鉴定rna结合蛋白的方法和组合物的制作方法

专利名称：鉴定rna结合蛋白的方法和组合物的制作方法
对相关申请的交叉参考按照35U.S.C.119(e)本申请要求递交于2003年12月22日的美国临时专利申请号60/531,719的优先权。
背景技术：
在活细胞中，从最初的RNA转录物完成到转录物编码的蛋白质的实际表达，发生多种细胞事件和机制，包括前RNA剪接、RNA编辑、mRNA在细胞核和细胞质之间的穿梭，以及保证运输mRNA的稳定性和翻译控制。这些事件的每一种都为细胞在RNA水平上调控基因表达提供了机会。
最近的研究显示RNA结合蛋白(RBP)是涉及每种这些重要转录后事件的分子“机制”的关键功能性组分(Maquat，L.E.等，Cell，104，173-6(2001))。这些RBP，也称作“细胞整合剂”的破坏，牵涉到癫痫症(Musunuru，K.，等，Annu.Rev.Neurosci.，24，239-62(2001))，风湿病(Fritsch，R.等，J.Immunol.，169，1068-76(2002))，癌症，运动神经疾病(Pellizzoni，L.，等，Cell，95，615-24(1998))，和智力迟钝(Turner，G.，等，Am.J.Med.Genet.，64，196-7(1996))的发病机制。目前可用治疗工具的缺乏部分是因为只有很少的体内RNA-蛋白质复合物被鉴定和表征。所以，形成核糖核蛋白(RNP)复合物的特定RNA和蛋白质的鉴定将能够开发治疗性工具，如基因表达的调控。这又将能够利用实验室中基因表达的生物学操作并且发展其作为目前不了解的细胞过程的治疗性工具的用途。
先前曾经利用几种方法来了解RNA-蛋白质结合活性。这些方法包括滤器结合测定法，UV交联测定法，和凝胶移位测定法。例如，通过在与蛋白质一起温育后显示RNA以较高分子量迁移，提示RNA和蛋白质之间的相互作用，凝胶移位测定法通常用来确证RNA结合活性。随后，当RNP-Ab复合物在电泳凝胶中以甚至更高的分子量物体的速率迁移时，由RNA-蛋白质复合物，或核糖核蛋白(RNP)暴露于针对所谓RBP生成的抗体组成的超级迁移(supershift)测定，确证了蛋白质在RNP复合物中的存在。利用这些经典方法获得的结果，其实用性和可用性在获RNA结合活性的详细了解方面受到限制，因为所述方法只揭示了发生在体外的结合相互作用。设计了其它更不常规的技术来致力于这一问题(Tenenbaum，S.A.，等，PNAS，97，14085-90(2000)，Brodsky，A.S.，等，Molecular & Cellular Proteomics，1.12，922-9(2002))，但是这些方法在其方法学中仍然依赖于体外技术，如，例如，通过cDNA阵列利用免疫沉淀(IP)来评估胚胎致死性异常视觉系统(ELAV)样神经元RNA-结合蛋白″HuB″(Tenenbaum，S.A.，等，PNAS，97，14085-90(2000))。为了真正理解RNA-蛋白质相互作用的动力学，首先必需具有体内鉴定所述相互作用的能力。在鉴定体外相互作用的尝试中，Miyashiro等开发了APRA(抗体定位RNA扩增)方法，其鉴定在体内与抗体靶蛋白复合的RNA载运(Miyashiro，K.Y.等，Neuron，37，417-31(2003))。不过，这种技术也具有几种缺陷，包括需要必须首先知道RNA结合蛋白的同一性，所以未知的蛋白质不能用该技术进行鉴定。
这些方法的每一种都允许对结合到特定RBP上的RNA载运进行特征鉴定。不过，为了对结合到任何特定RNA上的RBP进行特征鉴定，现有的方法繁琐而且复杂，它们需要大量的时间，它们需要大量的起始材料，并且它们导致许多假阳性。此外，所有尝试进行这种特征鉴定的现有测定法都利用体外的方法。需要一种提供在体内与靶mRNA相互作用的蛋白质的鉴定方法。所以，长期存在一种需要以提供鉴定在体内与预选RNA相互作用的蛋白质的方法。本发明致力于并且满足了这种需要。
发明简述本发明涉及一种膜可透性构建体用于构建体穿过脂膜的运输，包括一种与细胞内多核苷酸杂交的核酸类似物，包含至少一种光反应性部分的核酸类似物，包含R1-CPP-R2的肽部分，其中CPP是细胞穿透性肽，另外其R1和R2各自独立地选自肽、氨基酸、NH2，H，或OH，另外其中所述核酸类似物共价连接于选自R1、R2、肽部分内的半胱氨酸残基，或肽部分内的赖氨酸(K)残基中的一种，和连接所述核酸类似物和所述肽部分的化学键。
在一个实施方案中，膜可透性构建体包括选自SEQ ID NO2，SEQID NO6，SEQ ID NO7，和SEQ ID NO8的CPP。在一方面，所述膜可透性构建体包括选自SEQ ID NO2，SEQ ID NO6，SEQ IDNO7，和SEQ ID NO8的突变体、片段，或变异体的CPP。在一个实施方案中，肽部分的R1和R2的至少一种包含半胱氨酸，另外其中核酸类似物通过二硫键连接到半胱氨酸上。在一方面，核酸类似物通过二硫键连接到所述肽的赖氨酸残基上。在另一方面，二硫键置于一对半胱氨酸残基之间。在又一个方面，所述肽的C末端亮氨酸残基被酰胺化。
在本发明的一个实施方案中，膜可透性构建体包含一种不稳定的化学键。在一方面，所述不稳定的化学键选自二硫键、酯键、抗生物素蛋白-生物素联接、环状不饱和马来酰胺酸酯(maleamate)，和13-酰基腙。
在本发明的一个实施方案中，膜可透性构建体包括选自肽核酸(PNA)，PNA/DNA嵌合体，PNA/RNA嵌合体，RNA，DNA，2′-O-烷基RNA，2′-O-烷基RNA/DNA嵌合体，和核碱基修饰的寡核苷酸。
在一个实施方案中，膜可透性构建体包括选自光反应性氨基酸，对-苯甲酰基苯甲酰基(BzBz)部分，叠氮化物部分，4-苯甲酰苯甲酸衍生物，4-叠氮基-2，3，5，6，-四氟苯甲酸衍生物，和N-((2-吡啶基二硫代)乙基)-4-叠氮邻羟基苯甲酰胺衍生物的光反应性部分。在一方面，光反应性氨基酸选自对-苯甲酰基-L-苯丙氨酸(Bpa)和对-叠氮基-L-苯丙氨酸(Apa)。
在一个实施方案中，膜可透性构建体包括一种标记。在发明的一方面，标记选自生物素，二硝基苯，吖啶，荧光素，若丹明，酞菁，洋地黄毒苷，嵌入剂，小沟结合剂，化学发光物前体，硒和镉。
本发明还涉及一种膜可透性构建体用于构建体穿过脂膜的运输，包括一种与细胞内多核苷酸杂交的结构R3-Cys-PNA-Lys-酰胺的核酸类似物，其中R3是光反应性氨基酸，包含R1-AGYLLGKINLKALAALAKKIL-R2(SEQ ID NO2)的肽部分，其中R1是氢而R2是NH2，另外其中所述核酸类似物共价连接于肽部分内的半胱氨酸残基上，以及连接核酸类似物与肽的二硫键。在一方面，所述核酸类似物具有结构Bpa-Cys-PNA-Lys-酰胺。在另一方面，所述核酸类似物是选自SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，和SEQ ID NO5的PNA。
本发明还涉及一种鉴定结合到包含预定RNA序列的细胞内多核苷酸上的蛋白质的方法，所述方法包括以下步骤提供本发明的膜可透性构建体，在适于所述构建体与多核苷酸结合的条件下，让所述构建体与细胞内多核苷酸结合以形成构建体-多核苷酸复合物，激活光反应性部分，由此将所述核酸类似物与结合到预定RNA序列上的蛋白质共价交联，从细胞中分离交联的核酸类似物-蛋白质，以及鉴定交联到所述核酸类似物上的蛋白质。
在本发明的一个实施方案中，一种方法包括裂解含有交联的核酸类似物-蛋白质的细胞以形成细胞裂解物，将所述细胞裂解物与包含预定RNA序列的固体支持物在适于让交联的核酸类似物-蛋白质结合固体支持物的条件下接触以形成复合物，以及从裂解物中分离复合物。在一方面，所述分离步骤包括裂解含有交联的核酸类似物-蛋白质的细胞以形成细胞裂解物，将所述细胞裂解物与含有抗体的固体支持物在适于让交联的核酸类似物-蛋白质结合抗体的条件下接触以形成复合物，以及从所述裂解物中分离复合物，其中所述抗体对由CPP、核酸类似物、CPP-核酸类似物构建体以及结合预定RNA序列的蛋白质组成的组的至少一员是特异性的。在另一方面，所述PNA选自SEQ ID NO3，SEQ IDNO4，SEQ ID NO5。在又一方面，所述肽部分包含SEQID NO2，其中R1是氢而R2是NH2，另外其中所述核酸类似物共价连接于所述肽部分内的半胱氨酸残基上。
本发明还涉及鉴定结合到包含预定RNA序列的细胞内多核苷酸上的蛋白质的试剂盒，包括本发明的膜可透性构建体，涂药器，及其使用的说明材料。
附图简述为了说明本发明的目的，在附图中描述了本发明的某些实施方案。不过，本发明并不限于附图中所描述的实施方案的精确安排和手段。


图1是一般性描述了按照本发明的实施方案PNA退火和RNA结合表征(″PARC″)技术的图。图1中图示的PNA序列在SEQ ID NO2中给出。
图2中图示了Ank mRNA序列，在核苷酸序列下面显示相应的氨基酸序列。长合(ankylosis)mRNA的这一序列显示，相对于编码序列而言，本发明各个实施方案中所用的三种PNA的位置。Ank 1(SEQ IDNO5)和Ank 2(SEQ ID NO4)PNA重叠，除了3′-UTR中的少许碱基；另一方面，Ank 3(SEQ ID NO3)PNA位于5′-UTR中。
图3是考马斯染料染色的电泳凝胶图，包含BDNF处理和″PARC″分析(如图1中所述)之后重新得到的蛋白质。
图4是经过精简的表，阐明了利用针对Ank mRNA的三个不同区域利用PNA-CPP构建体鉴定RNA结合蛋白。“无处理”＝无处理的包含PNA-CPP构建体的细胞；″DHPG″＝用20μM DHPG处理包含PNA-CPP构建体的细胞；″K+″＝用3mM钾处理包含PNA-CPP构建体的细胞；而″BDNF″＝用50ng/ml BDNF处理包含PNA-CPP构建体的细胞)。″Ank3″是对应于Ank mRNA的残基-123到-102的PNA，″Ank2″是对应于AnkmRNA的残基+1508到+1525的PNA，而″Ank1″是对应于Ank mRNA的残基+1594到+1614的PNA。
发明详述RNA结合蛋白(RBP)是涉及许多转录后事件的分子“机制”的关键功能性组分，并且这些RBP的破坏在许多疾病状况的发病机理中有关联。本发明致力于满足鉴定在这些状况背后的分子机制的需要，以及因此鉴定通过提供新组合物治疗这些状况的途径以及进行这种治疗的方法。
通过组合细胞穿透性肽(CPP)和经改进的肽核酸(PNA)技术，本发明首次提供了鉴定在体内与靶mRNA相互作用的蛋白质的方法和组合物(图1)。本发明提供了CPP+PNA构建体，进一步包括一种光反应性标记，通过核酸样的杂交和CPP+PNA构建体与RBP的靶向交联，其能够用于靶向、交联和鉴定体内结合到特定RNA上的RBP。此外，本发明的组合物和方法可以延伸到除了PNA的其它核酸类似物的应用。本发明还可用于鉴定DNA结合蛋白。
定义如本文所用的，在本部分中下列术语的每一种都具有与它相关联的意义。
本文使用冠词″一″和″一个″指一种或超过一种(即至少一种)的该冠词的语法对象。例如，″一个元件″意指一种元件或多种元件。
“扩增”指拷贝多核苷酸序列以及由此扩增成大量多核苷酸分子的任何方法，例如，通过反转录、聚合酶链式反应，和连接酶链式反应等。
如本文所用的术语“抗体”，指能够特异性结合抗原上特异性表位的免疫球蛋白分子。抗体可以是源自天然来源的或源自重组来源的完整免疫球蛋白并且可以是完整免疫球蛋白的免疫反应性部分。抗体一般是免疫球蛋白分子的四聚体。本发明的抗体可以以多种形式存在，包括，例如，多克隆抗体、单克隆抗体、Fv、Fab和F(ab)2，以及单链抗体和人源化抗体(Harlow等，1999，Using AntibodiesALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY；Harlow等，1989，AntibodiesA Laboratory Manual，Cold SpringHarbor，New York；Houston等，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA855879-5883；Bird等，1988，Science 242423-426)。
本文所用的术语“合成性抗体”，意为利用重组DNA技术生成的抗体，如，例如，由本文所述噬菌体表达的抗体。该术语也应当解释为意指通过编码抗体的DNA分子之合成而生成的抗体，并且所述DNA分子表达抗体蛋白，或指定抗体的氨基酸序列，其中所述DNA或氨基酸序列是利用现有的和本领域公知的合成性DNA或氨基酸序列技术获得的。
“反义”指编码蛋白质的双链DNA分子的非编码链的核酸序列，或指基本上与该非编码链同源的序列。如本文所定义的，反义序列与编码蛋白质的双链DNA分子的序列互补。反义序列不必单独地与DNA分子的编码链的编码部分互补。反义序列可以与特异于编码蛋白质的DNA分子的编码链上的调控序列互补，所述调控序列控制编码序列的表达。
本文所用的术语“涂药器”，意指用于施用一种或多种分子如，但不限于，核酸，蛋白质，小分子化学部分给哺乳动物的任何装置，包括但不限于，皮下注射器，吸液管等等。
本文使用“结合”意指第一部分与第二部分物理性相互作用，其中所述第一和第二部分彼此物理连接。
