示了28hpf时的HUP8001K21morphant胚胎；图16显示了56hpf时的HUP8001K21morphant胚胎；图17显示了48-56hpf时的HUP8001K21morphant胚胎；图18示意描绘了基因HUP8003D24的微阵列数据；图19显示了48-56hpf时的HUP8003D24morphant胚胎；图20示意描绘了基因HUP8004N1的微阵列数据；图21显示了28hpf时的HUP8004N1morphant胚胎；图22显示了56hpf时的HUP8004N1morphant胚胎；图23显示了48-56hpf时的HUP8004N1morphant胚胎；图24示意描绘了基因HUP8010A10的微阵列数据；图25显示了28hpf时的HUP8010A10morphant胚胎；
图26显示了56hpf时的HUP8010A10morphant胚胎；图27显示了48-56hpf时的HUP8010A10morphant胚胎；图28示意描绘了基因NOC8003L17的微阵列数据；图29显示了28hpf时的NOC8003L17morphant胚胎；图30显示了56hpf时的NOC8003L17morphant胚胎；图31显示了48-56hpf时的NOC8003L17morphant胚胎；图32示意描绘了基因NOC8009C9的微阵列数据；图33显示了28hpf时的NOC8009C9morphant胚胎；图34显示了56hpf时的NOC8009C9morphant胚胎；图35显示了48-56hpf时的NOC8009C9morphant胚胎；图36示意描绘了基因NOC8009G23的微阵列数据；图37显示了28hpf时的NOC8009G23morphant胚胎；图38显示了56hpf时的NOC8009G23morphant胚胎；图39显示了48-56hpf时的NOC8009G23morphant胚胎；图40示意描绘了基因OJC8003C9的微阵列数据；图41显示了28hpf时的OJC8003C9morphant胚胎；图42显示了56hpf时的OJC8003C9morphant胚胎；图43显示了48-56hpf时的OJC8003C9morphant胚胎。
发明详述尽管已经详细阐释和描述了本发明的特殊实施方案，显然对于那些本领域的技术人员而言可以在不偏离本发明精神和范畴的条件下进行各种不同的其他改变和调整。因此所有在本发明范畴内的改变和调整都被所附的权利要求覆盖。未具体描述其合成的材料，或者是商品化的或者可以使用对本领域技术人员众所周知的方法进行制备。除非有其他说明，应当理解包括量、百分比、部分和比例在内的所有量都被词语“大约”修饰，并且量不表明有效数字。除非有其他说明，冠词″一″，″一个″，和″该″指的是“一个或多个”。所有引用文件的文件，其相关部分在这里被引用作为参考；对任何文件的引用不应当被理解为承认它是本发明的前案。
候选基因的确定从纯化分离的成年和胚胎小鼠的血管片段中收集mRNA，制备cDNA文库。收集的mRNA用于制备对在维管系统中表达的基因有广泛覆盖的cDNA文库。由于小鼠年龄的变异性，血管基因代表了在维管系统中不同情况下不同时刻都有活性的基因。
在制备cDNA文库之后，将cDNA文库的DNA印模在如本领域已知的固体支持物上，制备微阵列。使用微阵列通过基因表达组态分析找到候选基因。收集从成年和E 18.5胚胎小鼠中选择的组织。组织选择基于组织的量以及可以用于提取的RNA的纯度。除去组织以后，使用抗体或凝集素将细胞分为两部分。第一部分是内皮细胞级分或EC，含有内皮细胞以及周细胞和血管平滑肌细胞，他们与血管片段紧密相连。第二部分也被称为剩余部分或者LO，是分离EC之后剩下的细胞。
使用成年的小鼠脑和心脏组织，每一种组织都使用EC和LO级分。使用胚胎小鼠的脑、心脏和皮肤，每一种组织都使用EC和LO级分。从每一个级分中提取RNA。在这个阶段使用共同参考RNA(Universal MouseReference RNA；Stratagene，Inc.)用于参考的目的。分离的RNA和参考RNA逆转录，然后通过两轮反义RNA扩增进行两次扩增。使用荧光团青色素-3标记分离的RNA，使用青色素-5标记参考RNA。
标记之后，通过与以上描述的微阵列杂交对RNA进行检测。对杂交的微阵列进行扫描，进行成像分析对实验数据进行处理。通过基于信号强度的归一化算法对数据进行标准化，从而对差异表达的基因进行统计评价。选择显示差异表达的基因进行进一步分析。
具有差异表达基因的选择使用根据以上描述收集的数据，某些基因被确定为在血管中选择表达的基因。这是基于成年和胚胎EC和LO值的比较而得出的。图1显示通过比较胚胎脑EC和LO基因以及成年脑EC和LO基因得到的数据绘制的比率-比率图线。还对总的成年EC与总的胚胎EC进行了比较，数据未显示。使用“DT1候选基因”或“DT2候选基因”表示的数据点普遍被上调(＞0log2表达比率)。
通过对数据进行不同的比较，其他一些基因被确定为在血管发生中选择表达。总胚胎EC部分(即脑、心脏和皮肤的EC部分)与所有剩余的组织，包括总胚胎LO部分和所有的成年RNA(脑和心脏的EC和LO)进行比较。图2显示的是平均强度对所有基因的表达比率取log2的比率-强度图。标记为DT3候选基因和DT4候选基因的数据点是那些通过该选择性分析显示被上调的基因。还进行了比较，以分析所有的EC部分和所有的LO部分，数据未显示。
选择了共10个目标基因进行进一步分析。以下是每个基因的特异表达数据，并且包括了显示该基因表达组态的图。使用表格表示微阵列的信号强度、log2表达比率、p值、排位(只对某些领域给出排位)。基于表达比值，具有最高表达比率值的基因被给予最高的排位，具有最低表达数值的基因被给予最低的排位。P值从0到1。接近1的数值表明基因被上调，而接近0的数值表明统计学意义上被下调的基因。统计学意义上显著的p值0.05对应的是p值0.05或0.95。
在图片、表格和文本中缩写eec/r指的是胚胎EC部分对所有的剩余部分之比，ec/lo指的是所有的EC部分对所有的LO部分之比，abeclo指的是成年脑EC部分对成年脑LO部分之比，abecebec指的是成年脑EC部分对胚胎脑EC部分之比，aheclo指的是成年心脏EC部分对成年心脏LO部分之比，ebeclo指的是胚胎脑EC部分对胚胎脑LO部分之比，eheclo指的是胚胎心脏EC部分对胚胎心脏LO部分之比，eseclo指的是胚胎皮肤EC部分对胚胎皮肤LO部分之比。
对所选基因的评价通过在斑马鱼中的减弱(knock down)技术对所选基因进行进一步分析。
该过程包括使用特异的反义寡聚核苷酸阻断靶标mRNA分子的翻译。这使目标基因被抑制，可以确定在斑马鱼发育和健康中基因的功能。斑马鱼与哺乳脊椎动物例如小鼠和人具有共同的脊椎动物功能基因。研究证明斑马鱼中器官和/或组织的发育可以可靠地预测在人类中的作用(参见，特别是Shin和Fishman，From zebrafish to humansModularmedical models，Ann.Rev.Genomics and Human Genet.20023311-340；Clark等人，Anoligonucleotide fingerprint normalizedand expressed sequence tag characterized zebrafish library，Genome Res 2001 Sep；11(9)1594-602)。由于它们迅速地外部发育，可以容易地检测和分析斑马鱼胚胎的发育。卵黄囊的存在帮助提供了严重缺陷的胚胎发育的数据，所提供的数据多于使用其他研究生物例如小鼠所能够提供的数据。
为了制备胚胎，鉴别目标基因的斑马鱼同源物。然后设计特异的吗啉代二氨基磷酸盐寡核苷酸以匹配靶标基因的AUG起始密码子或剪接接受体/供体位点。为了制备吗啉代寡核苷酸的储液，将含有100nmol吗啉代二氨基磷酸盐寡核苷酸的沉淀溶解于33.3μl的milli-Q水中，得到的浓度是25mg/ml，储存于-20℃。为了制备注射溶液，将8μl储液加入到92μl除菌过滤的1×Danieu缓冲液(58mM NaCl，0.7mM KCl，0.4mM MgSO4，0.6mM Ca(NO3)2，5mM HEPES，pH 7.6，补充15mM Tris-Cl，pH8.0)中。2mg/ml的注射溶液也储存于-20℃。