本文所用的术语“生物学样品”，意指由哺乳动物或在哺乳动物中获得的样品，其能够用于评估核酸的表达水平，蛋白质的存在水平，或二者。这种样品包括，但不限于，细胞、血液样品、神经组织样品、脑样品和脑脊液样品。
本文使用“细胞穿透性肽”来指一种多肽，其与任何与该多肽相关联的分子一起促进所述多肽穿过一层或多层膜进入细胞内部的多肽。
如本文所用的术语“互补的”和“反义”，并不完全同义。“反义”特别指编码蛋白质的双链DNA分子的非编码链的核酸序列，或指基本上与非编码链同源的序列。
如本文所用的术语“互补的”指两种核酸，例如，两种DNA分子之间亚基序列互补性的宽泛概念。当所述两种分子的核苷酸位置被正常情况下能够相互进行碱基配对的核苷酸占据时，那么所述核酸被认为是在此位置上彼此互补的。因而，当每个分子中基本数目(至少50％)的相应位置被正常情况下彼此碱基配对(例如，A:T和G:C核苷酸对)的核苷酸占据时两种核酸彼此互补。如本文所定义的，反义序列与编码蛋白质的双链DNA分子的序列互补。反义序列不必仅与DNA分子的编码链的编码部分互补。反义序列可以与特异于编码蛋白质的DNA分子的编码链上的调控序列互补，所述调控序列控制编码序列的表达。
基因的“编码区”由该基因的编码链的核苷酸残基和该基因的非编码链的核苷酸组成，所述核苷酸分别与由基因转录产生的mRNA分子的编码区同源或互补。
mRNA分子的“编码区”也由该mRNA分子的核苷酸残基组成，其在mRNA分子的翻译过程中与转运RNA的反密码子区匹配或者其编码终止密码子。因而所述编码区可以包括对应于不存在于由所述mRNA分子编码的成熟蛋白质中的氨基酸残基(例如在蛋白质输出信号序列中的氨基酸残基)的核苷酸残基。
“编码性的”指多核苷酸，如基因，cDNA，或mRNA中核苷酸的特异性序列的固有特性，以在生物学过程中作为其它聚合物和大分子合成的模板而起作用，其具有指定的核苷酸序列(即，rRNA，tRNA和mRNA)或指定的氨基酸序列以及由其得到的生物学特性。因而，如果相应于一种基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其它生物学系统中产生蛋白质则该基因编码该蛋白质。其核苷酸序列与mRNA序列相同并且通常在序列表中提供的编码链，以及用作基因或cDNA转录的模板的非编码链，都能够称作编码蛋白质或该基因或cDNA的其它产物。
如果两个区域彼此相邻或者如果两个区域分隔不超过大约1000个核苷酸残基，并且优选不超过大约100个核苷酸残基，则寡核苷酸的第一个区域在该寡核苷酸的第二个区域的“侧翼”。
如本文所用的术语“功能性片段”，指保留与其更大对应物相同活性或能力的较大多肽或多核苷酸的片段。功能性片段的活性水平可以与所述更大对应物的活性相同，或比它更小或更大。例如，CPP运输蛋白(transportan)可以是这样的多肽，其由比全长运输蛋白更少的氨基酸组成，但是仍然可以保留跨细胞膜运输货物的能力，具有比全长运输蛋白低的活性。或者，运输蛋白的功能性片段可以具有比全长运输蛋白更高的货物运输活性。
如本文所用的“同源的”指在两种聚合分子，例如，在两种核酸分子，例如，两种DNA分子或两种RNA分子之间，或在两种多肽分子之间的亚基序列相似性。当两种分子中的亚基位置被相同的单体亚基占据，例如，如果两种DNA分子中的每种的位置都被腺嘌呤所占据，那么它们在该位置上是同源的。两种序列之间的同源性是匹配性或同源性位置数目的直接函数，例如，如果两种化合物序列的半数(例如，在长度为十亚基的聚合物中的五个位置)位置是同源的，那么所述两种序列是50％同源的，如果90％的位置，例如，10个中的9个，是匹配的或同源的，则所述两种序列共有90％的同源性。例如，DNA序列3′ATTGCC5′和3′TATGGC共有50％的同源性。
如本文所用的，“同源性”与“同一性”同义使用。
利用数学算法可以完成两种核苷酸或氨基酸序列之间百分比同一性的测定。例如，可用于比较两种序列的数学算法为如在Karlin和Altschul(1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 905873-5877)中所改进Karlin和Altschul算法(1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872264-2268)。这一算法掺入了Altschul，等(1990，J.Mol.Biol.215403-410)的NBLAST和XBLAST程序中，并且可以例如在生物技术信息国家中心(NCBI)全球网站上获取。可以使用如下参数用NBLAST程序(在NCBI网站上命名为“blastn”)进行BLAST核苷酸搜索缺口罚分＝5；缺口延伸罚分＝2；错配罚分＝3；匹配得分＝1；期望值10.0；词长(word size)＝11，以获得与本文所述核酸同源的核苷酸序列。可以使用如下参数用XBLAST程序(在NCBI网站上命名为“blastx”)或NCBI“blastp”程序进行BLAST蛋白质搜索期望值10.0；BLOSUM62评分矩阵，以获得与本文所述蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的带缺口比对，可以如Altschul等人(1997，Nucleic Acids Res.，253389-3402)所述利用Gapped BLAST。或者，可以使用PSI-Blast或PHI-Blast来进行迭代搜索，它检测分子(Id.)之间的远缘关系和共享共有模式的分子之间的相互关系。在利用BLAST、Gapped BLAST、PSI-Blast、和PHI-Blast程序时，可以使用各个程序(例如，XBLAST和NBLAST)的缺省参数。
可以使用与上面所述相似的技术来测定两种序列之间的百分比同一性，其中容许或不容许缺口。在计算百分比同一性时，通常对精确匹配进行计数。
如本文所用的“同源的”指相同核酸链的两个区域之间或两种不同核酸链的区域之间的核苷酸序列相似性。当两种区域中的核苷酸残基位置都相同核苷酸残基占据时，则所述区域在该位置上是同源的。如果每个区域的至少一个核苷酸残基位置被相同的核苷酸残基占据则第一区域与第二区域是同源的。两个区域之间的同源性用被相同核苷酸残基占据的两个区域的核苷酸残基位置的比例来表示。例如，具有核苷酸序列3′ATTGCC5′的区域与具有核苷酸序列3′TATGGC的区域共有50％的同源性。优选地，第一区域包含第一部分而第二区域包含第二部分，借此，每个部分的核苷酸残基位置的至少大约50％，优选至少大约75％，至少大约90％，或至少大约95％被相同的核苷酸残基占据。更加优选地，每个部分的全部核苷酸残基位置都被相同的核苷酸残基占据。
如本文所用的，“指导材料”包括出版物、录音、图表，或任何其它的表达介质，其能够用于传达本发明的组合物的有效性，用于其指定的用途。本发明的试剂盒的指导材料可以，例如，粘贴在包含所述组合物的容器上或与包含所述组合物的容器一起运输。或者，所述指导材料可以与所述容器分开运输，意在使接受者可以协同使用所述指导材料和组合物。
“分离的核酸”指核酸节段或片段，其从以天然发生的状态与其侧翼的序列中分离出来，例如，从正常情况下邻近该片段的序列，例如，在它天然出现的基因组中邻近该片段的序列移除的DNA片段。该术语还应用于已经基本上从其它组分中纯化的核酸，所述其它组分天然伴随着核酸，例如，RNA或DNA或蛋白质，其在细胞中天然伴随着它。所以该术语包括，例如，一种重组DNA，其掺入载体，掺入自主复制性质粒或病毒，或掺入原核生物或真核生物的基因组DNA，或者其作为独立于其它序列的分离分子(例如，作为由PCR或限制性酶消化产生的cDNA或基因组或cDNA片段)而存在。它还包括一种重组DNA，其是编码其它多肽序列的杂合基因的部分。
对一种对象应用“天然发生的”指这样的事实，即所述对象能够在自然中被发现。例如，存在于能够分离自自然中来源的生物(包括病毒)中并且未被人类有意进行修饰的多肽或多核苷酸序列是天然发生的。
在本发明的内容中，使用了下列普遍存在的核酸碱基的缩写。“A”指腺苷，“C”指胞苷，“G”指鸟苷，“T”指胸苷，而“U”指尿苷。
除非另外指定，“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括彼此互为简并性版本且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白质和RNA的核苷酸序列可以包含内含子。
描述两种多核苷酸“可操作连接”指单链或双链核酸部分包含两种多核苷酸，它们在核酸部分中的排列方式使得两种多核苷酸中的至少一种能够对另一种发挥其特征性的生理学作用。例如，可操作连接基因编码区的启动子能够促进编码区的转录。
“多核苷酸”指核酸的单链或平行和反向平行链。因此，多核苷酸可以是单链或双链核酸。
术语“核酸”一般指大的多核苷酸。
术语“寡核苷酸”一般指短的多核苷酸，通常不超过大约50个核苷酸。可以理解，在将核苷酸序列表述成DNA序列(即A、T、G、C)时，这也包括RNA序列(即A、U、G、C)，其中“U”取代“T”。
在本文中使用常规符号来描述多核苷酸序列单链多核苷酸序列的左手端是5’端；双链多核苷酸序列的左手端称为5’方向。
向新生RNA转录本添加核苷酸的5’-3’方向称为转录方向。具有与mRNA相同序列的DNA链称为“编码链”；DNA链上位于DNA上参照点5’的序列称为“上游序列；DNA链上位于参照点3’的序列称为“下游序列”。
多核苷酸的“一部分”意为多核苷酸的至少大约二十个连续的核苷酸残基。应当理解多核苷酸的一部分可以包括所述多核苷酸的每一个核苷酸残基。
“引物”指能够与指定多核苷酸模板特异性杂交并提供合成互补多核苷酸的起点的多核苷酸。当多核苷酸引物处于诱导合成的条件下时，即存在核苷酸、互补多核苷酸模板、和聚合剂诸如DNA聚合酶，发生这种合成。引物通常是单链的，但是可以是双链的。引物通常是脱氧核糖核苷酸，但是多种合成和天然存在引物可用于许多应用。因设计与模板杂交而与其互补的引物担当合成的起始位点，但是不必反映模板的精确序列。在这种情况中，引物与模板的特异杂交依赖杂交条件的严谨度。可以用例如显色、放射性、或荧光模块来标记引物，并用作可检测部分。
“探针”指能够与指定的另一种多核苷酸序列特异杂交的多核苷酸。探针可与互补多核苷酸靶发生特异杂交，但是不必反映模板的精确互补序列。在这种情况中，探针与靶的特异杂交依赖杂交条件的严谨度。可以用例如显色、放射性、或荧光模块来标记探针，并用作可检测部分。
“重组多核苷酸”指具有在自然状况下不连在一起的序列的多核苷酸。可以在合适载体中包含扩增或装配得到的重组多核苷酸，并且可以将载体用于转化合适的宿主细胞。
重组多核苷酸还可以承担非编码功能(如启动子、复制起点、核糖体结合位点等)。
包含重组多核苷酸的宿主细胞称作“重组宿主细胞”。在重组宿主细胞中表达的基因产生“重组多肽”，其中所述基因包含重组多核苷酸。
“重组多肽”指通过表达重组多核苷酸而生成的多肽。
“多肽”指由由肽键相连的氨基酸残基、与它们相关的天然存在的结构变体、和合成的非天然存在的类似物组成的聚合物，与它们相关的天然存在的结构变体，及其合成的非天然存在的类似物。可以使用例如自动化多肽合成仪来合成合成性多肽。
术语“蛋白质”通常指大的多肽。
术语“肽”通常指短的多肽。
在本文中使用常规符号来描述多肽序列多肽序列的左手端是氨基端；多肽序列的右手端是羧基端。
如本文所用的，术语“启动子/调控序列”指表达与启动子/调控序列可操作连接的基因产物所需要的核酸序列。在一些情况中，该序列可以是核心启动子序列；在其它情况中，该序列还可以包括增强子序列和表达基因产物所需要的其它调控元件。启动子/调控序列可以是例如以组织特异方式表达基因产物的序列。
“治疗性”处理是为了减弱或消除病理征候的目的而对显现这些征候的受试者施用的处理。
化合物的“治疗上有效量”是足以向施用该化合物的受试者提供有益效果的化合物的量。
“载体”是一种物质组分，其包含分离的核苷酸并且其能够用于将分离的核酸递送到细胞内部。许多载体是本领域已知的，包括但不限于，线性多核苷酸、与离子性或两亲性化合物相关联的多核苷酸、质粒和病毒。因而，术语“载体”包括自主复制的质粒或病毒。该术语还应视为包括促进核酸传递到细胞中的非质粒和非病毒化合物，例如，例如，多聚赖氨酸化合物、脂质体等等。病毒载体的例子包括，但不限于，腺病毒载体、腺相关病毒载体、反转录病毒载体等等。
“表达载体”指包含重组多核苷酸的载体，所述重组多核苷酸包含可操作性连接到待表达核苷酸序列上的表达控制序列。表达载体包含足够的顺式作用元件进行表达；进行表达的其它元件可以由宿主细胞或在体外表达系统中提供。表达载体包括本领域已知的全部表达载体，如粘粒、质粒(如裸露的或包含在脂质体中)和掺入重组多核苷酸的病毒。
“核酸类似物”是通过化学合成由单体核苷酸类似物单位制成的DNA和RNA的经结构修饰的，聚合类似物，并且具有与核酸相关联的一些性质和特性。PNA和硫代磷酸酯寡核苷酸是本领域已知的许多核酸类似物的其中两种。″Watson/Crick碱基配对″和″Watson/Crick互补性″指通过氢键结合在一起的核苷酸及其类似物的特异性配对的模式，例如，A与T和U配对，而G与C配对。特异性碱基配对的作用为“杂交(hybridization)”或“杂交性的(hybridizing)”。当两条，或多条核酸或核酸类似物的互补链进行碱基配对时杂合体形成。