在注射过程中，材料和胚胎维持于大约28℃。对注射针头进行校准使注射时间最好在100-600msec的范围内。使用一细胞阶段到早期八细胞阶段的胚胎。将吗啉代寡核苷酸微注射到卵黄囊中。以下描述吗啉代寡核苷酸的特定注射体积或者有效剂量。通常的起始注射剂量包括3，6，和12ng(分别是1.5，3，和6nl)。由于3nl剂量时的毒性，接下来的剂量为0.5，1，和2ng(分别是1，2，和4nl)。每个剂量水平注射大约40个胚胎，保留大约40个胚胎作为未注射的对照。
将吗啉代寡核苷酸注射到受精卵细胞中以后，使经过工程化、特异基因被减弱的胚胎发育(参见Nasevicius和Ekker，Effectivetargeted gene′knockdown′in zebrafish，Nature Genetics vol 26，October 2000.)。在发育过程中，通过检查形态和对发育中的组织进行特异分析和检测对胚胎进行监测。
除了单次吗啉代寡核苷酸注射以外，还进行两次吗啉代寡核苷酸注射。以下描述了两次吗啉代寡核苷酸注射的特异注射体积。注射后笫一天结束时在囊胚和原肠胚阶段的胚胎中加入2×丙硫脲(PTU)溶液，使其悬浮体积加倍。受精后48小时(hpf)两次注射的胚胎使用黏附分子5(cdh5)固定用于原位杂交。
当20％或更多的两次注射胚胎在维管系统中显示低度影响缺陷(用cdh5观察)时，或者当10％或更多胚胎显示中度或者高度影响缺陷时，则使用fli-1，flk-1，flt-4，tie-1，tie-2，和cdh5进行微血管病变和原位杂交。至少120个胚胎施用两倍吗啉代寡核苷酸剂量，其中至少100个带上述标志分子的在24hpf后收获用于原位杂交。剩余的胚用于微血管病变。
以下描述对十个靶标中每一个进行分析的特异数据。一般地，在24-48hpf时进行的形态学观察包括明确胚胎是否出现相对于对照胚胎的一般延迟。另外，记录细胞死亡类型和程度，还记录一般的胚胎形状和脑形态。最后，对卵黄囊水肿(如果存在的话)和心脏形态进行评价并且记录。
而且在大约24hpf时对两次注射吗啉代寡核苷酸的胚胎进行评价，使用fli-1，flk-1，flt-4，tie-1，tie-2，和cdh5进行原位杂交。注意到与对照胚胎相比，节间血管中染色减少的程度，与表达丧失的百分比是相关联的。显示节间表达丢失1-35％的胚胎认为具有低度影响，节间表达丢失36-70％的胚胎认为具有中度影响，节间表达丢失71-100％的胚胎认为具有高度影响。
在48-56hpf时对多种参数(例如一般胚胎性状、细胞死亡的程度、血液循环和心脏形态学)进行研究并且记录。根据以上刚刚的描述，对使用cdh5固定的胚胎在整个维管系统中的染色进行评价。
在两次注射吗啉代寡核苷酸的胚胎中对微血管病变进行评价。为了观察血管，将胚胎转移到三卡因(tricaine)溶液中，向静脉窦/总主静脉中注射10μlFITC-葡聚糖溶液(2,000,000Da，20mg/ml)。
基因OJC8009J7根据微阵列数据，具有SEQ ID NO1中所示序列的基因被确定为在血管中选择表达，参见图3。特异的数据在以下的表1中给出。使用序列和注解数据库，还推导出在小鼠中的等价基因(SEQ ID NO2)和在人中的同源物(SEQ ID NO4)。由这些序列编码的蛋白质分别在SEQ IDNO3和5中给出。
表1基因OJC8009J7的表达组态数据
根据该表达组态，在斑马鱼胚胎中对该基因进行进一步分析。确定了一个对应的斑马鱼基因用于靶向。制备两个吗啉代寡核苷酸sz175和sz176，每一个都靶向该斑马鱼基因。每一个受精卵施用两(2)ng的sz175吗啉代寡核苷酸和12ng的sz176吗啉代寡核苷酸。使胚胎发育。在24hpf时使用6个不同的探针进行第二次原位杂交。
在检测中对节间表达进行了分析，结果随着使用的探针不同而稍有不同。探针fli-1显示所分析的14个morphant胚胎中7％具有低度影响，29％具有高度影响，即丧失了71-100％的节间表达。探针flk-1(VEGF受体2)表明所研究的12个morphant中25％具有低度影响，8％具有高度影响。探针tie-1表明研究的9个morphant中11％具有中度影响，11％具有高度影响。探针cdh5(VE黏附分子)表明观察的16个morphant中19％具有低度影响，6％具有中度影响，19％具有高度影响。探针flt-4(VEGF受体3)表明所有观察的10个morphant都是正常的，探针tie-2表明所有观察的6个morphant都是正常的。
以下的表格表2总结了这些数据。
表2二次原位杂交数据
在28hpf时对胚胎进行形态观察。图5显示了在28hpf时代表性的morphant胚胎。由图可见，特别是根据图4的28hpf野生型胚胎观察，morphant显示了正常的形态。在56hpf时再次观察胚胎的表型特征，代表性的胚胎示于图7中。当根据图6的56hpf野生型胚胎观察图7时可以很容易地理解观察到的正常表型。
对48-56hpf的morphant胚胎进行其他分析。对17个morphant使用cdh5进行初次原位杂交筛选显示88％是正常的。在另外12％的胚胎中观察到节间表达降低的中度影响。对morphant使用微血管造影术定位FITC-葡聚糖在胚胎中各种不同区域的存在，参见图9，这可以与图8所示的该时刻的野生型胚胎进行比较。33个胚胎中没有一个胚胎在心脏和头中同时具有FITC-葡聚糖，但是4％只在心脏中有FITC-葡聚糖。在15％的胚胎中观察到了减少的节间维管系统。没有观察到渗漏的维管系统。正常胚胎占样本的81％。观察到的渗漏来自后侧头中的血管，如箭头所示。
基因OJC8009J7根据微阵列数据，具有SEQ ID NO6中所示序列的基因被确定为在血管中选择表达，参见图10。特异的数据在以下的表3中给出。使用序列和注解数据库，还推导出在小鼠中的等价基因(SEQ ID NO7)和在人中的同源物(SEQ ID NO9)。由这些序列编码的蛋白质分别在SEQ IDNO8和10中给出。
表3基因HUP8001K17的表达组态数据
根据该表达组态，在斑马鱼胚胎中对该基因进行进一步分析。确定了一个对应的斑马鱼基因用于靶向。制备两个吗啉代寡核苷酸sz143和sz144，每一个都靶向这个斑马鱼基因。如下描述，施用不同量的吗啉代寡核苷酸。到每一个受精卵中施用预先确定量的吗啉代寡核苷酸。使胚胎发育。在24hpf时使用6个不同的探针进行第二次原位杂交。
对接受1ng sz143吗啉代寡核苷酸和4ng sz144吗啉代寡核苷酸的胚胎进行一个筛选。特别选择了四个探针分析轴向和节间的血管表达，发现使用探针fli-1，17个胚胎中6％具有中度节间表达影响。另外18％具有高度影响。探针flk-1(VEGF受体2)表明所研究的15个morphant中20％具有中度影响，13％具有高度影响。当使用探针tie-1进行分析时，所观察的16个morphant中63％具有高度影响。探针cdh5(VE黏附分子)表明观察的24个morphant中4％具有中度影响，另外4％具有高度影响。探针flt-4(VEGF受体3)表明所有观察的14个morphant都是正常的，探针tie-2显示所有观察的18个morphant都是正常的。
对接受1.5ng sz143吗啉代寡核苷酸和6ng sz144吗啉代寡核苷酸的胚胎进行另一个筛选。探针fli-1表明所分析的12个morphant中42％具有高度影响。探针flk-1表明所观察的13个morphant中23％具有高度影响。探针tie-1显示，13个morphant中54％具有高度影响。探针cdh5表明27个morphant中15％具有中度影响，另外11％具有高度影响。探针flt-4表明所有观察的14个morphant都是正常的，探针tie-2表明所有观察的18个morphant都是正常的。
下面的表4总结了前面的数据。
表4二次原位杂交数据
在28hpf时观察胚胎的形态。用作对照的野生型胚胎显示了预期的正常形态。如前面所表明的，图4显示了28hpf时的野生型胚胎。得到1.5ng剂量sz143和6ng剂量sz144的morphant胚胎都没有表现出正常形态。代表性的胚胎示于图11。观察了20个胚胎，50％显示了卷曲向下的身体(由图11中的箭头表示)，具有卵黄管延伸(由短箭号表示)。在60％的胚胎中观察到轻度的细胞死亡，如图11中的长箭号所示。50％的胚胎具有卵黄细胞水肿。
在56hpf时再次观察胚胎，用于参考的野生型胚胎示于图6。在图12中表示了在相应阶段的morphant。观察了二十(20)个胚胎，90％具有卷曲向下的身体(如图12中的长箭号所示)，具有缩短的头部(如短箭号所示)。箭头所示的心包水肿在90％的胚胎中观察到，还在90％的胚胎中观察到减少的血流。
对48-56hpf morphant胚胎进行了另外的分析。对接受lng sz143和3ng sz144的18个morphant使用cdh5进行初步原位杂交筛选，发现28％具有降低的节间表达(在低度影响水平上)，具有短和卷曲的尾。剩余的72％正常。使用接受2ng sz143和6ng sz144的11个morphant进行相同的原位杂交筛选。这发现9％具有减少的节间表达(在低度影响水平上)，具有非常短的尾。剩余的91％正常。
对接受1.5ng sz143和6ng sz144的26个morphant使用微血管造影术定位FITC-葡聚糖在胚胎中各种不同区域的存在。在心脏中没有观察到FITC-葡聚糖，但是31％的胚胎在头部和心脏中具有FITC-葡聚糖。总共27％的胚胎具有减少的节间维管系统，在35％的胚胎中观察到渗漏的维管系统。只有42％的胚胎表现正常。由于一些胚胎表现出一种以上的非正常特性，所以组合的百分比大于100％。图13显示了所分析的48-56hpf胚胎中的代表。箭号指向了具有减少节间维管系统的区域，箭头表明渗漏的维管系统的点。参照用的处于该时刻阶段的野生型胚胎示于图8中。实验数据表明该基因在许多器官中由分散的细胞表达，但是在CNS中可以最清楚地观察到。
基因HUP8001K21根据微阵列数据，具有SEQ ID NO11中所示序列的基因被确定为在血管发生中选择表达，参见图14。特异的数据在以下的表5中给出。使用序列和注解数据库，还推导出在小鼠中的等价基因(SEQ ID NO12)和在人中的同源物(SEQ ID NO14)。由这些序列编码的蛋白质分别在SEQ ID NO13和15中给出。
表5基因HUP8001K21的表达组态数据
根据这个表达组态，在斑马鱼胚胎中对该基因进行进一步分析。确定了两个对应的斑马鱼基因用于靶向。制备两个吗啉代寡核苷酸sz257和sz258，每一个都靶向一个斑马鱼基因。每一个受精卵中施用十二(12)ng的sz257吗啉代寡核苷酸和12ng的sz258吗啉代寡核苷酸。使胚胎发育。在24hpf时使用6个不同的探针进行第二次原位杂交。
在检测中对节间表达进行了分析，结果随着使用的探针不同而稍有不同。探针fli-1显示所有15个检测morphant胚胎都是正常的。探针flk-1表明所研究的16个morphant中13％具有低度影响，6％具有高度影响。使用探针tie-1进行分析时，所有15个观察的morphant都是正常的。探针cdh5表明所有观察的26个morphant都是正常的。探针flt-4表明所有观察的17个morphant都是正常的，探针tie-2表明所有观察的20个morphant都是正常的。
以下的表格表6总结了这些数据。
表6二次原位杂交数据
在28hpf时观察了胚胎的形态。图15显示28hpf时的代表性morphant胚胎。如箭号所示，在55个分析的morphant中47％观察到了卵黄囊水肿。在56hpf时总共观察了53个胚胎，代表性的morphant胚胎示于图16。长箭号突出表示了在34％的胚胎中可见膨胀的后脑。短箭号表示的卵黄囊水肿也在58％的胚胎中观察到。箭头指出了检查心包水肿的位置；没有发现心包水肿。
对48-56hpf morphant胚胎进行了另外的分析。使用cdh5对20个morphant进行的初次原位杂交筛选显示所有的morphant均为正常的。对31个morphant使用微血管造影术定位FITC-葡聚糖在胚胎中各种不同区域的存在，参见图17。在31个胚胎中，19％的胚胎在心脏中具有FITC-葡聚糖，但是没有一个胚胎在心脏和头部中都具有FITC-葡聚糖。观察到减少的节间维管系统，如图17中的箭号所示。在19％的胚胎中观察到高度影响，在13％的胚胎中观察到中度影响，在29％的胚胎中观察到低度影响。没有观察到渗漏的维管系统。正常胚胎占样本的19％。
基因HUP8003D24根据微阵列数据，具有SEQ ID NO16中所示序列的基因被确定为在血管发生中选择表达，参见图18。特异的数据在以下的表7中给出。使用序列和注解数据库，还推导出在小鼠中的等价基因(SEQ ID NO17)和两个人的同源物(SEQ ID NO19和21)。由这些序列编码的蛋白质分别在SEQ ID NO18、20和22中给出。
表7基因HUP8003D24的表达组态数据
根据这个表达组态，在斑马鱼胚胎中对该基因进行进一步分析。确定了三个对应的斑马鱼基因用于靶向。制备两个吗啉代寡核苷酸sz185和sz186，用于靶向上述三个斑马鱼基因。对于低剂量组，每一个受精卵施用3ng的sz185吗啉代寡核苷酸和6ng的sz186吗啉代寡核苷酸。对于双剂量组，施用6ng的sz185吗啉代寡核苷酸和12ng的sz186吗啉代寡核苷酸。使胚胎发育。在24hpf时使用6个不同的探针进行第二次原位杂交。
在检测中对节间表达进行了分析，结果随着使用的探针不同而稍有不同。在低剂量组中，探针fli-1显示所检测的11个morphant胚胎中18％具有中度影响，即节间表达丢失了36-70％，18％具有高度影响。探针flk-1表明所研究的11个morphant中36％具有高度影响。使用探针tie-1表明所观察的14个morphant中有29％具有高度影响。探针cdh5表明所有观察的16个morphant中31％具有高度影响，31％具有中度影响。探针flt-4表明所有观察的16个morphant都是正常的，探针tie-2表明所有观察的15个morphant都是正常的。
在高剂量组中，探针fli-1显示所检测的3个morphant胚胎中33％具有低度影响，33％具有中度影响。探针flk-1表明所研究的2个morphant中100％或者全部都具有中度影响。使用探针tie-1表明所观察的100％，即全部7个morphant中都具有高度影响。探针flt-4表明所有观察的3个morphant都是正常的，探针tie-2表明所有观察的7个morphant都是正常的。
以下的表8总结了前面的数据。
表8二次原位杂交数据
在28hpf时观察了胚胎的形态。在所观察的66个胚胎中70％具有细胞死亡。在29％的morphant中观察到了卵黄囊水肿。在56hpf时总共观察了66个胚胎的表型特征。在42％的胚胎中观察到了卵黄囊水肿，35％显示了减少的IS血流，26％显示减少的血流。
对48-56hpf morphant胚胎进行了其他分析。使用cdh5对21个接受以上提到的低剂量(3ng sz185，6ng sz86)的morphant进行原位杂交筛选，显示52％为正常。在43％的胚胎中观察到减少的节间表达的低度影响，5％中观察到了中度影响。在48-56hpf阶段对接受双剂量(6ng sz185，12ng sz186)的胚胎进行研究时发现观察的23个胚胎中74％是正常的。在22％的胚胎中观察到减少的节间表达的低度影响，4％的胚胎中观察到了中度影响。
对给予低剂量吗啉代寡核苷酸(3ng sz185，6ng sz186)的morphants进行微血管造影术，用于定位FITC-葡聚糖在胚胎中各种不同区域的存在，参见图19。在33个胚胎中，没有一个胚胎在心脏中或者在心脏和头部中具有FITC-葡聚糖。观察到了减少的节间维管系统，如图19中的箭号所示。在6％的胚胎中观察到高度影响，15％的胚胎中观察到中度影响，36％的胚胎中观察到低度影响。没有观察到渗漏的维管系统。正常的胚胎占样本的43％。
数据显示该基因在许多位置例如血管和肾脏中以及大血管、巨核细胞、心脏瓣膜和的血管和皮肤上皮的上皮结构中都有表达。
基因HUP8004N1根据微阵列数据，具有SEQ ID NO23中所示序列的基因被确定为在血管发生中选择表达，参见图20。特异的数据在以下的表9中给出。使用序列和注解数据库，还推导出在小鼠中的等价基因(SEQ ID NO24)和人的同源物(SEQ ID NO26)。由这些序列编码的蛋白质分别在SEQ IDNO25和27中给出。
表9基因HUP8004N1的表达组态数据
根据这个表达组态，在斑马鱼胚胎中对该基因进行进一步分析。确定了两个对应的斑马鱼基因用于靶向。制备两个吗啉代寡核苷酸sz223和sz224，每一个靶向一个斑马鱼基因。使用两个剂量策略。第一个剂量组每个受精卵得到2ng的sz223吗啉代寡核苷酸和1ng的sz224吗啉代寡核苷酸。第二个剂量组每个受精卵得到1ng的sz223吗啉代寡核苷酸和0.5ng的sz224吗啉代寡核苷酸。使胚胎发育。在24hpf时使用6个不同的探针进行第二次原位杂交。