″缀合″或″缀合的″指共价的，离子性的，或疏水性相互作用，由此将分子的各部分控制在一起并且保持接近。
“接头”指一个或多个原子，其包含将核酸类似物连接到诸如肽、标记、修饰剂、稳定基团等等的部分上的链。
如本文所用的″嵌合体″指一种寡核苷酸，其包括一个或多个核苷酸或一个或多个核苷酸类似物单元。通过磷二酯和磷二酯类似物键连接单体单元。
″磷酸二酯类似物″或″核苷酸间(internucleotide)类似物″指天然磷酸二酯3′，5′-核苷酸间键的类似物，区别在于它们的组成和/或附于核苷酸上的位置，包括但不限于2′，5′-键、3′，3′-键、5′，5′-键、甲基膦酸酯、烷基化磷酸三酯、3′-N-氨基磷酸酯，和非桥连N-取代的氨基磷酸酯。
术语″2′-修饰的RNA″意为包含一个或多个核糖核苷酸的核酸类似物，其中在糖上的2′位置具有替代羟基的取代基。例如，2′-O-烷基RNA包含含有一个或多个核糖核苷酸的核酸类似物，其中在糖上的2′位置由-OR组成，其中R是低级烷基，如，但不限于，甲基或乙基部分(Sproat，1994，Protocols for Oligonucleotides andAnalogs，Humana Press)。
术语″浸透性的″和″可透性的″指本发明的构建体穿过细胞膜的能力，或归为细胞膜的易感性特征以便让构建体穿过它们(Alberts等，1989，Molecular Biology of the Cell，2nd Ed.，GarlandPublishing，New York)。
“标记”指共价附着于核碱基寡聚物的一端或两端上的基团。所述标记能够执行诸如给出信号用于通过荧光、化学发光和电化学发光的方式检测分子的功能。或者，所述标记允许通过特异性或非特异性方法进行分子的分离或固定(Andrus，1995，PCR 2A PracticalApproach，Oxford University Press，Oxford，pp.39-54)。标记包括，但不限于，荧光染料，如荧光素和若丹明衍生物(Menchen等，1993，美国专利号5,188,934；Bergot等，1994，美国专利号5,366,860)，酞菁染料，和能量传递染料(Clegg，1992，Meth.Enzymol.211353-388；Cardullo等，1988，PNAS 858790-8794)。
“光反应性标记”指在用光能进行该标记激活后变得在化学上有活性的标记。用于激活这些标记的光能包括，但不限于，可见光，紫外(UV)光，红外(IR)光等。激活的标记可以包含自由基，或其它高度反应性基团，并且可以与邻近的分子反应。通过非限制性实例的方式，苯甲酰苯丙氨酸(BPA)是一种光反应性氨基酸，其可以掺入肽中。用UV光激活BPA引发氨基酸的苯甲酰基部分得到释放，留下包含自由基的苯丙氨酸残基，其能够与邻近的其它氨基酸和/或蛋白质交联。
“检测”指在检测标记的基础上检测、观察，或测量构建体。
术语″不稳定的″指分子中的一个或多个键，其具有被试剂、酶，或细胞组分剪切的潜力。
术语“核碱基修饰的”指A，G，C，T，U的碱基配对衍生物，在DNA和RNA中发现的天然存在的核碱基。
″膜可透性构建体″指由两个或多个可独立识别的部分组成的分子，其中所述部分已经连接在一起以形成单一部分，或“构建体”，并且其中完整的构建体是膜可透性的。即，完整的构建体具有穿过脂质或细胞膜的能力。
当光反应性标记附着于，掺入，整合入，或连接到核酸类似物或细胞穿透性肽上时，该标记被“掺入”核酸类似物或细胞穿透性肽中。这包括标记偶联到核酸类似物或细胞穿透性肽的末端上，以及通过包括含有这种标记的核碱基或氨基酸类似物将所述标记掺入核酸类似物或细胞穿透性肽中。
描述I.核酸和核酸类似物A.编码细胞穿透性肽的核酸在一方面，本发明包括一种编码细胞穿透性肽(CPP)的分离核酸，或其功能性片段，其中所述CPP包含赋予CPP细胞穿透特性的氨基酸序列。如本领域技术人员将会理解的，CPP具有透过细胞膜，或穿过细胞膜进行运输的能力。另外，如本文其它地方所描述的，CPP具有携带货物穿过细胞膜的能力。这些货物包括，但不限于，肽、核酸、光反应性标记。CPP的其它特性包括，但不限于，诱导货物内吞入细胞中的能力。
CPP运输蛋白已经显示可渗透细胞(Pooga，M.，FASEB J.，12，67-77(1998))并且还穿过细胞膜将蛋白质如GFP和抗生物素蛋白-TRITC缀合物作为货物进行转位(Pooga，M.，等，FASEB J.，10，1096(2001))。此外，运输蛋白及其类似物被用于运输PNA反义寡聚物(Pooga，M.，等，Nat.Biotechnol.，16，857-61(1998))。所以，在一个实施方案中，本发明的CPP是TP10，其序列在SEQ ID NO1中给出。在本发明的另一个实施方案中，CPP是运输蛋白，其序列在SEQ ID NO6中给出。在本发明的另一个实施方案中，CPP是穿透素(RQIKIWFQNRRMKWKK；SEQ ID NO7(Derossi等，1994，J BiolChem 26910444-10450))。在本发明的又一个实施方案中，CPP是pTat(GRKKRRQRRRPPQ；SEQ ID NO8(Vives等，1997，J Biol Chem27216010-16017)。
编码TP10的核酸与具有SEQ ID NO1序列的核酸共有至少大约50％的同一性。优选地，该核酸与SEQ ID NO1具有大约60％同一性，更加优选地，该核酸与SEQ ID NO1具有大约65％同一性。优选地，该核酸与SEQ ID NO1具有大约70％同一性，更加优选地，该核酸与SEQ ID NO1具有大约75％同一性。优选地，该核酸与SEQ ID NO1具有大约80％同一性，更加优选地，该核酸与SEQ ID NO1具有大约85％同一性。优选地，该核酸与SEQ ID NO1具有大约90％同一性，更加优选地，该核酸与SEQ ID NO1具有大约95％同一性。优选地，该核酸与SEQ ID NO1具有大约97％同一性，更加优选地，该核酸与SEQ ID NO1具有大约98％同一性。优选地，该核酸与SEQ ID NO1具有大约99％同一性，更加优选地，该核酸与SEQ ID NO1具有大约99.9％同一性。还要更加优选地，该核酸与SEQ ID NO1相同，该核酸编码TP10。
本领域技术人员，当借助本文所给出的内容时，将会了解如何鉴定可用于本发明的编码TP10的核酸。简言之，当与包含至少一个光反应性部分的核酸类似物偶联时，可用于本发明的TP10能够形成膜透过性构建体。即，任何赋予TP10核酸类似物-光反应性部分构建体以膜透过性特性的TP10都被本发明所包括。类似地，熟练技术人员将会理解编码任何细胞穿透性肽的核酸也都包括在本发明中，所述细胞穿透性肽赋予TP10核酸类似物-光反应性部分构建体以膜透过性特性。
B.核酸类似物本发明涉及一种肽核酸(PNA)核酸类似物(Nielsen，P.E.，等，Science，2541497-1500(1991)；Bennet，C.，Biochem.Pharmacol.，559-19(1998))。PNA利用天然核碱基，其进行Watson/Crick碱基配对，通过中性、非手性的、聚[2-氨基乙基甘氨酸]酰胺主链连接，导致优良的杂交特性，即极高的特异性和亲和性(Egholm，M.，等，Nature，365566-68(1993)；Peffer，N.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，9010648-52(1993))。PNA不是任何已知核酸酶，蛋白酶，肽酶，或其它修饰性酶(Demidov，V.，等，Biochem.Pharmacol.，481310-13(1994))的底物，这是一种重要的特性，因为天然核酸、DNA和RNA能够被核酸酶快速降解(Akhtar，S.，等，Science 2611004-12(1991))。已经显示PNA在转录和翻译水平上封闭蛋白质表达，而微注射的PNA在完整细胞中显示强烈的反义效果(Knudsen，H.，等，Nucl.Acids Res.，24494-500(1996)；Knudsen，H.，等，Anticancer Drug，8113-18(1997))。通过杂交到靶多核苷酸上，PNA/DNA或PNA/RNA杂合双螺旋可以在转录水平上有效地抑制细胞内DNA的正常作用并且在翻译水平上抑制RNA的作用。以此方式，结合到在细胞内多核苷酸中发现的预定靶序列上的PNA可以进行延伸以鉴定也结合到这些多核苷酸上的多肽。不过，PNA寡聚物自身并未有效地递送或运输到细胞内部，这直到现在还阻碍PNA作为特异性识别多核苷酸-结合蛋白的手段而在体内应用(Nielsen，P.E.，等，Anti-Cancer Drug Design，853-63(1993)；(Hanvey，J.，等，Science 2581481-1485(1992)；(Knudsen，H.，等，AnticancerDrug，8113-18(1997))。
在本发明的一个实施方案中，PNA具有序列TACGAAACCTCTAAATCAAGG(SEQ ID NO3)，其对应于Ank mRNA的残基-123到-102。在另一个实施方案中，PNA具有序列AAACCTCTAAATCAAGGCCTC(SEQ ID NO4)，其对应于Ank mRNA的残基+1592到+1610。在本发明的又一个实施方案中，PNA具有序列AAGCGCGGCTGCTCTAGCAGAA(SEQ ID NO5)，其对应于Ank mRNA的残基+1594到+1614。
在本发明的另一个实施方案中，核酸类似物是经修饰的糖类似物。在一方面，对核酸类似物的至少一个核苷酸的糖部分进行修饰。在一个实施方案中，对核苷的2′-位置进行修饰。将具有2’-修饰核苷的寡核苷酸作为核酶、核酸酶耐受性反义类似物，以及其它细胞机制探针进行研究(Lamond，A.，等，Cell，58383-90(1989)；(Goodchild，J.，Nucleic Acids Research，204607-12(1992))。2’-O-烷基-寡核糖核苷的期望特性包括高度化学稳定性，基本上的RNA-和DNA-核酸酶耐受性(包括RNaseH)，以及提高的热双螺旋稳定性(Ohtsuka，E.，等，美国专利号5,013,830，1991年5月7日授权))。
在另一个实施方案中，核酸类似物的核糖核苷酸级分是2′-O-烷基核糖核苷酸，优选2′-O-甲基-核糖核苷酸。另外优选的经修饰的核糖核苷酸包括2′-O-烯丙基-核糖核苷酸，2′-烯丙基核糖核苷酸，2′-卤代-核糖核苷酸，2′-O-甲氧基乙基-核糖核苷酸，2′-分支基团-核糖核苷酸，和2′-O-分支基团-核糖核苷酸。
在本发明的另一个实施方案中，在1’-位置上对一个或多个核苷酸进行修饰。在一方面，所述1’-位置包括α-异头核苷酸碱基，其中糖的1’-位置的天然立体化学倒转，即杂环和5’-原子位于反式方向而非顺式方向(Morvan F.，等，Nucleic Acids Research，145019-35(1986))。1′-位置也可以具有分支性基团(Azhayeva，E.，等，Nucleic Acids Res.，231170-76(1995))。或者，经修饰的糖类似物是碳环核苷酸，其中糖的4′-氧原子被碳、硫，或氮原子代替(Perbost等，Biochem.Biophys.Res.Comm.，165742-(1989))。
在本发明的另一个实施方案中，构成核酸类似物部分的核苷酸的至少两个通过非标准的核苷酸间键连接。通过非限制性实例的方式，非标准的核苷酸间键包括2′-5′-键，反向3′-3′和5′-5′键，甲基膦酸酯，非桥连N-取代的氨基磷酸酯，烷基化磷酸三酯分支结构，3′-N-氨基磷酸酯，肽核酸(PNA)，和非核苷性聚合物等。术语“非核苷性聚合物”指不是多核苷酸的聚合物，例如，聚环氧乙烷，多肽，聚丙烯酰胺，和多糖。
在本发明的又一个实施方案中，核酸类似物中的至少一种核苷酸包括经修饰的核碱基。本发明的核碱基修饰包括，但不限于，C-5-烷基嘧啶，2，6-二氨基嘌呤，2-硫代嘧啶，C-5-丙炔嘧啶，7-脱氮杂嘌呤，异胞嘧啶和异鸟嘌呤，和通用碱基，其在显示Watson/Crick碱基配对杂交相互作用中显示减弱的碱基特异性识别作用，例如，3-硝基吡咯(Nichols，R.，等，Nature，369492-3(1994))和5-硝基吲哚(Loakes，D.，等，Nucleic Acids Research，224039-43(1994))。
一般，本发明的核苷酸类似物的设计和合成遵照常规教导。通过非限制性实例的方式，利用亚磷酰胺化学方法在自动固相DNA合成仪上合成核酸类似物(Beaucage，S.L.，等，Tetrahedron，482223-2311(1992))；(Caruthers，M.，等，美国专利号4,415,732，1983年11月15日出版)；例如ABI 392或394 DNA合成仪(PEApplied Biosystems，Foster City，Calif.)，或在自动固相肽合成仪上合成，例如ABI 433肽合成仪(PE Applied Biosystems，Foster City，Calif.)。