在检测中对第二个剂量组(1ng sz223，0.5ng sz224)的胚胎中的节间表达进行了分析，结果随着使用的探针不同而稍有不同。探针fli-1显示所检测的15个检测morphant胚胎中7％具有低度影响，7％具有高度影响。探针flk-1表明所研究的14个morphant中7％具有高度影响。使用探针tie-1表明所观察的14个morphant中有7％具有低度影响，7％具有高度影响。探针cdh5表明所有观察的26个morphant中8％具有中度影响。探针flt-4表明所有观察的15个morphant都是正常的，探针tie-2表明所有观察的15个morphant都是正常的。
以下的表格表10总结了这些数据。
表10二次原位杂交数据
在28hpf时对胚胎进行形态观察。图21显示了在28hpf时的代表性morphant胚胎。如箭头所表明的，在所研究的59个morphant中，56％观察到了卵黄囊水肿。在56hpf时观察了20个胚胎的表型特征，代表性的morphant胚胎示于图22中。如箭号所示，在35％的胚胎中观察到了心包水肿，65％的胚胎在卵黄中有血淤(如箭号所示)，30％的胚胎显示了降低的IS血流。
对来自第二个剂量组的48-56hpf morphant胚胎进行其他分析。对22个morphant使用cdh5进行初步原位杂交筛选，显示所有的胚胎均为正常。对30个第二剂量组的morphant使用微血管造影术对FITC-葡聚糖在胚胎中各种不同区域中的存在进行定位，参见图23。在30个胚胎中，13％在心脏中具有FITC-葡聚糖，3％在心脏和头部都具有FITC-葡聚糖。观察到减少的节间维管组织，如图23中的箭头所示。7％的胚胎中观察到高度影响，20％的胚胎中观察到低度影响。没有观察到渗漏的维管系统。正常胚胎占样本的57％。
数据表明该基因在特定上皮中表达。在肾脏中，它由特定的血管和一些其他上皮结构表达。在肝脏中也有一些表达。
基因HUP8010A10根据微阵列数据，具有SEQ ID NO28中所示序列的基因被确定为在血管发生中选择表达，参见图24。特异的数据在以下的表11中给出。使用序列和注解数据库，还推导出在小鼠中的等价基因(SEQ ID NO29)和人的同源物(SEQ ID NO31)。由这些序列编码的蛋白质分别在SEQ IDNO30和32中给出。
表11基因HUP8010A10的表达组态数据
根据这个表达组态，在斑马鱼胚胎中对该基因进行进一步分析。确定了两个对应的斑马鱼基因用于靶向。制备两个吗啉代寡核苷酸sz267和sz268，每一个靶向一个斑马鱼基因。在第一个剂量组中每个受精卵施用4ng的sz267吗啉代寡核苷酸和2ng的sz268吗啉代寡核苷酸。在第二个剂量组中施用6ng的sz267吗啉代寡核苷酸和3ng的sz268吗啉代寡核苷酸。使胚胎发育。在24hpf时使用6个不同的探针进行第二次原位杂交。
在检测中对节间表达进行了分析，结果随着使用的探针不同而稍有不同。在第一个剂量组(4ng sz267，2ng sz268)中，探针fli-1显示所检测的15个morphant胚胎中13％具有高度影响。探针flk-1表明所研究的15个morphant中33％具有低度影响，20％具有高度影响。探针tie-1表明所观察的所有17个morphant都是正常的。探针cdh5表明所观察的25个morphant中8％具有高度影响。探针flt-4表明所有观察的13个morphant都是正常的，探针tie-2表明所有观察的16个morphant都是正常的。
在第二个剂量组(6ng sz267，3ng sz268)中，探针fli-1显示所检测的16个morphant胚胎中25％具有低度影响，19％具有高度影响。探针flk-1表明所研究的6个morphant中33％具有低度影响。探针tie-1表明所观察的15个morphant中67％具有高度影响。探针cdh5表明所观察的24个morphant中21％具有低度影响，13％具有中度影响，29％具有高度影响。探针flt-4表明所有观察的15个morphant都是正常的，探针tie-2表明所有观察的15个morphant都是正常的。
以下的表12总结了前面的数据。
表12二次原位杂交数据
在28hpf时对胚胎进行形态观察。图25显示了在28hpf时的代表性morphant胚胎。如图25中箭号所表明的，在所观察的61个morphant中，47％观察到了头部细胞死亡。箭头表明了膨胀的后脑，这在51％的胚胎中观察到。在21％的morphant中观察到轻度的卵黄囊水肿。在56hpf时观察了总共59个胚胎的表型特征，代表性的morphant胚胎示于图26中。箭号指示了膨胀的后脑，这在44％的胚胎中观察到。如箭头所示，在29％的morphant中观察到轻度的卵黄囊水肿。在14％的胚胎中注意到了降低的IS血流，在17％的胚胎中发现了降低的血流。
对来自第二个剂量组的48-56hpf morphant胚胎进行其他分析。对19个morphant使用cdh5进行初步原位杂交筛选，显示68％的胚胎为正常。在32％的胚胎中观察到减少的节间表达的低度影响。对morphant使用微血管造影术对FITC-葡聚糖在胚胎中各种不同区域中的存在进行定位，参见图27。在32个胚胎中，没有一个在心脏中或者在心脏和头部具有FITC-葡聚糖。观察到减少的节间维管组织，如图27中的箭号所示。6％的胚胎中观察到高度影响，3％的胚胎中观察到中度影响，34％的胚胎中观察到低度影响。没有观察到渗漏的维管系统。正常胚胎占样本的56％。
基因NOC8003L17根据微阵列数据，具有SEQ ID NO33中所示序列的基因被确定为在血管中选择表达，参见图28。特异的数据在以下的表13中给出。使用序列和注解数据库，还推导出在小鼠中的等价基因(SEQ ID NO34)和人的同源物(SEQ ID NO36)。由这些序列编码的蛋白质分别在SEQ ID NO35和37中给出。
表13基因NOC8003L17的表达组态数据
根据该表达组态，在斑马鱼胚胎中对该基因进行进一步分析。确定了一个对应的斑马鱼基因用于靶向。制备两个吗啉代寡核苷酸sz180和sz181，每一个都靶向该斑马鱼基因。在第一个剂量组中，每个受精卵施用12ng的sz180吗啉代寡核苷酸和1ng的sz181吗啉代寡核苷酸。在第二个剂量组中，每个受精卵施用注射12ng的sz180吗啉代寡核苷酸和2ng的sz181吗啉代寡核苷酸。使胚胎发育。在24hpf时使用6个不同的探针进行第二次原位杂交。
在检测中对来自第一个剂量组的胚胎中的节间表达进行了分析，结果随着使用的探针不同而稍有不同。探针fli-1显示所检测的15个morphant胚胎中40％具有高度影响。探针flk-1表明所研究的所有7个morphant都是正常的。探针tie-1表明所观察的所有15个morphant都是正常的。探针cdh5表明所观察的20个morphant中15％具有低度影响，5％具有中度影响，30％具有高度影响。探针flt-4表明所有观察的11个morphant都是正常的，探针tie-2表明所有观察的16个morphant都是正常的。
以下的表格表14总结了这些数据。
表14二次原位杂交数据
在28hpf时对胚胎进行形态观察。图29显示了代表性的morphant胚胎。如箭号所表明的，在所研究的48个morphant中，67％观察到了卵黄囊水肿。在56hpf时观察的胚胎表现出正常的形态，代表性的胚胎示于图30中。
对来自第二个剂量组的48-56hpf morphant胚胎进行其他分析。对14个来自第二剂量组的morphant使用cdh5进行初步原位杂交筛选，显示79％的胚胎为正常，剩余的29％显示了减少的节间表达的中度影响。对29个第一剂量组的morphant使用微血管造影术对FITC-葡聚糖在胚胎中各种不同区域中的存在进行定位，参见图31。在29个胚胎中，没有一个在心脏中具有FITC-葡聚糖，3％在心脏和头部具有FITC-葡聚糖。在图31中箭头所示可见降低的节间维管结构。在7％的胚胎中观察到高度影响，3％的胚胎中观察到中度影响，38％的胚胎中观察到低度影响。没有观察到渗漏的维管系统。正常胚胎占样本的45％。
基因NOC8009C9根据微阵列数据，具有SEQ ID NO38中所示序列的基因被确定为在血管发生中选择表达，参见图32。特异的数据在以下的表15中给出。使用序列和注解数据库，还推导出在小鼠中的等价基因(SEQ ID NO39)和人的同源物(SEQ ID NO41)。由这些序列编码的蛋白质分别在SEQ IDNO40和42中给出。