一般利用已知的合成技术来合成本发明的核苷酸类似物。用来形成多核苷酸的化学方法是本领域公知的，并且能够在诸如Beaucage，1992的参考文献中发现。对于制备本发明的核酸类似物而言，多核苷酸合成的亚磷酰胺法是优选的方法，这是因为它的有效和快速偶联以及起始核苷单体的稳定性。合成一般以附于固体支持物上的正在生长的聚合物链进行，从而可以通过过滤轻易除去液相的多余试剂，由此消除了在循环之间对于纯化步骤的需要(Caruthers，M.，等，美国专利号4,458,066，1984年7月3日授权)。
在高分子量分子如核酸类似物、肽和构建体的分析和纯化中高分辨率和分离效率是挑战性的，所述高分子量分子由于电荷和分子内氢键而经常采用多重、稳定的构象。在用于传统的HPLC分离的非变性反相条件下，可能存在多重峰，使产物鉴定和收集变得复杂。
所以，在本发明的一个实施方案中，可以利用具有7M尿素作为变性剂的平板聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)进行构建体的分析和纯化。通过在标准条件下进行样品的电泳，在UV光下显影后切去条带，于室温浸于水中过夜，并且在寡核苷酸纯化盒上进行脱盐/浓缩，来从电泳运行中分离构建体。在多聚吸附剂(例如，Dionex NucleoPac PA100；4.times.250mm，Dionex Co.)上的阴离子交换HPLC能够给出良好的分辨率，可以预测的洗脱模式，以及可重复的滞留时间。有用的构建体方案必需下列流动相-溶剂A100mM NaCl，在10％乙腈中的10mM NaOH(pH 12)；溶剂B800mM NaCl，在10％乙腈中的10mM NaOH(pH 12)；洗脱流速＝1.0Ml/min；和从0min的0％B到25min的80％B的线性梯度(Andrus，A.，等，HPLC ofMacromolecules，Oliver，R.W.A.(ed.)，Oxford University Press，Oxford，pp.141-70(1998))。不过，本发明不应当仅仅限定于本文所述的这些纯化条件上。相反，熟练的技术人员，当借助于本说明书时，将理解存在其它的分离和纯化方法。见，例如，Koch等，1997，J.Pept.Res.4980-8，将其全部掺入本文作为参考。
C.具有光反应性标记的核酸类似物本发明涉及一种核酸类似物，其包括至少一种光反应性标记。即，本发明的核酸类似物包含至少一种光反应性标记。在本发明的一个实施方案中，光反应性标记是光反应性氨基酸。本发明的光反应性标记可用于核酸类似物与核酸结合蛋白的交联，所述核酸结合蛋白结合到所述核酸类似物结合的相同多核苷酸上。在本发明的一个实施方案中，使用光反应性标记将PNA与RNA结合蛋白交联。
根据本发明的可用于交联的光反应性标记的例子包括，但不限于，叠氮化合物，重氮化合物等等。当使用光反应性标记时，典型的交联条件包括在大约4℃高至大约40℃的温度范围上暴露于紫外线辐射持续大约0.1分钟到大约10分钟的时间，距离含有标记的样品为0.1到100英寸。不过，本发明不应被视为受限于这些条件，并且熟练的技术人员将会理解，当借助于本文给出的内容时，交联条件可以根据条件和任何特定情况的需要进行变化。
通过非限制性实例的方式，可用于本发明的光反应性氨基酸包括，但不限于对苯甲酰苯丙氨酸，对叠氮基苯丙氨酸。可用于本发明的其它光反应性标记包括，但不应视为受限于，苯甲酰基苯甲酰基(BzBz)部分，叠氮化物部分，4-苯甲酰苯甲酸衍生物，4-叠氮基-2，3，5，6，-四氟苯甲酸衍生物，和N-((2-吡啶基二硫代)乙基)-4-叠氮邻羟基苯甲酰胺衍生物等等。
如本文其它地方所详细描述的，可以将光反应性部分掺入核酸类似物。在本发明的一个实施方案中，光反应性部分被化学连接于本发明的核酸类似物上。在另一个实施方案中，将光反应性标记作为氨基酸或肽构建体的一部分与核酸类似物连接。例如，可以将光反应性氨基酸通过酯介导偶联化学连接于PNA上。或者，所述光反应性氨基酸通过光反应性氨基酸键合的一个或多个氨基酸连接于PNA上。基于本文所给出的内容，熟练的技术人员将会理解如何利用本领域公知的合成方法将光反应性部分偶联到核酸类似物上。
光反应性部分还可以掺入CPP，并且所述CPP因此与核酸类似物化学偶联，从而将光反应性部分掺入核酸类似物上。将核酸类似物偶联到CPP上的方法在本文其它地方进行详细描述。通过将光反应性部分偶联到CPP的末端上，偶联到CPP中的残基侧链上，或偶联到CPP的主链上，可以将光反应性部分掺入CPP中。还可以通过包括光反应性部分作为氨基酸残基的一部分，或CPP的其它亚基而将光反应部分掺入CPP中，由此通过将氨基酸残基或其它亚基掺入CPP结构中的方式而使得光反应性部分成为CPP的整体部分。
光反应性部分还可以掺入用来将核酸类似物与CPP相偶联的接头部分中。在一个实施方案中，光反应性部分被包含在用来将核酸类似物与CPP相偶联的接头部分中。所述光反应性部分可以内部定位于接头中，或者所述光反应性部分可以在接头的一端上。在另一个实施方案中，光反应性部分是用来将核酸类似物与CPP相偶联的接头。
在本发明的所有实施方案中，应当理解可以在核酸类似物内位置的任何组合之核酸类似物、CPP，或偶联CPP和核酸类似物的接头中，掺入一个以上的光反应部分。
D.其它核酸本发明不应当被视为仅限于本文所公开的核酸类似物，或核酸或由其编码的多肽。一旦借助于本发明，对于本领域技术人员来说，显而易见能够按照本文所述的方法以及本领域公知的和要发展的方法获得其它核酸，本文所述的方法如本文在实验细节部分对于生成其它核酸和核酸类似物所公开的方法(例如，定点诱变，框架移位突变，各种化学合成和修饰方法等等)。
另外，利用本领域公知的重组DNA方法如，例如，在Sambrook等(2001，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory Press，New York)和Ausubel等(1997，CurrentProtocols in Molecular Biology，Green&Wiley，New York)中描述的方法，任何其它方法都可以用于生成CPP的衍生物或其它形式。通过改变编码多肽的DNA序列将氨基酸改变导入蛋白质或多肽中的方法是本领域公知的并且也在Sambrook等(2001，同上)；Ausubel等(1997，同上)中描述。
II.肽和多肽本发明包括分离的细胞穿透性肽(CPP)。如本文其它地方所详细描述的，CPP具有透过细胞膜，或者穿过细胞膜进行运输的能力，以及携带货物穿过细胞膜的能力。在本发明的一方面，包含CPP的分离多肽与具有SEQ ID NO2(AGYLLGKINLKALAALAKKIL)的氨基酸序列，或其片段至少大约50％相同。优选地，分离的CPP与SEQ ID NO2，或其片段至少大约55％相同，更加优选地，大约60％相同，更加优选地，大约65％相同。还要更加优选地，分离的CPP与SEQ ID NO2，或其片段至少大约70％相同，更加优选地，大约75％相同，更加优选地，大约80％相同。更加优选地，分离的CPP与SEQ ID NO2，或其片段至少大约85％相同，更加优选地，大约90％相同，更加优选地，大约95％相同。还要更加优选地，分离的CPP与SEQ ID NO2，或其片段至少大约96％相同，更加优选地，大约97％相同，更加优选地，大约98％相同，并且还要更加优选地，大约99％相同。最优选地，包含CPP的分离多肽的部分为SEQ ID NO2，TP10的氨基酸序列。
熟练的技术人员，当借助本文给出的内容时，将会了解如何鉴定可用于本发明的CPP。简言之，可用于本发明的CPP是当与包含至少一个光反应性部分的核酸类似物偶联时能够形成膜可透性构建体的CPP。即，任何赋予CPP核酸类似物-光反应性部分构建体以膜透过性特性的CPP都被本发明所包括。
在一个实施方案中，由于CPP是TP10，其序列在SEQ ID NO2中给出。在本发明的另一个实施方案中，CPP是穿透素(RQIKIWFQNRRMKWKK；SEQ ID NO7(Derossi等，1994，J Biol Chem26910444-10450))。在本发明的又一个实施方案中，CPP是pTat(GRKKRRQRRRPPQ；SEQ ID NO8(Vives等，1997，J Biol Chem 27216010-16017)。大体上，所有称为CPP或膜转位序列或蛋白质转导结构域的肽都在(Eiriksdottir等，2004，Drug Delivery Reviews 1161-173)中进行了综述。
在本发明的又一个实施方案中，CPP是运输蛋白(Pooga，M.，等，FASEB J.，1267-77(1998))。运输蛋白可以通过如在本文其它地方所详述的包括生物学蛋白质合成和化学肽合成的一种或多种方法进行完整地或部分地合成。在另一个实施方案中，也如本文其它地方所述的，运输蛋白可以缀合到核酸类似物上。运输蛋白的序列如下GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL-酰胺(SEQ ID NO6).运输蛋白(galparan)是来自神经肽促生长激素神经肽N端(Bartfai，T.，Raven Press，1185 Ave of the Americas，New York，N.Y.10036(1995))的27氨基酸肽；(Habert-Ortoli，E.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，919780-83(1994))，以及C端的mastoparan，两种片段通过赖氨酸连接。如使用生物素标记的类似物Nδ13-生物素基-运输蛋白通过间接免疫荧光所判定的，运输蛋白是细胞穿透性肽。运输蛋白的吸收快速而有效，生物素基-运输蛋白的内化作用是能量依赖型的并且从0到37℃有效发生，并且于37℃在大约20min内达到最大细胞内收缩。运输蛋白的细胞穿透性能力并不受细胞类型所限，但是为所述肽序列的一般特征(例如，见Langel等，美国专利号6,025,140)。
不过，可用于本发明的CPP不应当限于本文公开的那些。相反，熟练的技术人员，当借助于本说明书时，将会理解任何能够将核酸类似物运输到细胞内的CPP，现在已知的或尚待发现的，都应当视为被本发明所包括。如本文所公开的，本发明还提供包含CPP的蛋白质或肽的类似物。通过保守性氨基酸序列差异或通过不影响序列的修饰，或二者，类似物可以区别于天然发生的蛋白质或肽。例如，可以进行保守性氨基酸改变，尽管它们改变了蛋白质或肽的一级序列，但正常情况下不改变其功能。保守性氨基酸取代一般包括下列组中的取代甘氨酸，丙氨酸；缬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸；天冬氨酸，谷氨酸；天冬酰胺，谷氨酰胺；丝氨酸，苏氨酸；赖氨酸，精氨酸；苯丙氨酸，酪氨酸。
修饰(其正常情况下不改变一级序列)包括体内，或体外的多肽的化学衍生化作用，例如，乙酰化作用，或羧化作用。还包括糖基化的修饰，例如，通过在其合成过程中改进多肽的糖基化作用模式进行的修饰；例如，通过将多肽暴露于影响糖基化作用的酶，例如，哺乳动物糖基化或去糖基化酶进行的修饰。还包括具有磷酸化氨基酸残基的序列，例如，磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，或磷酸苏氨酸。
还包括已经利用普通分子生物学技术进行修饰的多肽，从而提高它们对于蛋白水解降解作用的耐受性或优化溶解性特性或使它们更适合作为治疗剂。这些多肽的类似物包括那些含有除了天然发生的L-氨基酸之外的残基的多肽，所述残基例如，D-氨基酸或非天然发生的合成氨基酸。本发明的肽并不限于本文所列的特定示范性方法的产物。
本发明还应当视为包括本发明肽的“衍生物”和“变异体”(或编码其的DNA)，所述衍生物和变异体是已经在一个或多个氨基酸上改变了的CPP(当涉及编码其的核苷酸序列时，在一个或多个碱基对上被改变)，从而得到的肽(或DNA)与本文列举的序列不相同，但是具有与本文公开的肽相同的生物学特性，因为所述肽具有本发明的CPP的生物学/生物化学特性。例如，CPP运输蛋白的衍生物可以具有加到所述肽任一端上的一个或多个其它氨基酸。这些生物学/生物化学特性包括，但不限于，穿过细胞膜运输货物。
本发明还包括一种或多种标记加到其上的肽。标记可以用于鉴定和/或纯化所述肽，或用于鉴定所述肽的生物学作用或生物学相互作用。可用于本发明的标记应当具有独特的或可确认的特征，如荧光、放射性信号、光发射、磷光、顺磁性等等，其可以利用本领域已知的分光镜或分光光度计技术进行检测。可用于本发明的蛋白标记包括，但不应限于，生物素、二硝基苯、吖啶、荧光、若丹明、酞菁(如Cy3和Cy5等)、洋地黄毒苷，嵌入剂、小沟结合剂、化学发光剂前体、硒、镉、可用于量子斑点技术的标记等等。
如本文所用的，如下表所示，对于氨基酸通过它的全名，通过对应于它的三字母密码子，或通过对应于它的单字母密码子进行表示全名三字母密码子单字母密码子天冬氨酸Asp D谷氨酸 Glu E赖氨酸 Lys K精氨酸 Arg R组氨酸 His H酪氨酸 Tyr Y半胱氨酸Cys C天冬酰胺Asn N谷氨酰胺Gln Q丝氨酸 Ser S苏氨酸 Thr T甘氨酸 Gly G丙氨酸 Ala A缬氨酸 Val V