表15基因NOC8009C9的表达组态数据
根据该表达组态，在斑马鱼胚胎中对该基因进行进一步分析。确定了一个对应的斑马鱼基因用于靶向。制备两个靶向该斑马鱼基因的吗啉代寡核苷酸sz241和sz242。每个受精卵施用三(3)ng的sz241吗啉代寡核苷酸和1ng的sz242吗啉代寡核苷酸。使胚胎发育。在24hpf时使用6个不同的探针进行第二次原位杂交。
在检测中对节间表达进行了分析，结果随着使用的探针不同而稍有不同。探针fli-1显示所检测的15个morphant胚胎中7％具有中度影响。探针flk-1表明所观察的所有15个morphant都是正常的。探针tie-1表明所观察的15个morphant中7％具有高度影响。探针cdh5表明所观察的20个morphant中15％具有低度影响。在5％中观察到中度影响，在15％中观察到高度影响。探针flt-4表明所有观察的15个morphant都是正常的，探针tie-2表明所有观察的16个morphant都是正常的。
以下的表格表16总结了这些数据。
表16二次原位杂交数据
在28hpf时对胚胎进行形态观察。图33显示了在28hpf时代表性的morphant胚胎。在观察的53个胚胎中，25％中观察到轻度细胞死亡。在56hpf时观察52个胚胎的表型特征，代表性的胚胎示于图34中。如箭号所示，在13％的胚胎中观察到心包水肿。箭头指向了卵黄囊水肿的区域，在25％的胚胎中观察到卵黄囊水肿。在13％的胚胎中观察到降低的IS血流，在15％的胚胎中观察到降低的轴向血流。
对来自48-56hpf morphant胚胎进行其他分析。对31个morphant使用cdh5进行初步原位杂交筛选，显示所有的胚胎均为正常。对morphant使用微血管造影术对FITC-葡聚糖在胚胎中各种不同区域中的存在进行定位，参见图35。在29个胚胎中，7％在心脏中具有FITC-葡聚糖，14％在心脏和头部具有FITC-葡聚糖。观察到减少的节间维管系统，如图35中的箭号所示。在3％的胚胎中观察到高度影响，3％的胚胎中观察到中度影响，21％的胚胎中观察到高度影响。没有观察到渗漏的维管系统。正常胚胎占样本的52％。数据显示该基因在心脏内以及心脏周围和器官周围表达，包括在一些选择的器官中表达。
基因NOC8009G23根据微阵列数据，具有SEQ ID NO43中所示序列的基因被确定为在血管发生中选择表达，参见图36。特异的数据在以下的表17中给出。使用序列和注解数据库，还推导出在小鼠中的等价基因(SEQ ID NO44)和人的同源物(SEQ ID NO46)。由这些序列编码的蛋白质分别在SEQ IDNO45和47中给出。
表17基因NOC8009G23的表达组态数据
根据这个表达组态，在斑马鱼胚胎中对该基因进行进一步分析。确定了一个对应的斑马鱼基因用于靶向。制备两个吗啉代寡核苷酸s149和sz150，每个都靶向该斑马鱼基因。在第一剂量组中，每个受精卵施用1.5ng的sz149吗啉代寡核苷酸和1.5ng的sz150吗啉代寡核苷酸。在第二剂量组中，每个受精卵施用2ng的sz149吗啉代寡核苷酸和2ng的sz150吗啉代寡核苷酸。在第三剂量组中，每个受精卵施用3ng的sz149吗啉代寡核苷酸和3ng的sz150吗啉代寡核苷酸。使胚胎发育。在24hpf时使用6个不同的探针进行第二次原位杂交。
在检测中对节间表达进行了分析，结果随着使用的探针不同而稍有不同。在使用来自第二剂量组的胚胎进行的研究中，探针fli-1显示所检测的14个morphant胚胎中21％具有高度影响。探针flk-1表明所观察的所有16个morphant都是正常的。探针tie-1表明所观察的22个morphant中36％具有高度影响。探针cdh5表明所观察的15个morphant中13％具有低度影响，轴向表达中断。探针flt-4表明所有观察的16个morphant都是正常的，探针tie-2表明所有观察的13个morphant都是正常的。
在对第二剂量组进行的研究中，探针fli-1显示所检测的15个morphant胚胎中13％具有中度影响，27％具有高度影响。探针flk-1表明所研究的15个morphant中，7％具有低度影响，7％具有中度影响，20％具有高度影响。探针tie-1表明所观察的13个morphant中62％具有高度影响。探针cdh5表明所观察的12个morphant中25％具有高度影响，有一些轴向表达中断。探针flt-4表明所观察的15个morphant中13％在轴向血管中具有低度影响，包括轴向表达的中断和严重畸形的尾。探针tie-2表明所有观察的8个morphant都是正常的。
以下的表18总结了前面的数据。
表18二次原位杂交数据
在28hpf时对胚胎进行形态观察。图37显示了在28hpf时代表性的morphant胚胎。如箭头所示，在所观察的20个胚胎中40％观察到了细胞死亡。如箭头所示，55％的morphant中观察到了卵黄囊的水肿。在40％的morphant中观察到了向下弯曲的身体。在56hpf时观察20个胚胎的表型特征，代表性的胚胎示于图38中。如箭号所示，在55％的morphant中观察到心包水肿。箭头指向的是卵黄囊水肿，这在55％的morphant中观察到。30％的胚胎具有向下弯曲的身体。
对来自48-56hpf morphant胚胎进行其他分析。对来自第一剂量组的22个morphant使用cdh5进行初步原位杂交筛选，显示90％为正常。在5％的胚胎中观察到减少的节间表达和向下弯曲的胚胎的低度影响，在5％的胚胎中观察到具有非常短尾巴的高度影响。对来自第三剂量组的20个morphant使用cdh5进行初步原位杂交筛选，显示80％为正常。在5％的胚胎中观察到减少的节间表达的低度影响，在15％的胚胎中有中度影响。
对morphant使用微血管造影术对FITC-葡聚糖在胚胎中各种不同区域中的存在进行定位，参见图39。在25个胚胎中，没有一个在心脏或者心脏和头部具有FITC-葡聚糖。在24％的胚胎中观察到减少的节间维管系统，如图39中的箭头所示。没有观察到渗漏的维管系统。正常胚胎占样本的76％，箭头表示了正常节间血管。
基因OJC8003C9根据微阵列数据，具有SEQ ID NO48中所示序列的基因被确定为在血管中选择表达，参见图40。特异的数据在以下的表19中给出。使用序列和注解数据库，还推导出在小鼠中的等价基因(SEQ ID NO49)和人的同源物(SEQ ID NO51)。由这些序列编码的蛋白质分别在SEQ ID NO50和52中给出。
表19基因OJC8003C9的表达组态数据
根据这个表达组态，在斑马鱼胚胎中对该基因进行进一步分析。确定了对应的斑马鱼基因用于靶向。制备两个吗啉代寡核苷酸s129和sz130，每个都靶向该斑马鱼基因。在第一剂量组中，每个受精卵施用3ng的sz129吗啉代寡核苷酸和4.5ng的sz130吗啉代寡核苷酸。在第二剂量组中，每个受精卵施用4ng的sz129吗啉代寡核苷酸和6ng的sz130吗啉代寡核苷酸。在第三剂量组中，每个受精卵施用6ng的sz129吗啉代寡核苷酸和8ng的sz130吗啉代寡核苷酸。在第三剂量组中，每个受精卵施用6ng的sz129吗啉代寡核苷酸和9ng的sz130吗啉代寡核苷酸。使胚胎发育。在24hpf时使用6个不同的探针进行第二次原位杂交。
在检测中对节间表达进行了分析，结果随着使用的探针不同而稍有不同。在来自第二剂量组的胚胎中，探针fli-1显示所检测的10个morphant胚胎中20％具有低度影响，10％具有中度影响，10％具有高度影响。探针flk-1表明所研究的9个morphant中11％具有低度影响，33％具有中度影响，11％具有高度影响。探针tie-1表明所观察的9个morphant中22％具有高度影响。探针cdh5表明所观察的7个morphant中14％具有中度影响，14％具有高度影响。探针flt-4表明所有观察的9个morphant都是正常的，探针tie-2表明所有观察的7个morphant都是正常的。
在来自第三剂量组的胚胎中，探针fli-1显示所检测的10个morphant胚胎中10％具有中度影响，50％具有高度影响。探针flk-1表明所研究的12个morphant中25％具有中度影响，25％具有高度影响。探针tie-1表明所观察的6个morphant中17％具有低度影响，50％具有高度影响。探针cdh5表明所观察的5个morphant中40％具有中度影响。探针flt-4表明所有观察的9个morphant都是正常的，探针tie-2表明所有观察的6个morphant都是正常的。