亮氨酸Leu L异亮氨酸 Ile I甲硫氨酸 Met M脯氨酸Pro P苯丙氨酸 Phe F色氨酸Trp W通过如Stewart等(Solid Phase Peptide Synthesis，2ndEdition，1984，Pierce Chemical Company，Rockford，Illinois)所述和如Bodanszky和Bodanszky(The Practice of PeptideSynthesis，1984，Springer-Verlag，New York)所述的标准的充分确证的固相肽合成(SPPS)可以轻易制备本发明的肽。最初，将适当保护的氨基酸残基通过其羧基附于衍生的不可溶聚合支持物上，如交联的聚苯乙烯或聚酰胺树脂。“适当保护的”指保护性基团存在于氨基酸的两个α-氨基基团上，以及存在于官能团的任何侧链上。侧链保护性基团一般对于整个合成中所用的溶剂、试剂和反应条件稳定，并且可以在不会影响最终肽产物的条件下去除。通过从起始氨基酸上去除N-保护性基团，并且将其偶联到所需肽序列中的下一个氨基酸的羧基末端上进行寡肽的逐步合成。这一氨基酸也进行适当地保护。可以将引入氨基酸激化以便通过形成反应性基团如形成碳二亚胺，对称性酸酐或“活性酯”基团如羟基三唑甲苯或五氟苯基酯。
固相肽合成方法的例子包括利用叔丁氧羰基作为α-氨基保护性基团的BOC法，以及利用9-芴基甲氧羰基保护氨基酸残基的α-氨基的FMOC法，这两种方法都是本领域技术人员公知的。
利用固相肽合成方法的传统方案也能够实现N-和/或C-封闭基团的掺入。为了掺入C末端封闭基团，例如，一般利用支持性树脂作为固相进行所需要肽的合成，所述支持性树脂已经进行过化学修饰从而由树脂上剪切致成具有所需要C末端封闭基团的肽。为了提供C末端具有原初氨基封闭基团的肽，例如，利用对甲基二苯甲胺(MBHA)树脂进行合成，当肽合成完成时，用氢氟酸处理释放出所需的C末端酰胺化肽。类似地，利用N-甲基氨基乙基衍生化的DVB，树脂实现在C末端上掺入N-甲胺封闭基团，其在HF(氢氟酸)处理后释放出具有N-甲基酰胺化C末端的肽。利用常规方法也可以实现酯化作用对C末端的封闭。这必需利用树脂/封闭基团的组合，其允许从树脂上释放侧链肽，以便随后与所需醇进行反应，以形成酯官能。FMOC保护性基团，结合以甲氧基烷氧基苯甲醇或等同接头的DVB树脂可以用于这一目的，从支持物上剪切受到二氯甲烷中的TFA影响。随后通过添加所需的醇可以进行例如用DCC对适当活化的羧基官能的酯化作用，接着进行酯化肽产物的去保护和分离。
例如通过用合适的酐和腈处理，可以实现N末端封闭基团的掺入同时合成的肽仍然附于树脂上。为了在N末端上掺入乙酰基封闭基团，例如，树脂偶联的肽可以用乙腈中的20％乙酸酐进行处理。随后可以将N-封闭的肽产物从树脂上剪切下来，去保护并且随后进行分离。
为了确保由化学或生物学合成技术获得的肽是所需的肽，应当进行肽组合物的分析。利用高分辨率质谱分析可以进行这种氨基酸组合物分析以确定肽的分子量。备选地，或另外，通过在水溶液中水解肽，利用HPLC或氨基酸分析仪分离、鉴定和量化混合物的组分可以确认所述肽的氨基酸含量。也可以使用蛋白质测序仪明确测量所述肽的序列，所述蛋白质测序仪连续降解肽并且按顺序鉴定氨基酸。
在其应用前，将所述肽纯化以除去污染物。在这方面，应当理解将对所述肽进行纯化以便符合适当调控机构给出的标准或者用作特定用途。可以利用任一种常规纯化方法以达到所需的纯度水平，包括，例如，使用烷化硅柱如C4-，C8-或C18-硅的反相高压液体层析(HPLC)。一般使用提高有机含量的梯度流动相来实现纯化，例如，水性缓冲液中的乙腈，通常包含小量的三氟乙酸。还可以使用离子交换层析来基于它们的电荷分析肽。
III.膜可透性构建体本发明进一步包括一种分离的肽构建体，其包含分离的肽和非肽部分。本发明的构建体的肽部分包含细胞穿透性肽(CPP)。本发明的非肽部分包括核酸类似物，其进一步包含光反应性部分。所述核酸类似物包含一种核酸序列，其特异性地结合到预定的细胞内核酸序列上。本发明的构建体的用途是CPP能够携带货物，如核酸结合部分，穿过细胞膜并且进入细胞。
在构建体穿过细胞膜运输后，并且在所述构建体的核酸类似物部分结合到预定序列上后，所述核酸类似物的光反应性部分邻近核酸结合蛋白，所述核酸结合蛋白也结合到含有所述预定核酸序列的多核苷酸上。在激活核酸类似物上的光反应性部分后，可以将激活部分化学交联到所述核酸结合蛋白上。随后核酸类似物-核酸结合蛋白交联复合物的特异性分离可以促进核酸结合蛋白的鉴定。
在本发明的一个实施方案中，将CPP运输蛋白用于把PNA反义核酸类似物细胞内递送到细胞里的进展性长合mRNA中的特异性位点(″ank，″也叫作″termesin″)。通过二硫键的方式，将光反应性氨基酸加合物，对苯甲酰苯丙氨酸(BPA)，附于反义PNA上，并且将PNA-BPA缀合物附于运输蛋白。在通过运输蛋白穿过细胞膜运输PNA后，所述PNA杂交到ank mRNA靶标上。对包含PNA的细胞进行UV辐射激活了BPA，引发BPA的苯甲酰部分释放出来，并且生成游离的苯丙氨酸基团，其能够交联最近的物质，即，结合到ank靶标RNA上的RNA结合蛋白(RNP)。随后通过生物素标记的有义寡核苷酸的杂交来分离交联的PNA-RNP复合物，所述有义寡核苷酸对于PNA的序列是反义的并且偶联到链霉抗生物素磁珠上。
以此方式，根据本发明的PNA退火和RNA结合特征鉴定(″PARC″)提供了一种体内方法，通过它可以鉴定与任何靶标mRNA相互作用的RBP。通过非限制性实例的方式，鉴定与长合(ank)mRNA复合的蛋白质可以阐明编码的无机焦磷酸盐转运蛋白的表达调控机制。
制备本发明的构建体的一般缀合策略是分开合成核酸类似物和肽部分。试剂合自动合成仪是可商购的，用于合成肽和核酸类似物。每种部分都可以进一步衍生以包含反应性功能来形成联接。核酸类似物可以通过任何合适的键共价偶联到肽上。在本发明的一个实施方案中，合适的键包括不稳定键，如二硫化物。为了形成构建体中核酸类似物与肽之间的二硫键，可以将两个部分衍生成包含巯基，其中一个能够包含离去基团。在本发明的另一个实施方案中，可以利用抗生物素蛋白-生物素化学法形成核酸类似物与肽之间的联接。将抗生物素蛋白和生物素偶联到核酸类似物和肽上的方法是本领域公知的并且将不在此进行讨论。
不稳定接头将允许CPP-核酸类似物构建体的降解，其在一些条件下对于有害效应的减弱，或者对于核酸类似物功能的优化可以是重要的。对于细胞内递送，可能使用各种不稳定接头。通过非限制性实例的方式，可以使用二硫键，pH敏感性接头和蛋白酶/核酸酶底物。由于高浓度(mM范围)的谷胱甘肽，细胞内环境在化学势上是高度还原性的。含有巯基的谷胱甘胶能够以氧化(二硫化物)或还原(巯基)形式存在，其比例由谷胱甘肽-S-转移酶，以及其它氧化性物质调节。包含二硫键的化合物进行与还原型谷胱甘肽的反应，形成还原型二硫键和氧化型谷胱甘肽。对于包含二硫键的CPP缀合物，该过程已经由Hllbrink等(2001，Biochim Biophys Acta.1515101-9)进行了特征描述。
这些构建体可以直接在细胞膜上，或者在其它情况下，通过内吞作用穿过膜。内吞吸收机制包括内化作用后内吞媒介物的pH下降。所以，在本发明的一个实施方案中，使用pH敏感性接头以增强核酸类似物在pH改变后从CPP上释放出来。可用于此目的的接头包括环状、不饱和的马来酰胺酸酯，和13-酰基腙等(Fletcher等，2004，OrgLett.64245-4248；Braslawsky等，1991，Cancer ImmunolImmunother.33367-74)。在本发明的另一个实施方案中，酶，如青霉素G酰基转移酶，可以用来介导CPP从核酸类似物中的分离。(Grether等，2001，Chemistry 7959-971.)在本发明的另一个实施方案中，通过将一个部分附于驱动内化作用的核酸类似物，如PNA上来提高核酸类似物内化到细胞中。这些部分包括，但不应限于，(Lys)1-4，CPP-(PNA是否附于肽的N-或C-末端上依赖于CPP的结构需要，所以核酸类似物可以附于肽中的内部侧链上；Pooga等，1998，FASEB J.1267-77)，内化的配体，通过二硫键的方式附于核酸类似物上的肽或配体，核定位信号，高度带正电七聚体，如来自SV40核心蛋白的PKKKRKV。在本发明的一个实施方案中，[N13ε-Cys(Npys)]运输蛋白是附着的部分。
在本发明的一个实施方案中，本文给出的核酸类似物和CPP肽部分的缀合或偶联的方案，包括在半胱氨酸氨基酸上以硝基吡啶基离去基团(Npys)衍生的核酸类似物，如在实验性实施例中更加详述的那样。由肽的Npys基团替换核酸类似物的巯基产生二硫键连接的构建体。
本发明还涉及为了在细胞内结合预定核酸序列而进行的亲水性物质，例如核酸类似物的细胞内递送。在本发明的一个实施方案中，预定核酸序列是DNA。在本发明的另一个实施方案中，预定核酸序列是RNA。在一方面，RNA是主动长合磷酸转运蛋白RNA。在另一方面，RNA是编码谷氨酸盐受体的RNA。光反应性核酸类似物靶向到任何这种RNA序列上都允许结合到这些RNA序列上的蛋白质的交联、分离和鉴定。
所以，当借助于首次在此给出的内容时，熟练的技术人员将会理解，本发明可用于鉴定涉及任何疾病或状况的的发病和进展的机制，所述疾病或状况由RNA结合蛋白(RBPs)进行翻译后调控。这些疾病包括，但不限于，癫痫症、风湿病、癌症、运动神经元疾病，以及智力迟钝。包括在此范围内的分子机制包括，但不限于，ank mRNA调控，谷氨酸受体mRNA调控，脆弱性X疾病，癫痫症，三核苷酸重复疾病(如亨廷顿病)，和外伤性脑损伤。所以本发明提供一种有力的新工具用于理解和使用基础分子生物学以便发展新疗法。
熟练技术人员还会理解本文所述的构建体和方法能够与来自活体物种的细胞一起使用。这是因为本发明实现了一种改进的，更加有效的药物发现，帮助鉴定新的治疗性干涉点，并且提供了一种一般化的方法，用于通过本发明CPP构建体的膜透过活性的方式将核酸类似物导入基本上任何细胞中。
IV.载体在其它的相关方面，本发明包括一种分离的核酸，其编码可操作性连接到包含启动子/调控序列的核酸上的CPP，从而所述核酸优选能够指导所述核酸编码的肽的表达。因而，本发明包括表达载体和方法，用于将外源DNA导入细胞中，所述外源DNA在细胞中伴随性表达，所述细胞如，例如，在Sambrook等(2001，Molecular CloningALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，New York)，和在Ausubel等(1997，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，New York)中所述的那些。
细胞中CPP的表达，不论是单独地或融合到可检测标签多肽上，可以通过生成质粒、病毒，或其它类型的载体而完成，所述载体包含可操作性连接到启动子/调控序列上的所需核酸，所述启动子/调控序列作用来在有或无标签的情况下驱动蛋白质在导入载体的细胞中表达。许多可用于驱动基因构成性表达的启动子/调控序列是本领域已有的并且包括，但不限于，例如，巨细胞病毒立即早期启动子增强子序列，SV40早期启动子，以及劳氏肉瘤病毒启动子等。而且，编码CPP的核酸的可诱导的和组织特异性的表达可以通过将编码CPP的核酸在有或无标签的情况下，置于可诱导的或组织特异性启动子/调控序列的控制之下而完成。组织特异性或可诱导的启动子/调控序列的例子包括，但不限于MMTVLTR可诱导启动子，和SV40晚期增强子/启动子。此外，本领域公知的启动子也包括在本发明中，所述启动子响应于诱导剂如金属、糖皮质激素、激素等等而得以诱导出来。因而，应当理解本发明包括任何启动子/调控序列的用途，所述启动子/调控序列是已知的或未知的，能够驱动可操作性连接到其上的所需蛋白质的表达。
利用载体表达CPP允许分离大量的重组产生的蛋白质。另外，由启动子/调控序列驱动的CPP的表达能够允许CPP在各种细胞和组织类型中表达。所以，本发明不仅包括生产用于本发明方法中的CPP的方法，本发明还进一步包括在任何本领域已知的细胞或组织类型中表达CPP的方法，所述细胞包括真核细胞、原核细胞、来自真核生物的组织样品等等。
任何特定质粒载体或其它DNA载体的选择不是本发明中的限制性因素并且大量的载体是本领域公知的。另外，技术人员能够轻易选择特定启动子/调控序列并且将这些启动子/调控序列可操作性地连接到编码所需多肽的DNA序列上。这些技术是本领域公知的并且在，例如，Sambrook等(2001，Molecular CloningA Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory，New York)，和在Ausubel等(1997，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，NewYork)中得以描述。
本发明因而包括一种载体，其包含分离的编码CPP的核酸。将所需核酸掺入载体以及载体的选择是本领域公知的并且在，例如，Sambrook等(2001，Molecular CloningA Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory，New York)，和在Ausubel等(1997，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，NewYork)中得以描述。
本发明还包括含有这些载体的细胞、病毒、原病毒等等。生产包含载体和/或外源核酸的方法是本领域公知的。见，例如，Sambrook等(2001，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory，New York)，和在Ausubel等(1997，CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，New York)。
可以将编码CPP的核酸克隆入各种质粒载体中。不过，本发明不应当视为被质粒或被任何特定载体所限制。相反，本发明应当视为包括广泛的载体，所述载体可以轻易获得和/或是本领域公知的。
V.重组细胞本发明包括含有编码CPP的分离核酸，编码特异性结合CPP的抗体的核酸等等的重组细胞。在一方面，所述重组细胞能够以编码一部分编码CPP的核酸的质粒进行瞬时转染。所述核酸不需要整合入细胞基因组也不需要在细胞中表达。而且，该细胞可以是原核或真核细胞并且本发明不应当被视为受限于任何特定细胞系或细胞类型。这些细胞包括，但不限于，大肠杆菌(E.coli)、昆虫细胞、酵母细胞和哺乳动物细胞。
VI.抗体本发明进一步包括特异性结合本发明的CPP、核酸类似物，或CPP-核酸类似物构建体，或其片段的抗体。
基于本文提供的内容，本领域技术人员将会理解，特异性结合CPP、核酸类似物，或CPP-核酸类似物构建体的抗体可用于在细胞、组织或器官中检测这些分子等。所述抗体还可以用于分离和/或纯化CPP，核酸类似物，或CPP-核酸类似物构建体。另外，一旦CPP-核酸类似物构建体通过包含在构建体内的可光激活的部分交联到RBP上，抗体能够用来分离和/或纯化交联的复合物。
利用标准的抗体生产方法，如在例如，Harlow等(1988，InAntibodies，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，NY)中所述的方法，通过用抗原接种所述的动物并且分离特异性结合其抗原的抗体来完成多克隆抗体的生成。这些技术包括用嵌合性蛋白免疫动物，所述嵌合性蛋白包含另一种蛋白的一部分如麦芽糖结合蛋白或谷胱甘肽(GSH)标签多肽部分，和/或一种部分，从而使CPP、核酸类似物，或CPP-核酸类似物构建体具有免疫原性(例如，缀合以钥血蓝蛋白，KLH的CPP)。通过将合适的编码CPP、核酸类似物，或CPP-核酸类似物构建体的核酸(例如，SEQ ID NO2)克隆入适于这种目的的质粒载体，如但不限于pMAL-2或pCMX中来生成所述嵌合性蛋白。
不过，本发明不应当视为单单限于结合CPP、核酸类似物，或CPP-核酸类似物构建体的多克隆抗体。相反，本发明应当被视为包括结合CPP、核酸类似物，或CPP-核酸类似物构建体，并且当存在于蛋白质印迹上或在细胞裂解物中时能够结合这些分子的抗体。
基于本文提供的内容，本领域技术人员将会理解，能够特异性结合蛋白质的任何部分或全长蛋白质的抗体能够用于生成对其特异性的抗体。不过，本发明并不限于使用全长分子作为免疫原。相反，本发明包括利用分子的免疫原部分来生产特异性结合CPP、核酸类似物，或CPP-核酸类似物构建体的抗体。即，本发明包括利用CPP、核酸类似物，或CPP-核酸类似物构建体的免疫原部分或抗原决定子来免疫动物。
抗体能够通过用CPP、核酸类似物，或CPP-核酸类似物构建体，或其部分，或通过利用包含至少一部分的CPP、核酸类似物，或CPP-核酸类似物构建体或融合蛋白的蛋白质免疫动物进行生产，如，但不限于，兔或小鼠，所述融合蛋白包括标签多肽部分，其包含，例如，麦芽糖结合蛋白肽部分，与包含适合的CPP、核酸类似物，或CPP-核酸类似物构建体的部分共价连接。熟练技术人员也能够利用较小的这些蛋白质的片段来生产特异性结合适合的CPP、核酸类似物，或CPP-核酸类似物构建体的抗体。
针对蛋白质全长或肽片段的单克隆抗体或肽可以利用任何公知的单克隆抗体制备方法进行制备，如那些，例如，在Harlow等(1988，InAntibodies，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，NY)和在Tuszynski等(1988，Blood，72109-115)中描述的方法。还可以利用化学合成技术合在所需肽的量。或者，可以克隆编码所需肽的DNA并且在适于生成大量肽的细胞中由合适的启动子序列进行表达。利用本文提及的标准方法由用所述肽免疫的小鼠生成针对所述肽的单克隆抗体。
利用本领域中现有的，并且在，例如Wright等(1992，CriticalRev.Immunol.12125-168)，以及其中引用的参考文献中描述的技术可以克隆和测序利用本文所述方法获得的编码单克隆抗体的核酸。
另外，利用在，例如，Wright等(1992，Critical Rev.Immunol.12125-168)，以及其中引用的参考文献，和在Gu等(1997，Thrombosis and Hematocyst 77755-759)中所述的技术可以对本发明的抗体进行“人源化”。本发明还包括与CPP、核酸类似物，或CPP-核酸类似物构建体的表位特异性反应的人源化抗体的应用。这些抗体能够特异性结合CPP、核酸类似物，或CPP-核酸类似物构建体，或其片段。本发明的人源化抗体具有人框架并且具有一个或多个来自抗体的一种或多种互补决定区(CDRs)，所述抗体一般为，但不限于小鼠抗体，它与CPP、核酸类似物，或CPP-核酸类似物构建体，或其片段特异性反应。
当用于本发明的抗体得以人源化时，所述抗体可以如在Queen，等(U.S.Patent No.6,180,370)，Wright等，(1992，Critical Rev.Immunol.12125-168)以及其中引用的参考文献，或在Gu等(1997，Thrombosis and Hematocyst 77(4)755-759)中所述的那样生成。在Queen等中公开的方法部分指向设计人源化免疫球蛋白，其通过表达编码来自供体免疫球蛋白的重链和轻链互补决定区(CDRs)的重组DNA片段进行生产，所述供体免疫球蛋白能够结合希望的抗原上，如CPP、核酸类似物，或CPP-核酸类似物构建体，其附于编码受体人框架区的DNA片段上。一般来说，Queen专利中的发明对于基本上任何人源化的免疫球蛋白的设计统计都具有可应用性。Queen解释DNA片段将会一般包括可操作性连接到人源化免疫球蛋白编码序列上的表达控制DNA序列，包括天然关联的或异源启动子区。所述表达控制序列可以是载体中的真核启动子系统，所述载体能够转化或转染真核宿主细胞，或者所述表达控制序列可以是载体中的原核启动子系统，所述载体能够转化或转染原核宿主细胞。一旦将载体掺入适合的宿主中，将所述宿主保持在适于高水平表达导入的核苷酸序列的条件下，并且根据需要可以接下来进行人源化轻链、重链、轻/重链二聚体或完整抗体、结合片段或其它免疫球蛋白形式的收集和纯化(Beychok，Cells of Immunoglobulin Synthesis，Academic Press，New York，(1979)，将其掺入本文作为参考)。
可以根据公知的方法从多种人细胞中分离人恒定区(CDR)DNA序列。优选地，如在WO 87/02671中所述的那样将人恒定区DNA序列从永生化的B细胞中分离出来，将WO 87/02671掺入本文作为参考。类似地可用于生产本发明的抗体的CDRs可以源自编码单克隆抗体的DNA，所述单克隆抗体能够结合CPP、核酸类似物，或CPP-核酸类似物构建体。这些人源化的抗体可以利用公知的方法在任何方便的哺乳动物来源中生成，所述哺乳动物来源能够生产抗体，包括，但不限于，小鼠、大鼠、兔，或其它脊椎动物。对于恒定区和框架DNA序列的合适细胞以及表达和分泌抗体的宿主细胞可以获自多种来源，例如，美国典型培养物保藏中心，Manassas，VA。
除了上面讨论的人源化抗体之外，可以利用本领域技术人员公知的各种重组DNA技术轻易设计和制成对于天然抗体序列的其它修饰。而且，可以单一地或组合地使用多种不同的人框架区作为针对CPP、核酸类似物，或CPP-核酸类似物构建体的人源化抗体的基础。一般，可以利用多种公知的技术，如定点诱变轻易地完成基因的修饰(Gillman和Smith，Gene，881-97(1979)；Roberts等，1987，Nature，328731-734)。
或者，可以生成噬菌体抗体文库。为了生成噬菌体抗体文库，首先由分离自细胞，例如，杂交瘤的mRNA获得cDNA文库，所述杂交瘤表达要在噬菌体表面上表达的所需蛋白，例如，所需的抗体。利用反转录酶生产mRNA的cDNA拷贝。通过PCR获得指定免疫球蛋白片段的cDNA并且将得到的DNA克隆入合适的噬菌体载体中以生成包含DNA指定性免疫球蛋白基因的噬菌体DNA文库。制成包含异源DNA的噬菌体文库的方法是本领域公知的并且在，例如，Sambrook等(2001，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory，New York)中得以描述。
可以对编码所需抗体的噬菌体进行改造从而使蛋白质以这样一种方式展示在其表面上，所述方式可用于结合其相应的结合蛋白，例如，所述抗体针对的抗原。因而，当在细胞存在的情况下培养表达特异性抗体的噬菌体时，噬菌体将结合细胞，所述细胞表达相应的抗原。不表达抗体的噬菌体将不会结合所述细胞。这些淘选技术是本领域公知的并且在，例如Wright等(992，Critical Rev.Immunol.12125-168)中得以描述。
已经发展了诸如上述的那些方法用于利用M13噬菌体展示生产人抗体(Burton等，1994，Adv.Immunol.57191-280)。本质上，由获自一群生产抗体的细胞的mRNA生成cDNA文库。所述mRNA编码重排的免疫球蛋白，因而所述cDNA编码相同的免疫球蛋白。将扩增的cDNA克隆入M13表达载体中生成噬菌体文库，所述噬菌体在它们的表面上表达人Fab片段。通过抗原结合选择展示目标抗体的噬菌体并且在细胞中增殖以生产可溶性人Fab免疫球蛋白。因而，与常规单克隆抗体合成相反，这种方法使编码人免疫球蛋白的DNA永生化而不是表达人免疫球蛋白的细胞。
刚才给出的方法描述了编码抗体分子Fab部分的噬菌体的生成。不过，本发明不应当被视为单单受限于编码Fab抗体的噬菌体的生成。相反，编码单链抗体(scFv/噬菌体抗体文库)的噬菌体也包括在本发明中。Fab分子包含完整的Ig轻链，即，它们包含轻链的可变区和恒定区，但只包括重链的可变区和第一恒定区结构域(CH1)。单链抗体分子包含含有Ig Fv片段的蛋白质单链。Ig Fv片段只包括抗体重链和轻链的可变区，其中没有包含恒定区。遵照在Marks等(1991，J.Mol.Biol.222581-597)中所述的方法可以生成包含scFvDNA的噬菌体文库。以类似于对包含Fab DNA的噬菌体文库所述的方式淘选如此生成的噬菌体以便分离所需抗体。
本发明还应当被视为包括合成性噬菌体展示文库，其中可以合成重链和轻链可变区从而使它们包括几乎所有可能的特异性(Barbas，1995，Nature Medicine 1837-839；de Kruif等1995，J.Mol.Biol.24897-105)。
VII.方法本发明是部分基于这样的新发现，即CPP-核酸类似物膜可透性构建体可以用来鉴定结合到预定细胞内多核苷酸序列上的蛋白质。如本文其它地方所详述的，包含一个或多个光反应性基团的CPP-核酸类似物能够用来交联到蛋白质上，所述蛋白质与所述核苷酸类似物一样结合到相同的预定细胞内多核苷酸序列上。
在本发明的一个实施方案中，提供一种方法来鉴定结合到RNA序列上的蛋白质。在本发明的另一个实施方案中，提供一种方法来鉴定结合到DNA序列上的蛋白质。
在一个实施方案中，鉴定结合到包含预定RNA序列的细胞内多核苷酸上的蛋白质的方法包括以下步骤在适于允许构建体穿过细胞膜的条件下提供一种膜透过性构建体给细胞，在适于所述构建体结合所述多核苷酸的条件下允许所述构建体结合细胞内多核苷酸以形成构建体-多核苷酸复合物，激活构建体上的光反应性部分，由此将核酸类似物与结合预定RNA序列的蛋白质共价交联，从细胞中分离交联的核酸类似物-蛋白质复合物，并且鉴定交联的蛋白质。
在本发明的一个方面，所述膜透过性构建体包括含有至少一个光反应性氨基酸的核酸类似物。在一方面，所述光反应性氨基酸是BPA。在本发明的另一方面，所述膜透过性构建体包括同一性R1-CPP-R2的肽部分，其中CPP是细胞穿透性肽，另外其中R1和R2每一个都独立地选自肽、氨基酸、NH2，H，或OH，另外其中所述核酸类似物共价连接于选自R1，R2，所述肽部分内的半胱氨酸残基，或所述肽部分内的赖氨酸(K)残基。在本发明的另一方面，CPP是运输蛋白。在本发明的又一方面，所述CPP是TP10，R1-AFYLLGKINLKALAALAKKIL-R2(SEQ ID NO2)，其中R1是氢而R2是NH2。可用于本发明的其它CPPs在本文其它地方进行了详细描述。