下面的表20总结了前面的数据。
表20二次原位杂交数据
在28hpf时对胚胎进行形态观察。图41显示了在28hpf时代表性的morphant胚胎。如箭号所示，在所观察的20个胚胎中，35％发现具有向后弯曲的身体。在56hpf时观察总共20个胚胎的表型特征，代表性的胚胎示于图42中。如长箭号所示，60％的胚胎具有膨胀的后脑室。如短箭号所示，在25％的胚胎中观察到了卵黄囊水肿。箭头指出没有与卵黄囊水肿相关的心包水肿。
对来自48-56hpf morphant胚胎进行其他分析。对来自第一剂量组的19个morphant使用cdh5进行初步原位杂交筛选，显示所有胚胎均正常。对来自第四剂量组的10个morphant使用cdh5进行初步原位杂交筛选，显示只有90％正常，剩余的10％显示低度影响，具有弯曲的尾。对来自第三剂量组的19个morphant使用微血管造影术对FITC-葡聚糖在胚胎中各种不同区域中的存在进行定位，参见图43。在19个胚胎中，没有一个在心脏或者心脏和头部具有FITC-葡聚糖，但是16％仅在心脏中具有FITC-葡聚糖。在37％的胚胎中观察到减少的节间维管系统。没有观察到渗漏的维管系统。正常胚胎占样本的47％。
从体内数据确定的新型应用本发明涉及了十个基因靶标及其相关的蛋白质，最初通过微阵列分析确定它们在血管新生或血管发生中上调，接下来使用斑马鱼胚胎实验证明它们在体内起关键的作用。这些基因和蛋白质可能成为针对血管相关病况的新方法和治疗的基础。例如，可以对来自患者(怀疑该患者罹患血管发生相关的病况)的生物样品进行筛选，以确定本发明的基因或蛋白质在患者体内是否在正确的时间、位置表达，是否具有正确的表达强度。这些筛选方法构成要求的本发明的一部分。如果确定基因和/或蛋白质表达不正确，则可以根据这里描述的或者本领域内已知的方法和步骤启动矫正病况的治疗例如基因治疗或药物。有了这些特异的数据(现在使用这里描述的工具是可能得到这些数据的)，则可以进行迅速诊断和特异、靶向的治疗。
构思的一种类型的筛选方法依赖于基因扩增，用于检测具有血管新生或血管发生相关病况的患者。这些方法可以利用PCR、原位杂交和/或Southern印迹技术，以阐明病况。另一种类型的筛选方法可以基于对基因表达的分析，使用已知的技术例如定量PCR、微阵列、Northern印迹或者原位杂交。另一种类型可以使用的筛选方法对蛋白质表达进行测定或监测，可以使用例如免疫组化、Western印迹、ELISA或FACS等技术实现这种筛选方法。
如果通过本发明的方法或其他方法确定了可以通过施用含有根据本发明的基因和/或蛋白质的化合物改善血管发生相关的病况，则可以根据本领域内已知的方法同时或顺序施用一种或多种基因和/或蛋白质。
可以通过例如使用标准的直接肽合成技术或重组方法的合成方法，得到本发明的分离的核酸分子或蛋白质。可以用本领域内技术人员已知的各种不同方法(例如电泳纯化或层析技术)分离或纯化蛋白质。
可以通过任何能使化合物运输到需要其发生作用的位置的方法实现本发明化合物的施用。这些方法包括口服途径、灌食途径、胃肠道外注射(包括静脉内、皮下、肌肉内、血管内或输注)和局部给药。
可以使用基因治疗方法向细胞、细胞群或者生物内引入本发明的核苷酸。可以使用体内或间接体内方法。在该步骤中通常使用载体。可以使用非病毒或病毒载体，例如重组腺病毒或逆转录病毒。根据该使用，将所需基因引入DNA病毒或RNA病毒中，例如无毒的逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、牛痘病毒、痘病毒、脊髓灰质炎病毒、辛德毕斯病毒、仙台病毒、SV40和免疫缺陷病毒(HIV)。然后重组病毒感染进入靶标细胞。可以在单一载体中掺入多重基因，或者这些基因可以在分开的载体上同时或顺序引入靶标细胞中。这些方法是本领域内已知的并且在多个专利和出版物中有描述。
本发明构思的另一种干扰基因表达或蛋白质产生的方法是使用小干扰RNA(siRNA)。siRNA包含对应于目标基因(例如SEQ ID NO2)的RNA的有义和反义链。siRNA分子由大约19个核苷酸以及3′端大约2个核苷酸的延伸组成。一些优选的方法包括19-23个核苷酸以及3′延伸。通过已知方法将siRNA引入细胞内。在引入之后，细胞破坏具有相同序列的ssRNA。这导致靶标基因的翻译被降低或者阻止，蛋白质的产生被相应地降低或阻止。
可以在对治疗的对象、病患或病况的严重性、给药速率以及化合物的清除进行研究之后确定施用的活性化合物的量。剂量可以同时施用或者分散在不连续的时间段内施用。
本发明的化合物可以作为唯一的治疗方法应用或者可以含有一种或多种其他活性的药用或药物物质。组合物可以包括本领域内已知的载体、佐剂、缓冲剂或赋形剂。如果需要的话，组合物还可以含有以下成分，例如调味剂、甜味剂、粘合剂、染料、润湿剂、香料、增稠剂、稳定剂、乳化剂、分散剂、助悬剂、防腐剂和pH调节剂。组合物可以是任何适宜的形式，例如片剂、胶囊、丸剂、粉末、缓释配方、溶液、悬液、乳剂、软膏或乳膏。组合物可以是无菌的。使用特定量的活性化合物制备各种不同药物组合物的方法是本领域内技术人员已知的或者是明确的。已经描述的本发明药物组合物可以应用于需要血管新生或血管发生治疗的所有疾病。
例如，治疗血管发生相关疾患的一种方法包括了根据本发明的组合物用于使缺血的组织出现血管新生。有多种方法用于确定组织是否由于不利的血管堵塞而具有局部缺血性损坏的危险。这些方法是本领域内众所周知的，包括例如成像技术(如MRI)用于分析心肌疾病。在确定了何时何处应用本发明的组合物之后，可以施用组合物，用以增加受到血管阻塞影响或者具有受到血管阻塞影响风险的组织中的血管发生。这可能是在这种组织中阻止和/或减轻局部缺血症的有效方法。在本领域内已知评价和测定局部缺血症已经被减弱的程度的方法。
根据本发明的其他治疗方法包括使用任何允许对患者心脏局部缺血的功能性和程度进行呈现、测定和/或评价的已知技术。可以在治疗开始之前、在治疗过程中、在治疗完成后或者在某些或全部阶段进行这些评价。这种技术的示例包括超声波心动描记法、心血管核成像、磁共振成像以及对比血管造影。
尽管本发明在理解血管新生和血管发生以及与其相关的病况的治疗中向前迈进了一步，但是在本领域内仍然有进一步理解这些病况的需要。因此，本发明还涉及制备和使用可以用于分析和实验的非人转基因动物。因此本发明也包括含有与这里公开的基因相对应的突变体、敲除或修饰基因的转基因动物。转基因动物是遗传改变的动物，已经通过实验将重组、外源或克隆的遗传物质转移到这些动物中。这些遗传物质通常被称为转基因。转基因的核酸序列可以整合到通常没有该特定核酸序列的基因组的基因座上，或者整合到该转基因的正常基因组上。转基因可以由来自相同物种基因组的核酸序列组成或者由来自与靶标动物不同物种的核酸序列组成。
可以通过本领域内已知的各种不同方法，包括转染、电穿孔、微注射、胚胎干细胞中的基因靶向以及重组病毒和逆转录病毒感染，制备转基因动物。向重组感受态哺乳动物细胞中引入核酸片段的方法可以是任何有利于多个核酸分子共转化的方法。本领域的技术人员可以获得制备转基因动物的详细步骤，例如美国专利5,489,743和5,602,307。
可以使用转基因技术制备缺少以上描述的十个基因中一个或者多个基因的动物。可以使用这些敲除动物(特别是与野生型或对照动物的数据比较对这些动物的生长和发育进行测定时)用于阐明删除基因的表达时间和功能。另外还可以对这些动物进行工程化使其表现出血管发生相关疾病的状态，这样进一步理解特定基因在被选择疾病的进程中的作用。这些知识对于当前的技术状况是一种进展，可能产生有希望的新型疗法，用于疾病的预防、控制和治疗。
根据本发明的转基因动物的其他使用包括在研究生物体中使用人同源物基因替代以上确定的一个或多个基因。例如，转基因小鼠中对应于SEQ ID NO7的基因被人同源物SEQ ID NO9替代。尽管人们已经接受，有效药物治疗的研究可以在动物模型中进行，对于人用的可能候选药物而言这种转基因小鼠可能是更为有效的筛选工具。
序列表<110>Hellstrm，MatsWallgard，ElisabetKalén，Mattias<120>影响血管发生的多肽、蛋白质和组合物及其使用方法<130>78063<160>52<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>736<212>DNA<213>Murinae gen.sp.