在本发明的另一方面，所述核酸类似物是PNA。在另一方面，所述核酸类似物是PNA/DNA嵌合体。在本发明的又一方面，所述核酸类似物是核碱-修饰的寡核苷酸。在本发明的一个实施方案中，PNA具有序列TACGAAACCTCTAAATCAAGG(SEQ ID NO3)，其对应于Ank mRNA的残基-123到-102。在另一个实施方案中，PNA具有序列AAACCTCTAAATCAAGGCCTC(SEQ ID NO4)，其对应于Ank mRNA的残基+1592到+1610。在本发明的又一个实施方案中，PNA具有序列AAGCGCGGCTGCTCTAGCAG从(SEQ ID NO5)，其对应于Ank mRNA的残基+1594到+1614。
在本发明的一方面，所述核酸类似物通过化学键连接到CPP部分上。在一方面，所述键是二硫键。在又一方面，核酸类似物共价连接于CPP部分内的半胱氨酸残基上。许多可用于本发明的方法中的其它膜透过性构建体在本文其它地方进行了描述，并且因此将在不此作进一步讨论。
在本发明的另一个实施方案中，鉴定结合到细胞内多核苷酸上的蛋白质的方法包括分离交联核酸类似物-蛋白质复合物的特定方法步骤。在一方面，该方法包括裂解含有交联核酸类似物-蛋白质的细胞以形成细胞裂解物，将所述细胞裂解物在适于允许交联核酸类似物-蛋白质结合到固体支持物上以形成额外复合物的条件下与包含预定RNA序列的固体支持物相接触，并且由细胞裂解物中分离所述额外复合物。在本发明的又一个实施方案中，该方法包括裂解含有交联核酸类似物-蛋白质的细胞以形成细胞裂解物，将所述细胞裂解物与包含抗体的固体支持物相接触，所述抗体对于CPP、核酸类似物、CPP-核酸类似物构建体以及结合预定RNA序列的蛋白质的其中至少一种为特异性的。在适于允许交联核苷酸类似物-蛋白质结合抗体以形成复合物的条件下进行温育，并且由细胞裂解物中分离抗体复合物。
图1描述了本发明的一个实施方案，其中利用PNA退火和RNA结合特征鉴定(″PARC″)来鉴定RNA结合蛋白质。在此实施方案中，用光反应性氨基酸，直接附着于PNA上的对苯甲酰基苯丙氨酸(BPA)合成细胞穿透性肽-肽核酸(CPP-PNA)构建体。一旦将细胞暴露于CPP-PNA，为CPP提供足够的时间以穿过细胞膜，它携带着附着的PNA，其将在靶RNA上杂交到互补序列上。UV辐射导致产生游离的苯丙氨酸基团，其将PNA交联到最近的物质，RNA结合蛋白上。裂解所述细胞并将蛋白质裂解物与预先偶联了生物素标记的与PNA反义的寡核苷酸链霉抗生物素磁珠一起温育，因而只收回结合到PNA上的那些蛋白质。将这些分离的蛋白质进行电泳分离，通过用考马斯蛋白质染料来进行显影，在胶条中进行分离并通过质谱术进行分析。
如熟练技术人员将会理解的，基于本文给出的内容，本发明的方法也可以使用任何固体支持物，用于分离或纯化核酸类似物-蛋白质复合物。
VIII.试剂盒本发明包括各种试剂盒用于鉴定结合到细胞内多核苷酸上的蛋白质，其包含CTT-核酸类似物膜透过性构建体，涂药器，描述该试剂盒用途的说明性材料以进行本发明的方法。这些说明书简单地概括了本文提供的方法和实施例。尽管下面描述了模式试剂盒，但是按照本说明书其它用途试剂盒的组分对于熟练技术人员将是显而易见的。这些试剂盒的每一种都包括在本发明中。
本发明的试剂盒的膜透过性构建体包括连接到核酸类似物部分上的CPP部分。在一个实施方案中，所述CPP部分是运输蛋白。所述构建体进一步包括核酸类似物部分。在一个实施方案中，所述核酸类似物部分是PNA分子。在一方面，所述PNA选自ACGAAACCTCTAAATCAAGG(SEQ ID NO3)，AAACCTCTAAATCAAGGCCTC(SEQ ID NO4)和AAGCGCGGCTGCTCTAGCAGAA(SEQ ID NO5)。所述构建体进一步包括光反应性标记。在本发明的一个实施方案中，所述光反应性标记是光反应性氨基酸。在一方面，所述光反应性氨基酸是所述构建体的核酸类似物部分的一部分。
如本文其它地方所述，包括在本发明的试剂盒中的膜透过性构建体可以是一种分离的多肽。另外，应当理解本文所述的组合物和方法可以等同应用于本发明试剂盒中。
实验性实施例现在参照下列实施例对本发明进行介绍。这些实施例只是为了说明的目的提供的并且本发明不应被视为受限于这些实施例，而应当被视为包括任何以及全部变异形式，其作为本文提供教导的结果是显而易见的。
实验性实施例1PNA合成根据由Koch等(Koch T.，等，J.Pept.Res.，Jan；49(1)80-8(1997))所述的方案合成具有通用序列Bpa-Cys-PNA-Lys-酰胺的PNA寡聚体。简言之，以2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲四氟硼酸盐(TBTU)/1-羟基苯并三唑(Hobt)激活的t-Boc-Lys-OH和随后乙酰化为取代0.1mmol/g来下载(4-甲基二苯甲胺(MBHA)树脂。在Applied Biosystems 433A合成仪上以10μmol的规模将t-BocPNA单体组配为N-O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸(HATU)酯。将t-Boc-Cys(4-MeBzl)-OH和t-Boc-Bpa-OH手工偶联为TBTU酯。
利用t-Boc策略和二环己基碳二亚胺(DCC)/Hobt激活在AppliedBiosystems 433A合成仪上合成载体肽，TP10。在完成主肽链后将Lys的正交保护基团(Pooga M.，等，Methods Mol.Biol.，；208225-36(2002))特异性去除并且将TBTU/Hobt激活的t-Boc-Cys(Npys)-OH偶联到侧链上。
通过氢氟化物于0℃将肽和PNA寡聚体从树脂上剪切下来持续45分钟。将对甲酚或对甲酚和对硫代甲酚的混合物分别用作肽和PNA的清除剂。在反相HPLC(C18，Discovery 25cm×21.2mm，5μm，Supelco)上纯化剪切的肽。通过MALDI-TOF(Voyager-DE STR)质谱分析确证PNA和肽的质量(图3)。
将1μmol的肽和PNA寡聚体在100μl二甲亚砜(DMSO)，100μl二甲基甲酰胺和300μl 0.1M醋酸缓冲液pH 5.5中进行缀合。当PNA残存在沉淀物中时加入30μl三氟乙酸。将混合物在室温搅拌过夜并且在反相HPLC C18柱(Discovery，25cm×10mm，5μm)上分离反应产物。通过在HPLC的多重波长检测器和MALDI-TOF质谱分析来确定每种缀合物的同一性。产生的CPP-PNAs如下。″Ank3″是对应于Ank mRNA的残基-123到-102的PNA，″Ank2″是对应于Ank mRNA的残基+1508到+1525的PNA，而″Ank1″是对应于Ank mRNA的残基+1594到+1614的PNA。
如下所示，在PNA的N末端Cys和偶联到TP10中Lys7的侧链上的Cys之间形成二硫键
Ala-Gly-Tyr-Leu-Leu-Gly-Lys-Ile-Asn-Leu-Lys-Ala-Leu-Ala-Ala-Leu-Ala-Lys-Lys-Ile-Leu-酰胺CysSSCys-BPA-TACGAAACCTCTAAATCAAGG-Lys-酰胺Ank 1 PNA(MW 8467)-AAACCTCTAAATCAAGGCCTC-Ank2PNA(MW 8512)-AAGCGCGGCTGCTCTAGCAGAA-Ank 3PNA(MW 8901)实验性实施例2皮质培养物将皮质培养物与B27添加物一起于37℃保持在5％CO2中。一旦所述细胞达到合适年龄(7到22天)，将它们立即进行PARC处理或用钾、DHDG或BDHF进行预处理，通过将NB/B27培养基从细胞中除去并且用预热的1X MAPEX溶液于37℃在5％CO2中替代它5分钟来进行所述细胞的钾刺激，其后去除溶液并用预热的NB/B27培养基进行替代。为了用DHPG处理细胞，利用预热的NB/B27培养基进行一半培养基的更换。用新鲜培养基温育30分钟后，将DHPG加至最终浓度20μM并且将细胞温育30分钟。为了进行如实验性实施例3中所述的本发明的PARC处理，用预热的NB/B27培养基替换含有DHPG的培养基。在BDNF以50ng/ml的终浓度存在时Ank RNA表达在体细胞以及树突中在3小时的时期里显著提高。为了发展利用如实验性实施例3中给出的PARC处理获得的结果，将50ng/ml BDNF加到NB/B27培养基中进行90分钟的预处理，接下来加入PNA，进行总时间为3小时的BDNF处理。
实验性实施例3PARC处理将TP10-PNA缀合物以5μM的浓度悬浮于1M HBS(HEPES-缓冲盐溶液)，pH 7.4中并保存在-20℃待用。将皮质细胞在培养物中与神经基础培养基和B27添加物，和稀释在预热的神经基础培养基中的50nM TP10-PNA一起于37℃在5％CO2中温育90分钟。将包含PNA的神经基础培养基从培养皿中吸去，将冰冷的1M HBS，pH 7.4，迅速加到皿中以洗涤细胞并制备它们进行裂解。裂解前，将细胞在距离UV源2.5英寸处进行UV辐射2.5分钟以便将PNA和RNA结合蛋白交联。随后裂解细胞。
实验性实施例4细胞裂解和蛋白质裂解物的分离通过在UV辐射后去除HBS并且迅速加入冰冷的TX-100裂解缓冲液(25mM HEPES，pH 7.4，0.1％triton X-100，300mM NaCl，20mM甘油磷酯，1.5mM MgCl2，1mM DTT，200nM Na3VO4，2mM EDTA，pH 8.0，1mM苄脒，1mM PMSF，2μg/ml亮肽素，2μg/ml抑肽酶)。细胞立即从板中刮出，收集，并置于冰上。将蛋白质裂解物保存在-70℃待用。
实验性实施例5生物素标记的有义寡核苷酸偶联到链霉抗生物素磁珠上通过从贮存液中磁性分离10mg的链霉抗生物素磁珠(PureBiotech，Cat.No.MSTR0502)并用PBS，pH 7.4洗涤两次来实现生物素标记的有义寡核苷酸偶联到链霉抗生物素磁珠上。将第二次PBS洗涤液从珠中吸去，随后将所述珠重悬于1ml包含50μg生物素标记的有义寡核苷酸的PBS中。将此偶联反应在旋转摇动器上于室温温育1小时。磁性分离后，用PBS，pH 7.4洗涤珠-链霉抗生物素-生物素-寡复合物。将洗涤步骤重复5次以除去任何未结合的生物素标记寡核苷酸。吸去最后的PBS洗涤液，将珠以10mg/ml重悬于贮存缓冲液(10ml PBS中的10mg BSA和2mg NaN3，pH 7.4)或以10mg/ml重悬于TX-100裂解缓冲液中，如果它们要立即使用的话。将寡偶联珠保存于4℃直到可以使用，此时将它们从贮存溶液中磁性分离出来并以10mg/ml重悬于TX-100裂解缓冲液中。
实验性实施例6从总蛋白裂解物中分离RBPs将一小份总裂解物保持在-70℃进行凝胶分析；将其余裂解物与100μg之前偶联到有义寡核苷酸上的磁珠一起于室温旋转1小时。在磁性分离后除去流过液(保留一份用于将来的凝胶分析)。现在应当将所述珠杂交PNA上，所述PNA交联到RBPs。将珠-寡核苷酸-PNA-RBP复合物用TX-100缓冲液洗涤两次以除去任何未结合的PNA-RBP。将蛋白酶抑制剂加入到预热的无盐TX-1001裂解缓冲液中，通过与301的这种预热无盐缓冲液一起于RT/37℃/50℃旋转20分钟将蛋白质从磁珠上洗脱下来。
实验性实施例7凝胶电泳和染色利用NuPAGE 10％Bis-Tris Gels(Invitrogen，Cat.Nos.NP0301-3)对总裂解物、流过液和结合蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。为了检查利用PARC方案获得的结果，使用Biorad Silverstain PlusKit(Biorad Cat.No.161-0449)显影蛋白质。一旦用更加灵敏的银染确定优化条件，以在质谱分析之前使用考马斯蓝蛋白染色进行结合蛋白的显影。将蛋白质凝胶于室温在固定剂(46％甲醇，7％乙酸)中温育一小时，随后在染料(46％甲醇，7％乙酸，过滤除菌的0.1％考马斯亮蓝R-250)中一小时，随后在5％甲醇，7.5％乙醇中脱色直到可以检测出蛋白条带。此时，将凝胶转移到5％的乙酸终止溶液中。随后将结合蛋白中显示富集的条带从凝胶中提取，并将胶条放1-2％乙酸中并保存在-20℃中直到进行质谱分析。
利用本发明中给出的这一技术分离出复合以Ank mRNA的多种蛋白质。利用质谱分析鉴定分离的蛋白质；这些蛋白质中的一些，如hnRNPK和核仁蛋白，先前显示证明了RNA结合活性。核仁蛋白，不像任何其它由本发明的PARC方法所鉴定的蛋白质，已经以本文所用的每种PNA和在每一种预处理条件下得以分离。这一发现的功能性意义提示这种普遍存在的特性与核仁蛋白在调控Ank表达中的突出作用相关。其它蛋白质只是在与一种或两种本文公开的PNA的复合物中得以分离，而不是全部三种。已经发现HnRNP K只是联合Ank1 PNA而hnRNPU只是联合Ank2 PNA和Ank3 PNA得以分离(图3，4和4A)。
图3说明了考马斯染料染色的电泳凝胶的结果，所述凝胶包含在BDNF处理和″PARC″分析之后回收的蛋白质(如图1中所述)。在加入50nM Ank1 PNA再持续90分钟之前用50ng/ml BDNF处理十天的皮质细胞90分钟。随后对细胞进行UV辐射，裂解，并通过偶联到反义PNA生物素标记的寡核苷酸的链霉抗生物素磁珠回收结合的蛋白质。通过SDS-PAGE分离总裂解物(TL)、流过液(FT)和结合蛋白并进行考马斯染色。对富集的条带(如所示)进行分离、蛋白水解，并通过质谱分析进行鉴定。