<400>1gtgatccagg atccgaagag gcccggagca ggagcatggc gtcgtcgggg tcggtgcagc60agctgcccct ggtgctgctg atgttgctgt tggcgagtgc ggcacgggcc agactctact120tccgctcggg ccagacttgc taccatccca ttcgcgggga ccagctggct ctgctggggc180gcaggactta tcctcggccg catgagtacc tgtccccagc ggatctcccc aagaattggg240actggagaaa tgtgaacggt gtcaactatg ccagcgtcac caggaaccag cacatcccac300agtactgtgg ttcctgctgg gcccacggca gcaccagtgc catggcagac cgaatcaaca360tcaagaggaa aggtgcatgg ccctccatcc tgctgtccgt acagaatgtc attgactgtg420gcaatgctgg ctcttgtgaa gggggcaatg accttccggt gtgggagtat gcccacaagc480atggcatccc cgatgagacc tgcaacaact accaggcaag gaccaagact gtgacaagtt540taaccagtgt gggacctgca ctgaattcaa agagtgtcac accatccaga attacaccct600ctggagagtg ggtgattacg gtccctgtcc gggagggaga agatgatggc gagatctatg660ccaatggtcc catcagctgc gggataatgg gcaccagaga tgatgtctaa ctacactggg720ggcatctatg ctgagc736
<210>2<211>1404<212>DNA<213>Murinae gen.sp.
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gggcgaacgc agcacagagg aagaggcctg ctccacttgt ctgggaacct gggcaggagg3360cacagaggaa gccaaggcct ggagctgcag gtcccccggc atctctctct gtcccggcag3420cccaggatgg cctggtgccc ccacctgctg cagcaggagc cccaaggagt gctagctgag3480ggtggttgct ggggtggtcc tcatggacag tgaggtgtgc aagggtgcac tgagggtggt3540gggaggggat cacctgggtt ccaggccatc cttgctgagc atctttgagc ctgccttccg3600gtgggagcag aaaaggccag accctgctga gttagaggct gctgggatcc actgtttcca3660cacagcggga aggctgctgg gaacaggtgg cagagaagtg ccatgtttgc gttgagcctt3720gcagctcttc cagctgggga ctggtgcttg ctgaaaccca ggagctgaac agtgaggagg3780ctgtccacct tgcttggctc actgggacca ggaaagcctg tctttggtta ggctcgtgta3840cttctgcagg aaaaaaaaaa aaggatgtgt cattggtcat gatatttgaa aaggggagga3900ggccgaagtt gttcccattt atccagtatt ggaaaatatt tgaccccctt ggctgaattc3960ttttgcagaa ctactgtgtg tctgttcact accttttcag gtttattgtt tttatttttg4020catgaattaa gacgttttaa tttctttgca gacaaggtct agatgcggag tcagagatgg4080gactgaatgg ggagggatcc tttgtgttct catggttggc tctgactttc agctgtgttg4140ggaccactgg ctgatcacat cacctctctg cctcagtttc cccatctgta aaatgggaga4200ataatacttg cctacctacc tcacaggggt gttgtgagga ttcatttgtg attttttttt4260tttttgtaca gagcttttaa gcattaaaaa cagctaaatg tga4303<210>52<211>861<212>PRT<213>人<400>52Gly Cys Trp Gln Thr Met Gly Thr Thr Ala Ser Thr Ala Gln Gln Thr1 5 10 15
Val Ser Ala Gly Thr Pro Phe Glu Gly Leu Gln Gly Ser Gly Thr Met20 25 30Asp Ser Arg His Ser Val Ser Ile His Ser Phe Gln Ser Thr Ser Leu35 40 45His Asn Ser Lys Ala Lys Ser Ile Ile Pro Asn Lys Val Ala Pro Val50 55 60Val Ile Thr Tyr Asn Cys Lys Glu Glu Phe Gln Ile His Asp Glu Leu65 70 75 80Leu Lys Ala His Tyr Thr Leu Gly Arg Leu Ser Asp Asn Thr Pro Glu85 90 95His Tyr Leu Val Gln Gly Arg Tyr Phe Leu Val Arg Asp Val Thr Glu100 105 110Lys Met Asp Val Leu Gly Thr Val Gly Ser Cys Gly Ala Pro Asn Phe115 120 125Arg Gln Val Gln Gly Gly Leu Thr Val Phe Gly Met Gly Gln Pro Ser130 135 140Leu Ser Gly Phe Arg Arg Val Leu Gln Lys Leu Gln Lys Asp Gly His145 150 155 160Arg Glu Cys Val Ile Phe Cys Val Arg Glu Glu Pro Val Leu Phe Leu165 170 175Arg Ala Asp Glu Asp Phe Val Ser Tyr Thr Pro Arg Asp Lys Gln Asn180 185 190Leu His Glu Asn Leu Gln Gly Leu Gly Pro Gly Val Arg Val Glu Ser195 200 205Leu Glu Leu Ala Ile Arg Lys Glu Ile His Asp Phe Ala Gln Leu Ser210 215 220Glu Asn Thr Tyr His Val Tyr His Asn Thr Glu Asp Leu Trp Gly Glu225 230 235 240Pro His Ala Val Ala Ile His Gly Glu Asp Asp Leu His Val Thr Glu245 250 255
Glu Val Tyr Lys Arg Pro Leu Phe Leu Gln Pro Thr Tyr Arg Tyr His260 265 270Arg Leu Pro Leu Pro Glu Gln Gly Ser Pro Leu Glu Ala Gln Leu Asp275 280 285Ala Phe Val Ser Val Leu Arg Glu Thr Pro Ser Leu Leu Gln Leu Arg290 295 300Asp Ala His Gly Pro Pro Pro Ala Leu Val Phe Ser Cys Gln Met Gly305 310 315 320Val Gly Arg Thr Asn Leu Gly Met Val Leu Gly Thr Leu Ile Leu Leu325 330 335His Arg Ser Gly Thr Thr Ser Gln Pro Glu Ala Ala Pro Thr Gln Ala340 345 350Lys Pro Leu Pro Met Glu Gln Phe Gln Val Ile Gln Ser Phe Leu Arg355 360 365Met Val Pro Gln Gly Arg Arg Met Val Glu Glu Val Asp Arg Ala Ile370 375 380Thr Ala Cys Ala Glu Leu His Asp Leu Lys Glu Val Val Leu Glu Asn385 390 395 400Gln Lys Lys Leu Glu Gly Ile Arg Pro Glu Ser Pro Ala Gln Gly Ser405 410 415Gly Ser Arg His Ser Val Trp Gln Arg Ala Leu Trp Ser Leu Glu Arg420 425 430Tyr Phe Tyr Leu Ile Leu Phe Asn Tyr Tyr Leu His Glu Gln Tyr Pro435 440 445Leu Ala Phe Ala Leu Ser Phe Ser Arg Trp Leu Cys Ala His Pro Glu450 455 460Leu Tyr Arg Leu Pro Val Thr Leu Ser Ser Ala Gly Pro Val Ala Pro465 470 475 480Arg Asp Leu Ile Ala Arg Gly Ser Leu Arg Glu Asp Asp Leu Val Ser485 490 495