通过同时对ank RNA进行荧光原位杂交和对核仁蛋白进行荧光免疫组化来确证ank RNA和核仁蛋白的共存。将核仁蛋白抗体应用到固定的皮质神经元上。利用荧光检测抗体的结合。以结合到ank RNA不同区域上的短荧光标签寡核苷酸的混合物来进行原位杂交。对每一区域所用的荧光染料不同从而使得抗体染色出现绿色而RNA出现红色，以及从而使得共存的实体出现黄色。
表1举例说明了根据本发明的方法和组合物，作为药物刺激的功能结合到每种PNA(Ank1，Ank2，和Ank3)上的RNA结合蛋白。这些数据说明结合到ank RNA 3’末端的RBP比其它区域更多并且这种结合能够进行药学调节。
表1利用针对ank RNA三种不同区域的PNA-CPP构建体鉴定RNA结合蛋白。图标符号″无″＝未处理的含有PNA-CPP构建体的细胞；″DHPG″＝用20μM DHPG处理含有PNA-CPP构建体的细胞；″钾″＝用3mM钾处理含有PNA-CPP构建体的细胞；而″BDNF″＝用50ng/ml BDNF处理含有PNA-CPP构建体的细胞)。″Ank3″是对应于AnkmRNA的残基-123到-102的PNA，″Ank2″是对应于Ank mRNA的残基+1508到+1525的PNA，而″Ank1″是对应于Ank mRNA的残基+1594到+1614的PNA。
实验性实施例8利用二硫键将PNA缀合到细胞穿透性肽上为了获得PNA和细胞穿透性肽之间的异源二聚性二硫键，必须将一种组分，PNA或肽的半胱氨酸残基衍生化。3-硝基-2-吡啶硫苯基(NPys)-衍生的Cys对于游离巯基具有特异性反应性。Npys标记的Cys可以商购并且可以组配成像一般受保护氨基酸的肽链。
首先，在分离的微量离心管中制备1摩尔当量(0.5-2mg)的肽和1摩尔当量的PNA。偶联效率在PNA和肽的序列之间有所变化，并且依赖于每种的溶解度和纯度。所以，1∶1摩尔比在每一种情况下可能并非最佳，将需要优化所述比例以实现所需结果。将PNA溶于200μl脱氧的DMSO中。将肽溶于100μl 0.01M醋酸缓冲液pH 5.5，并将200μl的DMF加入到两种溶液中。将两种溶液混合并充分振荡。将混合物于室温避光搅拌过夜，或至少持续4小时。
反应产物可以通过半成品RP-HPLC进行分离。使用AC-18柱，或用于纯化所述肽的柱，如果不同的话。可以使用同量梯度，例如，20％洗脱液A持续5min，接下来在40min内逐渐将洗脱液A提高到100％。20％乙腈将防止″未反应的″PNA在柱内与固定相相互反应，并且未反应的PNA将与溶剂(DMSO和DMF)一起被洗出柱外。缀合的PNA在肽峰之前。所用的检测波长包括218nm(肽键的最大吸光度)和260nm(PNA核碱基)。对于单波长检测器，使用260nm筛选检测。收集吸收两种波长的级分。
将级分冻干并避光保存于-20℃。可以利用缀合物的质谱分析进一步确证所需产物。必须小心在制备样品或收集质谱数据期间不还原二硫键。
特此将本文引用的每个专利、专利申请和出版物的内容全部掺入本文作为参考。
尽管参照特定实施方案披露了本发明，但是显而易见本领域其它技术人员可以设计出本发明的其它实施方案和变更，而不背离本发明的真正精神和范围。随附的权利要求书意欲被视为包括所有这些实施方案和等同变更。
序列表<110>The Trustees of the University of PennsylvaniaEberwine，JamesZielinski，JenniferLangel，loKilk，Kalle<120>鉴定RNA结合蛋白的方法和组合物<130>053893-5077WO<150>US 60/531,719<151>2001-12-22<160>8<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>0<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>TP10<400>1000<210>2<211>21<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>TP10<400>2Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Lys Ile Asn Leu Lys Ala Leu Ala Ala Leu1 5 10 15Ala Lys Lys Ile Leu20<210>3<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Ank mRNA的残基-123到-102<400>3tacgaaacct ctaaatcaag g21
<210>4<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Ank mRNA的残基+1592到+1610<400>4aaacctctaa atcaaggcct c21<210>5<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Ank mRNA的残基+1594到+1614<400>5aagcgcggct gctctagcag aa22<210>6<211>27<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>运输蛋白<400>6Gly Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Lys Ile Asn Leu1 5 10 15Lys Ala Leu Ala Ala Leu Ala Lys Lys Ile Leu20 25<210>7<211>16<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>穿透素<400>7Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys1 5 10 15<210>8<211>13<212>PRT
<213>人工序列<220>
<223>pTat<400>8Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln1 5 10
权利要求
1.一种膜可透性构建体，用于所述构建体穿过脂膜的运输，包含a)与细胞内多核苷酸杂交的核酸类似物，所述核酸类似物包含至少一种光反应性部分；b)包含R1-CPP-R2的肽部分，其中CPP是细胞穿透性肽，另外其中R1和R2各自独立地选自肽、氨基酸、NH2，H，或OH，另外其中所述核酸类似物共价连接于选自R1、R2、所述肽部分内的半胱氨酸残基，或所述肽部分内的赖氨酸(K)残基的成员之一上；和c)连接所述核酸类似物和所述肽部分的化学键。
2.权利要求1的膜可透性构建体，其中所述CPP选自SEQ ID NO2，SEQ ID NO6，SEQ ID NO7和SEQ ID NO8。
3.权利要求1的膜可透性构建体，其中所述化学键是不稳定的。
4.权利要求2的膜可透性构建体，其中所述不稳定的化学键选自二硫键、酯键、抗生物素蛋白-生物素联接、环状不饱和马来酰胺酸酯，和13-酰基腙。
5.权利要求2的膜可透性构建体，其中R1和R2之一包含半胱氨酸，另外其中所述核酸类似物通过二硫键键合到所述半胱氨酸上。
6.权利要求1的膜可透性构建体，其中所述肽部分包含SEQ ID NO2的同源物或保守性变异体。
7.权利要求1的膜可透性构建体，其中所述核酸类似物选自肽核酸(PNA)，PNA/DNA嵌合体，PNA/RNA嵌合体，RNA，DNA，2′-O-烷基RNA，2′-O-烷基RNA/DNA嵌合体，和核碱基修饰的寡核苷酸。
8.权利要求1的膜可透性构建体，其中所述光反应性部分选自光反应性氨基酸，对-苯甲酰基苯甲酰基(BzBz)部分，叠氮化物部分，4-苯甲酰基苯甲酸衍生物，4-叠氮基-2，3，5，6，-四氟苯甲酸衍生物，和N-((2-吡啶基二硫代)乙基)-4-叠氮邻羟基苯甲酰胺衍生物。
9.权利要求8的膜可透性构建体，其中所述光反应性部分是选自对-苯甲酰基-L-苯丙氨酸(Bpa)和对-叠氮基-L-苯丙氨酸(Apa)的光反应性氨基酸。
10.权利要求1的膜可透性构建体，其进一步含有标记。
11.权利要求10的膜可透性构建体，其中所述标记选自生物素，二硝基苯，吖啶，荧光素，若丹明，酞菁，洋地黄毒苷，嵌入剂，小沟结合剂，化学发光剂前体，硒和镉。
12.权利要求1的膜可透性构建体，其中R1和R2之一包含半胱氨酸并且所述核酸类似物通过二硫键连接到所述半胱氨酸上。
13.权利要求1的膜可透性构建体，其中所述核酸类似物通过二硫键连接到所述肽部分中的赖氨酸残基上。
14.权利要求1的膜可透性构建体，其中C末端的亮氨酸残基被酰胺化。
15.权利要求13的膜可透性构建体，其中所述二硫键置于一对半胱氨酸残基之间。
16.一种膜可透性构建体，用于所述构建体穿过脂膜的运输，包含a)与细胞内多核苷酸杂交的结构R3-Cys-PNA-Lys-酰胺的核酸类似物，其中R3是光反应性氨基酸；b)包含R1-AFYLLGKINLKALAALAKKIL-R2(SEQ ID NO2)的肽部分，其中R1是氢而R2是NH2，另外其中所述核酸类似物共价连接于所述肽部分内的半胱氨酸残基上，和c)连接所述核酸类似物与所述肽的二硫键。
17.权利要求16的膜可透性构建体，其中所述核酸类似物具有结构Bpa-Cys-PNA-Lys-酰胺。
18.权利要求16的膜可透性构建体，其中所述PNA选自a)TACGAAACCTCTAAATCAAGG(SEQ ID NO3)；b)AAACCTCTAAATCAAGGCCTC(SEQ ID NO4)；和c)AAGCGCGGCTGCTCTAGCAGAA(SEQ ID NO5)。
19.一种鉴定结合到包含预定RNA序列的细胞内多核苷酸上的蛋白质的方法，所述方法包括步骤a)提供一种膜可透性构建体，用于所述构建体穿过脂膜的运输，其包含i)与细胞内多核苷酸杂交的核酸类似物，所述核酸类似物包含至少一种光反应性部分；ii)包含R1-CPP-R2的肽部分，其中CPP是细胞穿透性肽，另外其中R1和R2各自独立地选自肽、氨基酸、NH2，H，或OH，另外其中所述核酸类似物共价连接于选自R1、R2、所述肽部分内的半胱氨酸残基，或所述肽部分内的赖氨酸(K)残基的成员之一上；和iii)连接所述核酸类似物和所述肽部分的化学键；b)在适于所述构建体与所述细胞内多核苷酸结合的条件下，让所述构建体与所述细胞内多核苷酸结合以形成构建体-多核苷酸复合物；c)激活所述光反应性部分，由此将所述核酸类似物与结合到所述预定RNA序列上的所述蛋白质共价交联，d)从所述细胞中分离所述交联的核酸类似物-蛋白质；和e)鉴定交联到所述核酸类似物上的所述蛋白质；由此鉴定结合到预定RNA序列上的蛋白质。
20.权利要求19的方法，其中在步骤d)中的所述分离包括i)裂解含有交联的核酸类似物-蛋白质的细胞以形成细胞裂解物；ii)将所述细胞裂解物与包含所述预定RNA序列的固体支持物在适于所述交联的核酸类似物-蛋白质结合至所述固体支持物的条件下接触以形成复合物；和iii)从所述裂解物中分离所述复合物。
21.权利要求19的方法，其中在步骤d)中的所述分离包括i)裂解含有交联的核酸类似物-蛋白质的细胞以形成细胞裂解物；ii)将所述细胞裂解物与含有抗体的固体支持物在适于所述交联的核酸类似物-蛋白质结合至所述抗体的条件下接触以形成复合物，其中所述抗体特异于下列成员中的至少一种A)CPP；B)核酸类似物；C)CPP-核酸类似物构建体；和D)结合到预定RNA序列上的蛋白质；iii)从所述裂解物中分离所述复合物。
22.权利要求19的方法，其中所述PNA选自a)TACGAAACCTCTAAATCAAGG(SEQ ID NO3)；b)AAACCTCTAAATCAAGGCCTC(SEQ ID NO4)；和c)AAGCGCGGCTGCTCTAGCAGAA(SEQ ID NO5)。
23.权利要求19的方法，其中所述肽部分包含R1-AFYLLGKINLKALAALAKKIL-R2(SEQ ID NO2)，其中R1是氢而R2是NH2，另外其中所述核酸类似物共价连接于所述肽部分内的半胱氨酸残基上。
24.一种鉴定结合到包含预定RNA序列的细胞内多核苷酸上的蛋白质的试剂盒，所述试剂盒包含a)一种膜可透性构建体，用于所述构建体穿过脂膜的运输，其包含i)与细胞内多核苷酸杂交的核酸类似物，所述核酸类似物包含至少一种光反应性部分；ii)包含R1-CPP-R2的肽部分，其中CPP是细胞穿透性肽，另外其中R1和R2各自独立地选自肽、氨基酸、NH2，H，或OH，另外其中所述核酸类似物共价连接于选自R1、R2、所述肽部分内的半胱氨酸残基，或所述肽部分内的赖氨酸(K)残基的成员之一上；和iii)连接所述核酸类似物和肽部分的化学键；b)涂药器；和c)使用的说明材料。
全文摘要
本发明包括鉴定结合到预定RNA序列上的多肽的组合物、方法和试剂盒。本发明部分地包含一种光反应性部分以帮助鉴定这种多肽。
文档编号A61K47/48GK1914222SQ200480041280
公开日2007年2月14日 申请日期2004年12月22日 优先权日2003年12月22日
发明者J·艾伯文, U·兰吉尔, K·基尔克, J·齐林斯基 申请人:宾夕法尼亚州大学理事会