Pro Asp Ala Leu Ser Thr Val Arg Glu Met Asp Val Ala Asn Phe Arg500 505 510Arg Val Pro Arg Met Pro Ile Tyr Gly Thr Ala Gln Pro Ser Ala Lys515 520 525Ala Leu Gly Ser Ile Leu Ala Tyr Leu Thr Asp Ala Lys Arg Arg Leu530 535 540Arg Lys Val Val Trp Val Ser Leu Arg Glu Glu Ala Val Leu Glu Cys545 550 555 560Asp Gly His Thr Tyr Ser Leu Arg Trp Pro Gly Pro Pro Val Ala Pro565 570 575Asp Gln Leu Glu Thr Leu Glu Ala Gln Leu Lys Ala His Leu Ser Glu580 585 590Pro Pro Pro Gly Lys Glu Gly Pro Leu Thr Tyr Arg Phe Gln Thr Cys595 600 605Leu Thr Met Gln Glu Val Phe Ser Gln His Arg Arg Ala Cys Pro Gly610 615 620Leu Thr Tyr His Arg Ile Pro Met Pro Asp Phe Cys Ala Pro Arg Glu625 630 635 640Glu Asp Phe Asp Gln Leu Leu Glu Ala Leu Arg Ala Ala Leu Ser Lys645 650 655Asp Pro Gly Thr Gly Phe Val Phe Ser Cys Leu Ser Gly Gln Gly Arg660 665 670Thr Thr Thr Ala Met Val Val Ala Val Leu Ala Phe Trp His Ile Gln675 680 685Gly Phe Pro Glu Val Gly Glu Glu Glu Leu Val Ser Val Pro Asp Ala690 695 700Lys Phe Thr Lys Gly Glu Phe Gln Val Val Met Lys Val Val Gln Leu705 710 715 720Leu Pro Asp Gly His Arg Val Lys Lys Glu Val Asp Ala Ala Leu Asp725 730 735Thr Val Ser Glu Thr Met Thr Pro Met His Tyr His Leu Arg Glu Ile
740 745 750Ile Ile Cys Thr Tyr Arg Gln Ala Lys Ala Ala Lys Glu Ala Gln Glu755 760 765Met Arg Arg Leu Gln Leu Arg Ser Leu Gln Tyr Leu Glu Arg Tyr Val770 775 780Cys Leu Ile Leu Phe Asn Ala Tyr Leu His Leu Glu Lys Ala Asp Ser785 790 795 800Trp Gln Arg Pro Phe Ser Thr Trp Met Gln Glu Val Ala Ser Lys Ala805 810 815Gly Ile Tyr Glu Ile Leu Asn Glu Leu Gly Phe Pro Glu Leu Glu Ser820 825 830Gly Glu Asp Gln Pro Phe Ser Arg Leu Arg Tyr Arg Trp Gln Glu Gln835 840 845Ser Cys Ser Leu Glu Pro Ser Ala Pro Glu Asp Leu Leu850 855 860
权利要求
1.根据SEQ ID NO2，4，7，9，12，14，17，19，21，24，26，29，31，34，36，39，41，44，46，49和51任何一项的分离的核酸分子或者其片段或类似物，它们具有刺激或抑制至少一种选自如下的生物活性的能力血管新生、血管发生、血管通透，内皮细胞增殖、内皮细胞分化、内皮细胞迁移以及内皮细胞存活，或者在严谨条件下与前面序列中的一个杂交的分离的核酸分子。
2.在严谨条件下与权利要求1的核酸分子的互补物杂交的分离的核酸分子。
3.分离的siRNA分子，该分子靶向根据权利要求1或2的分离的核酸分子，其中分离的siRNA分子至少为19个碱基对长。
4.包含根据权利要求1或2的核酸的表达载体，任选地核酸可以与控制由所述核酸编码的多肽表达的调控核酸有效连接。
5.经过遗传工程化以含有根据权利要求1或2的核酸的宿主细胞。
6.使用根据权利要求4的表达载体转染的宿主细胞。
7.在细胞、细胞群或生物中治疗血管发生相关病况的方法，包括向细胞、细胞群或生物施用根据权利要求4的表达载体的步骤。
8.对根据权利要求1或2的核酸具有特异反应性的抗体，其中抗体可以优选是多克隆或单克隆的，且其中抗体可以进一步包含可检测的标记例如荧光标记。
9.已经经过遗传工程化以含有转基因的非人转基因动物，转基因包含根据权利要求1或2的核酸，优选地转基因可以被表达。
10.包含根据权利要求1或2的核酸序列的药物组合物。
11.在细胞、细胞群或生物中影响血管新生或血管发生的方法，包括向细胞、细胞群或生物施用根据权利要求16的药物组合物的步骤，影响可以优选地导致增加或减少，更优选地，细胞、细胞群或生物具有血管发生相关病患例如癌症、视网膜病、视黄斑变性、角膜溃疡、中风、缺血性心脏病、不育症、溃疡、硬皮症、伤口愈合、局部缺血症、局部缺血性心脏病、心肌梗塞、非炎症性心肌病、心绞痛、不稳定心绞痛、冠状动脉硬化、闭塞性动脉硬化症、Berger′s病、动脉栓塞、动脉血栓、脑血管阻塞、脑梗塞、脑血栓、脑栓塞、增生性玻璃体视网膜病变、慢性炎症、炎症性肠病、银屑病、肉状瘤病以及类风湿性关节炎。
12.包含如下氨基酸序列或者其片段或类似物的分离的多肽，所述氨基酸序列基本上相应于SEQ ID NO3，5，8，10，13，15，18，20，22，25，27，30，32，35，37，40，42，45，47，50和52中任何一项的氨基酸序列，所述的多肽能够影响细胞、细胞群或生物内的血管发生。
13.经过遗传工程化以表达根据权利要求12的多肽的宿主细胞。
14.对根据权利要求12的多肽具有特异反应性的抗体，其中抗体可以优选是多克隆或单克隆的，且其中抗体可以进一步包含可检测的标记例如荧光标记。
15.已经经过遗传工程化以含有转基因的非人转基因动物，转基因包含编码根据权利要求12的多肽的核酸，优选地转基因可以被表达。
16.包含根据权利要求12的分离的多肽的药物组合物。
17.在细胞、细胞群或生物体中影响血管新生或血管发生的方法，包括向细胞、细胞群或生物施用根据权利要求16的药物组合物的步骤，影响可以优选地导致增加或减少，更优选地，细胞、细胞群或生物具有血管发生相关病患例如癌症、视网膜病、视黄斑变性、角膜溃疡、中风、缺血性心脏病、不育症、溃疡、硬皮症、伤口愈合、局部缺血症、局部缺血性心脏病、心肌梗塞、非炎症性心肌病、心绞痛、不稳定心绞痛、冠状动脉硬化、闭塞性动脉硬化症、Berger′s病、动脉栓塞、动脉血栓、脑血管阻塞、脑梗塞、脑血栓、脑栓塞、增生性玻璃体视网膜病变、慢性炎症、炎症性肠病、银屑病、肉状瘤病以及类风湿性关节炎。
18.检测患者的细胞中血管发生相关转录物的方法，该方法包括使来自患者的生物样品与同如下序列选择性杂交的多核苷酸接触，所述序列与根据SEQ ID NO2，4，7，9，12，14，17，19，21，24，26，29，31，34，36，39，41，44，46，49和51的任何一项的序列有至少80％的一致性，其中当检测到杂交时血管发生相关的转录物被检测到，优选地多核苷酸包含根据SEQ ID NO2，4，7，9，12，14，17，19，21，24，26，29，31，34，36，39，41，44，46，49和51的任何一项的序列，优选地生物样品是组织样品或者包含分离的核酸例如mRNA，优选地在生物样品与多核苷酸接触步骤之前对核酸进行扩增，优选地多核苷酸固定在固体表面上。
19.在脊椎动物中影响至少一种选自血管发生和血管新生的生物活性的方法，所述方法包括向所述生物施用有效影响血管发生或血管新生的量的根据权利要求1或12的核苷酸或者多肽的步骤，其中生物优选是哺乳动物例如小鼠、大鼠、兔、豚鼠、猫、狗、猪、奶牛、猴和人，其中血管新生或血管发生优选被增强、增加、抑制或减少，其中生物优选具有血管发生相关病患例如癌症、视网膜病、视黄斑变性、角膜溃疡、中风、缺血性心脏病、不育症、溃疡、硬皮症、伤口愈合、局部缺血症、局部缺血性心脏病、心肌梗塞、非炎症性心肌病、心绞痛、不稳定心绞痛、冠状动脉硬化、闭塞性动脉硬化症、Berger′s病、动脉栓塞、动脉血栓、脑血管阻塞、脑梗塞、脑血栓、脑栓塞、增生性玻璃体视网膜病变、慢性炎症、炎症性肠病、银屑病、肉状瘤病以及类风湿性关节炎。
20.包含一个或多个如下细胞的、血管发生增加或减少的转基因实验动物，其中在所述细胞中根据SEQ ID NO2，4，7，9，12，14，17，19，21，24，26，29，31，34，36，39，41，44，46，49和51任何一项的序列的表达被上调、下调或者缺失。
全文摘要
本发明涉及的是与血管新生和血管发生相关病患有关的多核苷酸和蛋白质。本发明还涉及调节血管发生相关基因和基因产物表达的化合物的鉴别方法，以及涉及使用这些化合物作为治疗性物质用于治疗血管发生相关病患。本发明还涉及对血管发生相关病患进行诊断评价、遗传检测和预后的方法，以及涉及治疗这些病患的方法和组合物。
文档编号A61K38/17GK1910199SQ200480040284
公开日2007年2月7日 申请日期2004年12月6日 优先权日2003年12月5日
发明者M·赫尔斯特伦, E·瓦尔高, M·卡伦 申请人:血管遗传瑞典股份公司